KR101946822B1 - 분석물 검출을 위한 표면의 작용화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비공유적 방식으로 기재에 부착된 결합 중합체에 의해 적어도 부분적으로 덮인 플라스틱 기재를 포함하는, 분석물을 검출하기 위한 장치에 관한 것으로서, 상기 결합 중합체는 방향족 기 및 카르복실산기가 구비된 다당류 주쇄를 포함한다.

Description

분석물 검출을 위한 표면의 작용화 방법{METHOD OF FUNCTIONALIZING SURFACES FOR ANALYTE DETECTION}

본 발명은 분석물 검출을 위한 표면의 작용화 방법에 관한 것이다. 이 표면의 작용화 방법은 특히 다양한 화학적, 생물학적 및 진단적 분석을 실행하는 데에 사용될 수 있는 분석물을 검출하기 위한 장치를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 표면의 작용화 방법을 적용하는 데에 적절한 특별한 중합체를 제공한다.

분석에 있어서의 기준 분석은 소위 "ELISA" 분석이다. 이 분석으로 생물학 분야의 분석물을 검출 또는 측정할 수 있다. 일반적으로, 미량 역가판의 웰을 (실질적으로 소수성 상호 작용에 의해) 목적으로 하는 분석물(특히 항원)에 특이적으로 결합할 수 있는 포획 요소(예컨대 항체)로 코팅한다. 시험액을 그 다음 마이크로플레이트에 침착시키고, 목적으로 하는 분자가 존재하는 경우, 이는 포획 요소에 특이적으로 결합한다.

역시 목적으로 하는 분자에 결합할 수 있는 추적자 요소를 웰에 첨가한다. 이 추적자 요소는 예컨대 착색된 생성물의 형성을 촉매화하는 효소일 수 있고, 이에 따라 이 추적자 요소는 비색법에 의해 정량화될 수 있다.

ELISA 분석은 자동화에 잘 맞는다. 그러나, 이러한 분석에 통상적으로 사용되는 (폴리스티렌의) 표면은 음하전된 다당류와 같은 친수성 분자 또는 저분자량의 친수성 분자를 용이하게 부동화할 수 없다. 예컨대 폴리리신의 흡착능을 이용하여 이를 폴리스티렌의 표면에 고정시킬 수 있도록 다당류를 폴리리신으로 공액하는 것이 또한 제안되어 있다(Leinonen & Frasch, Infect Immun., 38(3): 1203-7, 1982).

ELISA 분석은 또한 표면 전하와 관련된 한계를 갖는데, 왜냐하면 상호 작용이 일반적으로 음하전된 표면에 더욱 특이적이기 때문인 반면(Graves, J. Immunol. Methods, 111(2): 157-66, 1988), 플라스틱의 표면은 소수성이기 때문이다.

또한, 표준 ELISA 분석은 시험마다 그리고 샘플마다 하나의 정보가 이용 가능함을 의미하는 단일 변수 분석에 한정된다. 동일한 샘플에 여러 가지 분석이 필요할 경우, "바이오칩"으로 공지된 장치에 통상적으로는 또는 소형화하여, 동시에 몇 가지 ELISA형의 분석을 실시할 필요가 있다. 매우 적은 바이오칩이 현재 판매 중이며, 현재 판매 중인 장치는 기재와 같은 유리 현미경 슬라이드를 주로 사용한다. 이러한 기재는 대량 용도에는 적절하지 않다.

한편, 플라스틱 기재는 바이오칩의 제작에는 적절하지 않다. 분석물의 상당한 비특이적 흡착으로 인해 기재 상에 직접 흡착된 만족스럽지 않은 신호/노이즈 비가 얻어진다. 소수성 플라스틱 표면도 단백질을 변성시켜 개질 없이는 사용할 수 없다는 단점을 갖는다.

그러나, 화학적 기가 거의 도입될 수 없으므로, 해당 중합체의 화학적 개질에 의한 플라스틱의 작용화 가능성은 매우 한정적이다. 또한, 중합체의 조성의 약간의 변화, 또는 하나의 배취에서 다음 배취로의 조성의 편차조차 작용화된 기재의 특성 차이를 초래할 수 있다.

또한, 바이오칩의 인쇄 동안 중요한 제약점에 부딪히는데, 이러한 기재 상에 나노 액적을 재현성있게 침착(하여 잘 정의되고 규칙적인 침착물을 얻는)하는 것은 어렵기 때문이다. 이러한 문맥에서 액적을 침착하기 위한 대부분의 실질적인 방법인 바늘로의 접촉 인쇄는 기술적인 도전 과제이기 때문에, 압전형의 무접촉 침착 기술이 일반적으로 사용된다. 그러나, 느리다는 관점에서, 후자는 산업적 생산에 매우 적절하지 않다.

96 웰 플라스틱 플레이트의 작용화의 몇몇 예가 제안되어 있다. 이에 따라, 당을 주성분으로 하는 칩의 제조를 위한 플라스마 기술이 Marson, Robinson et al., Glycobiology 19(2): 1537-46(2009)에서 제안되었다. 이 기술은 부동화 후 당의 기능을 보존하는 데에 어려움이 있다. 다른 예는 플라스틱 표면을 코팅하기 위한 스트렙타비딘의 사용을 기초로 한다(Gehring, Albin et al., Anal. Bioanal. Chem., 5 April 2008).

문헌 EP 1 953 555는 생리학적으로 활성인 물질 및 수소 결합을 생성하기 위한 화합물이 부동화된 금속막으로 덮인 플라스틱 기재를 포함하는 장치를 기재한다.

문헌 EP 2 030 677은 음이온 중합체가 고정된 금속막으로 덮인 기재를 포함하는 바이오센서를 기재한다.

이들 문헌은 중합체와 플라스틱 기재 사이의 직접적인 상호 작용은 개시하지 않는다.

따라서, 제조가 용이하고. 강건하며, 사용이 용이하고, 및/또는 다수의 분석물을 동시에 검출할 수 있게 하는, 분석물을 검출하기 위한 장치를 공급할 필요가 여전히 존재한다.

발명의 개요

본 발명은 우선 기재에 비공유적으로 고정된 결합 중합체로 적어도 부분적으로 덮인 플라스틱 기재를 포함하는 분석물을 검출하기 위한 장치에 관한 것으로서, 상기 결합 중합체는 방향족 기 및 카르복실산기가 구비된 다당류 골격을 포함한다.

구체예에 따르면, 다당류 골격은 분자량이 바람직하게는 15,000 내지 100,000, 더욱 특히 바람직하게는 30,000 내지 60,000인 덱스트란 골격이다.

구체예에 따르면, 다당류 골격에는 반응성 기가 더 구비되며, 상기 반응성 기 바람직하게는 형태 -X-CONH-Z'(식 중, X는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지쇄형, 치환 또는 비치환 알킬쇄를 나타내고, X는 더욱 특히 바람직하게는 CH₂이며, Z'는 다른 분자에 결합할 수 있는 기를 나타냄)의 것이다.

구체예에 따르면, 카르복실산기는 형태 -X-COOH(식 중, X는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지쇄형, 치환 또는 비치환 알킬쇄를 나타내고, X는 바람직하게는 CH₂임)의 것이다

구체예에 따르면, 방향족 기는 형태 -X-CONH-Z(식 중, X는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지쇄형, 치환 또는 비치환 알킬쇄를 나타내고, X는 바람직하게는 CH₂이고, Z는 바람직하게는 6 내지 30 개의 탄소 원자를 포함하는 아릴 작용기를 나타내고, Z는 바람직하게는 -CH₂-Ph 또는 -CH₂-Ph-파라OH와 같은 임의로 치환된 벤질 작용기임)의 것이다.

구체예에 따르면, 결합 중합체는

- 다당류 골격의 당류 단위당 0.4 내지 0.8 개의 방향족 기, 바람직하게는 0.4 내지 0.6 개의 방향족 기, 바람직하게는 0.45 내지 0.6 개의 방향족 기; 및/또는

- 다당류 골격의 당류 단위당 0 내지 0.8 개의 반응성 기, 바람직하게는 0 내지 0.6 개의 반응성 기; 및/또는

- 다당류 골격의 당류 단위당 방향족 기, 카르복실산기 및 반응성 기 합하여 0.5 내지 1.5 개, 바람직하게는 방향족 기, 카르복실산기 및 반응성 기 합하여 0.9 내지 1.3 개

를 포함한다.

구체예에 따르면, 기재는 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 또는 폴리프로필렌의 기재이며, 바람직하게는 폴리스티렌의 기재이다.

구체예에 따르면, 장치는 결합 중합체에 부동화된 포획 요소를 포함하며, 상기 포획 요소는 바람직하게는 임의로 개질 및/또는 공액된 폴리펩티드, 당류, 올리고당류 또는 리포다당류, 바이러스 또는 바이러스 분절 및 세포에서 선택되고, 포획 요소는 바람직하게는 반응성 F기에 대한 흡착 또는 공유 결합에 의해 결합 중합체 상에 부동화된다.

구체예에 따르면, 장치는 다수의 검출 구역을 가지며, 검출 구역은 바람직하게는 상이한 포획 요소를 포함한다.

구체예에 따르면, 기재는 불투명 또는 투명 슬라이드, 미량 역가판, 비드 수집물, 배양판, 스트립 또는 막대이다.

본 발명은 또한 방향족 기, 카르복실산기 뿐 아니라 하기 화학식 (V)의 반응성 기가 구비된 다당류 골격을 포함하는 중합체에 관한 것이다:

식 중, X 및 X'는 각각 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는, 치환 또는 비치환 알킬쇄를 나타낸다.

본 발명은 또한 방향족 기, 카르복실산기 뿐 아니라 하기 화학식 (V')의 반응성 기가 구비된 다당류 골격을 포함하는 중합체에 관한 것이다:

식 중, X 및 X'는 각각 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는, 치환 또는 비치환 알킬쇄를 나타내고, Pep은 펩티드 분절을 나타낸다.

상기 언급한 두 가지 중합체의 구체예에 따르면, X는 CH₂를 나타내고, 및/또는 X'는 (CH₂)₂를 나타낸다.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 반응성의 화학식 (V)의 기를 갖는 상기 중합체의 제조 방법에 관한 것이다:

- 다당류를 공급하는 단계;

- 다당류 상에 카르복실산기를 그래프팅하는 단계; 그 다음

- 그래프팅된 카르복실산기의 일부를 개질하여 방향족 기를 공급하는 단계; 후

- 그래프팅된 카르복실산기의 다른 일부를 개질하여 반응성의 화학식 (V)의 기를 공급하는 단계로서, 상기 개질은 다당류를 하기 화학식 (VII)의 화합물과 반응시키는 것을 포함하는 단계:

(식 중, X'는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는, 치환 또는 비치환 알킬쇄를 나타냄).

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 반응성의 화학식 (V')의 기를 갖는 상기 중합체의 제조 방법에 관한 것이다:

- 상기 화학식 (V)의 중합체를 공급하는 단계; 및

- 이 중합체를 폴리펩티드 H-Cys-Pep(식 중, Pep은 펩티드 분절을 나타내고, Cys는 시스테인 잔기를 나타냄)과 반응시키는 단계.

상기 기재된 장치의 구체예에 따르면, 결합 중합체는 (반응성의 화학식 (V) 또는 (V')의 기를 갖는) 상기 언급된 중합체이다.

본 발명은 또한 화학적 분자, 생물학적 분자, 세포 또는 유기체를 검출하고 임의로 정량하기 위한, 상기 기재된 바의 분석물을 검출하기 위한 장치의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 상기 기재된 분석물을 검출하기 위한 장치의 제조 방법에 관한 것이다:

- 플라스틱 기재를 공급하는 단계; 및

- 기재를 결합 중합체를 포함하는 1 이상의 용액과 접촉시키는 단계.

구체예에 따르면, 이 방법은 기재를, 포획 요소를 포함하는 1 이상의 용액과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 상기 기재된 바의 분석물을 검출하기 위한 장치의 제조 방법에 관한 것이다:

- 플라스틱 기재를 공급하는 단계; 및

- 기재를, 포획 요소에 결합된 결합 중합체를 포함하는 1 이상의 용액과 접촉시키는 단계.

본 발명은 종래 기술의 단점을 극복 가능하게 한다. 더욱 특히, 이는 제조가 용이하며 강건하고 사용이 용이한, 분석물을 검출하기 위한 장치를 제공한다. 구체예에 따르면, 이들 장치는 다수의 분석물을 동시에 검출 가능하게 한다. 특히, 본 발명은 친수성 및/또는 소형 분자(뿐 아니라 항체 또는 단백질도)를 부동화 가능하게 한다.

이는 다당류 골격을 갖는 결합 중합체에 의한 표면 작용화를 통해 달성된다. 결합 중합체는 (종종 그 자체로 음하전된) 검출되는 분석물과 결합 중합체 사이의 비특이적 흡착 현상을 제한하기 위해 결합 중합체를 음하전시키기 위해, 비교적 소수성인 표면에 결합 중합체를 비공유 고정시키는 것을 촉진하는 방향족 기 뿐 아니라 카르복실산기도 포함한다.

본 발명의 장치에서의 플라스틱, 특히 폴리스티렌 표면의 사용은 유리와 관련된 문제: 유리 파손 위험 및 개인에 대한 관련 위험, 폐기물 처분과 관련된 비용, 유리의 화학적 성질과 관련된 작용화의 이질성, 기재 및 특성화의 고비용, 기재 분리의 어려움을 회피 가능하게 한다.

특정의 특별한 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 하기에 열거된 유리한 특징 중 하나 또는 바람직하게는 여러 개를 갖는다.

- 종래 분석 기술(NMR, pH 측정, 미세 분석)에 의해 결합 중합체를 대량으로 용이하게 합성하고 특성화할 수 있어 엄격한 제조 제어가 가능해진다.

- 결합 중합체를 특히 결합 중합체의 방향족 기에 의해 간단한 흡착(비공유 결합)에 의해 표면 상에 고정시킨다. 이는 실행이 특히 간단하고 강건하며 표면의 물리 화학적 특성의 편차를 완화시키는 데에 그다지 민감하지 않은 고정 방식이다. 어떤 경우에는 표면 성질과 관련하여 결합 중합체 내 방향족 기의 밀도를 조정하는 것도 가능하다.

- 본 발명은 현재 널리 입수 가능하고 저렴한 기재인, 폴리스티렌으로 제조된 미량 역가판, 페트리 디쉬 등으로부터 출발하여 실시할 수 있다.

- 본 발명은 또한 바이오칩, 즉 플라스틱, 특히 폴리스티렌을 기초로 하여 다수의 분석물의 동시 검출을 위한, 분석물 검출용의 소형화된 장치의 제조에 사용될 수 있다.

- 본 발명에 따른 표면 작용화는 특히 포획 요소가 소형 분자일 때에는 (결합 중합체에 존재하는 반응성 기를 통해) 공유적으로, 또는 (흡착에 의해) 비공유적으로, 결합 중합체 상에 포획 요소(또는 프로브)를 고정시켜 실시된다. 따라서, 본 발명은 큰 적용 유연성을 제공한다.

- 작용기가 습기 또는 공기의 존재 하에 유리하게 안정적이다(이의 특성 보존).

도 1은 (x축 상의) 벤질아민 등가물의 수에 대한, 실시예 3으로부터의 중합체 PsAcAr1 내 (y축 상의) 방향족 기로의 치환도 사이의 관계를 도시한다. 이는 실시예 4를 참조할 것이다.
도 2는 (x축 상의) 아민 아지드 등가물의 수에 대한, 실시예 7로부터의 중합체 PsAcF1 내 (y축 상의) 아지드 기로의 치환도 사이의 관계를 도시한다. 이는 실시예 8을 참조할 것이다.
도 3은 작용화 또는 비작용화 폴리스티렌 플레이트 상의 접촉각(˚)의 측정을 도시하는 막대 그래프이다. 이는 실시예 22를 참조할 것이다.
도 4, 5 및 6은 본 발명에 따른 중합체에 대한 (다른 렉틴에 비한) 콘카나발린 A의 고정의 특이성을 도시한다. 이는 실시예 23 및 24를 참조할 것이다.
도 7은 작용화된 폴리스티렌 플레이트에 대한 접촉각(˚)에 대한 방향족 치환도의 영향을 도시한다. 이는 실시예 25를 참조할 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 중합체로 작용화된 표면에 대한 펩티드 알데히드의 화학 선택적 결합을 도시하는 막대 그래프이다. 이는 실시예 26을 참조할 것이다.
도 9 및 10은 펩티드로의 표면 작용화 및 적절한 항체(항-HA 또는 항-FLAG 항체로의 배양)로의 검출을 도시하는 막대 그래프이다. 이는 실시예 27을 참조할 것이다.
도 11은 본 발명에 따른 중합체로 작용화된 표면에 대한 N-말단 시스테인을 보유하는 펩티드의 화학 선택적 결합을 도시하는 막대 그래프이다. 이는 실시예 33을 참조할 것이다.
도 12 및 13은 96 웰 폴리스티렌 플레이트의 바닥에서의 항체 바이오칩 상의 비색적 검출을 도시하는 도면이다. 이는 실시예 34를 참조할 것이다.

발명의 구체예의 설명

본 발명을 이제 하기 설명에서 더욱 상세하게 그리고 비제한적으로 설명한다.

결합 중합체 및 이의 제조

본 발명의 문맥에서 사용되는 결합 중합체는 카르복실산기(이하, 약칭 "Ac") 및 방향족 기(이하, 약칭 "Ar")가 구비된 다당류 골격(이하, 약칭 "Ps")을 포함한다. 구체예에 따르면, 다당류 골격에는 또한 상기 언급된 카르복실산기와는 상이한 반응성 기(이하, 약칭 "F")가 구비될 수 있다.

"다당류 골격"은 O-오시딕(osidic) 결합에 의해 함께 결합된 당(또는 당류 단위)의 집합에 의해 형성된 구조를 의미한다. 이 구조는 직쇄형 또는 분지쇄형일 수 있다. 이는 바람직하게는 80 내지 600 개의 당류 단위, 더욱 특히 바람직하게는 150 내지 350 개의 당류 단위를 포함한다.

당류 단위는 바람직하게는 환형이다. 이는 삼당류, 사당류, 오당류, 육당류 또는 칠당류일 수 있으며, 바람직하게는 이는 육당류이다.

"치환 수준" 또는 "치환도"는 당류 단위당 치환기(Ac, Ar 또는 F)의 평균 수이다. 치환도의 결정 방법은 실시예 부분에 제공한다.

Ac, Ar 및 F기 모두는 바람직하게는 당류 단위의 히드록실 작용기의 일부 또는 전부 상에 그래프팅된다.

다당류 골격의 분자량은 바람직하게는 15,000 내지 100,000, 더욱 특히 바람직하게는 30,000 내지 60,000으로 구성된다.

다당류 골격은 동질 다당류형(동일 당류 단위) 또는 이질 다당류형(상이한 당류 단위)의 것일 수 있다.

동질 다당류의 예로서, 글루코산 또는 글루칸(알파-글루칸 또는 베타-글루칸), 예컨대 전분, 글리코겐, 셀룰로오스, 덱스트란, 풀러란, 히알루론산, 키틴 또는 키토산(키틴의 탈아세틸화된 형태); 아라비난, 크실란 또는 펙틴을 언급할 수 있다. 이질 다당류의 예로서, D-갈락토오스, L-아라비노오스, L-람노오스 및 D-글루쿠론산을 포함하는 분지쇄형 구조인 검 뿐 아니라 헤미셀룰로오스도 언급할 수 있다.

　바람직한 구체예에 따르면, 당류 단위는 글루코오스(또는 덱스트로오스) 단위이다. 바람직하게는, 다당류 골격은 덱스트란 분자이다. 즉, 이는 α-1,2 및/또는 α-1,3 및/또는 α-1,4 결합에 의해 주쇄에 부착된 분지를 임의로 갖는 α-1,6 글리코시드 결합에 의해 함께 결합된 글루코오스의 주쇄를 갖는다. 덱스트란은 대량으로 입수 가능하며 저렴하고 수용해성이 양호하다.

명세서 나머지에서는, 덱스트란형의 다당류 골격을 참조할 것이며, 이 설명은 다당류 골격의 다른 유형에 동일하게 적용됨을 이해하라.

반응성 F기("PsAcAr"형의 중합체)가 구비되지 않은 본 발명에 따른 결합 중합체는 하기 단계에 의해 얻을 수 있다:

- 다당류 Ps(비치환된 다당류 골격)를 공급하는 단계;

- 이 다당류 상에 Ac기를 그래프팅하여 "PsAc"형의 중합체를 얻는 단계; 및

- 중합체 PsAc의 Ac기의 일부를 개질하여 중합체 PsAcAr을 얻는 단계.

따라서, 하기 화학식 (I)을 참조하면:

출발 중합체 Ps는 화학식 (I)( R₁, R₂ 및 R₃ 기 모두는 수소 원자를 나타냄)의 중합체이고; 중간 중합체 PsAc는 화학식 (I)(식 중, R₁, R₂ 및 R₃ 기의 일부는 수소 원자이고, 나머지 R₁, R₂ 및 R₃ 기는 카르복실산 작용기를 보유하는 기를 나타냄)의 중합체이며; 결합 중합체 PsAcAr는 화학식 (I)(식 중, 일부 R₁, R₂ 및 R₃ 기는 수소 원자를 나타내고, 나머지 R₁, R₂ 및 R₃ 기는 카르복실산 작용기를 보유하는 기를 나타내며, R₁, R₂ 및 R₃ 기의 제3 및 마지막 일부는 방향족 핵을 보유하는 기를 나타냄)의 중합체이다.

카르복실산 Ac기는 형태 -X-COOH(식 중, X는 염소, 브롬, 케톤기, 불소, 알콜기, 카르복실산기 및 방향족 기에서 선택되는 1 이상의 치환기(특히 페닐)가 임의로 구비된, 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬쇄를 나타냄)의 것이다. 바람직하게는, 이 사슬은 직쇄형 및 비치환된 것이고, 및/또는 최대 5개의 탄소 원자, 최대 4개의 탄소 원자, 최대 3개의 탄소 원자 또는 최대 2개의 탄소 원자를 포함한다. 과잉의 반응성의 가능한 문제가 회피되는 바람직한 구체예에 따르면, Ac기는 형태 -CH₂-COOH(메틸카르복실산기)의 것이다.

Ac기는 상황에 따라 이온화된 형태(반대 이온과 관련된 COO^-로 치환된 COOH)로 또는 염화된 형태(예컨대 COONa로 치환된 COOH)로 존재할 수 있다.

바람직하게는 Ac기는 모두 동일하지만, 상이한 Ac기의 그래프팅을 생각할 수도 있다.

방향족 Ar기는 형태 -Y-Z(식 중, Y는 결합 기를 나타내고, Z는 바람직하게는 6 내지 30 개의 탄소 원자, 바람직하게는 6 내지 24 개의 탄소 원자, 더욱 특히는 6 내지 12 개의 탄소 원자, 및 할로겐, -OH, -NH₂, -NO₂, -OR', -COOR', -CONHR'(식 중, R'는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 알킬기임)에서 선택되는 1 이상의 치환기를 포함하는 아릴 작용기를 나타냄)의 것이다. Z는 단환형 또는 다환형, 그리고 임의로 헤테로환형일 수 있다. Z는 바람직하게는 벤젠 유도체, 특히 페닐, 벤질 또는 페놀 기이다.

Y는 바람직하게는 형태 -X-CONH-(식 중, X는 Ac기와 관련하여 상기에 제공된 의미와 동일한 의미를 가짐)의 아미드기이다.

바람직한 구체예에 따르면, Ar기는 -CH₂-CONH-CH₂-Ph 기(식 중, Ph는 페닐기임) 또는 -CH₂-CONH-CH₂-Ph-파라OH 기이다.

바람직하게는, Ar기는 모두 동일하지만, 상이한 Ar기의 그래프팅을 생각할 수도 있다.

다당류 Ps 상에 Ac기를 그래프팅하여 중합체 PsAc를 얻는 단계는 다당류 Ps를 할로겐 작용기, 바람직하게는 염소 작용기를 보유하는 카르복실산 화합물과 반응시키는 것에 의해 실시할 수 있다.

예컨대, 형태 -CH₂-COOH의 바람직한 Ac기의 그래프팅은 다당류 Ps를 모노클로로아세트산과 반응시켜 얻을 수 있다. 바람직하게는, 반응은 이소프로판올의 존재 하에 실시한다.

중합체 PsAc의 Ac기의 일부를 개질하여 중합체 PsAcAr을 얻는 단계는 중합체 PsAc를 R-Z형(식 중, Z는 상기와 동일한 의미를 가지며, R은 카르복실산 작용기와 반응성이 있는 작용기임)의 화합물과 반응시켜 실시할 수 있다. 바람직하게는, R은 Ac기와 아미드 결합을 형성할 수 있는 아민 작용기이다.

예컨대, -CH₂-CONH-CH₂-Ph형의 바람직한 Ar기는 다당류 PsAc를 벤질아민과 반응시켜 얻을 수 있다. 추가의 예로서, CH₂-CONH-CH₂-Ph-파라OH형의 바람직한 Ar기는 다당류 PsAc를 파라-히드록시벤질아민과 반응시켜 얻을 수 있다. 바람직하게는, 반응은 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카르보디이미드의 존재 하에 실시한다.

반응성 F기("PsAcArF"형의 중합체)가 구비된 본 발명에 따른 결합 중합체는 한쪽 상의 Ac기의 일부를 다른 한쪽 상의 F기로 그리고 다른 한쪽 상의 Ar기로 개질함으로써, (상기 얻어진 바와 같은) PsAc형의 중합체로부터 출발하여 얻을 수 있다. 이들 두 가지 개질 단계는 임의의 순서로 실시할 수 있다.

즉, 우선 PsAcAr형의 제1 중합체를(상기 기재된 바의) 중합체 PsAc로부터 제조한 후, 이 PsAcAr형의 중합체를 개질하여 PsAcArF형의 중합체를 얻을 수 있다. 우선 중합체 PsAc로부터 "PsAcF"형의 중합체를 제조한 후, 이 PsAcF형의 중합체를 개질하여 PsAcArF형의 중합체를 얻을 수도 있다(이 제2 개질에 사용된 방법은 PsAc형 중합체를 PsAcAr형 중합체로 개질하는 데에 사용된 것과 동일함).

이들 다양한 전략의 이점은 더 높은 수준의 Ar기 또는 더 높은 수준의 F기가 필요한지에 따라 치환도의 조정이 가능하다는 것이다.

하기 화학식 (I)을 참조하면:

중합체 PsAcF는 화학식 (I)(식 중, 일부 R₁, R₂ 및 R₃ 기는 수소 원자를 나타내고, 나머지 R₁, R₂ 및 R₃ 기는 카르복실산 작용기를 보유하는 기를 나타내며, R₁, R₂ 및 R₃ 기의 제3 및 마지막 일부는 (카르복실산기와는 상이한) 반응성 기를 나타냄)의 중합체이고; 중합체 PsAcArF는 화학식 (I)(식 중, 일부 R₁, R₂ 및 R₃ 기는 수소 원자를 나타내고, 나머지 R₁, R₂ 및 R₃ 기는 카르복실산기를 나타내며, 추가의 R₁, R₂ 및 R₃ 기는 방향족 기를 나타내며, R₁, R₂ 및 R₃ 기 중 제4 및 마지막 일부는 (카르복실산기와는 상이한) 반응성 기를 나타냄)의 중합체이다.

반응성 F기는 형태 -Y-Z'(식 중, Y는 결합기(상기와 동일한 의미)를 나타내고, Z'는 특히 하기에 더욱 상세히 설명되는 바의 포획 요소에 공유 결합 가능한 기를 나타냄)의 것이다. 바람직한 구체예에 따르면, 기 Z'는 폴리펩티드와의 공유 결합을 형성할 수 있다.

Y는 바람직하게는 형태 -X-CONH-(식 중, X는 Ac기와 관련하여 상기 제공된 것과 동일한 의미를 가짐(X는 바람직하게는 CH₂임))의 아미드기이다.

제1의 바람직한 구체예에 따르면, Z'기는 아지드기(특히 알킬아지드)이고, F기는 바람직하게는 형태 -X-CONH-X'-N₃(식 중, X 및 X'는 각각 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 치환 또는 비치환 알킬을 나타냄)의 기이며, F기는 따라서 예컨대-CH₂-CONH-(CH₂)₃-N₃ 기일 수 있다. 이러한 기는 중간 기로서 특히 유용하며, 이는 예컨대 트리아졸형의 기를 얻을 수 있게 한다(하기 제3 구체예 참조). 이들은 또한 특정 포획 요소에 결합할 수 있다.

제2의 바람직한 구체예에 따르면, Z'기는 히드라지드기이고, F기는 바람직하게는 형태 -X-CONH-NH₂(식 중, X는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 치환 또는 비치환 알킬쇄를 나타냄)의 기이며, F기는 따라서 예컨대 -CH₂-CONH-NH₂ 기일 수 있다. 이들 F기는 예컨대 펩티드의 알데히드 작용기에 결합할 수 있다. 이들은 또한 폴리펩티드의 흡착(비공유적 부동화)을 촉진할 수 있다.

제3의 바람직한 구체예에 따르면, Z'기는 바람직하게는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 1 이상의 직쇄형 또는 분지쇄형, 치환 또는 비치환 알킬쇄로 치환된 트리아졸기이고, F기는 따라서 예컨대 하기 화학식 (II)의 기일 수 있다:

식 중, R₄는 하기 화학식 (III)의 기를 나타낸다.

이러한 유형의 F기는 특정의 특별한 포획 요소에 결합할 수 있다. R₄가 -(CH₂)₃OH를 나타내는 화학식 (II)의 F기를 실시예에서 음전하 제어에 사용한다.

제4의 바람직한 구체예에 따르면, Z'기는 하기 화학식 (IV)의 것이다:

식 중, X'는 임의로 할로겐 치환기(특히 Cl 또는 Br)가 구비된, 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬쇄를 나타낸다. 바람직하게는, X'는 (CH₂)₂이다. 이 제4의 구체예에 따르면, F기는 따라서 바람직하게는 하기 화학식 (V)의 것이다:

식 중, X 및 X'는 상기 제공된 의미를 갖는다. 특히 바람직한 구체예에 따르면, X는 CH₂를 나타내고, X'는 (CH₂)₂를 나타낸다.

이 제4의 구체예에 상당하는 F기는 베타-아미노티올 또는 감마-아미노티올 작용기를 보유하는 분자, 예컨대 N-말단 위치에 시스테인 또는 호모시스테인을 갖는 폴리펩티와 반응하여 아미드 결합을 형성시킬 수 있다. 따라서, 이 제4의 구체예에 상당하는 결합 중합체는 N-말단 위치에 시스테인 또는 호모시스테인을 갖는 폴리펩티드에 의해 형성된 포획 요소에 결합할 수 있다.

따라서, 시스테인의 경우, 포획 요소에 결합된 F기가 하기 화학식 (V')의 것인 결합 중합체가 얻어진다:

상기 의미를 갖는 X 및 X' 및 Pep은 펩티드 분절, 즉 C-말단 작용기(예컨대 COOH 또는 CONH₂)가 구비된 1 이상의 아미노산 잔기(바람직하게는 연속적인 몇 개의 아미노산 잔기)를 포함하는 폴리펩티드의 일부를 나타낸다.

F기는 모두 동일할 수 있거나, 또는 상이한 F기의 그래프팅을 생각할 수 있다.

중합체 PsAc(중합체 PsAcAr 각각)의 Ac기의 일부를 개질하여 중합체 PsAcF(중합체 PsAcArF 각각)를 얻는 단계는 중합체 PsAc(중합체 PsAcAr 각각)를 유형 R-Z'(식 중, Z'는 상기와 동일한 의미를 가지며, R은 카르복실산 작용기와 반응성이 있는 작용기임)의 화합물을 반응시켜 실시할 수 있다. 바람직하게는, R은 Ac기와 아미드 결합을 형성할 수 있는 아민 작용기이다.

특정 F기는 우선 중간 반응성 F'기를 그래프팅한 후 F'기를 화학적으로 개질함으로써 그래프팅하여, 개별 반응 단계 후 F기'를 얻을 수 있다.

예컨대, -CH₂-CONH-NH₂형의 F기는 다당류 PsAc(또는 중합체 PsAcAr)를 (바람직하게는 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카르보디이미드의 존재 하에) 히드라진과 반응시켜 얻을 수 있다.

-CH₂-CONH-(CH₂)₃-N₃형의 F기는 다당류 PsAc(또는 중합체 PsAcAr)를 (바람직하게는 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카르보디이미드의 존재 하에) 3-아지도프로필암모늄 염산염과 반응시켜 얻을 수 있다.

상기 화학식 (II)의 F기는 -CH₂-CONH-(CH₂)₃-N₃형의 반응성 기가 구비된 중합체 PsAcF(또는 중합체 PsAcArF)를 (바람직하게는 구리(II) 이온 및 아스코르브산나트륨의 존재 하에) 하기 화학식 (VI)의 화합물과 반응시켜 얻을 수 있다:

이 경우, 모든 F기가 상기 화학식 (II)의 것이거나, 또는 F기의 일부가 상기 화학식 (II)의 것이고 F기의 일부가 -CH₂-CONH-(CH₂)₃-N₃형의 것(화학식 (VI)의 화합물로의 불완전 치환의 경우)인 중합체 PsAcF(또는 중합체 PsAcArF)가 얻어진다.

상기 화학식 (V)의 F기는 다당류 PsAc(또는 중합체 PsAcAr)를 (바람직하게는 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카르보디이미드의 존재 하에) 하기 화학식 (VII)의 화합물과 반응시켜 얻을 수 있다:

식 중, X'는 상기 제공된 의미를 갖는다. 화학식 (VII)의 화합물은 하기 제공된 실시예에 기재된 바와 같이 하여 제조할 수 있다.

일반적으로, Ac, Ar 및 F로의 치환도는 한편으로는 기의 그래프팅이 실시되는 순서(Ac 다음 Ar 다음 F 또는 Ac 다음 F 다음 Ar)에 따라 조정할 수 있고, 다른 한편으로는 그래프팅 조건, 특히 다당류와 해당 그래프팅 기의 그래프팅을 담당하는 시약 사이의 몰비를 적합화하여 조정할 수 있다.

덱스트란에서 유도된 중합체, 및 반응성 F기에 대한 설페이트 또는 설포네이트기를 갖는 상기 제공된 결합 중합체의 화학식에 상당하는 중합체 뿐 아니라, 치료 목적을 위한 이들 중합체의 용도도 문헌 WO 99/29734, WO 00/76452, WO 00/76562, WO 01/91742 및 FR 2891149에 기재되어 있다.

바람직하게는, 본 발명의 결합 중합체는 설페이트 또는 설포네이트 작용기를 갖지 않는다. 사실상, 이러한 작용기는 최적 검출에 상당히 많은 해로운 단백질과 상호 작용할 수 있다. 또한, 설페이트 또는 설포네이트 작용기의 부재는, 포획 교소가 그 자체로 설페이트화될 때(특히 올리고당류) 특히 유용하다.

표면의 작용화

(PsAcAr 또는 PsAcArF 형의) 본 발명에 따른 결합 중합체를 기재에 침착시켜 상기 기재의 표면을 작용화할 수 있다. 기재는 바람직하게는 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 및 폴리프로필렌에서 선택되는 플라스틱의 것(일반적으로 고온 및 감압 성형된 중합 성질의 고상 재료)이다.

따라서, 본 발명은 예컨대 투명 또는 불투명 플라스틱 슬라이드, 또는 폴리스티렌 미량 역가판(예컨대 96 웰), 비드(자기성 또는 비자기성), 폴리스티렌 배양판(예컨대 96 웰), 폴리스티렌 스트립 또는 막대의 표면을 작용화 가능하게 한다.

작용화는 일반적으로 하기의 두 단계를 포함한다: 기재의 표면 상에 결합 중합체를 고정하는 제1 단계, 및 결합 중합체 상에 포획 요소를 고정시키는 제2 단계. 대안적으로, 결합 중합체는 기재의 표면에 결합 중합체를 고정시키기 전에 포획 요소에 결합할 수 있다(특히 결합 중합체와 포획 요소 사이의 결합이 공유형일 때).

중합체 PsAcAr 또는 PsAcArF를 포함하는 용액 중에서 처리하고자 하는 표면을 침지하여 특히 편평한 표면에 대해 기재의 표면 상에의 결합 중합체의 고정을 실시한다. 액체를 담을 수 있는 성형 표면(예컨대 96 웰 적정판)에 대해, 간단한 충전에 의해 작용화를 실시할 수 있다. 후속 세정 및 건조를 일반적으로 생각할 수 있다. 일반적으로, 중합체 용액은 농도가 0.1 내지 50 ㎍/mL이고, 바람직하게는 1 내지 10 ㎍/mL이다.

임의의 이론에 구속시키려고 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 결합 중합체가 특히 Ar기를 통해 기재의 표면에 비공유적으로 고정(흡착)된다고 생각한다.

결합 중합체 상에 고정된 포획 요소는 임의로 개질 및/또는 공액된 폴리펩티드, 당류, 올리고당류 또는 리포다당류, 바이러스 또는 바이러스 분절 또는 심지어 세포일 수 있다. 예컨대, 포획 요소는 항체일 수 있다.

본 출원의 문맥에서 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 부착된 아미노산 잔기(그 수는 2 이상)의 임의의 사슬을 커버한다. 본 출원의 의미 내에서 "폴리펩티드"는 따라서 예컨대 이들 용어의 종래의 허용에 따른 올리고펩티드, 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 잔기는 단백질을 구성하는 아미노산 또는 단백질을 구성하지 않는 아미노산 잔기에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 이들은 20종의 단백질을 구성하는 아미노산 잔기에서 선택된다.

반응성 F기가 없는 결합 중합체가 사용되는 경우, 결합 중합체에의 포획 요소의 고정은 흡착에 의해 일어날 수 있다. 반응성 F기를 갖는 공유 결합의 확립에 의해 이것이 일어날 수도 있다. 반응성 F기에 의해 촉진된 흡착에 의해 이것이 일어날 수도 있다. 이는 예컨대 히드라지드형의 기에 의해 촉진된 항체의 흡착에 대한 경우이다.

몇 가지 부분을 포함하는 포획 요소를 생각해 볼 수도 있다. 예컨대 결합 중합체에 고정시킬 수 있는 중간 포획 요소(예컨대 폴리펩티드 또는 당류 화합물 또는 글리코펩티드), 및 중간 포획 요소에 결합할 수 있는 최종 포획 요소(예컨대 바이러스 또는 바이러스 분절 또는 세포)를 사용할 수 있다.

분석물 검출을 위한 장치가 하나의 분석물(또는 하나의 유형의 분석물)의 검출만을 위한 것일 경우, 기재의 전체 유용한 표면 상에 결합 중합체(및 포획 요소(들))를 침착시키는 것으로 충분하다.

분석물 검출을 위한 장치가 개별 포획 요소를 갖는 몇 개의 분석물의 검출을 위한 것일 경우, 몇 개의 개별 검출 구역이 제공되어야 한다. 96 웰 미량 역가판은 이 목적에 특히 유용한 기재의 예이다.

이 경우, 결합 중합체를 기재의 전체 유용한 표면 상에 증착시킬 수 있고, 그 다음 다양한 포획 요소를 (예컨대 기재의 정해진 위치에 포획 요소를 함유하는 다양한 용액을 몇 방울 침착시켜) 기재의 정해진 구역 상에 침착시킬 수 있거나; 또는 포획 요소에 결합된 다양한 결합 중합체의 용액을 (예컨대 미량 역가판의 웰 내) 기재의 정해진 구역에 직접 침착시킬 수 있거나; 또는 결합 중합체의 1 이상의 용액을 (예컨대 미량 역가판의 웰 내) 기재의 정해진 구역에 직접 침착시킨 후, 포획 요소를 함유하는 다양한 용액을 기재의 동일한 정해진 구역에 침착시킬 수 있다.

결합 중합체로 덮인 기재의 표면의 구역은 바람직하게는 친수성이며, 70° 이하, 바람직하게는 65° 이하, 이상적으로는 60° 이하의 물의 접촉각을 특징으로 한다. 결합 중합체로 덮인 기재의 표면의 친수성은 매우 많은 분석물(특히 단백질)과 기재의 비특이적 상호 작용을 최소화할 수 있게 한다. 이는 또한 바이오칩의 제조를 위한 나노 액적을 침착 가능하게 하는 반면, 이러한 유형의 침착은 미처리 플라스틱 기재에 직접 실시할 경우 재현성이 불량하고 복잡하다.

본 발명을 이용하여 검출할 수 있는 분석물은 모든 유형의 화학적 또는 생물학적 물질: 미네랄 입자, 유기 분자(특히 살충제 또는 다른 오염물), 바이오 분자(특히 당류 화합물, 폴리펩티드, 개질 또는 비개질된, 공액 또는 비공액의 것), 바이러스 또는 바이러스 분절, 세포 또는 유기체(단일 세포성 또는 다세포성)일 수 있다.

특히, 본 발명은 혈청형 구분, 항원 결정 인자의 스크리닝, 생물학적 매질 중의 단백질의 정량, 또는 리간드-수용체형의 펩티드 분자 사이의 비의 분석에 유용한, 폴리펩티드를 갖는 칩의 제조를 가능하게 한다.

일반적으로, 본 발명에 따른 검출 장치의 용도는 결합 중합체 및 포획 요소로 코팅된 기재 표면을 해당 분석물(예컨대 환경으로부터의 물의 샘플, 식료품의 샘플, 뇨, 혈액 또는 혈액 유도체 생성물과 같은 생물학적 샘플 등)을 포함할 수 있는 1 이상의 용액 또는 현탁액과 접촉시키는 것을 수반한다.

포획 요소에 특이적으로 고정될 수 있는 분석물의 검출은 예컨대 형광, 방사능 또는 화학 표지될 수 있고 본 발명에 따른 장치에 유지된 분석물에 결합할 수 있거나 조금 다른 방식으로 이와 반응할 수 있는 추적자 요소에 의해 실시할 수 있다. 그 다음, 본 발명에 따른 장치에 유지된 추적자 요소를 동정하고 형광 검출, 비색적 검출 또는 방사능 검출을 위한 장치에 의해 임의로 정량할 수 있다.

추적자 요소와 분석물 사이의 화학적 반응, 또는 (분석물에 고정된) 추적자 요소 및 추가의 시약 사이의 화학적 반응으로 인한 매질의 변화(예컨대 육안에 보이는 착색)에 대한 검출을 기초로 할 수도 있다.

예시로서, 추적자 요소는 착색된 생성물의 형성을 촉매화하는 효소를 포함할 수 있다. 이는 유지된 분석물에 결합할 수 있는 분자로 코팅된 비드를 포함할 수 있다. 분석물에 존재하는 항원에 부착할 수 있는 표지 항체(형광성 또는 방사성)을 이용할 수도 있다.

본 발명에 의해 가능해진 분석물의 검출 및 임의의 정량은 (인간 의학 또는 수의학을 위한) 의학 진단에서 특히 용도를 찾을 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명은 예시하지만 이를 한정하지 않는다. 덱스트란의 다당류 골격을 갖는 다양한 중합체를 하기 제공된 실시예에서 제조하였다:

- -CH₂COONa형의 Ac기를 포함하는 중합체 PsAc1;

- -CH₂COONa형의 Ac기 및 -CH₂CONHCH₂Ph형의 Ar기를 포함하는 중합체 PsAcAr1;

- -CH₂COONa형의 Ac기 및 -CH₂CONH(CH₂)₃N₃형의 F기를 포함하는 중합체 PsAcF1;

- -CH₂COONa형의 Ac기, -CH₂CONHCH₂Ph형의 Ar기 및 -CH₂CONHNH₂형의 F기를 포함하는 중합체 PsAcArF1;

- -CH₂COONa형의 Ac기, -CH₂CONHCH₂Ph형의 Ar기 및 -CH₂CONH(CH₂)₃N₃형의 F기를 포함하는 중합체 PsAcArF2;

- -CH₂COONa형의 Ac기 및 상기 화학식 (II)(R₄는 -(CH₂)₃OH를 나타냄)의 F기를 포함하는 중합체 PsAcF2;

- -CH₂COONa형의 Ac기 및 상기 화학식 (II)(R₄는 상기 화학식 (III)을 가짐)의 F기를 포함하는 중합체 PsAcF3;

- -CH₂COONa형의 Ac기, -CH₂CONHCH₂Ph형의 Ar기 및 상기 화학식 (II)(R₄는 -(CH₂)₃OH를 나타냄)의 F기를 포함하는 중합체 PsAcArF3;

- -CH₂COONa형의 Ac기, -CH₂CONHCH₂Ph형의 Ar기 및 상기 화학식 (II)(R₄는 상기 화학식 (III)을 가짐)의 F기를 포함하는 중합체 PsAcArF4;

- -CH₂COONa형의 Ac기, -CH₂CONHCH₂Ph형의 Ar기 및 상기 화학식 (V)(X는 CH₂를 나타내고, X'는 (CH₂)₂를 나타냄)의 F기를 포함하는 중합체 PsAcArF5.

형태 PsAc(x)는 x에 상당하는 Ac기로의 치환도를 포함하는 중합체를 지칭한다.

형태 PsAcAr(x; y)는 x에 상당하는 Ac 및 Ar 기로의 총 치환도 및 y에 상당하는 Ar기로의 치환도를 포함하는 중합체를 지칭한다.

형태 PsAcF(x; z)는 x에 상당하는 Ac 및 F 기로의 총 치환도 및 z에 상당하는 F기로의 치환도를 포함하는 중합체를 지칭한다.

형태 PsAcArF(x; y; z)는 x에 상당하는 Ac, Ar 및 F로의 총 치환도, y에 상당하는 Ar기로의 치환도, 및 z에 상당하는 F기로의 치환도를 포함하는 중합체를 지칭한다.

실시예 1 - 중합체 PsAc1 의 제조(일반적인 프로토콜)

덱스트란 T40(2 g, 11.1 mmol, 1 당량)을 6.4 mL의 탈이온수에 용해시켰다. 이소프로판올(36 mL)을 매우 격렬히 교반하면서 이 용액에 천천히 첨가한 후, 소다(2.4 g, 60 mmol, 5.4 당량)를 첨가하고, 반응 혼합물을 60℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 마지막으로, 모노클로로아세트산(3 g, 31.7 mmol)을 첨가한 후, 60℃에서 밤새 교반하였다. 얻어진 백색 페이스트를 회수하고, 메탄올로부터 3 회 침전시키고 원심 분리하였다. 얻어진 고체를 탈이온수에 용해시키고 동결 건조시켜 중합체 PsAc1을 얻었다. 통상적으로, 이 프로토콜로 1.2 내지 1.4의 Ac로의 치환도가 얻어졌다.

실시예 2 - 카르복실산기로의 치환도 측정

메틸카르복실레이트기로의 치환도의 측정을 가수 분해 후 ¹H NMR에 의해 실시하였다.

이를 위해, 생성물을 하기와 같이 가수 분해시켰다:

중합체 PsAc1(200 mg)을 2 mL의 D₂O에 용해시킨 후, 666 ㎕의 D₂SO₄를 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 4 시간 동안 90℃에서 가열하였다. 혼합물을 ¹H NMR 300 MHz에 의해 분석하였다.

치환도(DS)를 하기 식으로부터 계산하였다: DS=A/B, 여기서 A: (1/2)×4 내지 4.5 ppm 사이의 CH ₂CO₂H의 양성자의 신호의 적분값; B: 글루코오스 단위의 탄소 C₁에 의해 운반된 양성자의 적분값, 또는 (1/6)×3 내지 4 ppm 사이의 C_{2 -6}에 의해 운반된 양성자의 적분값.

실시예 3 - 중합체 PsAcAr1 의 제조

100 mg의 PsAc1(1.1)을 2 mL의 탈이온수에 용해시킨 후, pH를 1N HCl 용액으로 4.74로 조정하였다. 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노-에틸)카르보디이미드(CMC)(233 mg, 0.55 mmol, 1.1 당량)를 첨가한 후, pH를 1N HCl 용액으로 4.74로 조정하였다. 벤질아민을 첨가하고, 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 그 다음, 샘플을 70 시간 동안 2M NaCl 용액 중에서, 그 다음 100 시간 동안 탈이온수 중에서 투석하여 중합체 PsAcAr1을 얻었다.

실시예 4 - 방향족 기로의 치환도 측정

방향족 기로의 치환도를 하기 식을 이용하여 ¹H NMR 300 MHz 스펙트럼으로부터 계산하였다: DS=(B/A)/5, 여기서 A: C₁에 의해 운반된 양성자의 적분값; B: 페닐기로 인한 방향족 양성자의 적분값.

도 1은 CH₂CONHCH₂Ph 기로의 치환도(y)와 반응에 사용된 벤질아민 당량 수(이용 가능한 카르복실기로의 치환도에 대하여 0.3 당량, 0.6 당량, 1 당량, 2 당량, 5 당량 및 15 당량) 사이의 관계를 도시한다.

실시예 5 - 2-(3- 아지도프로필 )- 이소인돌 -1,3- 디온의 합성

N-(3-브로모프로필)프탈아미드(15 g, 56.02 mmol)를 200 mL의 디메틸포름아미드에 용해시킨 후, 질화나트륨을 첨가하였다(7.25 g, 112.05 mmol, 2 당량). 70℃에서 2 시간 동안 교반을 유지하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 증발시켜 건조시킨 후, 톨루엔으로 공증발시켜 미량의 디메틸포름아미드를 제거하였다. 얻어진 잔류물을 디에틸 에테르(15 mL)에 용해시키고, 유기상을 물(2×150 mL)로 세정하였다. 유기상을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시켜 2-(3-아지도프로필)-이소인돌-1,3-디온을 백색 분말(12.44 g, 54.1 mmol, 97%)의 형태로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 300 MHz): - ppm 7.78(m, 2H), 7.65(m, 2H), 3.72(t, 2H, J=6.9 Hz), 3.31(t, 2H, J=6.9 Hz), 1.90(tt, 2H, J=6.9 Hz).

¹³C NMR(75 MHz CDCl₃): - ppm 168.28, 134.04, 131.96, 123.31, 49.0, 35.35, 28.0; MALDI-TOF: M_계산치=230.08(C₁₁H₁₀N₄O₂), 실측치(m/z) 231.1 [M + H]⁺, 253.1 [M + Na]⁺.

실시예 6 - 3- 아지도프로필아민의 합성

2-(3-아지도프로필)-이소인돌-1,3-디온(3 g, 12 mmol)을 10 mL의 디클로로메탄에 용해시킨 후, 히드라진(9.6 mL, 32 mmol, 2.6 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반 하에서 가열하여 환류시켰다. 그 다음, 1 N의 염산 수용액(100 mL)을 첨가하였다. 유기상을 디캔팅한 후, 수상을 디클로로메탄(3×50 mL)으로 세정하였다. 수상의 pH를 포화 소다 용액으로 14로 조정하였다. 수상을 그 다음 디클로로메탄(3×40 mL)으로 추출하였다. 디클로로메탄 상을 합하고, 1N의 염산 수용액(3×50 mL)으로 추출하였다. 산성 수용액을 마지막으로 냉동시키고, 동결 건조시켰다. 3-아지도프로필암모늄 염산염을 백색 분말)의 형태로 얻었다(1.49 g, 10.97 mmol, 84%).

¹H NMR(D₂O, 300 MHz): - ppm 3.52(t, 2H, J=6.6 Hz), 3.11(t, 2H, J=7.2 Hz), 1.96(tt, 2H, J=6.6 Hz).

¹³C NMR(D₂O, 75 MHz): - ppm 39.02, 26.48, 15.67.

MALDI-TOF: M_계산치=100.07(C₃H₈N₄): 실측치 m/z 101.0 [M+H]⁺, 123.0 [M + Na]⁺, 139.0 [M + K]⁺, 107.1 [M+Li]⁺.

실시예 7 - 중합체 PsAcF1 의 제조

100 mg의 PsAc1 (1.4)를 2 mL의 탈이온수에 용해시킨 후, pH를 1N HCl 용액으로 4.74로 조정하였다. 그 다음, 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노-에틸)카르보디이미드(CMC)(296.5 mg, 0.7 mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, pH를 1N HCl 용액으로 4.74로 조정하였다. 염산염 형태의 3-아지도프로필아민을 첨가한 후, pH를 8.4로 조정하였다. 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 그 다음, 샘플을 70 시간 동안 2M NaCl 용액 중에서후, 그리고 100 시간 동안 탈이온수 중에서 투석하였다. 마지막으로, 이렇게 얻어진 생성물 PsAcF1을 냉동시키고, 동결 건조시켰다.

실시예 8 - 반응성 기로의 치환도 측정

아지드기로의 치환도를 하기 식으로부터 계산하였다: DS=(B/A)/2, 여기서 A: 탄소 C₁에 의해 운반된 양성자의 적분값; B: (3-아지도프로필아민의 양성자의 신호로 인한) 강자장의 양성자의 적분값.

도 2는 아지드기로의 치환도(y)와 이용 가능한 카르복실기로의 치환도에 대한 반응에 사용된 3-아지도프로필아민의 당량 수(Eq) 사이의 관계를 도시한다.

실시예 9 - 중합체 PsAc1 (1.15) 의 제조

90 mL의 이소프로판올을 격하게 교반하면서 16 mL의 물에 용해된 5 g(27.7 mmol, 1 당량)의 덱스트란 T40의 용액에 적가하였다. 6 g(150 mmol, 5.4 당량)의 소다를 반응 혼합물에 첨가한 후, 이를 1 시간 동안 60℃에서 교반하였다.

그 다음, 7.5 g(79.36 mmol, 2.8 당량)의 모노클로로아세트산을 이 혼합물에 첨가하였다. 그 다음, 60℃에서 밤새 교반하여 백색이 나는 페이스트가 얻어졌고, 이를 50 mL의 물에 용해시켰다. 그 다음, 생성물을 격하게 교반하면서 0℃로 냉각된 500 mL의 메탄올로부터 침전시켰다. 원심 분리(2500 r.p.m., 10 분, 4℃) 후 얻어진 펠렛을 최소량의 물에 용해시키고, 생성물을 500 mL의 메탄올로부터 2 회 침전시켰다. 제2 침전 후 얻어진 펠렛을 메탄올로 2 회 세정한 후, 최소량의 물에 용해시키고, 동결 건조시켰다. 치환도가 1.15인 3 g(15.7 mmol)의 PsAc1, 즉 PsAc1(1.15)이 얻어졌다.

실시예 10 - 중합체 PsAcAr1 (1.15; 0.64) 의 제조

9.4 mL의 물에 용해된 468 mg(2.44 mmol, 1 당량)의 PsAc1 (1.15)을 함유하는 용액의 pH를 1N 및 0.1N HCl을 첨가하여 4.74로 조정하였다. 1.187 g(2.806 mmol)의 CMC를 이 용액에 첨가하고, pH를 재차 4.74로 조정하였다. 266 ㎕(2.44 mmol, x에 대해 1 당량)의 벤질아민을 그 다음 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 상온에서 밤새 자기 교반기로 교반하였다. 용액의 최종 pH는 10.2였다.

그 다음, 3.5 L의 2M NaCl 용액에 침지하고 5 일 동안 유지시킨 후, 3.5 L의 물에 침지하고 또한 5 일 동안 유지시킨 반응 혼합물을 투석 관(3500 g/mol; 1 mL/cm)에 도입하였다.

그 다음, 백의 내용물을 포트에 넣고, 냉동시킨 후, 동결 건조시켰다. 477 mg(1.67 mmol)의 PsAcAr1 (1.15; 0.64)을 얻었다(벤질아미노기로의 치환도 0.64).

실시예 11 - 중합체 PsAcArF1 (1.15; 0.64; 0.26) 의 제조

2 mL의 물에 용해된 256 mg(0.895 mmol, 1 당량)의 PsAcAr1 (1.15; 0.64)을 함유하는 용액의 pH를 1N 및 0.1N HCl을 첨가하여 4.74로 조정하였다. 212.5 mg(0.502 mmol)의 CMC를 이 용액에 첨가하고, pH를 재차 4.74로 조정하였다. 870 ㎕(4.56 mmol)의 수중 24-26% 히드라진 용액을 그 다음 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 상온에서 밤새 자기 교반기로 교반하였다. 용액의 최종 pH는 10.28이었다.

3.5 L의 2M NaCl 용액에 침지하고 5 일 동안 유지시킨 후, 3.5 L의 물에 침지하고 또한 5 일 동안 유지시킨 반응 혼합물을 투석 관(3500 g/mol; 1 mL/cm)에 도입하였다.

그 다음, 백의 내용물을 포트에 넣고, 냉동시킨 후, 동결 건조시켰다. 235 mg(0.81 mmol)의 PsAcArF1 (1.15; 0.64; 0.26)을 이에 따라 얻었다(히드라진으로의 치환도 0.26).

실시예 12 - 중합체 PsAcAr1 (1.2; 0.49) 의 제조

10 mL의 탈이온수에 용해된 513.3 mg의 PsAc1 (1.2)의 용액의 pH를 1N 염산 용액으로 4.74로 조정하였다. N-시클로헥실-N'-(2-모르폴리노에틸)-카르보디이미드 메틸설포네이트(931.85 mg, 2.2 mmol, 1.1 당량)를 상온에서 첨가한 후, 용액의 pH를 동일한 방식으로 4.74로 조정하였다. 벤질아민(428.6 mg, 4.0 mmol, 2 당량)을 그 다음 적가하고, 용액을 16 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 3 일 동안 2M NaCl 용액 중에서, 그 다음 3 일 동안 탈이온수 중에서 투석에 의해 정제하였다. 동결 건조 후, PsAcAr1 (1.2; 0.49)을 비정질 백색 분말(벤질아미노기로의 치환도 0.49)의 형태로 얻었다.

¹H NMR(D₂O, 300 MHz): δ(ppm): 7.21(s, ls, H_ar), 5.09(s, ls, H_ano), 4.89(s, ls, H_ano), 4.53-3.39(m, ls).

실시예 13 - 중합체 PsAcF1(1.2; 0.38) 의 제조

513.3 mg의 PsAc1(1.2)을 10 mL의 탈이온수에 용해시켰다. 용액의 pH를 1N HCl 용액으로 4.74로 조정하였다. N-시클로헥실-N'-(2-모르폴리노에틸)-카르보디이미드 메틸설포네이트(931.85 mg, 2.2 mmol, 1.1 당량)를 용액에 첨가하고, pH를 재차 4.74로 조정하였다. 3-아지도프로필암모늄 염산염(819.5 mg, 6 mmol, 3 당량)을 반응 혼합물에 첨가한 후, pH를 1N Na₂CO₃ 용액으로 8.4로 조정하여다. 반응 혼합물을 16 시간 동안 상온에서 교반하였다. 미정제 생성물을 3 일 동안 2M NaCl 용액 중에서, 그 다음 3 일 동안 탈이온수 중에서 투석하였다. 동결 건조시켜 PsAcF1(1.2; 0.38)을 비정질 백색 분말(아지도기로의 치환도 0.38)의 형태로 얻었다.

¹H NMR(D₂O, 300 MHz): δ(ppm): 5.07(s, ls, H_ano), 4.88(s, ls, H_ano), 4.28-3.26(m, ls), 1.77(s, ls, CH₂).

실시예 14 - 중합체 PsAcArF2(1.2; 0.34; 0.38) 의 제조

5 mL의 탈이온수에 용해된 272.2 mg의 PsAcF1 (1.2; 0.38)의 용액을 1N HCl 용액으로 pH 4.74로 조정하였다. N-시클로헥실-N'-(2-모르폴리노에틸)-카르보디이미드 메틸설포네이트(372.8 mg, 0.88 mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, 반응 혼합물의 pH를 1N HCl 용액으로 재차 4.74로 조정하였다. 벤질아민(171.4 mg, 4.6 mmol, 2 당량)을 첨가하고, 용액을 18 시간 동안 상온에서 교반하였다. 2N NaCl 중에서 3 일 동안, 그 다음 탈이온수 중에서 3 일 동안 투석한 후, 동결 건조시켜 화합물 PsAcArF2(1.2; 0.34; 0.38)(벤질아미노기로의 치환도 0.34)를 얻었다.

¹H NMR(D₂O, 300 MHz): δ(ppm): 7.23(s, ls, H_ar), 5.05(s, ls, H_ano), 4.84(s, ls, H_ano), 4.33-3.26(m, ls), 1.68(s, ls, CH₂).

실시예 15 - 중합체 PsAcArF2(1.2; 0.49; 0.62) 의 제조

N-시클로헥실-N'-(2-모르폴리노에틸)-카르보디이미드 메틸설포네이트(372.7 mg, 0.88 mmol, 1.1 당량)를 pH=4.74에서 5 mL의 탈이온수 중 224.2 mg의 PsAcAr1(1.2; 0.49)의 용액에 첨가하였다. 용액의 pH를 1N HCl 용액으로 4.74로 조정한 후, 3-아지도프로필암모늄 염산염(327.8 mg, 2.4 mmol, 3 당량)을 첨가하였다. pH를 8.4로 조정한 후, 용액을 17 시간 동안 상온에서 교반하였다. 2N NaCl 중에서 3 일 동안, 그 다음 탈이온수 중에서 3 일 동안 투석하고, 마지막으로 동결 건조시켜 중합체 PsAcArF2(1.2; 0.49; 0.62)(아지드기로의 치환도 0.62)를 얻었다.

¹H NMR(D₂O, 300 MHz): δ(ppm): 7.23(s, ls, H_ar), 5.05(s, ls, H_ano), 4.84(s, ls, H_ano), 4.33-3.26(m, ls), 1.68(s, ls, CH₂).

실시예 16 - 펜트-4-이닐-α-D-글루코피라노시드의 합성

하기 화학식 (VIII)의 생성물은 하기와 같이 합성하였다:

D-(+)-글루코오스(360.3 mg, 2.0 mmol)를 4-펜틴-1-올(1.01 g, 12.0 mmol, 6.0 당량)에 첨가하고, 용액을 65℃로 가열하였다. 120 mg의 H₂SO₄-SiO₂를 첨가하고, 용액을 10 시간 동안 65℃에서 교반하였다. 용액을 상온으로 냉각시킨 후, 화합물을 용리액 혼합물로서 CH₂Cl₂에서 CH₂Cl₂-MeOH; 9:1의 구배로 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 원하는 생성물을 79%의 수율 및 1.6/1의 아노머 비 α/β로 무색 오일의 형태로 얻었다. 잔류물(405.0 mg, 1.63 mmol)을 상온에서 피리딘(5 mL) 및 아세트산 무수물(1.33 g, 13.0 mmol, 8 당량)에 용해시켰다.

DMAP(20 mg)를 그 다음 0℃에서 첨가하고, 반응 혼합물을 5 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 5 mL의 메탄올을 적가하여 중화시켰다. 용매를 감압 하에서 회전 증발기에서 제거하고, 잔류 용매를 톨루엔으로 3 회 공증발시켰다. 펜탄-EtOAc(8/2) 용리액 혼합물로의 실리카 겔 크로마토그래피에 의한 정제로 190 mg의 α 컨포메이션의 원하는 테트라아세틸화 생성물의 백색 결정 뿐 아니라 450 mg의 총 수율 98%에 상당하는 2 가지의 아노머의 혼합물을 얻었다.:

¹H NMR(D₂O, 300 MHz): δ(ppm): 5.47(dd, 1H, J=10.0, 9.6 Hz), 5.06(m, 2H), 4.87(dd, 1H, J=10.2, 3.7 Hz), 4.27(dd, 1H, J=12.3, 4.3 Hz), 4.07(m, 2H), 3.85(dt, 1H, J=9.9, 5.9 Hz), 3.54(dt, 1H, J=9.9, 6.1 Hz), 2.34(dt, 2H, 1H, J=6.8, 2.7 Hz), 2.10(s, 3H), 2.07(s, 3H), 2.03(s, 3H), 2.02(s, 3H), 1.97(t, 1H, J=2.6 Hz), 1.82(q, 2H, J=6.5 Hz).

¹³C NMR(D₂O, 75 MHz): δ(ppm): 170.9, 170.4, 170.3, 169.8, 96.1, 83.3, 71.0, 70.4, 69.4, 68.9, 68.7, 67.4, 66.9, 62.1, 28.4, 20.9, 20.9, 20.8, 20.8, 15.2. C₁₉H₂₆O₁₀에 대해 계산된 HRMS [M+Na]⁺: 437.5; 실측치 m/z: 437.1.

실시예 17 - 펜트 -4- 이닐 -α-D- 글루코피라노시드의 합성

하기 화학식 (IX)의 생성물은 하기 기재된 바와 같이 합성하였다:

메탄올 중 4 mL의 0.1M NaOMe를 3 mL의 메탄올에 용해된 실시예 16에서 얻어진 테트라아세틸화 화합물(180 mg, 0.434 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하고, 반응 혼합물을 4 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 그 다음 Dowex-50W 수지로 pH=7로 중화시켰다. 반응 혼합물을 그 다음 여과하고, 감압 하에서 증발시켜 건조시키고, 용리액으로서 CH₂Cl₂-MeOH; 9:1로 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 오일의 형태로 정량적 수율로 α-글루코오스의 유도체를 얻었다.

¹H NMR(D₂O, 300 MHz): δ(ppm): 5.12(d, 1H, J=3.9 Hz), 4.08(m, 2H), 4.00(m, 1H), 3.92(m, 2H), 3.82(m, 1H), 3.76(m, 1H), 3.62(m, 1H), 2.55(m, 3H), 2.03(m, 2H). ¹³C NMR(D₂O, 75 MHz): δ(ppm): 100.0, 87.0, 75.1, 73.6, 73.3, 71.6, 71.4, 68.2, 62.4, 29.3, 16.5. C₁₁H₁₈O₆에 대해 계산된 HRMS [M+Na]⁺: 269.1; 실측치 m/z: 269.0

실시예 18 -중합체 PsAcF2(1.2; 0.4) 의 제조

중합체 PsAcF1(1.2; 0.4)(24.8 mg) 및 4-펜틴-1-올(200 ㎕의 수중 92.5 mg/mL의 용액, 0.22 mmol, 2.2 당량)을 상온에서 150 ㎕의 탈이온수 중에서 교반하였다. 아스코르브산나트륨(50 ㎕의 수중 200 mg/mL의 새로 제조된 용액, 0.05 mmol, 0.5 당량), 및 오수화 황산구리(II)(50 ㎕의 수중 25 mg/mL의 용액, 0.005 mmol, 0.05 당량)를 그 다음 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 20 시간 동안 상온에서 혼합하였다. 반응 혼합물을 3일 동안 2M NaCl 중에서, 그 다음 3 일 동안 탈이온수 중에서 투석에 의한 정제 후 동결 건조시켜 중합체 PsAcF2 (1.2; 0.4)를 비정질 백색 분말의 형태로 얻었다. 트리아졸로의 치환도는 0.4였다(즉, 실질적으로 모든 반응성 Ar기가 전환됨).

¹H NMR(D₂O, 300 MHz): δ(ppm): 7.65(s, ls, H_트리아졸), 5.03(s, ls, H_ano), 4.85(s, ls, H_ano), 4.30-3.30(m, ls), 3.13(s, ls, CH₂), 2.61(s, ls, CH₂), 2.01(s, ls, CH₂), 1.75(s, ls, CH₂).

실시예 19 - 중합체 PsAcF3(1.2; 0.34) 의 제조

아스코르브산나트륨(50 ㎕의 수중 200 mg/mL의 새로 제조된 용액, 0.05 mmol, 0.5 당량), 그 다음 오수화된 황산구리(II)(50 ㎕의 수중 25 mg/mL의 용액, 0.005 mmol, 0.05 당량)를 상온에서 900 ㎕의 탈이온수 중 PsAcF1(1.2; 0.34)(24.8 mg) 및 펜트-4-이닐-α-D-글루코피라노시드(49.3 mg, 0.2 mmol, 2.0 당량)의 혼합물에 연속적으로 첨가하였다. 20 시간 후, 반응 혼합물을 3일 동안 2M NaCl 중에서, 그 다음 2 일 동안 탈이온수 중에서 투석에 의해 정제하였다. 중합체 PsAcF3 (1.2; 0.34)을 동결 건조 후 비정질 백색 분말의 형태로 얻었다. 트리아졸로의 치환도는 0.26이었다. 즉, 반응성 F기의 일부만이 전환되었다.

¹H NMR(D₂O, 300 MHz): δ(ppm): 7.74(s, ls, H_트리아졸), 5.06(s, ls, H_ano), 4.88(s, ls, H_ano), 4.78(s, ls, H_ano), 4.34-3.16(m, ls), 2.71(s, ls, CH₂), 2.05(s, ls, CH₂), 1.89(s, ls, CH₂).

실시예 20 - 중합체 PsAcArF3(1.2; 0.42; 0.38) 의 제조

아스코르브산나트륨(50 ㎕의 수중 200 mg/mL의 새로 제조된 용액, 0.05 mmol, 0.5 당량), 그 다음 오수화된 황산구리(II)(50 ㎕의 수중 25 mg/mL의 용액, 0.005 mmol, 0.05 당량)를 상온에서 700 ㎕의 탈이온수 중 PsAcF2(1.2; 0.42; 0.38)(28.7 mg) 및 4-펜틸-1-올(200 ㎕의 수중 92.5 mg/mL의 용액, 0.22 mmol, 2.2 당량)의 혼합물에 연속적으로 첨가하였다. 20 시간 후, 반응 혼합물을 3일 동안 2M NaCl 중에서, 그 다음 2 일 동안 탈이온수 중에서 투석에 의해 정제하였다. 중합체 PsAcF3(1.2; 0.42; 0.38)을 동결 건조 후 비정질 백색 분말의 형태로 얻었다. 트리아졸로의 치환도는 0.28이었다(반응성 F기의 전환도 74%).

¹H NMR(300 MHz, D₂O) δ(ppm): 7.62(s, ls, H_트리아졸), 7.21(s, ls, H_ar), 5.04(s, ls, H_ano), 4.89(s, ls, H_ano), 4.29-3.50(m, ls), 3.13(s, ls, CH₂), 2.58(s, ls, CH₂), 1.96(s, ls, CH₂), 1.73(s, ls, CH₂).

실시예 21 - 중합체 PsAcArF4(1.2; 0.42; 0.38) 의 제조

아스코르브산나트륨(100 ㎕의 PBS 중 200 mg/mL, 0.05 mmol, 1 당량)을 500 ㎕의 탈이온수 및 400 ㎕의 PBS 중 0.1 M의 PsAcArF2 (1.2; 0.42; 0.38)(28.7 mg) 및 펜트-4-이닐-α-D-글루코피라노시드(43.8 mg, 0.178 mmol, 1.8 당량)의 용액에 첨가하였다. 오수화된 황산구리(II)(100 ㎕의 PBS 중 25 mg/mL, 0.005 mmol, 0.1 당량)를 첨가하고, 반응 혼합물을 20 시간 동안 상온에서 교반하였다. 덱스트란을 0.5 M(2 mL)의 EDTA-2Na의 수용액에 취한 후, 3 일 동안 2M NaCl 용액 중에서, 그 다음 2 일 동안 탈이온수 중에서 투석에 의해 정제하였다. 동결 건조시켜 비정질 백색 분말 형태의 PsAcArF4 (1.2; 0.42; 0.38)를 얻었다. 트리아졸로의 치환도는 0.34였다(반응성 F기의 전환도 89%).

¹H NMR(300 MHz, D₂O) δ(ppm): 7.63(s, ls, H_트리아졸), 7.21(s, ls, H_ar), 5.00(s, ls, H_ano), 4.90(s, ls, H_ano), 4.85(s, ls, H_ano), 4.23-3.22(m, ls), 3.09(s, ls, CH₂), 2.64(s, ls, CH₂), 1.22(s, ls, CH₂), 1.19(s, ls, CH₂).

실시예 22 - 폴리스티렌 플레이트의 작용화 및 접촉각의 측정

사전에 물 및 에탄올로 세정한 폴리스티렌 플레이트(Goodfellow 플레이트, 10 cm×10 cm)를 10 ㎍/mL의 농도로 PBS 완충액 중 중합체의 용액에 또는 PBS(대조)에만 밤새 상온에서 반침지하였다(중합체의 형태당 하나의 플레이트). 시험한 중합체는 상기에 기재된 것들이고, 더욱 특히 PsAc1 (1.2), PsAcAr1 (1.2; 0.42), PsAcArF2(1.2; 0.42; 0.38) 및 PsAcArF4(1.2; 0.42; 0.27)(0.27의 값은 여기서는 트리아졸로의 치환도만을 나타냄)였다.

용액과 접촉된 폴리스티렌 표면을 그 다음 수조에 5 분 동안 2 회 침지시켰다. 이것을 그 다음 10 분 동안 질소 하에서 건조시켰다.

그 다음, 이들 표면을 접촉각의 측정에 사용하였다. 용액과 접촉하지 않은 기재의 구역을 대조로서 사용하였다.

10 개의 1 ㎕의 물방울을 처리 및 비처리(대조) 표면 중앙에 침착시켰다. 결과(각의 중앙 및 사분위수 범위)를 도 3에 도시한다.

다당류 PsAcAr1, PsAcArF2 및 PsAcArF4로의 폴리스티렌 표면의 처리로 비처리 폴리스티렌에 비해 물의 접촉각의 상당한 감소가 초래되었음을 알 수 있다. 이들 중합체는 따라서 폴리스티렌의 작용화를 가능하게 한다.

실시예 23 - 리간드를 갖는 96 웰 폴리스티렌 플레이트의 작용화

이 실시예에서는, 폴리스티렌 웰의 바닥을 PsAc, PsAcAr 또는 PsAcArF의 층으로 완전히 덮은 후, 리간드(렉틴)로 배양하였다. 그 다음, 단백질을 리간드로 작용화된 표면으로 배양하였다. 마지막으로, 형광 검출 시스템으로 표적 단백질을 포획한 웰을 동정할 수 있었다.

사용된 96 웰 플레이트는 제조자가 Nunc인 MaxiSorp Immunoplate형이었다.

1) PBS 중 100 ㎕의 중합체의 용액(pH=7.4)(50 ㎍/mL와 0.1 ㎍/mL 사이)을 상온에서 16 시간 동안 플레이트의 웰에 배양하였다.

2) 그 다음 웰을 3×5 분 동안 0.1%의 Tween 20을 함유하는 3×300 ㎕의 PBS(pH=7.4)로 세정하였다.

3) 그 다음 웰을 1 시간 동안 상온에서 BSA(3%, 1% 또는 0.1%) 또는 카제인(0.1%)을 함유하는 300 ㎕의 PBS(pH=7.4) Tween 20(0.1%)의 용액으로 배양하였다.

4) 웰을 3×5 분 동안 3×300 ㎕의 PBS(pH=7.4) Tween 20(0.1%)으로 세정하였다.

5) 그 다음 웰을 최종 농도 1 mM의 MnCl₂ 및 CaCl₂를 함유하는 PBS(pH=7.4) Tween 20(0.1%) 중 200 ㎕의 바이오티닐화 렉틴(예컨대 10 ㎍/mL, 5 ㎍/mL 또는 1 ㎍/mL)의 용액으로 배양하였다. 항온 처리는 교반 하에서 상온에서 1 시간 소요되었다.

하기 렉틴(상업적으로 입수 가능)을 사용하였다: 콘카나발린 A(ConA), 소맥 배아 응집소(WGA) 및 Erythrina cristagalli 렉틴(ECL).

ConA는 말단 알파-D-글루코오스 또는 알파-D-만노오스 잔기와 상호 작용하였다. WGA는 N-아세틸-D-글루코사민을 인지하였다. ECL은 말단 알파-D-갈락토오스 잔기를 인지하였다.

6) 웰을 3×5 분 동안 3×300 ㎕의 PBS(pH=7.4) Tween 20(0.1%)로 세정하였다.

7) 그 다음 웰을 상온에서 2 시간 동안 PBS(pH=7.4) Tween 20(0.1%) 중 200㎕의 테트라메틸로다민 표지 스트렙타비딘(5 ㎍/mL 또는 1 ㎍/mL)의 용액으로 배양하였다.

8) 웰을 3×5 분 동안 3×300 ㎕의 PBS(pH=7.4) Tween 20(0.1%)으로 세정하였다.

9) 웰을 3×5 분 동안 3×300 ㎕의 탈이온수로 세정하였다.

10) 플레이트를 10 분 동안 원심 분리로 건조시킨 후, 5 분 동안 질소 하에서 건조시켰다.

11) 웰의 바닥에서의 형광성을 공초점 형광 스캐너를 이용하여 532 nm에서 측정하였다.

결과를 도 4 및 5에 도시한다.

도 4는 중합체 PsAcArF4(1.2; 0.42, 0.34)(트리아졸 F기에 관해서만 치환도 0.34) 및 상기 언급한 세 가지 렉틴으로 얻어진 형광의 세기를 도시하는 막대 그래프이다. x 축에 나타난 비는 렉틴/스트렙타비딘 비이다.

PsAcArF4는 예상한 대로 ConA에 의해 선택적으로 인지되었음을 알 수 있으며, 이는 표적 단백질에 대한 리간드의 이용 가능성 및 폴리스티렌 플레이트의 작용화를 품질을 보여준다.

도 5는 동일한 중합체 PsAcArF4(1.2; 0.42, 0.34) 및 ConA로 얻어진 형광의 세기를 도시하는 막대 그래프이다. x 축 상에 나타난 비는 렉틴/스트렙타비딘 비이다. 마지막 결과(T)는 다당류가 없는 대조이다.

이 실험은 형광 신호 세기와 웰에 사용된 ConA의 농도 사이의 관계를 예시한다. ConA, 스트렙타비딘 또는 PsAcArF4를 받지 않은 웰과 관련된 형광성은 매우 낮았다.

실시예 24 - 다당류의 인쇄에 의한 96 웰 플레이트의 웰의 바닥에서의 마이크로도트의 형성, 렉틴과의 상호 작용

이 실험에서는, 다양한 중합체를 미처리 96 웰 플레이트의 바닥에 인쇄하였다.

이렇게 제조된 바이오칩을 그 다음 단백질(렉틴)로 배양하였다.

사용된 96 웰 플레이트는 제조자 Nunc로부터의 MaxiSorp Immunoplate형의 것이었다. 300 pL의 중합체 용액(농도 PBS 중 10 ㎍/mL, 7.5 ㎍/mL, 5 ㎍/mL 및 1 ㎍/mL)을 Packard BioChipArrayer BCA-1 장치를 이용하여 하기 배열로 플레이트 상에 침착시켰다:

중합체 PsAcArF4에 대해, 0.27의 치환도는 트리아졸기에만 해당한다. 중합체 PsAcArF3에 대해서는, 0.28의 치환도는 트리아졸기에만 해당된다.

1) 그 다음 웰을 상온에서 15 분 동안 BSA(3%)를 함유하는 100 ㎕의 PBS(pH=7.4) Tween 20(0.1%)의 용액으로 배양하였다.

2) 그 다음 웰을 3×5 분 동안 0.1%의 Tween 20을 함유하는 3×100 ㎕의 PBS(pH=7.4)로 세정하였다.

3) 그 다음 웰을 상온에서 1 시간 동안 궤도 교반 하에서 PBS(pH=7.4) Tween 20(0.1%) 중 100 ㎕의 바이오티닐화 렉틴(예컨대 20 ㎍/mL, 10 ㎍/mL 또는 5 ㎍/mL)의 용액으로 배양하였다. 렉틴(ConA, ECL 및 WGA)에 대해, MnCl₂ 및 CaCl₂의 염을 1 mM의 최종 농도로 첨가하였다.

4) 웰을 3×5 분 동안 3×100 ㎕의 PBS(pH=7.4) Tween 20(0.1%)으로 세정하였다.

5) 그 다음 웰을 상온에서 2 시간 동안 PBS(pH=7.4) Tween 20(0.1%) 중 100 ㎕의 스트렙타비딘 테트라메틸로다민(5 ㎍/mL)의 용액으로 배양하였다.

6) 웰을 3×5 분 동안 3×100 ㎕의 PBS(pH=7.4) Tween 20(0.1%)으로 세정하였다.

7) 웰을 3×5 분 동안 3×100 ㎕의 탈이온수로 세정하였다.

8) 플레이트를 10 분 동안 원심 분리로 건조시킨 후, 5 분 동안 질소 하에서 건조시켰다.

9) 532 nm에서 스캐너로 검출을 실시하였다.

도 6은 얻어진 결과를 정리한 것이다. ConA가 중합체 PsAcArF4에 선택적으로 고정되었고, 다른 두 가지 렉틴은 고정되지 않았음을 알 수 있다.

실시예 25 - 폴리스티렌 플레이트의 작용화 및 접촉각의 측정, 방향족 치환도의 영향

중합체 PsAc1(1.27), PsAcAr1(1.27; 0.03), PsAcAr1(1.27; 0.39) 및 PsAcAr1(1.27; 0.54)을 이 실험에 사용하였다.

사전에 물 및 에탄올로 세정한 5개의 폴리스티렌 플레이트(Goodfellow 플레이트, 10 cm×10 cm)를 10 ㎍/mL의 농도로 PBS 완충액에 용해된 PsAc1 또는 PsAcAr1의 용액에 또는 PBS에만 밤새 상온에서 반침지하였다.

용액과 접촉된 폴리스티렌 표면을 그 다음 수조에 5 분 동안 2 회 침지시켰다. 이것을 그 다음 10 분 동안 질소 하에서 건조시켰다.

그 다음, 이들 표면을 접촉각의 측정에 사용하였다. 용액과 접촉하지 않은 기재의 구역을 대조로서 사용하였다.

10 개의 1 ㎕의 물방울을 처리 및 비처리(대조) 표면 중앙에 침착시켰다.

결과(각의 중앙 및 사분위수 범위)를 도 7에 도시한다. 첫번째 막대는 즉시 측정의 결과이고, 두번째 막대는 부분 진공(데시케이터) 하에서 24 시간 동안 보관 후의 결과이다.

PsAcAr1 (1.27; 0.54)은 접촉각의 상당한 감소를 가능하게 함을 알 수 있으며, 이는 비처리 폴리스티렌에 대해 86°로부터 처리 폴리스티렌에 대해 56°로 감소하였다. PsAcAr1(1.27; 0.54)에 의해 폴리스티렌 표면에 그래프팅된 작용기는 표면을 더욱 친수성으로 만들며, 이는 비처리 폴리스티렌에 비해 이들 표면 상의 물의 접촉각의 감소에 반영된다. 중합체 PsAcAr1(1.27; 0.54)는 따라서 폴리스티렌의 화학적 작용화를 가능하게 한다.

실시예 26 - 96 웰 폴리스티렌 플레이트의 작용화 및 형광성 펩티드로의 히드라존 결찰

중합체 PsAcArF1(1.1; 0.75; 0.03) 및 PsAcAr 1(1.1; 0.75)을 이 실험에 사용하였다. 중합체 PsAcArF 1(1.1; 0.75; 0.03)은 히드라지드 작용기를 갖는 웰의 바닥을 작용화 가능하게 한다. 이 작용기를 보유하지 않는 중합체 PsAcAr1(1.1; 0.75)은 대조로서의 역할을 한다. 히드라지드 작용기는 알데히드 작용기를 보유하는 분자와 반응하는 것으로 공지되어 있다. 형성된 결합은 히드라존이었다. 반응의 원리는 하기와 같다:

두 가지 펩티드를 사용하였다: 화학식 Rho-KR-NH(CH₂)₃-NH-CHOCO(테트라메틸로다민 및 CHOCO 작용기로 작용화됨)의 펩티드 1(서열 번호 1) 및 화학식 Rho-KR-NH₂(테트라메틸로다민 및 아미드 작용기로 작용화됨)의 펩티드 2(서열 번호 2). 이들 펩티드의 합성은 Ollivier et al., Alpha-oxo semicarbazone peptide or oligodeoxynucleotide microarrays, Bioconjug. Chem. 14, 430-9(2003)에 기재되어 있다.

프로토콜:

96 웰 폴리스티렌 마이크로플레이트(Maxisorp, Nunc)의 웰을 PBS 중 5 ㎍/mL의 농도의 100 ㎕의 PsAcArF1(1.1; 0.75; 0.03) 또는 PsAcAr1(1.1; 0.75)의 용액으로 처리하였다. 처리는 밤새 교반 하에서 상온에서 실시하였다.

그 다음, 플레이트를 플레이트 워셔(300 ㎕/웰, 6 회 세정)를 이용하여 PBS/Tween 20-0.05%로 세정하였다.

펩티드 1 및 2의 용액의 두 가지 시리즈를 BSA의 아세테이트 완충액 pH 5.5/0.1% 중에 10^-6, 5×10^-7, 2.5×10^-7, 1.25×10^-7 및 6.25×10^-8 M의 농도로 제조하였다. 60 ㎕의 각각의 용액을 PsAcArF1 (1.1; 0.75; 0.03) 또는 PsAcAr1(1.1; 0.75)(2 웰/조건)로 처리된 웰의 바닥에 침착시켰다. 상온에서 2 시간 동안 교반하면서 결찰 반응을 실시하였다.

플레이트를 PBS/Tween 20(0.05%)(300 ㎕/웰, 6 회 세정)으로 세정한 후, 탈이온수(300 ㎕/웰, 3 회 세정)로 세정하였다. 그 다음 원심 분리로 건조를 실시하였다(2500 r.p.m., 5 분, 20℃). 그 다음, 플레이트를 Tecan 형광 스캐너로 판독하였다.

결과를 도 8에 도시한다. 회색 막대는 펩티드 1에 해당하고, 백색 막대는 펩티드 2에 해당한다. Cn은 상이한 농도의 PsAcArF1 (1.1; 0.75; 0.03)에 해당하고, C'n은 상이한 농도의 PsAcAr1 (1.1; 0.75)에 해당하며, 1=10^-6 M; 2=5×10^-7 M; 3=2.5×10^-7 M; 4=1.25×10^-7 M; 5=6.25×10 ^-8 M이다.

PsAcArF1(1.1; 0.75; 0.03)로 처리된 후 알데히드 펩티드 1로 배양된 웰과 관련된 신호의 세기(y 축)는 높았다(Cn, 펩티드 1). 비교로서, PsAcAr1 (1.1; 0.75)로 처리된 웰(펩티드 1의 알데히드 작용기에 대해 반응성이 있는 히드라지드 작용기를 갖지 않는 대조 웰)과 관련된 신호의 세기는 매우 낮았다(C'n, 펩티드 1).

모든 경우, 알데히드 작용기를 갖지 않는 대조 펩티드 2로 배양된 웰과 관련된 신호의 세기는 매우 낮았다(Cn 또는 C'n, 펩티드 2).

이 실시예는 PsAcArF1(1.1; 0.75; 0.03)로 처리되고 접근 가능한 히드라지드 작용기를 갖지 않는 웰에 대한 알데히드 펩티드 1의 화학 선택적 결합을 증명한다.

결찰 반응의 pH를 변화시켜 보충 실험을 실시하였다. 반응에 대한 바람직한 pH는 이러한 유형의 화학 반응에 대해 예상되는 바와 같이 5였다.

실시예 27 - 96 웰 폴리스티렌 플레이트의 작용화 , 펩티드의 인쇄 및 계내 반응에 의한 바이오칩의 제조

이 실험에서, 웰을 다당류 중합체로 작용화하였다. 펩티드를 인쇄하여 바이오칩을 형성시키고, 히드라존 공유 결합을 형성시켜 펩티드를 표면에 결합시켰다.

이 실험에 사용된 펩티드의 합성은 Carion et al., Chemical Micropatterning of Polycarbonate Site-Specific Peptide Immobilization and Biomolecular Interactions. Chembiochem 8, 315-322(2007)에 기재되어 있다.

사용된 펩티드는 하기와 같다:

- Ser-HA: H-SGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAS-NH₂(서열 번호 3);

- Ser-FLAG: H-SDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGGS-NH₂(서열 번호 4);

- -CHOCO-HA: CHOCO GYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAS-NH₂(서열 번호 5);

- -CHOCO-FLAG: CHOCO-DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGGS-NH₂(서열 번호 6).

프로토콜:

중합체 PsAcArF1(10 ㎍/mL), 중합체 PsAcAr1(10 ㎍/mL), PBS 완충액으로 작용화되거나 또는 미처리된 96 웰형의 플레이트에 pH 5.5에서 PBS 완충액 또는 아세테이트 완충액 중 10^-4 M의 농도로 펩티드 Ser-HA, CHOCO-HA, Ser-FLAG 및 CHOCO-FLAG를 인쇄하였다.

교반 하에서 30 분 동안 300 ㎕의 PBS+1%BSA로 웰의 포화를 실시하였다.

웰을 PBS/0.1% Tween 20으로 수동으로 세정하였다.

항-HA 및 항-FLAG 항체의 배양을 교반 하에서(100 ㎕/웰) 1.5 시간 동안 PBS/0.1%BSA 중 1 ㎍/mL의 농도로 실시하였다. 웰을 PBS/0.1% Tween 20으로 수동을 세정하였다.

테트라메틸로다민으로 표지된 항-IgG 뮤린 항체의 배양을 교반 하에서(100 ㎕/웰) PBS/0.1%BSA 중 2 ㎍/mL의 농도로 실시하였다.

웰을 PBS/0.1% Tween 20, 물로 3 회 수동으로 세정하고, 원심 분리(2500 r.p.m., 5 min, 20℃)에 의해 건조시켰다.

플레이트를 Tecan 스캐너(포커스 오프셋: -1,000/MTP 게인: 90/해상도: 4 ㎛)로 판독하였다.

항-HA 항체로의 배양의 결과를 도 9에 도시하고, 항-FLAG 항체로의 배양의 결과를 도 10(형광의 세기 y 축)에 도시한다.

실시예 28 - 비스({2-[트리페닐메틸)설파닐]에틸})아민의 제조

1.50 g의 비스(2-클로로에틸)아민(8.4 mmol) 및 4.65 g의 트리페닐메탄티올(2 당량, 16.80 mmol)을 플라스크에 도입하고, 불활성 분위기 하에 두었다. 25 mL의 무수 디메틸포름아미드(DMF)를 자기 교반 하에서 첨가하고, 반응 혼합물을 빙조에 냉각시켰다. 4 당량의 1,8-디아자비시클로[5,4,0]운덱-7-엔(DBU)을 혼합물에 적가하였다. 혼합물을 3 시간 동안 상온에서 교반하고, 박층 크로마토그래피(TLC)(용리액: 시클로헥산/아세트산에틸/트리에틸아민: 8/2/0.1)에 의해 반응을 모니터링하였다. 이 시간 후, 용매를 회전 증발기 내에서 증발시켰다. 얻어진 백색 고체를 그 다음 50 mL의 디클로로메탄(DCM)에 용해시키고, 생성물을 KH₂PO₄의 5% 수용액으로 3 회 추출하였다. 그 다음 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액: 시클로헥산/EtOAc/트리에틸아민(TEA): 8/2/0.1)에 의해 정제하여 1.46 g의 비정질 백색 고체를 얻었다(수율 28%).

생성물의 분석은 하기와 같다.

Rf=0.37(실리카 겔, 시클로헥산/EtOAc/TEA: 8/2/0.1).

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ 7.41-7.37(m, 12H, Trt), 7.15-7.29(m, 18H, Trt), 2.23-2.36(m, 8H, CH2), 1.26(s, 1H, NH).

¹³C(75 MHz, CDCl₃) 154.1; 129.8; 128.1; 126.9; 47.9; 32.6; MALDI-TOF: 243.1 [Trt⁺], 622.3 [M+H⁺]⁺, 644.3 [M⁺+Na⁺].

실시예 29 - Boc-βAla-N(CH ₂ CH ₂ STrt) ₂ 의 합성

Boc-β 알라닌(1.908 g, 10.1 mmol)을 50 mL의 디클로로메탄에 용해시킨 후, 용액을 0℃로 냉각시키고, N,N-디시클로헥실-카르보디이미드(5 mmol)를 첨가하였다. 상온에서 30 분 동안 교반을 유지하였다. 여과 후, 비스({2-(트리페닐메틸)설파닐]에틸})아민(2.5 g, 4 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시켜 건조시켰다. 100 mL의 수성 소다 용액(1 N)을 얻어진 잔류물에 첨가하고, 디클로로메탄(3×100 mL)으로 추출하였다. 유기상을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 증발시켰다. 미정제 생성물을 실리카겔 크로마토그래피(시클로헥산/아세트산에틸/트리에틸아민, 80/20/0.1, v/v/v)에 의해 정제하였다. 생성물 Boc-βAla-N(CH₂CH₂STrt)₂를 백색 분말의 형태로 얻었다(3.1 g, 3.9 mmol, 97%).

반응도는 하기와 같다:

융점: 53℃.

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ ppm 1.43(9 H, s, CH ₃); 1.94(2 H, t, J=4 Hz, CH ₂S); 2.14(2 H, t, J=4 Hz, CH ₂S); 2.31(2 H, t, J=4 Hz, CH ₂CON); 2.73(4 H, m, CONCH ₂); 3.23(2 H, m, OCONCH ₂); 5.23(H, m, CONH); 7.10-7.50(30 H_Ar, m).

¹³C NMR(75 MHz, CDCl₃): δ ppm 28.50(CH₃); 29.50(CH₂); 30.0(CH₂); 33.0(CH₂); 36.0(CH₂); 45.0(CH₂); 47.0(CH₂); 126.7(CH); 127.0(CH); 128.0(CH); 129.5(CH); 130.0(CH); 143.0(Cquat); 144.5(Cquat); 145.0(Cquat); 156.0(Cquat); 171.0(Cquat).

MALDI-TOF(DHB 매트릭스): Mcalc=792.3(C₅₀H₅₂N₂O₃S₂); m/z=815.4 [M + Na]⁺; m/z=831.3 [M+K]+.

실시예 30 - Boc-βAla-디티아제판의 합성

생성물 Boc-βAla-디티아제판(3 g, 3.78 mmol)을 디클로로메탄(50 mL)에 용해시키고, 요오드(2.87 g, 11.3 mmol)를 첨가하였다. 교반을 상온에서 30 분 동안 유지하였다. 과잉의 요오드를 티오황산나트륨의 수용액(3 M, 100 mL)으로 중화시켰다. 디클로로메탄(4×100 mL)으로 추출을 실시하였다. 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 증발시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸/트리에틸아민, 40/60/0.1, v/v/v)에 의해 정제하였다. 생성물 Boc-βAla- 디티아제판을 백색 페이스트의 형태로 얻었다(1.1 g, 3.6 mmol, 95%).

반응도는 하기와 같다:

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ ppm 1.39(9 H, s, CH ₃); 2.48(2 H, t, J=4 Hz, CH ₂CON); 2.87(2 H, t, J=4 Hz, CH ₂S); 3.04(2 H, t, J=4 Hz, CH ₂S); 3.39(2 H, m, OCONCH ₂); 3.76(2 H, t, J=4 Hz, CONCH ₂); 3.86(2 H, t, J=4 Hz, CONCH ₂); 5.25(H, m, NH).

¹³C NMR(75 MHz, CDCl₃): δ ppm 28.5(CH₃); 33.0(CH₂); 36.0(CH₂); 37.0(CH₂); 39.5(CH₂); 50.0(CH₂); 53.0(CH₂); 143.0(Cquat); 156.0(Cquat); 172.0(Cquat).

MALDI-TOF(DHB 매트릭스): Mcalc=306.1(C₁₂H₂₂N_2OS₂); m/z=307.1 [M + H]⁺; m/z=329.1 [M + Na]⁺; m/z=345.1 [M+K]⁺.

실시예 31 - NH ₂ -βAla-디티아제판의 합성

생성물 Boc-βAla-디티아제판(1 g, 3.26 mmol)을 디클로로메탄(5 mL)에 용해시키고, 트리플루오로아세트산(5 mL)을 첨가하였다. 교반을 상온에서 30 분 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 증발시켜 건조시켰다. 소다 수용액(1 N)을 얻어진 잔류물에 첨가하고, 디클로로메탄(3×100 mL)으로 추출하였다. 유기상을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 증발시켰다. 생성물 NH₂-βAla-디티아제판을 반투명 오일의 형태로 얻었다(628 mg, 3.04 mmol, 94%).

반응도는 하기와 같다:

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ ppm 2.44(2 H, t, J=4 Hz, CH ₂CON); 2.60(H, m, NH ₂); 2.90(2 H, t, J=4 Hz, NH₂CH ₂); 3.0(4 H, m, CH ₂S); 3.77(2 H, t, J=4 Hz, CONCH ₂); 3.84(2 H, t, J=4 Hz, CONCH ₂).

¹³C NMR(75 MHz, CDCl₃): δ ppm 35.0(CH₂); 35.5(CH₂); 37.5(CH₂); 39.0(CH₂); 50.0(CH₂); 52.0(CH₂); 172.0(Cquat).

MALDI-TOF(DHB 매트릭스): Mcalc=206.05(C7H14N2OS2); m/z=207.0 [M + H]⁺; m/z=229.0 [M + Na]⁺.

실시예 32 - 중합체 PsAcArF 5 의 합성

50 mg의 중합체 PsAcAr1 (1.1; 0.49)(0.20 mmol)을 플라스크 내 1 mL의 탈이온수에 용해시키고, pH를 1N HCl 용액으로 4.74로 조정하였다. 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노-에틸)카르보디이미드(CMC)(100 mg, 0.22 mmol, 1.1 당량)를 첨가한 후, pH를 4.74로 조정하였다. 아민 H₂N(CH₂)₂CON(CH₂CH₂S-)₂(75 mg, 0.36 mmol, 1.8 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다.

그 다음, 반응 혼합물을 투석관(3500 g/mol; 1 mL/cm)에 넣은 후, 2.5 L의 2M NaCl 용액에 침지시키고, 5 일 동안 유지시킨 후, 2.5 L의 물에 침지시키고, 또한 5 일 동안 유지시켰다.

백의 내용물을 포트에 넣어 동결 건조시켜 47 mg의 PsAcArF5를 얻었다. 반응도는 하기와 같다:

실시예 33 - 96 웰 폴리스티렌 플레이트의 화학적 작용화, 형광성 펩티드로의 아미드 결찰

중합체 PsAcAr1 및 PsAcArF5를 이 실시예에 사용하였다.

중합체 PsAcArF5는 CON(CH₂CH₂S-)₂ 작용기를 갖는 웰의 바닥을 작용화 가능하게 한다. 이 작용기를 보유하지 않는 중합체 PsAcAr1은 대조로서의 역할을 한다. CON(CH₂CH₂S-)₂ 작용기는 예컨대 펩티드의 N-말단 위치에 존재하는 시스테인과 같은 베타-아미노티올 작용기를 보유하는 분자와 반응할 수 있다. 형성된 결합의 형태는 아미드 결합이다.

중합체 PsAcArF5에 의한 부동화의 화학을 하기 도면에 도시한다:

두 가지 펩티드를 이 실시예에서 사용하였다:

1) H-CILK(로다민)EPVHGV-NH₂(서열 번호 7);

2) H-SILK(로다민)EPVHGV-NH₂(서열 번호 8).

이들 두 가지 펩티드는 하기 프로토콜에 따라 합성하였다:

펩티드 H-ILK(Mtt)E(tBu)PVH(Trt)GV-NH₂(서열 번호 9)를 마이크로파 펩티드 합성기(CEM) 및 Fmoc/tert-부틸 전략을 이용하여 Novasyn TGR® 수지(Novabiochem, 0.25 mmol, 0.23 mmol/g) 상에 어셈블링하였다. Mtt기의 탈보호를 CH₂Cl₂(17×15 mL) 중 1% TFA 용액으로 실시하였다. 수지를 CH₂Cl₂(5×2 분) 중 5% DIEA 용액으로 중화시킨 후, CH₂Cl₂(3×2 분)로 세정한 후, DMF(3×2 분)로 세정하였다. 그 다음 수지를 DMF 중 5(6)-카르복시테트라메틸로다민(150.6 mg, 0.35 mmol), HOBT(47 mg, 0.35 mmol), HBTU(132.7 mg, 0.35 mmol) 및 DIEA(217.8 ㎕, 1.75 mmol, 5 당량)와 2 시간 동안 반응시켰다. 그 다음 수지를 DMF(4×2 분)로 세정하였다. Fmoc 말단기를 DMF(5 및 15 분) 중 피페리딘의 20% 용액으로 탈보호하였다. 수지를 DMF(4×2 분)로 세정하였다. 수지를 두 부분으로 나누고, 각각 Fmoc-Cys(Trt)-OH 또는 Fmoc-Ser(tBu)-OH로 세정하였다. 4 당량의 보호된 아미노산, 4 당량의 HBUT 및 HOBT, 및 12 당량의 DIEA를 사용하여 수동으로 커플링을 실시하였다. 수지를 DMF(4×2 분)로 세정하였다. Fmoc 말단기를 DMF(5 및 5 분) 중 피페리딘의 20% 용액으로 탈보호하였다. 그 다음, 수지를 DMF(4×2 분), CH₂Cl₂(6×2 분), 에틸 에테르로 세정한 후, 감압 하에서 건조시켰다. 그 다음 펩티드의 탈보호 및 분할을 1 시간 동안 펩티드 1)의 부피에 대해 TFA/H₂O/EDT/TIS: 94/2.5/2.5/1의 용액으로, 그리고 펩티드 2)의 부피에 대해 TFA/H₂O/TIS: 95/2.5/2.5의 용액으로 실시하였다. 그 다음 펩티드를 Et₂O/n-헵탄 용액(부피로 1/1)으로부터 침전시키고, 물에 용해시키고, 동결 건조시켰다. RP-HPLC에 의해 정제를 실시하여 각각 펩티드 1) 및 2)에 대해 41 mg(20%) 및 28 mg(14%)을 얻었다.

MALDI-TOF(DHB 매트릭스) 펩티드 1): Mcalc=1505.7(C₇₄H₁₀₄N₁₆O₁₆S); m/z=1506.8 [M + H]⁺; m/z=1528.8 [M + Na]⁺.

MALDI-TOF(DHB 매트릭스) 펩티드 2): Mcalc=1488.7(C₇₅H₁₀₅N₁₅O₁₇); m/z=1489.7 [M + H]⁺; m/z=1511.7 [M + Na]⁺.

중합체 PsAcAr1 및 PsAcArF5를 교반 하에서(100 ㎕/웰) 상온에서 밤새 PBS 중 10 ㎍/mL의 농도로 96 웰 폴리스티렌 플레이트 내에서 배양하였다.

그 다음 웰을 PBS/0.1% Tween 20의 용액으로 6 회 세정하였다. 플레이트를 원심 분리로 건조시켰다.

펩티드 1) 및 2)를 200 mM의 머캅토페닐아세트산(MPAA) 및 80 mM의 트리스(카르복시에틸)포스핀의 존재 하에 pH 7.6에서 200 mM 인산염 완충액 중 10^-4 M의 농도로 용해시켰다. 이들 용액을 작용화된 웰 내에서 37℃에서 교반하면서(60 ㎕/웰) 10 분 동안 배양하였다.

그 다음, 웰을 PBS/0.1% Tween 20의 용액으로 6 회, 그리고 탈이온수로 3 회 세정하였다. 플레이트를 원심 분리(2500 r.p.m., 5 min, 20℃)로 건조시켰다. 플레이트를 Tecan 형광 스캐너에서 분석하였다.

결과를 도 11(y 축 형광 세기)에 도시한다. 이 실시예는 중합체 PsAcArF5에 의해 작용화된 폴리스티렌 플레이트의 웰이 시스테인 펩티드 1)을 결합시키고 대조인 세린 펩티드 2)를 결합시키지 않음을 증명한다. 두 가지 펩티드에 대해 대조 중합체 PsAcAr1로 얻은 매우 약한 신호는 시스테인 펩티드 1)의 결합을 위한 폴리스티렌 표면 상의 2,5-디티아제판 작용기를 갖는 것의 중요성을 보여준다.

실시예 34 - 96 웰 폴리스티렌 플레이트의 바닥에서의 항체로의 바이오칩의 제조

이 실시예에서는, 웰을 다당류에 의해 작용화한 후, 항체를 인쇄하여 바이오칩을 형성시켰다. 이들 단백질은 비공유 결합의 형성에 의해 표면에 결합한다. 그 다음, 바이오칩을 표적 단백질로 배양하였다.

96 웰 폴리스티렌 마이크로플레이트(Maxisorp, Nunc-Immuno Plate)의 8 웰을 완충액 중 10 ㎍/mL의 농도로 100 ㎕의 PsAcArF1 (1.15; 0.64; 0.26)로 처리하였다(조건 A). 8 웰을 완충액만으로 처리하였다(조건 B). 교반 하에서 상온에서 밤새 처리를 실시하였다.

그 다음 플레이트를 플레이트 워셔(200 ㎕/웰, 3 회 세정, 교반)를 이용하여 완충액으로 세정한 후, 플레이트 워셔(200 ㎕/웰, 3 회 세정, 교반를 이용하여 탈이온수로 세정하였다).

항-스트렙타비딘 항체(토끼 항-스트렙타비딘 다클론성 항체, Antibodies-on line, 참조 번호 ABIN107091)를 그 다음 완충액에 용해된 웰의 바닥에 인쇄하였다(웰당 3 스팟, 총 24 스팟에 대해 8 웰).

웰의 포화를 2 시간 동안 2%의 BSA를 포함하는 200 ㎕의 완충액으로 실시하였다.

0.05%의 Tween 20을 첨가하면서 완충액을 사용하여 자동 워셔(3 사이클, 교반)로 웰을 세정하였다.

그 다음, 스트렙타비딘-HRP(스트렙타비딘-HRP, 참조 번호 Thermo-Pierce 21130)를 1 시간 동안 Tween 20을 0.05%로 그리고 BSA를 0.2%로 첨가(100 ㎕/웰)하면서 완충액 중에 1:10,000 희석으로 배양하였다.

동일한 용액 중 1:6,000으로 희석된 대조 단백질인 염소 항-마우스 IgG HRP 컨쥬게이트, Southern Biotech, 참조 번호 103105으로 보충 실험을 실시하였다.

웰을 0.05%의 Tween 20을 함유하는 완충액으로 자동 워셔(3 사이클)로 세정하였다. 그 다음, 이를 상온에서 12 분 동안 TMB(3,3',5,5"-테트라메틸벤지딘)의 불용성 용액으로 배양하였다. 웰을 200 ㎕의 탈이온수로 세정하였다.

각각의 웰의 바닥의 이미지를 그레이 스케일 이미지의 생성을 가능하게 하는 CCD 카메라(해상도: 3 ㎛)를 이용하여 얻었다. 그 다음 스팟을 마이크로어레이의 정량을 위한 표준 소프트웨어에 의해 정량하였다.

스트렙타비딘-HRP로의 배양 후 모든 스팟에 대한 세기의 결과를 도 12에 도시한다(y 축 임의 단위의 세기; A: PsAcArF1(1.15; 0.64; 0.26)로 처리된 웰; B: 미처리된 대조 웰). 대조 단백질인 염소 항-마우스 IgG HRP 컨쥬게이트로의 배양은 임의의 검출 가능한 신호를 제공하지 않았다.

이 도면은 웰 A 내의 항-스트렙타비딘 항체의 스팟에 대해 얻어지 중간 세기가 웰 B보다 상당히 높음을 보여준다.

모든 스팟에 대한 중간 및 사분위수 편차를 갖는, 각각의 스팟(빈 원)에 대한 픽셀의 표준 편차의 결과를 도 13에 도시한다. 스팟팅의 품질을 특징화하는 스팟 내 이 표준 편차는 조건 B에 비해 조건 A에 대해 매우 많이 낮았다.

전체적으로, 이들 결과는 바이오칩의 제조를 위한 처리 A의 우수성을 보여준다.

Claims (22)

1. 기재에 비공유적으로 고정된 결합 중합체(bonding polymer)로 적어도 부분적으로 직접 덮인 플라스틱 기재를 포함하는, 분석물을 검출하기 위한 장치로서, 상기 결합 중합체는
   - 형태 -X-CONH-Z(식 중, X는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지쇄형, 치환 또는 비치환 알킬쇄를 나타내고, Z는 아릴 작용기를 나타냄)의 방향족 기; 및
   - 형태 -X-COOH(식 중, X는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지쇄형, 치환 또는 비치환 알킬쇄를 나타냄)의 카르복실산기
   가 구비된 다당류 골격을 포함하는 장치.
2. 제1항에 있어서, 다당류 골격은 분자량이 15,000 내지 100,000 Da인 덱스트란 골격인 것을 특징으로 하는 장치.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다당류 골격에는 반응성 F기가 추가로 구비되고, 상기 반응성 F기는 형태 -X-CONH-Z'(식 중, X는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지쇄형, 치환 또는 비치환 알킬쇄를 나타내고, Z'는 다른 분자에 결합할 수 있는 기를 나타냄)의 것인 것을 특징으로 하는 장치.
4. 제3항에 있어서, 반응성 F기는
   - 형태 -X-CONH-X'-N₃의 기;
   - 형태 -X-CONH-NH₂의 기;
   - 하기 화학식 (V)의 기:
   

   

   
   - 하기 화학식 (V')의 기:
   

   

   
   (식 중, X 및 X'는 각각 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 치환 또는 비치환 알킬쇄를 나타내고, Pep은 펩티드 분절을 나타냄)
   에서 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
5. 제1항에 있어서,
   - X는 CH₂이고; 및
   - Z는 -CH₂-Ph 또는 -CH₂-Ph-파라OH인 것을 특징으로 하는 장치.
6. 제1항에 있어서, 결합 중합체는
   - 다당류 골격의 당류 단위당 0.4 내지 0.8 개의 방향족 기;
   - 다당류 골격의 당류 단위당 0 내지 0.8 개의 반응성 기; 및
   - 다당류 골격의 당류 단위당 방향족 기, 카르복실산기 및 반응성 기 합하여 0.5 내지 1.5 개
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
7. 제1항에 있어서, 기재는 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 또는 폴리프로필렌의 기재인 것을 특징으로 하는 장치.
8. 제1항에 있어서, 결합 중합체 상에 부동화된 포획 요소(capturing element)를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
9. 제8항에 있어서, 포획 요소는
   - 폴리펩티드;
   - 당류, 올리고당류 및 리포다당류;
   - 바이러스 또는 바이러스 분절 및 세포;에서 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
10. 제1항에 있어서, 복수의 검출 구역을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
11. 제1항에 있어서, 기재는 불투명 또는 투명 슬라이드, 미량 역가판, 비드 수집물, 배양판, 스트립 또는 막대인 것을 특징으로 하는 장치.
12. 제1항에 따른 분석물을 검출하기 위한 장치를 사용하여 화학적 분자, 생물학적 분자, 세포 또는 유기체를 접촉시키는 단계를 포함하는, 화학적 분자, 생물학적 분자, 세포 또는 유기체를 검출하는 방법.
13. - 플라스틱 기재를 공급하는 단계; 및
    - 기재를, 결합 중합체를 포함하는 1 이상의 용액과 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 제1항에 따른 분석물을 검출하기 위한 장치의 제조 방법.
14. 제13항에 있어서, 기재를, 포획 요소를 포함하는 1 이상의 용액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. - 플라스틱 기재를 공급하는 단계; 및
    - 기재를, 포획 요소에 결합된 결합 중합체를 포함하는 1 이상의 용액과 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 제1항에 따른 분석물을 검출하기 위한 장치의 제조 방법.
16. - 형태 -X-CONH-Z(식 중, X는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지쇄형, 치환 또는 비치환 알킬쇄를 나타내고, Z는 아릴 작용기를 나타냄)의 당류 단위당 0.4 내지 0.8 개의 방향족 기;
    - 형태 -X-COOH(식 중, X는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬쇄를 나타냄)의 카르복실산기; 및
    - 반응성 F기;가 구비된 다당류 골격을 포함하며,
    상기 반응성 F기는:
    - 형태 -X-CONH-X'-N₃의 기;
    - 형태 -X-CONH-NH₂의 기;
    - 하기 화학식 (V)의 기:
    

    

    
    - 하기 화학식 (V')의 기:
    

    

    
    (식 중, X 및 X'는 각각 1 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 치환 또는 비치환 알킬쇄를 나타내고, Pep은 펩티드 분절을 나타냄)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제1항에 따른 장치에 사용할 수 있는 결합 중합체.
17. 제16항에 있어서, 다당류 골격은 덱스트란 골격인 것을 특징으로 하는 결합 중합체.
18. 제16항에 있어서,
    - X 또는 X'는 CH₂이고; 또는
    - X 또는 X'는 (CH₂)₂이고; 및
    - Z는 -CH₂-Ph 또는 -CH₂-Ph-파라OH인 것을 특징으로 하는 결합 중합체.
19. 제16항에 있어서,
    - 다당류 골격의 당류 단위당 0.4 내지 0.6 개의 방향족 기;
    - 다당류 골격의 당류 단위당 0 내지 0.8 개의 반응성 기;
    - 다당류 골격의 당류 단위당 방향족 기, 카르복실산기 및 반응성 기 합하여 0.5 내지 1.5 개를 포함하는 것을 특징으로 하는 결합 중합체.
20. - 덱스트란 다당류를 공급하는 단계;
    - 다당류 상에 카르복실산기를 그래프팅하는 단계;
    - 그래프팅된 카르복실산기의 일부를 개질하여 방향족 기를 공급하는 단계; 및
    - 카르복실산기의 일부를 개질하여 반응성 기를 공급하는 단계
    를 포함하는, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 결합 중합체의 제조 방법.
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