PL229329B1 - Rusztowanie kostne na bazie β-1,3-glukanu (kurdlanu) i bioceramiki oraz sposób jego wytwarzania - Google Patents

Abstract

Rusztowanie kostne na bazie bioceramiki fosforanowo - wapniowej i kurdlanu, charakteryzuje się tym, że zawiera 6 - 20% (w/v) roztwór ß-1,3-glukanu zwany dalej kurdlanem, przygotowany w 0,1 - 0,5 M roztworze zasady sodowej (NaOH), korzystnie 0,3 M (komponent x) oraz 2 - 90% (w/v) bioceramiki fosforanowo - wapniowej rozprowadzonej w przygotowanym roztworze kurdlanu, w postaci nanoproszku, proszku lub granul, o rozmiarze 0,1 - 1,0 mm wypalanych w temperaturach 500°C - 1300°C, korzystnie 1100 - 1200°C (komponent y), przy czym najkorzystniej gdy proporcje wagowe stałych składników wynoszą odpowiednio 7 - 10% kurdlanu i 60 - 80% bioceramiki, a maksymalna ilość komponentu y (w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH) w zależności od komponentu x (w gramach na 100 ml NaOH), wynika ze wzoru: ymax(x)=0,079x2-6,1557x+123,57. Przedmiotem zgłoszenia jest także sposób wytwarzania rusztowania kostnego na bazie bioceramiki fosforanowo - wapniowej i kurdlanu. Materiał przygotowany ze względu na swoje właściwości biologiczne nadaje się do stosowania zarówno in vitro w inżynierii tkankowej jako rusztowanie kostne, wstępnie zasiedlane komórkami osteoprogeniterowymi, wyprowadzonymi z organizmu pacjenta w celu wygenerowania tzw. żywego wszczepu, jak i in vitro w medycynie regeneracyjnej, jako materiał przyspieszający procesy regeneracyjne w miejscu implantacji. Ponadto, przygotowany materiał nadaje się do stosowania jako baza do immobilizacji substancji bioaktywnych, również termowrażliwych (np. białek adhezyjnych, czynników wzrostu, antybiotyków peptydowych), metodą pułapkowania wewnątrz struktury polimerowej żelu kurdlanowego (na etapie wytwarzania rusztowania kostnego), co wpłynie na poprawę jego właściwości biologicznych oraz będzie chronić przed post - operacyjnymi infekcjami.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania wysoko biokompatybilnego materiału na bazie β-1,3-glukanu (kurdlanu) i bioceramiki do zastosowań w inżynierii tkankowej kości w celu przyspieszania procesów regeneracyjnych w miejscu implantacji. Otrzymany według wynalazku materiał może znaleźć zastosowanie jako rusztowanie kostne zasiedlane w warunkach in vitro komórkami osteoprogeniterowymi wyprowadzonymi od pacjentów w celu uzupełniania niewielkich ubytków kostnych u tych samych pacjentów po przebytych złamaniach lub resekcji nowotworu (pacjenci mogą w tym przypadku być dawcami i biorcami komórek).

Kluczowym elementem procesu rekonstrukcji tkanek jest przygotowanie odpowiedniego materiału implantacyjnego (Bose S. i wsp., Trends in Biotechnology 30, 546-554, 2012; Rezwan K. i wsp., Biomaterials 27, 3413-3431, 2006). W medycynie regeneracyjnej kości wyróżnia się dwa typy biomateriałów: substytuty kostne służące do wypełniania dużych ubytków kostnych, poddawane dużym obciążeniom mechanicznym, więc charakteryzujące się parametrami mechanicznymi zbliżonymi do kości ludzkiej oraz rusztowania kostne (tzw. skafoldy), które nie zawsze są poddawane dużym obciążeniom mechanicznym, a ich główną funkcją jest przyspieszanie procesów regeneracyjnych w miejscu niewielkich ubytków kostnych (Przekora A. i wsp., Mater. Sci. Eng. C. Mater. Biol. Appl. 58, 891-899, 2016). Ze względu na fakt, że system biomechaniczny kości jest złożony, rusztowanie kostne musi spełniać szereg zróżnicowanych kryteriów. Przede wszystkim powinno charakteryzować się wysoką biokompatybilnością, tj. zgodnością tkankową, sprzyjać zasiedlaniu komórek, pobudzać proliferację i różnicowanie komórek kościotwórczych (osteoblastów) oraz nie wykazywać cytotoksyczności. Rusztowanie powinno także posiadać zwartą strukturę, odpowiednią elastyczność oraz plastyczność, dzięki czemu charakteryzuje się poręcznością chirurgiczną i łatwością w dopasowywaniu się do miejsca ubytku kostnego. Innym ważnym czynnikiem jest stopniowa biodegradowalność skafoldu in vivo, dzięki czemu powstają miejsca do zasiedlenia i wzrostu nowych komórek. (Chen G. P. i wsp., Macromolecular Bioscence 2, 67-77, 2002; O’Brien F. J., Materials Today 14, 88-95, 2011; Dhandayuthapani B. i wsp., International Journal of Polymer Science 290602,1-19, 2011).

Głównym materiałem implantacyjnym stosowanym w inżynierii tkankowej kości jest hydroksyapatyt (HAp) oraz pokrewne mu trójfosforany wapnia (tj. α-TCP oraz β-TCP). HAp, który jest głównym składnikiem części mineralnej kości, jest materiałem biozgodnym, osteokonduktywnym oraz bioresorbowalnym (Karageorgiou V. i Kapłan D., Biomaterials 26, 5474-5491,2005; Knowles J. C., Journal of Materiał Chemistry 13, 2395-2401,2003; Oonishi H. i wsp., Eighth International symposium on ceramics in medicine, Eselvier Science Ltd. Tokyo, Japan 1995,137-144). Niemniej jednak, bioceramika fosforanowo-wapniowa (HAp i TCP) jest stosunkowo długo degradowana w organizmie, posiada niezadowalające właściwości mechaniczne, a także ze względu na swoją sypkość, jest nieporęczna chirurgicznie. W inżynierii tkankowej kości stosowane są również polimery, zarówno pochodzenia naturalnego, takie jak: alginian, fibrynogen, kolagen, chitosan, czy kwas hialuronowy, jak i pochodzenia syntetycznego np. polikaprolakton, czy kwas polimlekowy. Wspomniane polimery charakteryzują się wysoką bioaktywnością, jak również stopniową biodegradowalnością in vivo. Dlatego też tworzenie kompozytów złożonych z bioceramiki HAp lub/i TCP oraz naturalnych, bądź syntetycznych polimerów, pozwala połączyć zalety obu typów materiałów tak, aby wykazywały lepsze właściwości mechaniczne, spełniały wymagania fizjologiczne i były szybko degradowane (Gloria A. i wsp., Journal of Applied Biomaterials & Biomechanics, 8, 57-67, 2010; Lee S. -H. i Shin H., Advances in Drug Delivery Research, 22, 339359, 2007).

Ze względu na swoją zdolność do tworzenia zwartego, sprężystego żelu, kurdlan znalazł zastosowanie jako materiał wiążący (lepiszcze) dla ceramiki HAp. Dotychczasowe badania ograniczają się jednak do zastosowania żelu kurdlanowego otrzymanego metodą termiczną z zawiesiny wodnej tego polisacharydu. Jedna z koncepcji obejmuje zastosowanie proszku HAp o wielkości cząsteczek ok. 1 pm oraz wodnej zawiesiny kurdlanu, ogrzewanej w temperaturze 40°C, co pozwala na uzyskanie plastycznej kompozycji (US Patent nr 5 132 255). Kolejny sposób dotyczący zastosowania kurdlanu związany jest z zastosowaniem żelu kurdlanowego otrzymanego w temperaturze 80-100°C jako lepiszcza dla bioceramiki fosforanowo-wapniowej w postaci mikroporowatych granul (HAp, HAp-TCP, TCP, HAp modyfikowany) o rozmiarze 0,1-1,0 mm i porowatości otwartej 50-70% (PL Patent nr 206 394, International Patent nr EU 2 421 570 B1). Materiały kompozytowe, otrzymane według wymienionego patentu, zawierają w swoim składzie mikroporowatą bioceramikę przez co wykazują wysoką reaktywność jonową, która negatywnie wpływa na żywotność fibroblastów i komórek kościotwórczych in vitro (Przekora

PL 229 329 Β1 i wsp., Inżynieria Biomateriałów 15 (114), 59-65, 2012). W związku z tym materiały te nie spełniają podstawowych wymagań stawianych rusztowaniom kostnym i nie mogą być wstępnie zasiedlane w warunkach in vitro komórkami osteoprogeniterowymi wyprowadzonymi od pacjenta. Niemniej jednak, materiały o wysokiej reaktywności jonowej, według aktualnej wiedzy, wykazują zwiększoną bioaktywność w terapii in vivo (w przypadku implantacji do kości), co bardzo korzystnie wpływa na szybką regenerację i mineralizację tkanki kostnej w miejscu implantacji. Kompozyty otrzymane według patentu PL nr 206 394 i EP nr 2 421 570 zostały z powodzeniem wykorzystane jako materiały kościozastępcze do wypełniania niewielkich ubytków kostnych (Belcarz A. i wsp., Central European Journal of Biology 8, 534-548, 2013; Borkowski i wsp., Materials Science and Engineering C: Materials for Biological Applications 53, 60-67, 2015).

Przedmiotem wynalazku jest opracowana metoda wytwarzania w temperaturze pokojowej implantacyjnego materiału na bazie kurdlanu i bioceramiki fosforanowo-wapniowej (HAp, TCP, HAp-TCP), cechującego się wysoką bioaktywnością, biokompatybilnością oraz poręcznością chirurgiczną, którego wariant zawiera dodatek termowrażliwych substancji bioaktywnych, np. białek adhezyjnych lub czynników wzrostu, w celu intensyfikowania procesów adhezji, proliferacji i różnicowania komórek kościotwórczych na powierzchni biokompozytu. Sposób według wynalazku umożliwia także zastosowanie antybiotyków peptydowych zwłaszcza gliko- i lipopeptydowych już na etapie wytwarzania kompozytu w celu zapobiegania postoperacyjnym zakażeniom bakteryjnym, co pozwala na stopniowe, przedłużone w czasie uwalnianie, zapewniając długoterminową postoperacyjną ochronę przeciw-bakteryjną.

Opracowana wg wynalazku metoda wytwarzania rusztowania kostnego w temperaturze pokojowej jest korzystniejsza w porównaniu do tej wykorzystującej do żelowania temperaturę powyżej 80°C (PL nr 206 394 i EP nr 2 421 570), gdyż ta ostatnia uniemożliwia modyfikację biomateriału specyficznymi substancjami aktywnymi, które często są wrażliwe na wysoką temperaturę, a nawet mogą całkowicie utracić aktywność biologiczną. Dotyczyć to może takich substancji jak białkowe czynniki wzrostu, białka adhezyjne, antybiotyki peptydowe i inne, które dodane do kompozytu mogą poprawić jego właściwości biologiczne (np. w kierunku korzystnej adhezji komórek).

Rusztowanie kostne według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera β-1,3-glukan zwany dalej kurdlanem (komponent x) oraz bioceramikę fosforanowo-wapniową w postaci nanoproszku, proszku lub granul, o rozmiarze od 0,1 do 1,0 mm wypalanych w temperaturach 500-1300°C, korzystnie 1100-1200°C (komponent y), przy czym maksymalna ilość komponentu y (w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH) w zależności od komponentu x (w gramach na 100 ml NaOH) jest zgodna z proporcją wyrażoną w sposób matematyczny, jak niżej wskazano:

Niech „x” oznacza masę kurdlanu w gramach na 100 ml NaOH, gdzie:

χε <6;20> (zakres został ustalony eksperymentalnie).

Niech „y” oznacza masę granul ceramicznych w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH. Najkorzystniej jest, gdy proporcje składników wynoszą odpowiednio 7-10% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v) bioceramiki.

Z eksperymentów wynika, że minimalna ilość granul ceramicznych (y_min) w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH, wynosi 2 - niezależnie od wartości x, natomiast maksymalna ilość granul ceramicznych (y_max) w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH wynosi (w zależności od „x”):

ymax (x) = 0,079x²- 6,1557x + 123,57, zatem dla dowolnego χε <6;20>:

< y < ymax (x).

Najkorzystniejszy rezultat uzyskuje się, gdy dla dowolnego χε <6;20> spełniony jest warunek: 90% ymax (X) < y < ymax (X).

Dla uzyskania rusztowań o dobrych właściwościach mechanicznych i biologicznych, najkorzystniej jest, gdy masa granul „y” wynosi nie mniej niż 60 g ze względu na fakt, że zawartość całkowitej ilości fazy mineralnej kości wynosi co najmniej 60% (Hui P. i wsp., Journal of Minerals & Materials Characterization & Engineering 9, 683-692, 2010). Masa granul ceramiki fosforanowo-wapniowej uzależniona jest od:

a) temperatury wypalania, przy czym im wyższa temperatura wypalania, tym niższa porowatość granul (Aminatun i wsp., Research Journal of Pharmaceutical Biological and Chemical Sciences 4, 1431-1442, 2013), tym większa zawartość wagowa w kompozycie;

b) rozmiaru granul, przy czym im większy rozmiar granul, tym wyższa waga pojedynczej granuli, tym niższa całościowa masa granul w kompozycie;

PL 229 329 Β1

Rusztowanie kostne, według alternatywnego rozwiązania, o składnikach i proporcjach jak wskazano w rozwiązaniu pierwszym, zawiera dodatkowo substancje bioaktywne, jak białka adhezyjne w ilości 0,1-500 mg na 100 ml NaOH oraz białka morfogenetyczne kości, przy czym jako białka adhezyjne zawiera lamininę, fibronektynę, zaś jako białka morfogenetyczne kości - BMP-2, BMP-4, BMP-7.

Rusztowanie korzystnie zawiera antybiotyki glikopeptydowe, zwłaszcza wankomycynę.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania rusztowania kostnego według wynalazku, który polega na tym, że w 6-20% (w/v) roztworu β-1,3-glukanu zwanego dalej kurdlanem, przygotowanym w 0,1-0,5 M roztworze zasady sodowej (NaOH), korzystnie 0,3 M (komponent x), rozprowadza się 2-90% (w/v) bioceramiki fosforanowo-wapniowej w postaci nanoproszku, proszku lub granul o rozmiarze 0,1-1,0 mm wypalanych w temperaturach 500-1300°C, korzystnie 1100-1200°C (komponent y), przy czym najkorzystniej gdy proporcje wagowe stałych składników wynoszą odpowiednio 710% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v) bioceramiki, a maksymalna ilość komponentu y (w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH) w zależności od komponentu x (w gramach na 100 ml NaOH), wynika ze wzoru:

ymax (x)= 0,079x²- 6,1557x + 123,57, (przy czym wzór ten wyjaśniono szerzej w sposób matematyczny przy opisywaniu rozwiązania pierwszego), otrzymaną mieszaninę umieszcza się następnie w workach dializacyjnych w roztworze soli wapniowej, korzystnie chlorku wapnia (CaCb) o stężeniu od 70 g/l do 150 g/l, korzystnie 100 g/l, na okres czasu 2-24 godzin, korzystnie 4 godziny w temperaturze 18-28°C, a następnie komponent płucze się w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.

Alternatywny sposób otrzymywania materiału według wynalazku polega na tym, że do 6-20% (w/v) roztworu β-1,3-glukanu zwanego dalej kurdlanem, przygotowanego w 0,1-0,5 M roztworze zasady sodowej (NaOH), korzystnie 0,3 M (komponent x), dodaje się substancje bioaktywne takie jak czynniki wzrostu w ilości 0,1-200 pg na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH lub/i białka adhezyjne w ilości 0,1500 mg na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH, a następnie w przygotowanym roztworze kurdlanu i substancji bioaktywnych rozprowadza się 2-90% (w/v) bioceramiki fosforanowo-wapniowej w postaci nanoproszku, proszku lub granul o rozmiarze 0,1-1,0 mm wypalanych w temperaturach 500-1300°C, korzystnie 1100-1200°C (komponent y), przy czym najkorzystniej, gdy proporcje wagowe stałych składników wynoszą odpowiednio 7-10% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v) bioceramiki, a maksymalna ilość komponentu y (w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu NaOH) w zależności od komponentu x (w gramach na 100 ml NaOH), wynika ze wzoru:

ymax (x) = 0,079x² - 6,1557x + 123,57 (wzór wyjaśniono matematycznie opisując pierwsze rozwiązanie).

Otrzymaną mieszaninę umieszcza się w workach dializacyjnych w roztworze soli wapniowej, korzystnie chlorku wapnia (CaCb) o stężeniu od 70 g/l do 150 g/l, korzystnie 100 g/l, na okres czasu 2-24 godzin, korzystnie 4 godziny w temperaturze 18-28°C, a następnie komponent płucze się w wodzie dejonizowanej. Korzystnie, gdy jako substancje bioaktywne materiał zawiera BMP-2, BMP-4, BMP-7, lamininę, fibronektynę. Korzystnie jest, gdy do roztworu kurdlanu dodaje się antybiotyki glikopeptydowe.

Znamiennym jest, że materiał przygotowany według wynalazku wykazuje wszystkie cechy, którymi powinno charakteryzować się rusztowanie kostne mające za zadanie przyspieszanie procesów regeneracyjnych w miejscu implantacji oraz umożliwiające wstępne zasiedlenie komórkami in vitro. Cechy te to:

1) dobra poręczność, spoistość, a także bioaktywność;

2) dobra plastyczność, dzięki czemu można go łatwo dopasować do miejsca niewielkiego ubytku kostnego. Jest podatny na przycinanie do pożądanego kształtu za pomocą noża bądź skalpela;

3) po wysuszeniu łatwe wchłanianie płynów, np. wody, soli fizjologicznej, surowicy, krwi. Kompozyt wtedy odzyskuje swoje sprężyste właściwości;

4) brak cytotoksyczności. Ocenę cytotoksyczności materiału wytworzonego według wynalazku przeprowadzono z zastosowaniem linii komórkowej prawidłowych mysich preosteoblastów (MC3T3-E1) oraz prawidłowych płodowych ludzkich osteoblastów (hFOB 1.19), pozyskanych z Amerykańskiej Kolekcji Kultur Komórkowych (ATCC). Przed doświadczeniem, materiał pocięto na krążki o średnicy 8 mm i grubości 1-2 mm i poddano sterylizacji za pomocą tlenku etylenu. Następnie, komórki MC3T3-E1 i hFOB 1.19 były wysiewane bezpośrednio na krążki materiału. Po 24-godzinnej inkubacji w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37°C wykonywano barwienie różnicowe żywe/martwe w celu oceny ilości, żywotności oraz morfologii komórek. Komórki żywe wykazywały zieloną fluorescencję, podczas gdy komórki martwe wykazywały czerwoną fluorescencję.

PL 229 329 Β1

Po 24-godzinnej inkubacji, obserwowano dużą ilość żywych komórek osteoblastycznych oraz pojedyncze komórki martwe. Żywe komórki wykazywały prawidłową morfologię i były dobrze rozpłaszczone na materiale. Obserwacja ta potwierdza, że materiał nie jest cytotoksyczny w stosunku do komórek kościotwórczych;

5) sprzyjanie adhezji komórek.

Wpływ materiału na adhezję komórek badano z zastosowaniem linii komórkowej prawidłowych mysich preosteoblastów (MC3T3-E1) oraz prawidłowych płodowych ludzkich osteoblastów (hFOB 1.19) pozyskanych z ATCC. Przed doświadczeniem, materiał pocięto na krążki o średnicy 8 mm i grubości 1-2 mm i poddano sterylizacji za pomocą tlenku etylenu. Następnie, osteoblasty były wysiewane bezpośrednio na krążki materiału. Po 2 godzinnej inkubacji w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 34°C wykonywano test kolorymetryczny WST-8, który ocenia aktywność metaboliczną mitochondriów żywych komórek. Zasada tego testu opiera się na aktywności dehydrogenazy bursztynianowej, która przekształca sól tetrazoliową do pomarańczowego, rozpuszczalnego w wodzie formazanu. Intensywność barwy jest więc wprost proporcjonalna do ilości żywych, metabolicznie czynnych komórek. Poniższa tabela przedstawia ilość komórek, która uległa adhezji do materiału wytworzonego według wynalazku:

Ilość komórek hFOB 1.19 wy siewana na	Ilość komórek hFOB 1.19, która uległa
materiał:	adhezji do materiału po 2 godzinach:
5 xl04 kom^dysk	1,2 xl04 kom./dysk
Ilość komórek MC3T3-E1 wysiewana na	Ilość komórek MC3T3-E1, która uległa
materiał:	adhezji do materiału po 2 godzinach:
1 χΙΟ5 kom./dysk	2,73 xl04 kom./dysk

Po 2-godzinnej inkubacji komórek na materiale wytworzonym według wynalazku wykazano, że ok. 24% komórek hFOB 1.19 oraz 27% komórek MC3T3-E1 uległo adhezji do jego powierzchni. Wytworzony materiał umożliwia adhezję osteoblastów porównywalną do opisanych w literaturze materiałów wzmagających proliferację oraz różnicowanie komórek kościotwórczych, a więc procesy regeneracyjne kości (Przekora A. i wsp., Journal of Biotechnology 182-183, 46-53, 2014);

6) sprzyjanie proliferacji komórek.

Wpływ materiału na proliferację komórek badano z zastosowaniem linii komórkowej prawidłowych płodowych ludzkich osteoblastów (hFOB 1.19) pozyskanych z ATCC. Przed doświadczeniem, materiał pocięto na krążki o średnicy 8 mm i grubości 1-2 mm i poddano sterylizacji za pomocą tlenku etylenu. Następnie, komórki hFOB 1.19 były wysiewane bezpośrednio na krążki materiału. Po 2, 5 oraz 8 dniach inkubacji w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 34°C, ilość komórek była oceniania za pomocą testu WST-8 (opis w punkcie 5). Ponadto, morfologia komórek była monitorowana poprzez obserwację w mikroskopie konfokalnym po barwieniu cytoszkieletu i jąder komórkowych. Poniższa tabela przedstawia wzrost liczby komórek na materiale w czasie:

Czas inkubacji	Ilość komórek hFOB 1.19
2 dni	2,3 xlO4 kom./dysk
5 dni	5,0 x!04 kom./dysk
8 dni	11,5 xl04 kom./dysk ..........

Wraz z wydłużaniem czasu inkubacji, zaobserwowano wzrost liczby komórek hFOB 1.19 na materiale przygotowanym w oparciu o metodę stanowiącą przedmiot wynalazku. Co więcej, obserwacja w mikroskopie konfokalnym wykazała, że komórki są dobrze rozpłaszczone, mają prawidłową morfologię oraz dobrze rozbudowaną strukturę cytoszkieletu. Komórki obrastały nie tylko granule bioceramiki, ale również pokrywały powierzchnię kurdlanowego żelu. Zatem, materiał sprzyja wzrostowi oraz proliferacji (zdolności do podziałów) komórek kościotwórczych;

7) możliwość immobilizacji bioaktywnych związków, również termowrażliwych, metodą pułapkowania wewnątrz struktury polimerowej żelu kurdlanowego (na etapie wytwarzania rusztowania kostnego podczas sieciowania komponentu kurdlanowego w roztworze CaCb). Inkorporacja związków bioaktywnych wewnątrz macierzy kurdlanowej rusztowania kostnego umożliwi ich stopniowe, przedłużone w czasie uwalnianie zapewniając długoterminową postoperacyjną ochronę przeciwbakteryjną (immobi

PL 229 329 Β1 lizacja antybiotyków) lub/i stymulację procesów regeneracyjnych w miejscu implantacji poprzez intensyfikowanie procesu kościotworzenia (immobilizacja czynników wzrostu) lub/i intensyfikowanie adhezji oraz proliferacji komórek kościotwórczych (immobilizacja białek adhezyjnych);

8) zachowanie wszystkich swoich właściwości, gdy poddawany jest sterylizacji za pomocą tlenku etylenu.

Materiał wytworzony w oparciu o nową metodę neutralizacji i dializy, będącą przedmiotem wynalazku, ze względu na swoje bardzo dobre właściwości biologiczne będzie sprzyjał procesom regeneracyjnym w miejscu implantacji i może być stosowany zarówno w inżynierii tkankowej jako rusztowanie kostne do wstępnego przedoperacyjnego zasiedlania komórkami osteoprogeniterowymi in vitro, a także in vivow medycynie regeneracyjnej jako wypełniacz niewielkich ubytków kostnych.

Przedmiot wynalazku ilustrują przedstawione poniżej przykłady.

Przykład I

Do 0,16 g kurdlanu dodawano 2 ml 0,3 M zasady sodowej i mieszano przez 5 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 1,6 g niskoporowatego HAp (wypalanego w temperaturze 1150°C, rozmiar granul 0,3-0,6 mm) i mieszano. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 10 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) w stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 3 godziny, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany kompozyt nie zmienił swoich właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych, brak toksyczności, sprzyjanie adhezji i proliferacji osteoblastów).

Przykład II

Do 0,16 g kurdlanu dodawano 2 ml 0,3 M zasady sodowej i mieszano przez 5 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 1,0 g wysokoporowatego HAp (wypalanego w temperaturze 800°C, rozmiar granul 0,4-1,0 mm) i mieszano. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 10 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) w stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 5 godzin, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany materiał nie zmienił swoich właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych, brak toksyczności, sprzyjanie adhezji i proliferacji osteoblastów).

Przykład III

Do 0,56 g kurdlanu dodawano 7 ml 0,3 M zasady sodowej i mieszano przez 7 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 4,2 g mieszanki HAp i TCP (stosunek wagowy 3:1, wypalane w temperaturze 1200°C, rozmiar granul 0,4-1,0 mm) i mieszano przez 6 min. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 23 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) o stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 3 godziny, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany materiał nie zmienił swoich właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych, brak toksyczności, sprzyjanie adhezji i proliferacji osteoblastów).

Przykład IV

Do 0,16 g kurdlanu dodawano 2 ml 0,3 M zasady sodowej, a także roztwór białka - fibronektyny (stężenie końcowe 10 pg/ml) i mieszano przez 5 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 1,0 g niskoporowatego HAp (wypalanego w temperaturze 1150°C, rozmiar granul 0,4-1,0 mm) i mieszano. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 10 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) w stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 5 godzin, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany materiał nie zmienił swoich

PL 229 329 Β1 właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych, brak toksyczności, sprzyjanie adhezji i proliferacji osteoblastów).

Przykład V

Do 0,16 g kurdlanu dodawano 2 ml 0,3 M zasady sodowej, a także roztwór białka - lamininy (stężenie końcowe 10 pg/ml) oraz roztwór BMP-2 (stężenie końcowe 300 ng/ml) i mieszano przez 5 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 1,6 g niskoporowatego HAp (wypalanego w temperaturze 1150°C, rozmiar granul 0,3-0,6 mm) i mieszano. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 10 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) w stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 3 godziny, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany materiał nie zmienił swoich właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych, brak toksyczności, sprzyjanie adhezji i proliferacji osteoblastów).

Przykład VI

Do 0,16 g kurdlanu dodawano 2 ml 0,3 M zasady sodowej, a także roztwór BMP-4 (stężenie końcowe 200 ng/ml) i mieszano przez 5 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 1,6 g niskoporowatego HAp (wypalanego w temperaturze 1150°C, rozmiar granul 0,30,6 mm) i mieszano. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 10 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) w stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 3 godziny, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany materiał nie zmienił swoich właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych, brak toksyczności, sprzyjanie adhezji i proliferacji osteoblastów).

Przykład VII

Do 0,16 g kurdlanu dodawano 2 ml 0,3 M zasady sodowej, a także roztwór antybiotyku glikopeptydowego - wankomycyny (stężenie końcowe 16 pg/ml) i mieszano przez 5 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 1,0 g wysokoporowatego HAp (wypalanego w temperaturze 800°C, rozmiar granul 0,4-1,0 mm) i mieszano. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 10 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) w stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 3 godziny, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany materiał nie zmienił swoich właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych).

Poniżej porównano właściwości materiału HAp-kurdlan przygotowanego w oparciu o metodę neutralizacji i dializy będącą przedmiotem wynalazku oraz materiału HAp-kurdlan otrzymanego metodą termicznego żelowania kurdlanu w oparciu o patent nr PL 206 394 i International Patent nr EU 2 421 570 B1, w kontekście zastosowania ich jako rusztowania komórkowe:

	Materiał otrzymywany według patentu PL 206394 i International Patent EU	Materiał otrzymywany według wynalazku
Żywotność osteoblastów po 48 godzinach inkubacji (test pośredni na ekstraktach)	58%	98,5%
Zdolność przyklejania komórek do powierzchni materiału	Brak	ok. 30%

PL 229 329 Β1

Wzrost osteoblastów na powierzchni materiału po 5 dniach hodowli

Cała powierzchnia

Pojedyncze komórki o materiału pokryta nieprawidłowej morfologii komórkami o prawidłowej morfologii

Możliwość immobilizacji bioaktywnych związków term (wrażliwych (na etapie wytwarzania)

Materiał przygotowany według metody będącej przedmiotem wynalazku wykazuje korzystniejsze właściwości biologiczne in vitro w porównaniu do kompozytu przygotowanego w oparciu o patent nr PL 206 394 i nr EP 2 421 570. W przeciwieństwie do materiału otrzymanego metodą opisaną w patencie nr PL 206 394 i International Patent nr EU 2 421 570 B1, materiał wytworzony według wynalazku nie obniża żywotności komórek kościotwórczych (osteoblastów), sprzyja adhezji (przyklejaniu się) oraz proliferacji osteoblastów, dzięki czemu może być wstępnie zasiedlany w warunkach in vitro komórkami wyprowadzonymi od pacjenta. Zatem można wnioskować, że w warunkach in vivo materiał przygotowany według nowej metody będzie stymulować przerastanie tkanką kostną, przyspieszając jej regenerację oraz osteointegrację implantu z kością pacjenta.

Materiał przygotowany według wynalazku ze względu na swoje bardzo dobre właściwości biologiczne nadaje się do stosowania zarówno in vitro w inżynierii tkankowej jako rusztowanie kostne wstępnie zasiedlane komórkami osteoprogeniterowymi wyprowadzonymi z organizmu pacjenta w celu wygenerowania tzw. żywego wszczepu, jak i in vivo w medycynie regeneracyjnej jako materiał przyspieszający procesy regeneracyjne w miejscu implantacji. Natomiast materiał kompozytowy przygotowany w oparciu o PL nr 206 394 oraz International Patent nr EP 2 421 570 B1, ze względu na swoje stosunkowo słabe właściwości biologiczne in vitro może być wyłącznie stosowany in vivo jako materiał kościozastępczy, czyli substytut kostny do wypełniania niewielkich ubytków kostnych.

Ponadto, materiał przygotowany według wynalazku, w przeciwieństwie do materiału otrzymanego w oparciu o patent PL nr 206 394 oraz International Patent EU nr 2 421 570 B1, nadaje się do stosowania jako baza do immobilizacji substancji bioaktywnych, również termowrażliwych (np. białek adhezyjnych, czynników wzrostu, antybiotyków peptydowych), metodą pułapkowania wewnątrz struktury polimerowej żelu kurdłanowego (na etapie wytwarzania rusztowania kostnego), co wpłynie na poprawę jego właściwości biologicznych oraz będzie chronić przed postoperacyjnymi infekcjami.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Rusztowanie kostne na bazie bioceramiki fosforanowo-wapniowej i kurdlanu, znamienne tym, że zawiera 3-1,3-glukan zwany dalej kurdlanem (komponent x) oraz bioceramikę fosforanowo-wapniową w postaci nanoproszku, proszku lub granul, o rozmiarze od 0,1 do 1,0 mm wypalanych w temperaturach 500°C-1300°C, korzystnie 1100°C-1200°C (komponenty), przy czym proporcje wagowe (gramy na 100 ml NaOH) stałych składników wynikają z wzoru (maksymalna ilość komponentu y w zależności od komponentu x): y_max (x) = 0,079 x² - 6,1557 x + 123,57, a najkorzystniej, gdy wynoszą one odpowiednio 7-10% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v) bioceramiki.
2. 2. Rusztowanie kostne na bazie bioceramiki fosforanowo-wapniowej i kurdlanu, znamienne tym, że zawiera 3-1,3-glukan zwany dalej kurdlanem (komponent x) oraz bioceramikę fosforanowo-wapniową w postaci nanoproszku, proszku lub granul, o rozmiarze od 0,1 do 1,0 mm wypalanych w temperaturach 500°C-1300°C, korzystnie 1100°C-1200°C (komponent y), przy czym proporcje wagowe (gramy na 100 ml NaOH) stałych składników wynikają z wzoru (maksymalna ilość komponentu y w zależności od komponentu x): y_max (x) = 0,079 x² - 6,1557 x + 123,57, a najkorzystniej, gdy wynoszą one odpowiednio 7-10% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v)

   PL 229 329 Β1 bioceramiki, ponadto rusztowanie zawiera substancje bioaktywne takie jak białka adhezyjne w ilości 0,1-500 mg na 100 ml NaOH oraz białka morfogenetyczne kości.
3. 3. Rusztowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że jako białka adhezyjne zawiera lamininę, fibronektynę, zaś jako białka morfogenetyczne kości - BMP-2, BMP-4, BMP-7.
4. 4. Rusztowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że zawiera antybiotyki glikopeptydowe.
5. 5. Sposób wytwarzania rusztowania kostnego na bazie bioceramiki fosforanowo-wapniowej, znamienny tym, że w 6-20% (w/v) roztworze β-1,3-glukanu zwanego dalej kurdlanem, przygotowanym w 0,1-0,5 M roztworze zasady sodowej (NaOH), korzystnie 0,3 M (komponent x), rozprowadza się 2-90% (w/v) bioceramiki fosforanowo-wapniowej w postaci nanoproszku, proszku lub granul o rozmiarze 0,1-1,0 mm wypalanych w temperaturach 500°C-1300°C, korzystnie 1100°C-1200°C (komponent y), przy czym najkorzystniej, gdy proporcje wagowe stałych składników wynoszą odpowiednio 7-10% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v) bioceramiki, a maksymalna ilość komponentu y (w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w 0,3 M NaOH) w zależności od komponentu x (w gramach na 100 ml NaOH), wynika ze wzoru: y_max (x) = 0,079 x²- 6,1557 x + 123,57, otrzymaną mieszaninę umieszcza się w workach dializacyjnych w roztworze soli wapniowej, korzystnie chlorku wapnia (CaCb) o stężeniu od 70 g/l do 150 g/l, korzystnie 100 g/l, na okres czasu 2-24 godzin, korzystnie 4 godziny w temperaturze 1828°C, a następnie komponent płucze się w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
6. 6. Sposób wytwarzania rusztowania kostnego na bazie bioceramiki fosforanowo-wapniowej, znamienny tym, że do 6-20% (w/v) roztworu β-1,3-glukanu zwanego dalej kurdlanem, przygotowanego w 0,1-0,5 M roztworze zasady sodowej (NaOH), korzystnie 0,3 M (komponent x), dodaje się substancje bioaktywne jak białka morfogenetyczne kości w ilości 0,1-200 pg na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH lub/i białka adhezyjne w ilości 0,1-500 mg lub antybiotyki glikopeptydowe w ilości 0,02-5 mg na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH, a następnie w przygotowanym roztworze kurdlanu i substancji bioaktywnych rozprowadza się 2-90% (w/v) bioceramiki fosforanowo-wapniowej, w postaci nanoproszku, proszku lub granul o rozmiarze 0,1-1,0 mm wypalanych w temperaturach 500°C-1300°C, korzystnie 1100°C-1200°C (komponent y), przy czym najkorzystniej, gdy proporcje wagowe stałych składników wynoszą odpowiednio 710% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v) bioceramiki, a maksymalna ilość komponentu y (w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH) w zależności od komponentu x (w gramach na 100 ml NaOH), wynika ze wzoru: y_max (x) = 0,079 x² - 6,1557 x +123,57, otrzymaną mieszaninę umieszcza się w workach dializacyjnych w roztworze soli wapniowej, korzystnie chlorku wapnia (CaCb) o stężeniu od 70 g/l do 150 g/l, korzystnie 100 g/l, na okres czasu 2-24 godzin, korzystnie 4 godziny w temperaturze 18-28°C, a następnie komponent płucze się w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako substancje bioaktywne zawiera białka morfogenetyczne kości, takie jak BMP-2, BMP-4, BMP-7 oraz białka adhezyjne, jak laminina, fibronektyna.
8. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że do roztworu kurdlanu dodaje się antybiotyki glikopeptydowe.