KR101162191B1

KR101162191B1 - 뼈 형성용 기질 복합재, 그의 제조 방법 및 그로 코팅된 조직 공학용 지지체

Info

Publication number: KR101162191B1
Application number: KR1020067021372A
Authority: KR
Inventors: 디테르 사른베버; 하르트무트 보흐; 수사네 비르바움
Original assignee: 넥실리스 아게
Priority date: 2004-04-15
Filing date: 2005-04-15
Publication date: 2012-07-05
Also published as: EP1735022A1; WO2005099785A1; US8043627B2; CA2563545A1; AU2005232363A2; US20070237799A1; ATE435668T1; EP1735022B1; JP2007532211A; KR20070004844A; DE502005007658D1; ES2329153T3; AU2005232363A1; AU2005232363B2; CA2563545C; US20100119575A1

Abstract

본 발명은 콜라겐 및 세포외 기질의 비콜라겐성 성분(ECM 성분)을 포함하는 뼈 형성 복합재 기질, 상기 기질의 제조 방법, 상기 뼈 형성 복합재 기질에 의해 형성된 코팅을 제공하며, 예컨대 뼈에 임플란트 병합과 같은 경질 조직 형성을 자극하고 가속화하는데 사용되는 조직 공학용 임플란트 또는 지지체 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 뼈 형성 복합재 기질은 콜라겐과 하나 이상의 비콜라겐성 ECM 성분 또는 그의 유도체를 포함하며, 상기 콜라겐 성분은 피브릴 형성에 의해 제조된 비가교성 콜라겐 섬유와 상기 콜라겐 섬유에 병합되는 비콜라겐성 ECM 성분 또는 그의 유도체로 구성된다.

비콜라겐성 성분, 지지체, 임플란트

Description

뼈 형성용 기질 복합재, 그의 제조 방법 및 그로 코팅된 조직 공학용 지지체{OSTEOGENIC COMPOSITE MATRIX, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND IMPLANT AND SCAFFOLD FOR TISSUE ENGINEERING PROVIDED WITH A COATING FORMED BY SAID OSTEOGENIC COMPOSITE MATRIX}

본 발명은 세포외 기질(ECM 성분)의 콜라겐 및 비콜라겐성 성분들로 이루어진 뼈 형성용 기질 복합재, 그의 제조 방법, 그것으로 코팅된 조직 공학용 임플란트 및 지지체의 제조 방법, 및 예컨대, 임플란트의 뼈 유착(osseointegration) 분야에서의, 자극 및 경질 조직 형성 가속화를 위한 뼈 형성용 기질 복합재로 코팅된 조직 공학용 임플란트 및 지지체의 제조 방법에 관한 것이다.

조직에서, 세포는 세포 환경에 중요한 부분인, 세포외 천연 기질로 싸여 있다. 천연 ECM은 콜라겐, 당단백질, 프로테오글리칸 및 글리코아미노글리칸(GAG)으로 구성된, 고도로 정렬된 조직 특이적인 네트워크이다. 다양한 조직과 다양한 발생 단계에 따라 그 구성은 매우 상이하며, 각 기질은 세포와 성장 인자간의 상호 작용에 있어서 특이적인 특징을 갖는다.

뼈의 천연 기질을 구성하는 주된 구조 단백질은 콜라겐 I형이지만, 프로테오글리칸 및 당단백질과 같은 그외 여러가지 기질 단백질들도 콜라겐과 상호작용할 수 있으며, 기질의 구조와 기능에 작용할 수 있다. 이러한 비콜라겐성 ECM 단백질은 기질의 특이적 기능을 실현시킨다. 따라서, 파이브로넥틴은 세포 결합 특징 이외에도, 콜라겐 결합성 및 GAG 결합성을 가지고 있으며(Stamatoglou and Keller, 1984, Biochim Biophys Acta. Oct 28; 719(1): 90-7), 데코린(decorin)과 같은 소형의 루신-리치(rich) 단백질(SLRP) 역시 천연 ECM의 조직화(데코린은 생체내에서 파이브릴 형성을 매개함)를 수행할 뿐만 아니라 TGF-β와 같은 성장 인자에 결합하거나 심지어는 신호 분자로서 작용하기도 한다(Kresse and Schonherr, 2001, J Cell Phys 189: 266-274).

프로테오글리칸과 당단백질은 당화(glycosylation) 정도, 특히 여러가지 글리코사미노글리칸으로 구성된, 고도로 당화된 프로테오글리칸의 당 함량 측면에서 차이가 있다. 이들 체인들의 분포는 조직 특이적일 수 있으며, 그 예로 데코린이 있다(뼈는 콘드로이틴, 피부는 더마탄 설페이트). 글리코사미노글리칸은, 예컨대, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 글루쿠로네이트 또는 이두로네이트(iduronate)로 구성된 이당류가 반복되어 있으며, 다양한 수준으로 황산화된, 거대 비분지형의 다당류이다. 당쇄는 프로테오글리칸과 결합된 상태로 생체내에서 존재하며, 이들 단백질의 기능, 즉 성장 인자의 결합과 조절에 중요한 역할을 한다(Bernfield et al, 1999, Annu Rev Biochem, 68: 729-777).

각각의 ECM 구성 요소들, 특히 콜라겐은 이미 세포 부착과 조직 유합을 향상시키기 위해, 지지체 및 임플란트의 생체친화적 변형에 활용되고 있다. 콜라겐과 더불어, 다당류와 같은 다른 ECM 구성 요소들도 여러가지 용도로 사용되고 있다. 즉, 조직 배양용 3차 구조의 지지체를 제조하기 위해, 뼈 조직을 글리코사미노글리칸과 교차연결시키는 방법이 제시된 바 있다(WO 01/02030A2).

콘드로이틴 설페이트 함유 혼합물은 뼈 결함 회복에 사용되며, 주로 함유된 아미노당이 연결 조직의 치유를 촉진시키고, 따라서 기질 생산을 증가시킨다(WO 98/27988, WO 99/39757). 식물 다당류는 콜라겐과 함께 상처를 덮는 용도로 사용되며(EP 0140569 A2), 키토산과 GAG의 조합은 경질 조직의 재생을 자극하는 제제로 알려져 있다(WO 96/02259). 천연 ECM에서 형성되는 것과 유사한 콜라겐-GAG 혼합물은 비구조화된 침전물 및 불명확한 콜라겐 피브릴의 산 공동침강에 의해 제조된다(US 4448718, US 5716411, US 6340369).

임플란트 적용에 있어서, 재조합 성장 인자의 점진적인 이용가능성과, 임플란트와 주변 조직간의 상호작용에 적극적으로 작용하는 이들 뼈 유도성 인자들에 대한 관심이 증가하고 있다(Anselme K (2000). Biomaterials 21, 667-68). 뼈 치유와 관련하여, '뼈 형태 형성 단백질(bone morphogenetic protein)' (BMP 2, 4-7)은 중간엽 줄기 세포의 연골 세포 및 골아세포로의 분화와 뼈 신생을 유발하기에, 특히 관심이 집중되고 있다(Celeste AJ, Taylor R, Yamaji N, Wang J, Ross J, Wozney JM (1994) J. Cell Biochem. 16F, 100; Wozney JM, Rosen V (1993) Bone morphogenetic proteins in Mundy, GR, Martin TJ (Ed.) Physiology and pharmacology of bone. Handbook of experimental pharmacology, Vol. 107. Springer Verlag, Berlin, 725-748). 이러한 강력한 뼈 유도 작용으로 인해, 골 재생을 촉진 및 향상시키기 위하여 다양한 담체 물질들에 재조합 BMP가 사용되고 있다. 형태 형성 단백질에 유효한 담체는 이들에 결합하여, 가수분해를 방지하고, 이후의 조절성 방출을 가능하게 하고, 세포의 조합 반응을 촉진시킬 수 있어야 한다. 더욱이, 담체는 생체친화적이어야 하며, 생분해성이어야 한다. BMP에 바람직한 담체 물질로는, 예컨대 이종의 뼈 기질(xenogenic bone matrix)(WO 99/39757) 또는 GAG(WO 01/02030 A2)과 가교된 천연 조직이나, 또는 HAP, 콜라겐, TCP, 메틸셀룰로스, PLA, PGA, 및 여러가지 공중합체(EP 0309241 A2, DE19890329, EP 0309241 A2, DE 19890906, WO 8904646 Al, DE 19890601)가 있다. 추가적으로는, GAG, 콜라겐 또는 생활성 인자(WO 97/22371)와 같은 부가적인 성분을 함유할 수 있는 가교된 합성 폴리머나, 또는 글리코사미노글리칸 및 뼈 형성 인자(WO 91/18558, WO 97/21447)와 혼합된 가교 콜라겐이 있다. 콜라겐-GAG 혼합물은 산 공동침강에 의해 제조된다.

재조합 성장 인자의 이용에는 많은 문제점들이 있다. 재조합 인자는 일반적으로 조직에 있는 천연 내인성 인자에 비해 활성이 낮으므로, 생체내 효과를 수득하기 위해선 비-생리학적인 수준으로 다량 투여하여야 한다. 재조합 인자의 투여로 내인성 인자의 작용만 매우 불충분하게 자극될 수 있다.

BMP의 작용을 촉진시키는 인자를 사용하거나, 또는 동소(in situ)에서 성장 인자를 발현할 수 있는 세포를 사용함으로써, 이러한 문제를 최소화하거나 회피하고자 하는 시도가 있었다(WO 97/21447, WO 98/25460). BMP 수용체가 다수의 상이한 조직들에서 형성되고, 이러한 성장 인자의 기능이 뼈에만 한정되지 않는다는 점에서, 또다른 문제점들이 야기될 수 있다.

발명의 개요:

본 발명은 당면한 상황에서 기질 복합재로 코팅된 임플란트 표면상에서, 뼈 축적 및 뼈 성장을 촉진 및 가속화하며, 합성, 금속 또는 세라믹 임플란트의 코팅에 특히 사용될 수 있는, 생체친화적이고 생분해성인 기질 복합재를 특정화하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 시험관내와 이후 생체내에서의 경질 조직 형성을 보조하는, 조직 공학용 담체 물질(지지체)의 코팅에 관한 것을 목적으로 한다.

본 발명은 뼈와 접촉되어 있는 임플란트 사례 대부분에서, 적량의 내인성 뼈-형성 인자가 주변 조직과 혈액 순환계에 존재한다는 과학적 관찰 결과를 토대로 한 것이다. 생체내 생리학적 조건하에서 관찰할 수 있는 BMP의 뼈-유도 효과는 개별적인 성장 인자 타입에 의한 것일 뿐만 아니라 다수의 내인성 인자들의 상승 작용의 결과이다.

전술한 종래기술에 반해, 임플란트 코팅은 이식 부위에 존재하는 내인성 뼈-형성 인자들을 유리하게 활용하는데 적합하다.

본 발명의 목적은 콜라겐과 및 하나 이상의 비콜라겐성 ECM 성분이나 또는 그의 유도체로 이루어진 뼈 형성용 기질 복합재에 의해 달성되는데, 상기 복합재에서 콜라겐 성분은 피브릴 형성(fibrillogenesis)으로 생성된 비가교성 콜라겐 피브릴로 구성되며, 이 콜라겐 성분에 하나 이상의 비콜라겐성 ECM 성분 또는 그의 유도체가 병합(integration)되어 있다.

뼈 형성용 기질 복합재는, 자연적으로 형성된 뼈의 기질 구성 성분들과 조성 및 형태가 가능한 유사하며, 생체친화적이며 생분해성이며, 뼈 인자와의 결합성 및 존재성 모두에서 뼈 조직 특이적인 기능을 가지는, 본 발명에 따른 세포외 기질 구성 성분을 사용하며, 이는 세포 반응들에 직접적으로 작용할 수 있다. 그 결과, 생체내 조건과 매우 유사하며, 세포 기능과 성장 인자와 같은 뼈-형성 인자와의 반응에 긍정적으로 작용하는 미세환경이 세포에 형성된다.

용어 콜라겐은 피브릴-형성 콜라겐 타입 모두를 포함한다. 임의의 콜라겐 공급원은 비가교성의, 산-가용성 콜라겐 단량체, 재조합 또는 조직 유래의 것이며, 텔로펩티드가 있거나 없는 것일 수 있다.

용어 비콜라겐성 ECM 성분은 천연 ECM의 구성 성분으로 공지된, 글리코사미노글리칸과 비콜라겐성 단백질 모두를 포함한다.

용어 비콜라겐성 단백질은 비콜라겐성(프로테오글리칸 및 당단백질) 또는 부분적인 콜라겐(FACIT) 구성을 가지는 모든 기질 단백질을 포함한다.

뼈 형성용 기질 복합재의 주된 성분은 콜라겐 I, II, III, V,IX, XI 형 또는 이들의 조합이다. 원칙적으로, 뼈에 주로 있는, 비가교성, 산-가용성 콜라겐 단량체, 콜라겐 I, III 및 V형을 형성하는 각 피브릴-형성 콜라겐 타입을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

뼈 형성용 기질 복합재는 GAG 성분으로 콘드로이틴 설페이트 A, C, D, E; 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 케라탄 설페이트(keratan. sulfate), 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 헤파린, 히알루론산 또는 그의 유도체들을 각각 및 혼합된 형태로 포함하며, 콘드로이틴 설페이트가 바람직하다. 사용되는 당은 합성 또는 생물원으로부터 분리된 것이다.

뼈 형성용 기질 복합재는 추가적인 비콜라겐성 기질 단백질로서 파이브로넥틴, 데코린(decorin), 비글리칸(biglycan), 라미닌(laminin) 또는 베르시칸(versican)을 각각 및 혼합된 형태로 포함할 수 있으며, 데코린과 비글리칸이 바람직하다. 사용되는 단백질은 합성 또는 생물원으로부터 천연 상태로 분리된 것이다.

뼈와 가능한 유사한 기질을 제조하기 위해, 바람직하기로는 콜라겐 I형, 데코린 및 비글리칸 및/또는 콘트로이틴 설페이트와 같은 이들의 GAG 체인을 사용한다. 기질, 성장 인자 및 세포간의 결합 또는 상승 작용을 이용하기 위해, 데코린 또는 비글리칸을 사용한다. 보다 바람직하기로는, 내인성 성장 인자에 결합하거나, 또는 그것의 작용을 증강시킬 수 있는 GAG 체인, 특히 뼈에서 흔히 형성되는 콘드로이틴 설페이트를 사용할 수도 있다. 또한, 빠른 치유를 위해 콜라겐을 다른 GAG나 기질 구성 성분들과 조합하여 추가적인 내인성 성장 인자를 사용할 수 있으며, 예컨대 혈관형성(invascularization)을 촉진하기 위해 헤파란 설페이트 조합에 의한 VEGF를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 콜라겐과, 하나 이상의 비콜라겐성 ECM 성분 또는 그의 유도체로 구성된 뼈 형성용 기질 복합재는, 콜라겐 피브릴을 피브릴 형성 방법으로 제조하며, 피브릴 형성 전에 하나 이상의 비콜라겐성 ECM 성분 또는 이의 유도체를 첨가하는 방법으로 제조한다.

이러한 방법으로 제조된 콜라겐 피브릴은 물이나, 완충 시스템에 재현탁한 다음, 코팅액으로 사용하거나, 또는 동결건조시킬 수 있다.

피브릴 형성(즉, 콜라겐 피브릴 형성)은 4℃ 내지 40℃, 바람직하기로는 25℃ 내지 37℃에서 콜라겐 농도 50 내지 5000 ㎍/ml, 바람직하기로는 250 내지 1000 ㎍/ml, pH 4 내지 pH 9, 바람직하기로는 pH 6 내지 pH 8, 포스페이트 함량 500 mmol/l 이하, 바람직하기로는 30 내지 60 mmol/l, NaCl 함량 1000 mmol/l 이하, 바람직하기로는 300 mmol/l 이하의 조건하에서 수행된다.

본 발명에 따른 제조 방법에 의해, 규정된 구조와 천연 ECM 상태와 유사한 조성을 가지는 뼈 형성용 기질 복합재가 제조된다.

콜라겐 단량체의 정렬된 상호 교차적인 측면 조합(ordered, mutually transposed lateral association)은 생체내 콜라겐 피브릴의 특징이며, 64 내지 67 nm의 주기의 전형적인 밴드 패턴을 나타낸다. 이러한 조합은 본래 단량체들의 전하 패턴으로 인한 것이다. 시험관내 피브릴 형성은 생리학적 파라미터 전후 수준의, pH, 온도 및 차가운 콜라겐 산성 용액의 이온 강도에 의해 유발된다.

글리코사미노글리탄 또는 그외 기질 성분을 피브릴 형성 이전에 콜라겐 단량체가 함유된 용액에 첨가하며, 따라서 이후 피브릴 형성 과정에 포함된다. 피브릴 형성 과정중에 존재하는 비콜라겐성 ECM 성분은 제조되는 피브릴에 병합되고, 천연 ECM과 성분, 조성 및 구조 측면에서 동일한 기질이 형성된다.

시험관내에서의 피브릴 형성 과정 중에, 콜라겐은 생체내 구조와 유사한 특징적인 횡문형의 피브릴(transversely striated fibril)로 형성되고, 제조되는 피브릴의 구조는 프로세스 파라미터(pH, 이온 강도, 포스페이트 농도)와 반응액에 존재하는 비콜라겐성 성분의 함량과 성질에 영향을 받는다. 또한, 데코린과 같은 생체내 기질 변형 프로테오글리칸의 경우, 이러한 방식으로 시험관내 조건하에서 제조되는 피브릴의 구조에 작용할 수 있어, 천연 생물학적 기능과 매우 유사한 기능을 갖게 된다.

피브릴 형성에 의한 응집 결과인 구조 형성과는 대조적으로, 산성 매질중에 글리코사미노글리칸과 같은 폴리양이온의 첨가에 의해 콜라겐 응집을 유발할 수 있으며, GAG와 콜라겐 단량체간의 정전기적 상호작용이 원인이다. 이러한 산 침강에서, 콜라겐 단량체 조합은 대략적인 생리학적인 조건의 경우와 비교되지 않는다. 무정형의 침전물이 형성되거나, 또는 적정 정량 비 및 충분한 전하 일치 패턴(sufficient agreement of the charge pattern)을 가지는, 다양한 세그먼트 결정체(segment long-spacing crystallity)와 같은 다형의 응집물(polymorphous aggregate)이 형성된다.

데코린과 같은 당단백질 또는 프로테오글리칸의 경우, 산성 매질로부터 침전되지 않는다.

생체내 조건과 가능한 일치되도록 유지하기 위해, 본 발명의 콜라겐 피브릴은 가교되지 않은 것이다. 가교는 안정성을 증가시키지만, 내인성 뼈-형성 인자와 특이적인 결합을 이룰 수 있는 도메인에 작용하는 문제점이 있다. 이는 GAG의 기능에 특히 중요한데, 그들의 성장 인자- 결합 특성은 당쇄의 자유로운 이동성을 근간으로 하는데, 이는 가교로 속박되기 때문이다. 동시에, 당은 기질로부터 방출될 수 있으며, 이는 세포 표면에 성장 인자의 존재성에 중요하다.

본 발명은 조직 공학에 있어서 임플란트 또는 지지체의 코딩을 위한, 본 발명에 따른 뼈 형성용 기질 복합재의 용도를 포함한다.

본 발명의 임플란트는 모든 금속성, 세라믹 및 폴리머 임플란트, 또는 뼈 조직과 일정 부분 이상 접촉되는 표면이 여러가지 물질 군으로 구성된 임플란트로 이해된다. 모든 금속성, 세라믹 및 폴리머 구조물 또는 여러가지 물질 군들로 구성된 구조물은 경질 조직의 조직 공학용 지지체로서 제공된다.

전술한 뼈 형성용 기질 복합재는 특히 인공 고관절, 치아 임플란트 또는 그외 고형 임플란트의 신속한 뼈 삽입에 필수적인 그외 하중(load) 지지용 제품과 같이 뼈와 접촉시 미분해성 임플란트의 코팅에 적합하다.

뼈 대체물로서 이식되는 3차 구조의 분해성 임플란트와 조합 형태의 뼈 형성용 기질은, 임플란트의 삽입 및 재건과, 뼈 신생을 유리하게 촉진시킬 수 있다. 임플란트는, 예컨대, 칼슘 포스페이트로 구성된 미립자 또는 3차 구조물을 포함할 수 있으며, 또한 기본 성분으로서 폴리머 물질을 포함할 수 있다.

조직 공학용 뼈 형성용 기질 복합재는 지지체와 조합 형태로, 뼈-형성 세포의 증식 및 분화에 이로울 수 있다. 지지체로서, 합성 및/또는 천연 폴리머(예, 콜라겐), 세라믹 또는 금속의 개별 또는 조합 형태의, 모든 3차 구조의 다공성 구조물이 가능하며, 생분해성 폴리머 및/또는 세라믹 지지체가 바람직하다.

예컨대, 생체내에 존재하는 성장 인자와 같은 뼈-형성 인자는, 뼈 형성용 기질 복합재에 의해, 이식 후, 임플란트의 표면에 결합하여 그 활성이 증가된다. 유리하게는, 이식 부위에 존재하는 여러가지 내인성 인자는 상기 뼈 형성용 기질 복합재로 코팅된 임플란트에 의해 보충(recruit)된다.

조직 공학용 임플란트 또는 지지체의 제조시, 뼈 형성용 기질 복합재를 딥-코팅 공정으로 표면에 편리하게 고정하기 위해, 뼈 형성용 기질 복합재를 포함하는 코팅액을 dl용한다. 상기 코팅액의 콜라겐 농도는 0.5 mg/ml 내지 5 mg/ml일 수 있으며, 1 mg/ml 내지 2 mg/ml이 바람직하다. 뼈 형성용 기질 복합재는 5 내지 20분동안 실온에서 임플란트를 둔 다음 건조 및 물로 세척하여, 고정시킬 수 있다. 제조되는 코팅 층의 두께는 코팅액의 농도 및 공정 반복 횟수에 따라 달라질 수 있다.

전술한 뼈 형성용 기질 복합재와 조합 형태로 코팅된 3차 구조의 지지체 제조시, 구성 성분의 혼합물을 금속, 세라믹 및/또는 폴리머 기원일 수 있는 지지체에, 피브릴 형성 개시 이전에 도입하는 것이 이롭다. 피브릴 형성은 이후 승온에 의해 유도한다. 생체외에서 형성된 피브릴은 콜라겐 젤로서 잔존시키거나, 또는 표면 코팅과 유사하게 건조할 수 있다.

이러한 방법으로 제조한 임플란트 또는 지지체는 공지의 비-열 방법(nonthermal method), 예컨대 에틸렌 옥사이드 또는 감마 조사와 같은 방법으로 멸균하는 것이 좋으며, 실온에서 보관할 수 있다.

본 발명에 따른, 뼈 형성용 기질 복합재로 코팅된 임플란트 또는 지지체는 종래에 공지된 용액에 비해 다음과 같은 장점을 가진다:

- 천연 세포 환경에 상응하는 제조 조건 및 성분 이용으로 인한 거의 생리적인 구성 및 구조로 제조된 기질의 우수한 생물학적 친화성 및 기능성

- 이용가능한 성분 및 구성 성분 혼합물에서의 성분들의 비율 측면에 있어서의 우수한 다변성

- 용이한 보관성 및 멸균 조건

- 내인성 뼈 형성 인자 이용으로 인한 우수한 특이성 및 효능

본 발명은 하기 실시예, 비교 실험 및 도면을 들어 보다 구체적으로 설명한다.

도 1은 시간에 따른 OD로 피브릴 형성 용액의 탁도 증가로 측정한, 콜라겐 피브릴 형성에 대한 데코린과 콘드로이틴 설페이트(CS)의 영향을 나타낸 것이다.

도 2는 피브릴 구조의 AFM 사진이다.

도 3은 본 발명에 따른 뼈 형성용 기질 복합재에 있는 콘드로이틴 설페이트 및 데코린이다.

도 4는 재조합 성장 인자 BMP-4 및 TGF-1β에 대한 본 발명에 따른 뼈 형성용 기질 복합재의 결합 양상이다.

도 5는 본 발명에 따른 여러가지 뼈 형성용 기질 복합재에 대한 원시 랫 칼바리아의 골아세포(primary rat calvaria osteoblast)의 반응- 부착 및 오스테오폰틴 발현에 대한 효과를 나타낸 것이다.

도 6은 4 pmol/cm²의 BMP-4 첨가 이후에, 본 발명에 따른 여러가지 뼈 형성용 기질 복합재에 대한 랫 칼바리아 세포의 알카리 포스파타제 활성을 나타낸 것이다.

도 7은 6개월후 미니피그 턱에 삽입한 임플란트의 표면에서의 뼈 신생 퍼센트를 나타낸 것이다.

실시예 1

여러 조건에서 피브릴을 형성시킨 후 피브릴 구조

뼈 형성용 기질 복합재를 제조하기 위해, 0.01 M 아세트산 중의 콜라겐 단량체 용액을 4℃에서 24시간 교반하여 준비하였다. 중성 pH의 인산 완충 수용액중의 37℃에서, 비콜라겐성 성분들의 존재하에 자가-응집(피브릴 형성) 공정으로 콜라겐 피브릴을 형성시켰다.

피브릴 형성에 적합한 조성은 콜라겐 0.5 내지 5 mg/ml 및 글리코사미노글리칸 0.1 내지 5 mg/ml이며, 콜라겐 1 mg/ml 및 GAG 0.2 mg/ml 및 프로테오글리칸 30 ㎍/ml이 바람직하다. 바람직한 피브릴 형성 파라미터는 NaCl 135 mmol/l 첨가 또는 무첨가된 pH 7.0의 인산 완충액 30 mmol/l이다.

피브릴 형성 이전에 콜라겐 단량체에 글리코사미노글리칸이나 그외 기질 성분들을 첨가하여, 이후 피브릴 형성 공정으로 제조되는 피브릴에 일정 부분이상 병합시킨다.

도 1은 피브릴 형성으로 인한 용액의 탁도를 시간에 따라 측정한 것으로, 데코린의 농도를 증가(몰 비율)시키면 형성 동역학(formation kinetic)이 느려지고, 최대 OD 값이 감소되는데, 이는 피브릴 직경 감소를 의미한다. 콘드로이틴 설페이트의 경우, 반대 작용이 관찰되었다. 제조 조건: 콜라겐 250 ㎍/ml, 37℃, NaCl 135 mmol/l이 함유된 pH 7.4의 인산 완충액 30 mmol/l.

도 2에서, 제조되는 피브릴의 구조에 대한 제조 조건의 영향을 AFM 사진으로 나타낸다. 데코린을 첨가하면, 모든 조건에서 피브릴의 직경(a 및 d)이 작아졌다. 콘드로이틴 설페이트는 특히 이온 강도가 낮은 조건에서 피브릴의 직경이 매우 현저하게 불균일하게 분포되었고, 피브릴의 평균 직경은 증가하였고(f), 보다 높은 이온 강도에서는 효과가 없었다(c). b와 e는 비콜라겐성 첨가물이 없는 피브릴 구조를 나타낸다. 제조 조건: 콜라겐 250 ㎍/ml, 37℃, pH 7.4의 인산 완충액 30 mmol/l(완충액 A), NaCl 135 mmol/l이 함유된 pH 7.4의 인산 완충액 30 mmol/l(완충액 B).

그러나, 피브릴 형성 과정중에 시험관내 콜라겐 단량체는 생체내 구조와 유사한 특징적인 횡문형 피브릴을 형성하지만, 공정 파라미터(pH, 이온 강도, 포스페이트 농도) 및 첨가된 비콜라겐성 성분의 성질 및 함량 둘다에 의해 영향받는다. 글리코사미노글리칸 또는 데코린과 같은 비콜라겐성 성분을 포함하는 콜라겐 피브릴은 콜라겐이 피브릴에 병합되는데 영향을 미치지 않거나 또는 단지 일부 영향을 미치는 범위내에서, 비교적 광범위한 범위의 중량 비로 적절히 제조할 수 있다.

실시예 2

콜라겐 피브릴에 비콜라겐성 성분의 병합

뼈 형성용 기질 복합재를 제조하기 위해, 0.01 M 아세트산 중의 콜라겐 단량체 용액을 4℃에서 24시간 교반하여 준비하였다. 이후, 비콜라겐 성분들의 존재하에, 중성 pH의 인산 완충 수용액에서, 자가-응집(피브릴 형성) 공정으로 콜라겐 피브릴을 형성시켰다. 제조 조건: 콜라겐 250 ㎍/ml, 37℃, pH 7.4의 인산 완충액 30 mmol/l(완충액 A), 또는 콘드로이틴 설페이트 및 데코린이 다양한 농도로 첨가된 NaCl 135 mmol/l을 함유하는 pH 7.4의 인산 완충액 30 mmol/l(완충액 B).

105℃에서 6시간 동안 6 M HCl 500 ㎕중에서 피브릴을 세척 및 가수분해시킨 후, 피브릴에 병합된 데코린과 콘드로이틴 설페이트를 Pieper et al.(Pieper JS., Hafmans T, Veerkamp JH, van Kuppevelt TH. Development of tailor-made collagen-glycosaminoglycan matrices EDC/NHS crosslinking, and ultrastructural aspects Biomaterials 2000, 21(6) 581-593) 방법에 따라 확인하였다.

콘드로이틴 설페이트의 경우, 병합 정도는 사용한 완충 시스템의 이온 강도에 따라 결정된다. 이온 강도가 낮은 경우(완충액 A), 사용한 20 ㎍중에서 약 2.5 ㎍의 CS가 콜라겐 250 ㎍에 병합되었지만, 이온 강도가 높은 경우(완충액 B)에는 상기 함량의 1/3에 불과하였다(도 3)

또한, 데코린의 병합 역시 사용한 완충 시스템에 의존적이었다. 완충액 A의 경우, 사용한 양의 1/3이 병합되었으며, 완충액 B의 수치보다 현저하게 낮았다.

실시예 3

뼈 형성용 기질 복합재로 코팅된 임플란트에 의한 성장 인자 보충

본 발명에 따라 구성 및 제조된 기질은 내인성 성장 인자의 보충에 의해 재조합 성장 인자를 사용하지 않고도 뼈 형성 및 축적을 가속화 및 향상시킬 수 있다. 본 실험에서, 재조합 성장 인자를 이용하여 이러한 결합 양상을 입증할 수 있다.

직경 10 mm의 TiA16V4 분사형의 원통 샘플을 에탄올, 아세톤 및 물로 세척하였다.

0.01 M 아세트산 중의 소 콜라겐 I형 1 mg/ml 용액을 4℃에서 하룻밤동안 교반하여 준비하였다. 이 용액에 비콜라겐성 ECM 성분(글리코사미노글리칸 30 ㎍/ml, 프로테오글리칸 15 ㎍/ml)을 첨가하였다. 상기 혼합물은 얼음상에서 피브릴 형성 완충액(60 mmol/l의 포스페이트, 270 mmol/l의 NaCl, pH 7.4)으로 처리한 다음 37℃에서 18시간 두었다. 제조되는 피브릴은 원심분리하고, 세척 및 균질화한 다음 최종 농도 1 mg/ml로 재현탁하였다.

원통형 샘플을 15분간 실온에서 상기 용액으로 코팅(딥-코팅)하고, 물로 세척하여 건조시켰다.

이후, 흡착 공정(PBS, 4℃, 18시간)으로 표면에 성장 인자(재조합 BMP-4 또는 TGF-1β)를 고정시킨 다음, ELISA로 측정하였다.

이러한 재조합 성장 인자를 이용한 시험관내 테스트로, 비콜라겐 성분을 본 발명에 따라 첨가하면, 기질에 대한 성장 인자 rhBMP-4 (특히, 콘드로이틴 설페이트 첨가시) 또는 rhTGF-lβ(특히, 데코린 첨가시)의 결합성이 증가되는 것으로 확 인되었다. BMP의 경우, 소량(2 - 20 ng/cm²) 사용시에는 효과가 없었으며, 다량(50 ng/cm²부터) 사용시에는 콘드로이틴 설페이트 함유 층에 대한 결합성이 순수한 콜라겐 층에 비해 사용한 함량에 대한 %로 측정하였을때 약 10% 높았다(도 4).

데코린 1 ng/cm² 및 10 ng/cm²을 함유하는 표면에 대한 rhTGF-lβ의 결합성은 모두 증가하였다.

기질 제조 조건: 콜라겐 500 ㎍/ml, 데코린 및/또는 콘드로이틴 설페이트 30 ㎍/ml, 37℃, NaCl 135 mmol/l이 함유된 pH 7.4의 인산 완충액 30 mmol/l.

실시예 4

여러가지 기질 복합재에서의 랫 칼바리아 골아세포 병합

여러가지 기질상에서의 원시 랫 칼바리아 골아세포의 반응 양상을 도 5에 나타낸다. 여러가지 기질 복합재에 대한 상기 세포의 부착 개시는 세포 형태, 세포골격 조직(cytoskeletal organization)(팔로이딘(phalloidin)을 이용한 엑틴 염색)으로 분석하였고, 및 초점 부착 복합체(focal adhesion complexe)는 인테그린 수용체로(빈쿨린(vinculin)에 대한 면역 염색) 분석하였다. 2시간 후에 콜라겐-데코린상에서의 부착이 명확해졌으며, 이어 콜라겐-CS 기질에서의 부착도 명확해졌다. 또한 FACS(초록-노란색의 점과 엑틴 피브릴의 말단 붉은색) 형성이 촉진되었고, 데코린 특히 CS에 의해 가속화되었다. 순수한 콜라겐 기질을 이용한 대조군의 경우 2시간 후에 매우 낮은 FACS가 확인되었다.

골아세포의 분화에 대한 기질 복합재 효과는, 형광 활성화 세포 스캐닝으로 마커 단백질인 오스테오폰틴의 발현으로 평가하였다. 콜라겐-CS 표면상의 골아세포는 8일 후에 순수한 콜라겐 표면상의 세포틴(~ 500 형광 단위)에 비해 오스테오폰틴(~ 2500 형광 단위)을 5배 이상으로 생산하였다. 기질 제조 조건: 콜라겐 500 ㎍/ml, 데코린 및/또는 콘드로이틴 설페이트 30 ㎍/ml, 37℃, NaCl 135 mmol/l이 함유된 pH 7.4의 인산 완충액 30 mmol/l.

랫 칼바리아 골아세포를 이용한 추가적인 실험으로, 담체 기질의 복합재에 의존적인 rhBMP-4에 대한 여러가지 세포 반응을 확인하였다. 도 6은 랫 칼바리아 세포에 rhBMP-4를 4 pmol/cm²첨가한 후 단백질 mg당 활성 단위 U로 알카리 포스파타제의 활성을 나타낸다. 데코린 함유 기질에서, BMP의 활성은 통제되는 수준(underregulated)이었지만, 콘드로이틴 설페이트 함유 기질상에서는 증가하였다. 기질 제조 조건: 콜라겐 500 ㎍/ml, 데코린 및/또는 콘드로이틴 설페이트 30 ㎍/ml, 37℃, NaCl 135 mmol/l이 함유된 pH 7.4의 인산 완충액 30 mmol/l.

실시예 5

동물 실험

동물 실험으로, 재조합 성장 인자와 함께 제공되는 기질이 콜라겐 I형 및 콘드로이틴 설페이트를 기초로 한 본 발명에 따른 가교되지 않은 뼈 형성용 기질 복합재 보다 유도성 뼈 형성 측면이, 현저하게 불량하다는 놀라운 사실을 확인하였다.

Ti 임플란트는 축과 직각으로 원형 절개가 있는 결손 모델(defect model)로, 1% 트리톤 X-100, 아세톤 및 96% 에탄올로 세척하고, 증류수로 헹군 다음 건조시켰다.

사용한 임플란트는 하기한 성분으로 2단계의 딥-코팅하였다:

A. 콜라겐 I형의 피브릴,

B. 실시예 1에 따른 콜라겐 I형과 콘드로이틴 설페이트를 기본으로한 본 발명의 뼈 형성용 기질 복합재

C. 실시예 1에 따른 콜라겐 I형과 콘드로이틴 설페이트를 기본으로한 본 발명의 뼈 형성용 기질 복합재

임플란트는 증류수로 세척하고, 공기중에 건조한 다음 42℃에서 12시간동안 에틸렌 옥사이드로 멸균하였다. 이식하기 바로 전에, 재조합 BMP-4(400 ng/ml)로 4℃에서 하룻밤동안 표면을 코팅하고, 이후 건조시켰다.

임플란트는 미니피그의 아래 턱을 사용하였다. 뼈의 임플란트 접촉성은 6개월 후 조직형태학적으로 확인하였다.

콜라겐 및 콘드로이틴 설페이트를 기본으로한 본 발명에 따른 뼈 형성 기질로 코팅한 임플란트에서 가장 높은 접촉%가 관찰되었으며(27.8%), 동일한 코팅 성분과 재조합 BMP-4로 코팅한 임플란트는 약 15%로 현저하게 낮았다. 가장 낮은 수치는 순수한 콜라겐으로만 코팅한 경우였다(12.8%)(도 7).

본 발명에 하기 약어가 사용된다:

bFGF 염기성 섬유아세포 성장 인자

BMP 뼈 형태 형성 단백질

ECM 세포외 기질

EGF 내피세포 성장 인자

FACITs 삼중나선형으로 조합된 콜라겐 피브릴

FACS 초점 부착 접촉(Focal adhesion contacts)

FGF 섬유아세포 성장 인자

GAG 글리코사미노글리칸

HAP 하이드록실아파티트(Hydroxylapatite)

IGF-I 인슐린계 성장 인자

PGA 폴리글리콜산

PLA 폴리아세트산

SLRP 소형 루신-다량 함유 단백질(Small leucine-rich protein)

TCP 트리칼슘 포스페이트 상(Tricalcium phosphate phases)

TES (N-(트리스(하이드록시메틸)메틸)-2-아미노-에탄설폰산

TGF-β 형질전환성 성장 인자 β(Transforming growth factor β)

VEGF 혈관 내피세포 성장 인자

WF 성장 인자

Claims

뼈 형성용 기질 복합재(osteogenic matrix composite)의 코팅을 가지는, 조직 공학용 임플란트 또는 지지체의 제조 방법으로서,

여기서 상기 뼈 형성용 기질 복합재는 콜라겐 및 하나 이상의 비콜라겐성(noncollagenic) 세포외 기질(ECM) 성분을 포함하는 기질 복합재이며, 상기 복합재에서 콜라겐 성분은 피브릴 형성(fibriliogenesis)에 의해 생성된 가교되지 않은 콜라겐 피브릴로 구성되며, 상기 콜라겐에 하나 이상의 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분이 병합(integration)되고,

여기서 상기 콜라겐 피브릴은 콜라겐 단량체들의 자가-응집(self-aggregation) 공정으로 형성되며, 여기서 피브릴 형성 이전에 상기 하나 이상의 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분이 첨가되며, 그리고 여기서 제조된 콜라겐 피브릴을 물이나 완충액에 재현탁하고, 이후 딥-코팅 공정으로 상기 임플란트 또는 지지체의 표면에 고정화시키거나, 또는 조직 공학용 지지체의 제조에서 피브릴 형성이 상기 지지체에서 유도되고, 동소(in situ)에서 형성된 콜라겐 피브릴은 젤 형태로 잔존하거나 또는 건조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,

상기 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분은 글리코사미노글리칸을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 공학용 임플란트 또는 지지체의 제조 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분은, A, C, D 또는 E형의 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 카라탄 설페이트(keratan sulfate), 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 헤파린 및 히알루론산을 각각 또는 조합된 형태로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 공학용 임플란트 또는 지지체의 제조 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분은 비콜라겐성 기질 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 공학용 임플란트 또는 지지체의 제조 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분은 비콜라겐성 기질 단백질로서 파이브로넥틴, 데코린(decorin), 비글리칸(biglycan), 라미닌(laminin), 베르시칸(versican)을 각각 또는 조합된 형태로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 공학용 임플란트 또는 지지체의 제조 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 콜라겐은 콜라겐 I형, II형, III형, V형, IX형, XI형 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 공학용 임플란트 또는 지지체의 제조 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 피브릴 형성은 온도 4℃ 내지 40℃, 콜라겐 농도 50 내지 5000 ㎍/ml, pH 4 내지 pH 9, 포스페이트 함량 500 mmol/l 이하, NaCl 함량 1000 mmol/l 이하의 조건하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 뼈 형성용 기질 복합재의 제조 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 피브릴 형성은 온도 25℃ 내지 37℃, 콜라겐 농도 250 내지 1000 ㎍/ml, pH 6 내지 pH 8, 포스페이트 함량 30 내지 60 mmol/l, NaCl 함량 300 mmol/l 이하의 조건하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 뼈 형성용 기질 복합재의 제조 방법.
뼈 형성용 기질 복합재의 코팅을 가지는, 조직 공학용 임플란트 또는 지지체로서,

여기서 상기 뼈 형성용 기질 복합재는 콜라겐 및 하나 이상의 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분을 포함하는 기질 복합재이며, 상기 복합재에서 콜라겐 성분은 피브릴 형성에 의해 생성된 가교되지 않은 콜라겐 피브릴로 구성되며, 상기 콜라겐에 하나 이상의 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분이 병합되고,

여기서 상기 콜라겐 피브릴은 콜라겐 단량체들의 자가-응집 공정으로 형성된 것임 특징으로 하는 조직 공학용 임플란트 또는 지지체.
제 1항에 따른 조직 공학용 임플란트 또는 지지체의 제조 방법에 의하여 제조된, 뼈 형성용 기질 복합재의 코팅을 가지는, 조직 공학용 임플란트 또는 지지체로서,

여기서 상기 뼈 형성용 기질 복합재는 콜라겐 및 하나 이상의 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분을 포함하는 기질 복합재이며, 상기 복합재에서 콜라겐 성분은 피브릴 형성에 의해 생성된 가교되지 않은 콜라겐 피브릴로 구성되며, 상기 콜라겐에 하나 이상의 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분이 병합되고,

여기서 상기 콜라겐 피브릴은 콜라겐 단량체들의 자가-응집 공정으로 형성된 것임 특징으로 하는 조직 공학용 임플란트 또는 지지체.
제 9항 또는 제 10항에 있어서,

상기 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분은 글리코사미노글리칸을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 공학용 임플란트 또는 지지체.
제 9항 또는 제 10항에 있어서,

상기 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분은, A, C, D 또는 E형의 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 카라탄 설페이트(keratan sulfate), 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 헤파린 및 히알루론산을 각각 또는 조합된 형태로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 공학용 임플란트 또는 지지체.
제 9항 또는 제 10항에 있어서,

상기 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분은 비콜라겐성 기질 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 공학용 임플란트 또는 지지체.
제 9항 또는 제 10항에 있어서,

상기 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분은 비콜라겐성 기질 단백질로서 파이브로넥틴, 데코린(decorin), 비글리칸(biglycan), 라미닌(laminin), 베르시칸(versican)을 각각 또는 조합된 형태로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 공학용 임플란트 또는 지지체.
제 9항 또는 제 10항에 있어서,

상기 콜라겐은 콜라겐 I형, II형, III형, V형, IX형, XI형 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 공학용 임플란트 또는 지지체.
콜라겐 및 하나 이상의 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분을 포함하는 뼈 형성용 기질 복합재를 포함하는 코팅액으로서,

상기 복합재에서 콜라겐 성분은 피브릴 형성에 의해 생성된 가교되지 않은 콜라겐 피브릴로 구성되며, 상기 콜라겐에 하나 이상의 비콜라겐성 세포외 기질(ECM) 성분이 병합되고, 여기서 상기 콜라겐 피브릴은 콜라겐 단량체들의 자가-응집 공정으로 형성된 것임을 특징으로 하는 코팅액.