PL236369B1 - Sposób otrzymywania rusztowania kostnego na bazie ceramiki fluoroapatytowej i polimeru oraz rusztowanie kostne - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest ceramiczno-polimerowe sposób otrzymywania rusztowania kostnego na bazie ceramiki fluoroapatytowej i polimeru oraz rusztowanie kostne, które znajduje zastosowanie w ortopedii i chirurgii weterynaryjnej jako materiał do leczenia ubytków tkanki kostnej jako tworzywo implantacyjne oraz rusztowanie kostne na bazie ceramiki fluoroapatytowej i polimeru.

Ograniczenia związane z pozyskaniem przeszczepów kostnych oraz możliwe powikłania towarzyszące przeszczepom kości własnej lub egzogennej (np. prawdopodobieństwo odrzucenia przeszczepu, wytworzenie ubytku w nowym miejscu, ból, możliwość przeniesienia czynnika zakaźnego) przyczyniają się do poszukiwania nowych materiałów kościozastępczych. Syntetyczne substytuty kostne takie jak hydroksyapatyt (HAP), fosforany wapnia (a- i β-TCP) lub bioaktywne szkła (BG) stanowią alternatywę dla przeszczepów kostnych. Materiały te cechuje biokompatybilność i bioaktywność oraz zdolności osteokondukcyjne, które sprzyjają procesowi odbudowy tkanki kostnej. Jednakże wadami materiałów ceramicznych są niska odporność na kruche pękanie oraz słaba poręczność chirurgiczna. Niniejsze ograniczenia mogą być zniwelowane poprzez dodanie innego składnika tj. polimeru (syntetycznego lub naturalnego, takiego jak kolagen czy polisacharydy), z wytworzeniem tworzywa kompozytowego łączącego ciągliwość i elastyczność fazy polimerowej z wytrzymałością i biozgodnością fazy ceramicznej.

W ostatnim czasie zwrócono uwagę na korzyści jakie niesie dla regeneracji tkanki kostnej zastosowanie ceramiki wapniowo-fosforanowo-fluorowej (fluoroapatytu, FAP). W badaniach Wu i wsp., (Implant Dentistry 19 (2010) 487-497) stwierdzono, że fluoroapatyt może nasilać syntezę kolagenu, a Bhadang i wsp., wykazali, że FAP dobrze integruje się z tkanką kostną (Biomaterials, 25 (2004) 49354945). Z kolei w badaniach Harrison i wsp., (Biomaterials 25 (2004) 4977-4986) odnotowano, że żywotność komórek w podłożu po 48 godzinach inkubacji z materiałem FAP była wyższa niż w obecności HAP. Z kolejnych badań wynika, iż fluor uwalniający się z implantów kostnych może stymulować proliferację i różnicowanie osteoblastów (Acta Biomaterialia 9 (2013) 5771-5779; Science and Technology of Advanced Materials 16 (2015) 035006) oraz przyspieszać proces mineralizacji kości (Journal of Biomedical Materials Research Part A 102 (2014) 647-654). Z tego względu obiecujące może być wykorzystanie hydroksyapatytu modyfikowanego jonami F^- w procesie leczenia uszkodzonej tkanki kostnej.

Dotychczas fluoroapatyt znalazł zastosowanie m.in. do wybielania zębów (CrystEngComm 15 (2013) 5853-5859) - a w zastosowaniach medyczno-regeneracyjnych, jako składnik cementów do wypełnienia zębów (Ceramics International 42 (2016) 17866-17875), jako warstwa pośrednia pomiędzy HAP i ZrO2 (Biomaterials 24 (2003) 3277-3284) oraz do pokrycia implantów metalicznych, głównie tytanowych (Materials 29 (2013) 521-529; Acta Biomaterialia 5 (2009) 1798-1807; Biomaterials 25 (2004) 3351-3358). W eksperymentach in vivo materiały tytanowe z FAP wszczepiano zarówno do szczęki psów (Journal of Biomedical Materials Research 48 (1999) 224-234) jak i kości długich kóz (Journal of Biomedical Materials Research 27 (1993) 127-138). Badania te potwierdziły, iż FAP redukuje resorpcję powłoki ceramicznej na implantach, a także sprzyja odkładaniu się tkanki kostnej. Natomiast dotychczas nie przeprowadzono badań, w których bezpośredniej analizie poddano wpływ samego fluoroapatytu (w postaci granularnej lub sproszkowanej) na proces leczenia ubytków kostnych.

Z polskiego i europejskiego opisu patentowego nr PL 206394 B1 i EP2421570 A2 znany jest bioaktywny ceramiczno-polimerowy materiał kompozytowy wytworzony z granul hydroksyapatytu i β-1,3glukanu, charakteryzujący się bioaktywnością i dużą elastycznością.

Z amerykańskiego opisu patentowego nr US 4708652 znany jest kompozyt ceramiczny, który składa się z fluoroapatytu i bioaktywnego szkła, powstający przez spiekanie hydroksyapatytu oraz bioszkła wzbogaconego fluorem w temperaturze 700-1100°C. Taki materiał wykazuje wysokie powinowactwo biologiczne (silne wiązanie z kością) i dużą wytrzymałość mechaniczną.

Z chińskiego opisu patentowego nr CN 1087807 znane jest kompozytowe tworzywo do implantacji zawierające 0,5-2% fluoroapatytu (lub fluorohydroksyapatytu) oraz polimer do formowania tj. glikol polietylenowy (PEG) albo alkohol poliwinylowy (PVA). Materiał ten powstaje poprzez zmieszanie ze sobą substratów, umieszczenie prekursora w odpowiedniej formie, tłoczenie, a następnie wypalanie otrzymanej kształtki w temperaturze 1100-1300°C przez 0,5-2 godziny.

Z chińskiego opisu patentowego nr CN 105920663 znany jest materiał implantacyjny składający się z TCP, silanu (stanowiącego spoiwo), karbodiimidu, tlenku tytanu, dwutlenku cyrkonu, siarczanu

PL 236 369 B1 wapnia i fluoroapatytu. Materiał ten wypala się w wysokiej temperaturze tj. 1500-2000°C przez 5-6 godzin, dodaje karboksymetylo-chitozan i otrzymuje wysoce porowaty kompozyt stanowiący rusztowanie do wrastania tkanki kostnej.

Z przedstawionego przeglądu patentów wynika, iż brak jest obecnie materiału „kościozastępczego” o wysokiej poręczności chirurgicznej, który jednocześnie tworzyłby rusztowanie dla odbudowy tkanki kostnej oraz był nośnikiem jonów fluorowych, uwalnianych w określonych ilościach bezpośrednio w miejscu ubytku kostnego w celu stymulacji komórek kościotwórczych oraz przyspieszenia procesu mineralizacji, a w efekcie intensyfikacji procesu regeneracji tkanki kostnej. Dlatego celem obecnego wynalazku jest wytworzenie bioresorbowalnego rusztowania kostnego spełniającego powyższe kryteria.

Wynalazek rozwiązuje zagadnienie otrzymywania kompozytu - rusztowania zawierającego polisacharyd tj. 3-1,3-glukan zwany kurdlanem oraz bioceramikę fosforanowo-wapniowo-fluorową zwaną fluoroapatytem w postaci granul, który stanowi materiał do leczenia ubytków tkanki kostnej jako tworzywo implantacyjne oraz rusztowanie kostne.

Sposób według wynalazku polega na tym, że do wodnej zawiesiny 3-1,3-glukanu (kurdlanu), zawierającej od 8 do 20 korzystnie 10-14 części wagowych kurdlanu na 100 części wagowych wody, dodaje się porowate granule ceramiki fosforanowo-wapniowo-fluorowej o rozmiarze 0,1-1 mm w ilości od 3 do 9,5 korzystnie 4 do 8 części wagowych granul na 1 część wagową kurdlanu i miesza się do czasu uzyskania jednolitej masy, po czym uzyskany prekursor umieszcza się w formach mocno ugniatając i unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza, a następnie ogrzewa przez 10-25 minut w temperaturze 85-105 korzystnie 90-95°C. Korzystnie stosuje się granule o porowatości całkowitej 50-80%. Wytworzony wynalazek po wyjęciu z formy można poddać w zależności od potrzeb między innymi następującym procesom: sterylizacji przez autoklawowanie w temperaturze 120-130°C, sterylizacji korzystnie w środowisku tlenku etylenu w temperaturze 55°C (z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji), suszeniu w temperaturze 25-100°C, obróbce kształtu (na mokro przez przycinanie, okrawanie lub na sucho przez frezowanie, ucieranie na warstwie ściernej), nasączaniu płynami (np. krew pacjenta, surowica, sól fizjologiczna, roztworami leków, antybiotyków lub czynników wzrostowych), umieszczeniu w papierowo-foliowych rękawach sterylizacyjnych i magazynowaniu przez okres do kilku lat.

Zaletą wynalazku jest połączenie bardzo dobrych właściwości biologicznych z dużą poręcznością chirurgiczną. Biomateriał posiada zdolność do stopniowego uwalniania jonów fluorowych, co sprzyja proliferacji komórek kościotwórczych oraz nasila syntezę osteokalcyny, co wykazano w badaniach in vitro. Stwierdzono także wysoką, wynoszącą ok 100%, żywotność osteoblastów na ekstraktach z kompozytu FAP/glukan na podstawie testu MTT przeprowadzonego wg normy ISO 10993-5:2009. Wyniki tych badań dla kompozytu FAP/glukan wg wynalazku oraz dla porównania analogicznego kompozytu zawierającego β-1,3-glukan i hydroksyapatyt wg patentów PL 206394B1 i EP2421570A2 (bez zawartości fluoru) zestawiono w Tabeli 1.

Rusztowanie kostne według wynalazku zawiera spolimeryzowany termicznie β-1,3-glukan (kurdlan), uprzednio uwodniony, przy czym wodna zawiesina kurdlanu zawiera od 8 do 20 korzystnie 1014 części wagowych kurdlanu na 100 części wagowych wody oraz ceramikę fosforanowo-wapniowofluorową w postaci granul o rozmiarze 0,1-1 mm, przy czym proporcje stałych składników wynoszą od 3 do 9,5 korzystnie 4 do 8 części wagowych granul na 1 część wagową kurdlanu. Korzystnie stosuje się granule o porowatości całkowitej 50-80%.

Kompozyt według wynalazku zawiera β-1,3-glukan zwany kurdlanem oraz bioceramikę fosforanowo-wapniowo-fluorową zwaną fluoroapatytem w postaci granul o porowatości całkowitej 50-80% i wielkości granul 0,1-1 mm, która to bioceramika odznacza się zdolnością do stopniowego uwalniania jonów fluorowych. β-1,3-glukan pełni w kompozycie rolę spoiwa łączącego granule ceramiczne oraz nadającego wynalazkowi właściwości wytrzymałościowych.

PL 236 369 Β1

Tabela 1. Wyniki badań biologicznych kompozytu wg wynalazku oraz kompozytu HAP/glukan wg patentów PL206394B1 i EP2421570A2.

	Kompozyt FAP/glukan otrzymywany wg wynalazku	Kompozyt HAP/glukan wg patentów PL 206394 BI i EP242157042
Odsetek żywotności po 24 godzinach osteoblastów [%] 4g godzinach	98,6 99,4	85,7 82,1
Poziom syntezy osteokalcyny [ng/ml]	2,209	1,296
Wzrost osteoblastów na powierzchni materiałów (barwienie falloidyną i DAPI)	prawidłowa morfologia, komórki o podłużnym kształcie, dobrze rozpłaszczone na materiale, rozbudowany cytoszkielet	komórki okrągłe i nieprzytwierdzone do powierzchni, cytoszkielet słabo rozbudowany
Ocena cytotoksyczności w kontakcie bezpośrednim (barwienie Live-Dead)	osteoblasty żywotne, duże i rozpłaszczone, nieliczne komórki martwe	osteoblasty żywe ale okrągłe i nieprzytwierdzone do materiału, więcej martwych komórek

Obserwacja pod mikroskopem konfokalnym komórek barwionych falloidyną i DAPI wykazała, że osteoblasty hodowane na kompozycie z FAP wykazały prawidłową morfologię, były dobrze rozpłaszczone i miały podłużny kształt. Uzyskane wyniki sugerują, że właściwości biologiczne wynalazku będą sprzyjały zasiedlaniu przez komórki gospodarza, co przyspieszy proces regeneracji uszkodzonej tkanki kostnej. Ponadto kompozyt jest biokompatybilny, resorbowalny i bioaktywny, co oznacza, że posiada zdolność integracji z kością oraz dodatkowo będzie stanowić źródło jonów wapniowych i fosforanowych w okresie post-implantacyjnym. Wynalazek może być stosowany w ortopedii, chirurgii urazowej kości, chirurgii stomatologicznej i twarzowo-szczękowej oraz weterynaryjnej, jako nośnik jonów fluorowych oraz rusztowanie do wypełnienia i leczenia ubytków kostnych.

Przedmiot wynalazku ilustrują przedstawione poniżej przykłady.

Przykład 1 ml wody dejonizowanej i 0,625 g kurdlanu umieszczono na szkiełku zegarkowym, mieszano szpatułką przez 20 minut, dodano 3 g granul FAP frakcji o wielkości 0,2-0,3 mm i wymieszano do czasu uzyskania jednolitej masy. Materiał naprzemiennie przenoszono porcjami do probówki szklanej o średnicy 11 mm i ugniatano tłoczkiem, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza, a po umieszczeniu całej masy w formie ogrzewano ją przez 15 minut w łaźni wodnej w temperaturze 95°C. Następnie probówkę wyjęto z łaźni, ostudzono i wyjęto z niej elastyczny materiał, który pokrojono na fragmenty o długości 11 mm i suszono przez 72 godziny w temperaturze 37°C. Porowatość całkowita wytworzonego kompozytu wynosiła 53,19% (SD=0,57), średnia średnica porów wynosiła 0,363 μm (SD=0,02), a gęstość objętościowa (ang. bulk density) wynosiła 1,136 g/cm³ (SD=0,005). Żywotność komórek kościotwórczych linii hFOB 1.19. hodowanych w obecności ekstraktu z kompozytu FAP/glukan wynosiła odpowiednio 98,6% (SD=6,4) oraz 99,4 (SD=5,6) po 24 i 48 godzinach inkubacji.

Przykład 2

2,5 ml wody dejonizowanej i 0,312 g kurdlanu umieszczono na szkiełku zegarkowym, mieszano szpatułką przez 15 minut, dodano 1,5 g granul FAP frakcji o wielkości 0,2-0,3 mm i wymieszano do czasu uzyskania jednolitej masy. Materiał naprzemiennie przenoszono porcjami do probówki szklanej o średnicy 8 mm i ugniatano tłoczkiem, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza, a po umieszczeniu całej masy w formie ogrzewano ją przez 20 minut w łaźni wodnej w temperaturze 90°C. Następnie probówkę wyjęto z łaźni, ostudzono i wyjęto z niej kompozyt, który pokrojono na gładkie krążki o masie w zakresie 120-140 mg. Następnie materiał sterylizowano przez autoklawowanie w temperaturze 121°C. Poziom osteokalcyny produkowanej przez komórki linii hFOB 1.19. i mierzonej za pomocą testu ELISA po 13 dniach inkubacji na materiale wynosił 2,2 ng/ml (SD=0,32).

Przykład 3 ml wody dejonizowanej i 0,5 g kurdlanu umieszczono na szkiełku zegarkowym, mieszano szpatułką przez 20 minut, dodano 3,8 g granul FAP (mieszanina frakcji o wielkości 0,2-0,3 mm : 0,4-0,6 mm w stosunku 1:3) i wymieszano do czasu uzyskania jednolitej masy. Materiał naprzemiennie przenoszono porcjami do szklanej zlewki o średnicy 28 mm i ugniatano tłoczkiem, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza, a po umieszczeniu całej masy w formie zabezpieczono zlewkę przed odparowaniem

PL 236 369 B1 wody i ogrzewano ją przez 20 minut w łaźni wodnej w temperaturze 95°C. Następnie probówkę wyjęto z łaźni, ostudzono i wyjęto z niej materiał, który pokrojono na fragmenty o długości 11 mm i suszono przez 24 godziny w temperaturze 90°C. Kompozyt stosowano po nasączaniu przez 1 godzinę w roztworze soli fizjologicznej.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania rusztowania kostnego na bazie fluoroapatytu oraz polimeru, znamienny tym, że do wodnej zawiesiny β-1,3-glukanu (kurdlanu) zawierającej od 8 do 20 części wagowych kurdlanu na 100 części wagowych wody, dodaje się porowate granule ceramiki fosforanowo-wapniowo-fluorowej o rozmiarze 0,1-1 mm w ilości od 3 do 9,5 części wagowych granul na 1 część wagową kurdlanu w temperaturze 20-25°C i całość miesza się do czasu uzyskania jednolitej masy, po czym uzyskany prekursor umieszcza się w formach, a następnie ogrzewa przez 10-25 minut w temperaturze 85-105°C aż do uzyskania spolimeryzowanej masy kurdlanowej, po czym otrzymany biomateriał suszy się.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wodna zawiesina kurdlanu zawiera 10-14 części wagowych kurdlanu na 100 części wagowych wody.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zawartość granul fluoroapatytu wynosi od 4 do 8 części wagowych na 1 część wagową kurdlanu.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że temperatura ogrzewania kompozytu wynosi 9095°C.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymany biomateriał, po wysuszeniu poddaje sterylizacji.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 i 4, znamienny tym, że sterylizacja przebiega w środowisku tlenku etylenu w temperaturze 55°C przez okres od 0,5 do 2 godzin.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się granule ceramiki fosforanowo- wapniowo-fluorowej o porowatości 50-80%.
8. 8. Rusztowanie kostne na bazie fluoroapatytu oraz polimeru, znamienne tym, że zawiera spolimeryzowany termicznie β-1,3-glukan (kurdlan), uprzednio uwodniony, przy czym wodna zawiesina kurdlanu zawiera od 8 do 20 części wagowych kurdlanu na 100 części wagowych wody oraz ceramikę fosforanowo-wapniowo-fluorową w postaci granul o rozmiarze 0,1-1 mm, przy czym proporcje stałych składników wynoszą od 3 do 9,5 części wagowych granul na 1 część wagową kurdlanu.
9. 9. Rusztowanie kostne na bazie fluoroapatytu oraz polimeru według zastrz. 8, znamienne tym, że wodna zawiesina kurdlanu zawiera 10-14 części wagowych kurdlanu na 100 części wagowych wody.
10. 10. Rusztowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że zawartość granul fluoroapatytu wynosi od 4 do 8 części wagowych na 1 część wagową kurdlanu.
11. 11. Rusztowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że granule ceramiki fosforanowo-wapniowofluorowej mają porowatość 50-80%.