JP2007532211A - 骨形成マトリックス複合体、その製造方法および骨形成複合体マトリックスのコーティングを有する組織工学用のインプラントおよび骨組 - Google Patents
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Abstract
Description
温度範囲が4℃から40℃、好ましくは25℃から37℃、コラーゲン濃度が50から5000μg/ml、好ましくは250から1000μg/ml、pH4からpH9、好ましくはpH6からpH8、リン酸塩含量が500mmol/lまで、好ましくは30から60mmol/l、NaCl含量が1000mmol/lまで、好ましくは300mmolまで。
・天然の細胞環境に対応する製造条件および成分を使用したための、かなり生理学的な組成および構造による、製造されたマトリックスの良好な生体適合性および機能性、
・成分混合物中における用いることができる成分およびそれらの割合の高い可変性
・容易な保存および安定化条件
・内因性の骨誘導因子を用いることによる高い特異性および効率性
[各種条件下で原繊維形成した後の原繊維の構造]
骨形成マトリックス複合体の製造のために、コラーゲンモノマーの0.01M酢酸溶液を、4℃で24時間撹拌することにより調製する。ついで非コラーゲン成分の存在下、pH中性、温度37℃でリン酸塩の水性緩衝液中で自己凝縮(原繊維形成)の工程によりコラーゲン原繊維を形成する。
[非コラーゲン性成分のコラーゲン原繊維への組み込み]
骨形成マトリックス複合体の製造のために、コラーゲンモノマーの0.01Mの酢酸溶液を4℃で24時間撹拌することにより調製する。ついで非コラーゲン成分の存在下、pH中性でリン酸塩の水性緩衝液中で自己凝縮(原繊維形成)の工程によりコラーゲン原繊維を形成する。形成条件:250μg/mlのコラーゲン、37℃、pH7.4の30mmol/lのリン酸塩緩衝液(緩衝液A)または135mmol/lのNaClを含むpH7.4の30mmol/lのリン酸塩緩衝液(緩衝液B)、コンドロイチン硫酸塩およびデコリンの濃度は異なる。
デコリンの組み込みもまた用いられる緩衝液系に依存する。緩衝液Aの場合は用いられた量の1/3が組み込まれ、一方緩衝液Bの値はここでも著しく低い。
[骨形成マトリックス複合体を被覆したインプラントによる成長因子の補給]
本発明により構成され製造されたマトリックスは、内因性の成長因子を補給することにより、組み換え型成長因子を用いることなく骨の形成および蓄積を加速し、向上させることができる。本実験においては、このような結合挙動は組み換え型成長因子を用いてのみ示される。
これらの組み換え型成長因子を用いたin vitroテストは、本発明による非コラーゲン性成分の添加により成長因子rhBMP‐4(特にコンドロイチン硫酸塩の添加による)またはrhTGF‐1β(特にデコリンの添加による)のマトリックスへの結合が増すことを示している。BMPは少量(2から20ng/cm2)では影響はないが、より多量(50ng/cm2から)では、純粋なコラーゲン層と比較して、コンドロイチン硫酸塩を含有した層に対して、約10%高い結合が生じる。用いた量を%で示す(図4)。
[ラットの頭蓋冠の骨芽細胞を用いた種々のマトリックス複合体に関する研究]
図5は初代ラットの頭蓋冠の骨芽細胞の種々のマトリックス上での挙動を示す。細胞の異なるマトリックス組成物に対する初期の接着を、細胞の形態、細胞骨格構造(ファロイジンによるアクチン染色)およびインテグリン受容体による接着斑複合体の形成(ビンキュリンに対する免疫染色)により分析した。接着は2時間後コラーゲン‐CSマトリックスにおいてもっとも顕著であり、次にコラーゲン‐デコリンであった。FACS(アクチン原繊維の端の緑黄色の点および赤味)の形成もまたデコリンおよび特にCSにより促進され、加速された。純粋なコラーゲンマトリックスを用いたコントロールは2時間後明らかに少ないFACSを示した。
[動物実験]
動物実験においては、驚くべきことに、組み換え型成長因子を供給されたマトリックスは誘導された骨形成に関し、コラーゲンタイプIおよびコンドロイチン硫酸塩を基にした本発明の非架橋の骨形成マトリックス複合体よりも著しく不十分に機能することが見出された。
A.コラーゲンタイプIの原繊維、
B.実施例1による、コラーゲンタイプIおよびコンドロイチン硫酸塩を基にした本発明の骨形成マトリックス複合体
C.実施例1による、コラーゲンタイプIおよびコンドロイチン硫酸塩を基にした本発明の骨形成マトリックス複合体
bFGF 塩基性繊維芽細胞成長因子
BMP 骨形態形成タンパク質
ECM 細胞外マトリックス
EGF 内因性の成長因子
FACITs 中断された三重らせんを伴う原繊維関連コラーゲン
FACS 接着斑接触
FGF 繊維芽細胞成長因子
GAG グリコサミノグリカン
HAP ヒドロキシルアパタイト
IGF−I インシュリン様成長因子
PGA ポリグリコール酸
PLA ポリ乳酸
SLRP 小さなロイシンリッチなタンパク質
TCP リン酸トリカルシウム相
TES (N‐[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]‐2‐アミノエタンスルホン酸‐
TGF−β トランスフォーミング増殖因子ベータ
VEGF 血管内皮成長因子
WF 成長因子
Claims (13)
- コラーゲンおよび少なくとも一つの非コラーゲン性のECM成分またはその誘導体の骨形成マトリックス複合体であって、コラーゲン成分が原繊維形成によって生成された非架橋コラーゲン原繊維からなり、かつ少なくとも一つの非コラーゲン性のECMまたはその誘導体がコラーゲン成分に組み込まれていることを特徴とする骨形成マトリックス複合体。
- 前記非コラーゲン性のECM成分がグリコサミノグリカンを含むことを特徴とする請求項1に記載の骨形成マトリックス複合体。
- 前記非コラーゲン性のECM成分がタイプA、C、D、またはBのコンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、ケラタン硫酸塩、ヘパラン硫酸塩、ヘパリン、ヒアルロン酸およびそれらの誘導体を単独であるいは混合して含むことを特徴とする請求項2に記載の骨形成マトリックス複合体。
- 前記非コラーゲン性のECM成分が非コラーゲン性マトリックスタンパク質を含むことを特徴とする請求項1に記載の骨形成マトリックス複合体。
- 前記非コラーゲン性のECM成分が非コラーゲン性マトリックスタンパク質として、フィブロネクチン、デコリン、ビグリカン、ラミニン、ベルシカンを単独であるいは混合して含むことを特徴とする請求項4に記載の骨形成マトリックス複合体。
- 前記コラーゲン成分がコラーゲンI、II、III、V、IX、XIの一つまたはそれらの組み合わせからなることを特徴とする請求項1から5の一項に記載の骨形成マトリックス複合体。
- コラーゲンおよび少なくとも一つの非コラーゲン性のECM成分またはその誘導体の骨形成マトリックス複合体の製造方法であって、コラーゲン原繊維が原繊維形成によって生成され、原繊維形成の前に少なくとも一つの非コラーゲン性のECM成分またはその誘導体が添加され、このように生成されたコラーゲン原繊維が水または緩衝液系に再度縣濁され、および場合によっては凍結乾燥されることを特徴とする骨形成マトリックス複合体の製造方法。
- 前記原繊維形成が温度範囲、4℃から40℃、好ましくは25℃から37℃、コラーゲン濃度、50から5000μml、好ましくは、250から1000μml、pH4からpH9、好ましくはpH6からpH8、リン酸塩濃度、500mmol/lまで、好ましくは、30から60mmol/l、NaCl濃度、1000mmol/lまで、好ましくは、300mmolまでの条件下で行なわれることを特徴とする請求項7に記載の骨形成マトリックス複合体の製造方法。
- 請求項1から8の一項に記載の骨形成マトリックス複合体の組織工学用のインプラントまたは骨組のコーティングのための使用。
- 請求項1から6の一項に記載の骨形成マトリックス複合体のコーティングを有する組織工学用のインプラントまたは骨組の製造方法であって、コラーゲン原繊維が原繊維形成によって生成され、原繊維形成の前に、前記少なくとも一つの非コラーゲン性のECM成分またはその誘導体を添加し、このように生成されたコラーゲン原繊維を水または緩衝液系に再度縣濁し、ついでインプラントまたは骨組の表面にティップ‐コーティング法で固定化することを特徴とする組織工学用のインプラントまたは骨組の製造方法。
- 請求項1から6の一項に記載の骨形成マトリックス複合体のコーティングを有する組織工学用の骨組の製造方法であって、コラーゲン原繊維が原繊維形成によって生成され、原繊維形成の前に、前記少なくとも一つの非コラーゲン性のECM成分またはその誘導体が原繊維の形成が骨組内で誘導されるように添加され、その場で形成された前記原繊維がゲルのままであるか、または乾燥されることを特徴とする組織工学用の骨組の製造方法。
- 請求項1から6の一項に記載の骨形成マトリックス複合体のコーティングを有する組織工学用のインプラントまたは骨組。
- 請求項1から6の一項に記載の骨形成マトリックス複合体を含むコーティング溶液。
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