FR3106900A1 - Procédé de capture et d’identification d’agglutinats cellulaires pour la détection d’anticorps anti-érythrocytaires multiplexe - Google Patents
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Abstract
Procédé de capture et d’identification d’agglutinats cellulaire s pour la détection d’anticorps anti-érythrocytaires multiplexe La présente invention concerne un procédé in vitro de détection d’anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon, comprenant au moins les étapes suivantes : a) mettre en contact le dit échantillon avec un ou plusieurs érythrocyte(s) test(s) ou suspension d’érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu, dans des conditions susceptibles d’induire une hémagglutination, de sorte à obtenir un mélange réactionnel ; b) mettre en contact le dit mélange réactionnel avec un support solide contenant une pluralité de zones d’adsorption délimitées ayant préalablement fixé des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques présents sur les dits érythrocyte(s) test(s) ; c) déterminer la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur au moins l’une des dites zones d’adsorptions, de sorte à détecter la présence ou l’absence d’anticorps anti-érythrocytaires dans le dit échantillon ; les dites étapes a) et b) étant réalisées séparément ou simultanément. Figure pour l’abrégé : Néant
Description
La présente invention concerne le domaine des procédés de détection et de diagnosticin vitromettant notamment en œuvre des échantillons d’origine biologique. Les procédés plus particulièrement concernés ont trait à la détection d’anticorps anti-érythrocytaires participant à la détermination du groupe sanguin.
La détection d’anticorps anti-érythrocytaires dans des échantillons biologiques demeure d’une importance capitale, notamment en immunohématologie, dans le domaine de la transfusion sanguine, et tout particulièrement pour la détermination de groupes sanguins ou l’évaluation du risque chez le receveur.
La recherche d’anticorps anti-érythrocytaires englobe, en pratique clinique, un nombre important d’anticorps dits réguliers ou irréguliers, généralement dirigés contre des motifs antigéniques exprimés à la surface des cellules érythrocytaires.
Les antigènes liés au groupe sanguin ABO sont des motifs oligosaccharidiques. Le groupage ABO a ainsi pour but de déterminer quatre groupes sanguins selon la présence ou non de deux antigènes, A et B, à la surface des globules rouges. Chaque individu est alternativement du groupe A s’il possède le motif A, du groupe B s’il possède le motif B, du groupe AB s’il possède les motifs A et B, du groupe O s’il ne possède aucun des 2 motifs A ou B.
De plus, chaque patient possède dans son sérum ou plasma le ou les anticorps correspondant aux antigènes qu’il n’a pas (loi dite de “Landsteiner”). Un sujet de groupe A portant l’antigène A, dispose d’anticorps anti-B. Un sujet B portant l’antigène B, dispose d’anticorps anti-A. Un sujet AB portant les antigènes A et B, ne dispose pas d’anticorps anti-A ni anti-B. Un sujet de groupe O ne portant aucun antigène A ou B, dispose des anticorps anti-A et anti-B.
Les conséquences d’une détection erronée d’anticorps anti-érythrocytaires anti-A ou anti-B sont majeures, au même titre qu’une mauvaise définition du groupe ABO. En effet, si les anticorps anti-A (ou anti-B) du receveur se fixaient sur les antigènes A (ou B) des globules rouges du donneur, ils provoqueraient l’agglutination de ces cellules, voire leur destruction. Cette agglutination entraînerait l’échec de la transfusion, et dans certains cas, des réactions cliniques graves, voire dramatiques, pouvant conduire au décès du patient concerné. C’est pourquoi, lors d’une transfusion, la compatibilité entre groupes sanguins doit absolument être respectée.
Les exigences de fiabilité relatives à ce type de tests sont donc extrêmes. L’Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l'arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale, paru au Journal Officiel de la République Française (JORF), impose que la réalisation d’un groupage sanguin ABO repose sur deux épreuves complémentaires :
- une épreuve globulaire, dite deBeth-Vincent, consistant à rechercher les antigènes A (ABO1) et B (ABO2) avec les réactifs monoclonaux suivants : anti-A (anti-ABO1), anti-B (anti-ABO2) et anti-AB (anti-ABO3) ;
- une épreuve plasmatique (sérique), dite deSimoninouSimonin-Michon, consistant à rechercher les anticorps anti-A et anti-B avec les hématies-tests A1 et B, au moins l’une de ces hématies devant être de phénotype Rhésus (RH) négatif.
C’est la concordance de ces épreuves qui détermine le groupe ABO du patient.
D’autres anticorps anti-érythrocytaires sont également impliqués dans la sécurité transfusionnelle, ils reconnaissent: Rhésus, Kell, MNS, P, Lutheran, lewis, Duffy, Kidd, Diégo, Cartwright, Xg, Scianna, Dombrock, Colton, Landsteiner-Wiener, Chido/Rodgers, Hh, Kx, Gerbich, Cromer, Knops, Indian, OK, RAPH, John Milton Hagen, Li, Globoside, GIL, Rh-associated glycoprotein, Forssmann, JR, LAN, VEL, CD59.
En dehors de situations pathologiques, telles que des maladies auto-immunes, le sérum d’un individu peut contenir des anticorps dirigés contre un ou plusieurs des antigènes listés ci-dessus. Ces anticorps apparaissent à l’occasion d’une stimulation antigénique par des globules rouges étrangers, par exemple suite à une immunisation contre un ou plusieurs antigènes lors d’une transfusion sanguine ou encore lors d’une grossesse par réaction immunitaire maternelle dirigée contre les antigènes érythrocytaires fœtaux n’appartenant pas au groupe maternel, notamment lors de l’accouchement. Ces anticorps dits irréguliers (ou immuns) sont le plus souvent d’isotype IgG.
La recherche de ces anticorps dits irréguliers est appelée Recherche d’Agglutinines Irrégulières (RAI), test de Coombs indirect ou Test indirect à l’anti-globuline (TIA). Ces tests visent à détecter la présence d’anticorps dirigés contre des marqueurs érythrocytaires étrangers. Ces tests reposent sur l’agglutination d’hématies tests, dont les phénotypes sont connus, par le plasma du patient et après ajout d’anti-globuline humaine. De nombreux types de globules rouges sont alors utilisés dans les tests. La comparaison des résultats permettant de déduire la ou les spécificités des anticorps.
Dans un contexte transfusionnel, l’objectif sera d’attribuer aux patients les culots globulaires présentant la meilleure compatibilité.
La recherche d’anticorps anti-érythrocytaire en immunohématologie est basée sur l’agglutination d’hématies tests dont le phénotype est connu. Il existe un grand nombre de variantes de ces techniques. Elles peuvent être manuelles, sur plaque d’opaline, en tube ou en cupule de microplaque, en colonne de gel, ou complètement automatisées. Ces tests bien que très efficaces n’ont pas significativement évolué depuis 60 ans et présentent certaines limites:
- le résultat final correspond au cumul de plusieurs résultats uniques obtenus pour chaque anticorps testés, de nombreux tests doivent être répétés, ce qui demande une traçabilité exemplaire;
- la multiplication des tests entraîne un allongement des délais de résultats;
- la multiplication des tests demande d’avoir recours à des prises d’échantillons différentes, ce qui peut influencer sur la fiabilité du test et nécessite un volume important de sang, ce qui peut être problématique chez certains patients (par exemple les nourrissons et les patients fortement anémiés).
Pourtant, de nombreux laboratoires/sociétés ont essayé de miniaturiser et de combiner les tests à mettre en œuvre. Cependant, les résultats obtenus par ces techniques sont difficilement corrélables avec les techniques traditionnelles.
WO85/01354etWO02/16942enseignent une méthode de détection d’anticorps dans le sang, comprenant une étape d’adsorption d’un antigène sur une surface solide.
EP0223978A1enseigne un dispositif pour déterminer un groupe sanguin, constitué d’un substrat solide, et d’un ou plusieurs anticorps réactifs avec des déterminants antigéniques érythrocytaires.
US2007077605enseigne un dispositif optique de type bio-disque, adapté à la détermination d’un groupe sanguin.
WO2007/051844A1etWO2008148886A1enseignent des dispositifs ou procédés d’identification d’anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon, comprenant une mise en contact avec des groupes de billes, ou particules.
WO2009007649A1enseigne un dispositif pour déterminer un groupe sanguin, comprenant un support incluant une zone réactive constituée d’une membrane poreuse et d’une membrane absorbante.
WO2012010666enseigne un procédé de détection d’anticorps anti-érythrocytes, comprenant la mise en contact d’un échantillon avec des particules magnétiques portant lesdits érythrocytes.
WO2019158726A1enseigne un dispositif de détection, constitué d’un support et d’une membrane poreuse hydrophobe comprenant des billes complexées à un anticorps ou antigène.
Il subsiste un besoin de développer de nouveaux procédés pour la détection d’anticorps anti-érythrocytaires. En particulier, il subsiste un besoin de développer de nouveaux procédés qui demeurent applicables en clinique, en banques de sang et laboratoires d’analyses médicales.
Il demeure aussi un besoin de développer des procédés adaptables aux techniques haut-débit automatisées, plus particulièrement des procédés qui permettent la détection multiplexe d’anticorps anti-érythrocytaires.
Il demeure aussi un besoin de développer des procédés qui soient acceptables sur le plan réglementaire en biologie médicale, et tout particulièrement qui satisfassent les conditions d’une épreuve plasmatique de type «Simonin» ou RAI (Recherche d’Agglutinines Irrégulières).
L’invention vise précisément à répondre à l’ensemble de ces besoins.
Pour répondre à ces besoins, les inventeurs proposent de tirer parti du fait que les biopuces à anticorps puissent être mises à profit comme système de triage de cellules agglutinées.
En particulier, l’originalité de cette approche repose sur le fait que la capture, sur des dépôts d’anticorps, de cellules agglutinées, est apte à produire un signal plus intense et de morphologie différente que celui généré par des cellules non agglutinées.
Connaissant la nature des anticorps déposés, notamment d’anticorps monoclonaux, sur le support, ainsi que leur spécificité vis-à-vis des antigènes d’intérêt, les inventeurs ont pû déterminer les phénotypes cellulaires impliqués dans l’agglutination et donc la nature des anticorps initialement présents dans l’échantillon testé.
Cette technologie peut être avantageusement mise en œuvre dans le cadre de la recherche d’anticorps anti-érythrocytaires réguliers tels que des anticorps anti-groupe ABO, ou irréguliers. Cette application trouve un intérêt tout particulier pour la réalisation de l’épreuve plasmatique indirecte ou épreuve de Simonin et la réalisation d’une Recherche d’Agglutinines Irrégulières (RAI).
De manière surprenante, les inventeurs démontrent ainsi que ce procédé présente une fiabilité au moins comparable aux tests sur colonne de gel habituellement mis en œuvres en immuno-hématologie, tout en demeurant compatible avec des applications multiplexes.
De telles applications multiplexes peuvent comprendre ou consister, notamment, enla détection:
- de plusieurs types d’anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon;
- de plusieurs types d’anticorps anti-érythrocytaires dans plusieurs échantillons.
Avantageusement, ces applications peuvent donc permettre la détection simultanée de plusieurs paramètres, dans un ou plusieurs échantillons.
Ainsi, selon son aspect principal, la présente invention concerne un procédéin vitrode détection d’anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon, comprenant au moins les étapes suivantes :
a) mettre en contact le dit échantillon avec un ou plusieurs érythrocyte(s) test(s) ou suspension d’érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu, dans des conditions susceptibles d’induire une hémagglutination, de sorte à obtenir un mélange réactionnel ;
b) mettre en contact le dit mélange réactionnel avec un support solide contenant une pluralité de zones d’adsorption délimitées ayant préalablement fixé des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques présents sur les dits érythrocyte(s) test(s) ;
c) déterminer la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur au moins l’une des dites zones d’adsorptions, de sorte à détecter la présence ou l’absence d’anticorps anti-érythrocytaires dans le dit échantillon ;
les dites étapes a) et b) étant réalisées séparément ou simultanément.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques choisis parmi les systèmes ou antigènes suivants: ABO, Rhésus, Kell, MNS, P, Lutheran, lewis, Duffy, Kidd, Diégo, Cartwright, Xg, Scianna, Dombrock, Colton, Landsteiner-Wiener, Chido/Rodgers, Hh, Kx, Gerbich, Cromer, Knops, Indian, OK, RAPH, John Milton Hagen, Li, Globoside, GIL, Rh-associated glycoprotein, Forssmann, JR, LAN, VEL, CD59.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques du système ABO.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les dits anticorps ou fragments d’anticorps de la zone d’adsorption sont des anticorps monoclonaux ou polyclonaux choisis parmi : des anticorps anti-A (ABO1), des anticorps anti-B (ABO2), des anticorps anti-AB (ABO3), des anticorps anti-H (H1), des anticorps anti-D (RH1), des anticorps anti-C (RH2), des anticorps anti-c (RH4), des anticorps anti-E (RH3), des anticorps anti-e (RH5), des anticorps anti-K (KEL1), des anticorps anti-k (KEL2), des anticorps anti-Kpb (KEL4), des anticorps anti-Fya (FY1), des anticorps anti-Fyb (FY2), des anticorps anti-Jka (JK1), des anticorps anti-Jkb (JK2), des anticorps anti-S (MNS3), des anticorps anti-s (MNS4), des anticorps anti-Lea (LE1), des anticorps anti-Leb (LE2), des anticorps anti-M (MNS1), des anticorps anti-N (MNS2), des anticorps anti-P1, des anticorps anti-Kpa (KEL3), des anticorps anti-Lua (LU1), des anticorps anti-Lub (LU2), des anticorps anti-Cw (RH8).
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce qu’au moins deux des zones d’adsorption du support solide fixent chacune une pluralité d’anticorps et/ou fragment(s) d’anticorps apte(s) à lier un déterminant antigénique érythrocytaire distincts.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que l’échantillon est un échantillon biologique choisi parmi : un sérum humain, un plasma humain, un échantillon humain de sang total.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce qu’au moins deux des zones d’adsorption du support solide soient espacées entre elles d’au moins 100 µm, et/ou que les dites zones d’adsorption définissent une aire d’au moins 10000 µm2.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que le dit support solide est un support plastique, et les dites zones d’adsorption sont hydrophiles.
Selon certains modes de réalisation, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que la dite pluralité de zones d’absorption délimitées est plane, conique ou hémisphérique.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier les déterminants antigéniques sont fixés aux zones d’adsorption délimitées, de manière non-covalente.
Selon certains modes de réalisation particuliers, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un squelette polysaccharidique pourvu :
- de groupements aromatiques de la forme -X-CONH-Z, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et Z représente une fonction aryle ; et/ou
- de groupements acides carboxyliques de la forme -X-COOH, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone.
Selon certains modes de réalisation particuliers, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que le dit support solide est, au moins en partie, fonctionnalisé par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un ou plusieurs groupements chargés positivement au pH du dit mélange réactionnel.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur la dite, ou les dites, zone(s) d’adsorption(s) est déterminée par comparaison avec une zone de référence distincte de la dite, ou les dites, zone(s) du dit support solide.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que l’étape c) de détermination est réalisée après une étape de sédimentation du dit mélange réactionnel sur le dit support solide.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que l’étape c) de détermination est réalisée après une étape de centrifugation du dit support solide.
L’invention est décrite plus en détail ci-après.
Description des figures
Figure 1:illustration du principe général de l’invention, appliqué à la détermination d’anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon.
Figure 2:illustration d’un plan de biopuce/plaque, ou réseau de dépôts, incluant au fond de puits un ou plusieurs spots (ou zones d’adsorptions délimitées), constitués d’anticorps anti-ABO et 3 anti-D. Le spot A représente un dépôt d’anti-ABO1. Le spot B représente un dépôt d’anti-ABO2. Le spot D1 représente un dépôt d’anti D. Le spot D2 représente un dépôt d’anti D. Le spot D3 représente un dépôt d’anti D.
Figure 3: images photographiques du fond de puits en présence d’échantillons plasmatiques humains. En3A, résultat d’un test à partir d’un échantillon AB. En3B, résultat d’un test à partir d’un échantillon A. En3C, résultat d’un test à partir d’un échantillon B. En3D, résultat d’un test à partir d’un échantillon O.
Figure 4: images photographiques du fond de puits en présence d’échantillons plasmatiques humains. En4 A, résultat d’un test à partir d’un échantillon irrégulier négatif. En 4B, résultat d’un test à partir d’un échantillon irrégulier négatif. En4 C, résultat d’un test à partir d’un échantillon irrégulier positif. En 4D, résultat d’un test à partir d’un échantillon irrégulier positif.
Description détaillée
Le terme «pluralité», tel que «pluralité de zones d’adsorption», implique la présence d’«au moins deux»; ce terme peut donc, par exemple, désigner 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, voire plus de 10.
Les termes «érythrocyte», «hématie» ou «globule rouge» sont utilisés ici indifféremment.
Le terme «déterminant antigénique présent sur les érythrocytes» englobe non seulement tout déterminant antigénique présent de manière physiologique à la surface des érythrocytes, en particulier tout déterminant de groupe sanguin, mais aussi de tout autre déterminant présent à la surface des dits érythrocytes en particulier non-physiologique, et/ou résultant de réactions immunologiques, relevant de l’immunité innée ou acquise, telles que des anticorps, ou fragments d’anticorps, ou d’éléments appartenant au système du complément.
Le terme «échantillon», notamment employé pour désigner un échantillon biologique, englobe en particulier tout échantillon susceptible d’avoir été préalablement obtenu chez un individu, ce qui inclut tout fluide corporel ou fraction de fluide corporel, ou biopsie de tissu, qui soit susceptible d’inclure des érythrocytes et/ou des anticorps anti-érythrocytes, physiologiques ou pathologiques, réguliers ou irréguliers. Tout particulièrement, un «échantillon biologique» peut désigner ici tout échantillon de sang, ou culot d’échantillon de sang, et/ou toute autre préparation dérivée du sang, telle qu’un échantillon de sang total, le sérum ou le plasma, la lymphe ou le liquide céphalo-rachidien. Un échantillon est également susceptible d’inclure un échantillon de salive, de sueur, de larme, de lait ou d’urine.
Le terme «anticorpsou fragment d’anticorps» englobe l’ensemble des molécules de type immunoglobuline, ainsi que toute partie immunologiquement active des dites immunoglobulines, telles que les molécules contenant un ou plusieurs sites d’interaction à un antigène spécifique des dites immunoglobulines. A ce titre, ce terme n’est pas seulement limité aux anticorps entiers, réguliers (naturels) ou irréguliers, mais englobe également les fragments d’anticorps et leurs variants synthétiques ou recombinants. Sauf indication contraire, ce terme englobe donc à la fois les anticorps dits naturels et non-naturels, ou synthétiques, obtenus de manière recombinante ou non. Les anticorps sont classiquement définis par deux chaines lourdes reliées entre elles par un pont disulfure, et chaque chaine lourde est elle-même reliée à une chaine légère par un ou plusieurs ponts disulfures. Sauf indication contraire, ce terme englobe donc l’ensemble des anticorps, ou fragments des dits anticorps, comprenant l’une des cinq principales classes de chaîne lourde, choisies parmi les IgM, IgD, IgG, IgA et IgE; ou encore l’un des deux types de chaîne légère choisis parmi les chaînes lambda (1) et kappa (k).
Le terme «anticorps synthétique» englobe l’ensemble des anticorps obtenus in vitro et comprenant au moins un fragment d’une région variable d’anticorps. Les anticorps synthétiques peuvent ainsi être choisis parmi les constructions suivantes: Fab, a F(ab)’2, single domain antibody (sdAb), ScFv, Fab-scFv, ScFv-Fc, Sc(Fv)2, diabody, di-diabody, triabody, tetrabody, pentabody, unibody, minibody, maxibody, nanobody, Small Modular Immunopharmaceutical (SMIP), et les fragments comprenant des régions variables tels que chaînes variables légères (VL) et lourdes (HL).
Le terme «anticorps anti-érythrocytaire» ou «anticorps anti-érythrocyte» désigne ici tout anticorps, régulier ou irrégulier, dirigé contre au moins un déterminant antigénique présent sur les érythrocytes.
Le terme «anticorps régulier», ou «anticorps naturel», désigne ici tout anticorps anti-érythrocytaire susceptible d’être naturellement présent chez un individu, donc en dehors de toute pathologie et d’exposition à un antigène extérieur. Ce type d’anticorps englobe généralement l’ensemble des anticorps ABO (ex. anti-A et anti-B) et H.
Le terme «anticorps irrégulier», désigne ici tout anticorps anti-érythrocytes qui n'est pas systématiquement présent chez les sujets dépourvus de l'antigène correspondant. De manière générale, la plupart des anticorps non-ABO sont classiquement définis comme anticorps irréguliers, ce qui inclutnotamment les anticorps suivants:anti-D, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e, anti-K, anti-k,anti-Cw, anti-Kpa, anti-Kpb, anti-Fya, anti-Fyb, anti-Jka, anti-Jkb, anti-Lea, anti-Leb, anti-M, anti-N, anti-S, anti-s, anti-Lua, anti-Lub.
Le terme «hémagglutination» désigne, selon son sens usuel, l’ensemble des réactions d’agglutination comprenant la fixation d’anticorps anti-érythrocytaires sur des structures antigéniques présentes à la surface des globules rouges, et susceptibles d’entrainer, directement ou indirectement, la formation d’un agrégat d’hématies. Ce terme englobe donc à la fois les réactions d’hémagglutination directe, indirecte et passive.
Ainsi, selon son aspect principal, la présente invention concerne un procédéin vitrode détection d’anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon, comprenant au moins les étapes suivantes :
a) mettre en contact le dit échantillon avec un ou plusieurs érythrocyte(s) test(s) ou suspension d’érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu, dans des conditions susceptibles d’induire une hémagglutination, de sorte à obtenir un mélange réactionnel ;
b) mettre en contact le dit mélange réactionnel avec un support solide contenant une pluralité de zones d’adsorption délimitées ayant préalablement fixé des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques présents sur les dits érythrocyte(s) test(s) ;
c) déterminer la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur au moins l’une des dites zones d’adsorptions, de sorte à détecter la présence ou l’absence d’anticorps anti-érythrocytaires dans le dit échantillon ;
les dites étapes a) et b) étant réalisées séparément ou simultanément.
Selon un mode de réalisation, les étapes a) et b) sont réalisées séparément.
Selon un mode de réalisation, les étapes a) et b) sont réalisées simultanément.
Lorsque les étapes a) et b) sont réalisées simultanément, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes:
a) mettre en contact(i)un support solide contenant une pluralité de zones d’adsorption délimitées ayant préalablement fixé des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques présents sur des érythrocyte(s) test(s), avec(ii)un échantillon et(iii)un ou plusieurs des dits érythrocyte(s) test(s) ou suspension d’érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu, dans des conditions susceptibles d’induire une hémagglutination ; puis
b) déterminer la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur au moins l’une des dites zones d’adsorption, de sorte à détecter la présence ou l’absence d’anticorps anti-érythrocytaires dans le dit échantillon.
Le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont des anticorps réguliers ou irréguliers.
Ces anticorps sont susceptibles de lier spécifiquement des antigènes de surface des érythrocytes.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques choisis parmi les systèmes ou antigènes suivants : ABO, Rhésus, Kell, MNS, P, Lutheran, lewis, Duffy, Kidd, Diégo, Cartwright, Xg, Scianna, Dombrock, Colton, Landsteiner-Wiener, Chido/Rodgers, Hh, Kx, Gerbich, Cromer, Knops, Indian, OK, RAPH, John Milton Hagen, Li, Globoside, GIL, Rh-associated glycoprotein, Forssmann, JR, LAN, VEL, CD59.
Ainsi, les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter peuvent être aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques choisis parmi les systèmes ou antigènes ABO et Rhésus.
Préférentiellement, lesdits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques du système ABO.
Ainsi, les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter peuvent être des anticorps anti-A, des anticorps anti-B, ou des anticorps anti-H.
Tout particulièrement, les anticorps susceptibles d’être détectés sont des anticorps dits réguliers.
Selon certains modes de réalisation, les anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont choisis parmi les IgM, IgD, IgG, IgA et IgE; en particulier choisis parmi les IgM et IgG.
L'échantillon biologique peut être notamment tout échantillon susceptible de contenir des anticorps anti-érythrocytaires, et en particulier tout fluide biologique, tel qu'un échantillon de sang, notamment de sang total, ou de dérivé de sang, tel que le plasma ou le sérum, l’urine, le liquide céphalorachidien, la lymphe, la salive, ou un échantillon de tissu, tel qu'un tissu obtenu par biopsie, une cellule ou un ensemble de cellules, ou leurs combinaisons. Un dérivé de sang désigne tout produit, en particulier fluide, obtenu à partir d'un échantillon de sang.
L'échantillon à analyser peut également être un milieu de cultureet/ou un surnageant de culture. Avant d'être analysé, l'échantillon peut subir une ou plusieurs étapes préalables de traitement, tels que dilution, centrifugation, traitement thermiqueet/ou chimique, lyse cellulaire (par exemple par un ou plusieurs agents chaotropiques, un ou plusieurs agents réducteurset/ou par chauffage), extraction, ajout d'un ligand de détection non marqué ou leurs combinaisons.
L'échantillon peut également être un mélange d'au moins deux échantillons qui peuvent être de même nature ou de nature différente, issus d’un même individu ou d’individus différents.
A titre d'exemple de mélange d'échantillons de nature différente, on peut citer un mélange de sangetde sérum, un mélange de sangetde plasma, un mélange de sérumetde plasma, ou encore un mélange de sang, sérumetplasma.
Un échantillon préféré selon l'invention est un échantillon ou un mélange d'échantillons de sanget/ou dérivé du sang.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que l’échantillon est un échantillon biologique choisi parmi : un sérum humain, un plasma humain, un échantillon humain de sang total.
Lorsque le procédéin vitrode détection selon l’invention est mis en œuvre sous un format multiplexe, par exemple pour l’analyse (simultanée ou non) de plusieurs anticorps anti-érythrocytaires, celui-ci peut impliquer une étape de mise en contact d’un échantillon avec un ou plusieurs érythrocyte(s) test(s) ou suspension d’érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut ainsi être caractérisé en ce qu’il comprend au moins les étapes suivantes :
a) mettre en contact un échantillon avec un ou plusieurs érythrocyte(s) test(s) ou suspension d’érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu, dans des conditions susceptibles d’induire une hémagglutination, de sorte à obtenir un mélange réactionnel ;
b) mettre en contact le dit mélange réactionnel avec un support solide contenant une pluralité de zones d’adsorption délimitées ayant préalablement fixé des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques présents sur les dits érythrocyte(s) test(s) ;
c) déterminer la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur les zones d’adsorptions mises en contact avec le dit échantillon, de sorte à détecter la présence ou l’absence des anticorps anti-érythrocytaires dans le dit échantillon ;
les dites étapes a) et b) étant réalisées séparément ou simultanément.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur la dite, ou les dites, zone(s) d’adsorption(s) est déterminée par comparaison avec une zone de référence distincte du dit support solide. Selon certains modes de réalisation, la dite zone de référence distincte du dit support solide peut comprendre ou consister en une zone d’adsorption délimitée distincte, et/ou un compartiment distinct, et/ou un spot distinct.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que l’étape de détermination est réalisée après une étape de sédimentation du dit mélange réactionnel sur le dit support solide.
En particulier, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que l’étape de détermination est réalisée après une étape de centrifugation du dit support solide.
Les procédésin vitrode détection selon l’invention sont particulièrement adaptés à la mise en œuvre du test de Simonin, et notamment sous la forme de procédés multiplexes.
Selon ces modes de réalisation particuliers, les procédésin vitrode détection selon l’invention sont particulièrement adaptés à la détection d’anticorps anti-érythrocytaires, et notamment d’anticorps dirigés contre des déterminants antigéniques du système ABO.
Selon ces modes de réalisation particuliers, les anticorps fixés aux zones d’adsorption délimitées du support solide, sont notamment choisis parmi des anticorps anti-A (ABO1), des anticorps anti-B (ABO2), des anticorps anti-AB (ABO3); les érythrocytes-tests de phénotype connu, sont notamment choisis parmi des érythrocytes exprimant les déterminants antigéniques A1 et B.
En particulier, dans le cadre de la mise en œuvre du test de Simonin, le ou les dits érythrocyte(s)-test(s) sont de phénotype Rhésus connu ou déterminable.
Selon certains modes de réalisation, tout ou partie de ce ou ces érythrocyte(s) test(s) est de phénotype Rhésus négatif. Ainsi, selon certains de ces modes de réalisation, au moins l’un de ces érythrocyte(s) test(s) est de phénotype Rhésus (D) négatif.
Préférentiellement, dans le cadre de la mise en œuvre du test de Simonin, le support solide convenant à l’invention comprend au moins deux zones d’adsorption délimitées fixant chacune des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques d’érythrocytes distincts.
Des variantes du support solide susceptible d’être mis en œuvre dans les procédés de détection sont développées ci-après.
Un support solide convenant à la mise en œuvre d’un procédéin vitroselon l’invention contient une pluralité de zones d’adsorption délimitées, les dites zones d’adsorption fixant des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques d’érythrocytes.
Un support solide convenant tout particulièrement à l’invention est un support solide de type multiplexe, soit un support apte à détecter un ou plusieurs anticorps anti-érythrocytaires (par exemple deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, onze, douze, treize, quatorze, quinze ou plus de quinze), sur un ou plusieurs échantillons tels que décrits dans la présente demande, et ce de manière simultanée ou non, au cours d’un procédé d’analyse multiplexe.
Un tel support solide peut être notamment sous la forme d'une plaque, d'une microplaque, d'une lame, de billes, d'une membrane ou d’une barrette de plusieurs puits ou d’un seul puits. De préférence, un tel support solide peut être mis sous la forme d’une microplaque ou d’une barrette de plusieurs puits ou d’un puits seul.
Un support solide peut être en toute matière appropriée pour la mise en œuvre du procédé d'analyse, tel qu’un support plastique ou autre que plastique.
Un tel support solide est par exemple un support à base d'un polymère ou d'un mélange de polymères. Un support solide approprié selon l'invention est, par exemple, un support en polystyrène, polypropylène, poly(méth)acrylate, polybutadiène ou leurs combinaisons. De préférence, un support solide approprié est à base de polystyrène tels que : une microplaque sécable ou non de type COSTAR High binding, ou tout autre microplaque de polystyrène sécable ou non et présentant un haut pouvoir de fixation.
Un autre type de support solide approprié selon l'invention est par exemple un support inorganique, tel que le verre,et/ou un support métallique.
Un autre exemple de support solide approprié est une membrane, par exemple une membrane en nitrocellulose, PVDF (Polyfluorure de vinylidène), nylon ou leurs combinaisons.
Selon un mode de réalisation, un support solide convenant au procédé comprend un unique compartiment. Le dit compartiment unique peut être un compartiment comprenant une ou plusieurs parois. Alternativement, le dit compartiment unique peut être dépourvu de parois, et s'assimiler alors au support solide lui-même. Le fond du compartiment peut alors consister en la face supérieure du support solide. Un exemple d'un tel support solide comprenant un unique compartiment comportant ou non une ou plusieurs parois est une lame ou une membrane.
Alternativement, le dit compartiment unique peut être dépourvu de parois tout en étantséparé des autres compartiments par une zone qui permet d’éviter le mélange entre 2 échantillons adjacentspar exemple une zone hydrophobe.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention où un support solide (par exemple une lame ou une membrane) comprend un unique compartiment, typiquement, au moins un (par exemple un ou deux) support solide est utilisé par échantillon à analyser.
Selon un mode de réalisation, un support solide convenant au procédé comprend une pluralité de compartiments.
Lorsqu'un support solide comprend au moins deux compartiments, les dits compartiments peuvent être isolés les uns des autres, de sorte qu'ils ne communiquent pas entre eux, ou de manière limitée, c'est-à-dire de sorte que les différentes compositions ou solutions utilisées pour l'analyse ne puissent pas circuler d'un compartiment à un autre pendant l'analyse, ou tout du moins pas librement.
Ainsi, selon un mode de réalisation du dit support solide, une solution (par exemple un échantillon) ajoutée dans un compartiment ne va pas dans les autres compartiments, ou de manière limitée. Par exemple, le ou les compartiments comprennent ou sont constitués d'un fond et d'une ou plusieurs parois, la ou lesdites parois isolant le ou les compartiments les uns des autres de sorte qu'ils ne communiquent pas entre eux.
Un exemple de compartiment est un puits.
Un support solide comprend par exemple une pluralité de puits, soit par exemple un ensemble d’au moins 2 puits.
Un support solide est par exemple une microplaque.
La microplaque peut être une microplaque de 96 puits ou de 384 puits.
Un support solide convenant au procédé comprend une pluralité de zones d’adsorption délimitées. Les dites zones d’adsorption délimitées peuvent notamment comprendre, voire consister en, des spots.
Une zone d’adsorption délimitée n’est pas nécessairement d’une unique forme définie. A ce titre, une zone d’adsorption délimitée peut ainsi comprendre un ou plusieurs spots, espacés de manière régulière ou non, et comprenant au moins un anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques d’érythrocytes, lié à la surface dudit support, et/ou le cas échéant du dit compartiment, notamment par des interactions physico-chimiques non covalentes (en particulier de type liaisons faibles, par exemple, ioniques, van der Waals, hydrogène et/ou hydrophobe) et/ou par des liaisons covalentes.
De manière non-exhaustive, les zones d’adsorption délimitées du support solide, en particulier les dépôts d’anticorps ou fragments d’anticorps, peuvent être obtenus manuellement ou par tout dispositif, notamment tout dispositif apte à la préparation de microarrays, tel qu’un dispositif avec ou sans contact, en particulier tout dispositif permettant de déposer des volumes inférieurs au microlitre tels que des systèmes piézoélectrique ou électrovanne.
Le terme «spot» désigne ici une zone d’adsorption délimitée, ou une partie d’une zone d’adsorption délimitée du support solide, par exemple d’un compartiment du support solide, comprenant au moins le dit composé d'intérêt lié à la surface dudit support solide (voire, le cas échéant, du dit compartiment), notamment par des interactions physico-chimiques non covalentes (en particulier de type liaisons faibles, par exemple, ioniques, van der Waals, hydrogène et/ou hydrophobe) et/ou par des liaisons covalentes, généralement obtenus par le dépôt d'au moins une goutte d'une solution contenant une quantité déterminée dudit ou desdits composé(s) d'intérêt(s) à un endroit précis à la surface du dit support et/ou du dit compartiment.
Un spot peut être de forme discoïdale, cylindrique ou approximativement discoïdale ou cylindrique, par exemple ovale, en particulier lorsqu'un support solide est une microplaque ou une lame. Alternativement, un spot peut être de forme carrée ou rectangulaire (ce peut être en particulier une bande), par exemple lorsqu'un support solide est une membrane, ou de tout autre forme.
Un support solide peut ainsi comprendre au moins deux, voire trois, zones d’adsorption délimitées, par exemple trois zones, quatre zones ou cinq zones, ou au moins six zones.
Un support solide peut ainsi comprendre au moins trois spots, par exemple trois spots, quatre spots ou cinq spots, ou au moins six spots.
Selon un mode de réalisation, les dits anticorps ou fragments d’anticorps de la zone d’adsorption sont des anticorps monoclonaux ou polyclonaux choisis parmi : des anticorps anti-A (ABO1), des anticorps anti-B (ABO2), des anticorps anti-AB (ABO3), des anticorps anti-H (H1), des anticorps anti-D (RH1), des anticorps anti-C (RH2), des anticorps anti-c (RH4), des anticorps anti-E (RH3), des anticorps anti-e (RH5), des anticorps anti-K (KEL1), des anticorps anti-k (KEL2), des anticorps anti-Kpb (KEL4), des anticorps anti-Fya (FY1), des anticorps anti-Fyb (FY2), des anticorps anti-Jka (JK1), des anticorps anti-Jkb (JK2), des anticorps anti-S (MNS3), des anticorps anti-s (MNS4), des anticorps anti-Lea (LE1), des anticorps anti-Leb (LE2), des anticorps anti-M (MNS1), des anticorps anti-N (MNS2), des anticorps anti-P1, des anticorps anti-Kpa (KEL3), des anticorps anti-Lua (LU1), des anticorps anti-Lub (LU2), des anticorps anti-Cw (RH8).
Selon un mode de réalisation, les dits anticorps ou fragments d’anticorps de la zone d’adsorption sont des anticorps monoclonaux ou polyclonaux choisis parmi : des anticorps anti-A (ABO1), des anticorps anti-B (ABO2), des anticorps anti-AB (ABO3), des anticorps anti-D (RH1), des anticorps anti-C (RH2), des anticorps anti-c (RH4), des anticorps anti-E (RH3), des anticorps anti-e (RH5), des anticorps anti-K (KEL1), des anticorps anti-k (KEL2), des anticorps anti-Kpb (KEL4), des anticorps anti-Fya (FY1), des anticorps anti-Fyb (FY2), des anticorps anti-Jka (JK1), des anticorps anti-Jkb (JK2), des anticorps anti-S (MNS3), des anticorps anti-s (MNS4), des anticorps anti-Lea (LE1), des anticorps anti-Leb (LE2), des anticorps anti-M (MNS1), des anticorps anti-N (MNS2), des anticorps anti-P1, des anticorps anti-Kpa (KEL3), des anticorps anti-Lua (LU1), des anticorps anti-Lub (LU2), des anticorps anti-Cw (RH8).
De tels anticorps ou fragments d’anticorps de la zone d’adsorption sont par exemple des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, tels que ceux susceptibles d’être disponibles à la vente chez Diagast, Merck, Quotient ou Biorad, et choisis parmi :
- des anticorps monoclonaux anti-A (ABO1), des anticorps monoclonaux anti-B (ABO2), des anticorps monoclonaux anti-AB (ABO3) qui seraient des IgM murins,
- des anticorps monoclonaux anti-N (MNS2) qui seraient des IgG murins,
- des anticorps monoclonaux anti-D (RH1), des anticorps monoclonaux anti-C (RH2), des anticorps monoclonaux anti-c (RH4), des anticorps monoclonaux anti-E (RH3), des anticorps monoclonaux anti-e (RH5), des anticorps anti-Cw (RH8), des anticorps monoclonaux anti-K (KEL1) des anticorps monoclonaux anti-Jka (JK1), des anticorps monoclonaux anti-Jkb (JK2), des anticorps monoclonaux anti-S (MNS3), des anticorps monoclonaux anti-s (MNS4), des anticorps monoclonaux anti-P1qui seraient des IgM humains,
- des anticorps monoclonaux anti-D (RH1), des anticorps monoclonaux anti-k (KEL2), des anticorps monoclonaux anti-Fya (FY1), des anticorps monoclonaux anti-M (MNS1) qui seraient des IgG humains,
- des anticorps anti-Kpb (KEL4), des anticorps anti-Kpa (KEL3), des anticorps anti-Lua (LU1), des anticorps anti-Lub (LU2), des anticorps anti-Fyb (FY2), des anticorps anti-Lea (LE1), des anticorps anti-Leb (LE2).
Selon un mode de réalisation, au moins deux des zones d’adsorption du support solide fixent chacune une pluralité d’anticorps et/ou fragment(s) d’anticorps apte(s) à lier un déterminant antigénique érythrocytaire distinct.
Selon un mode de réalisation, au moins deux des zones d’adsorption délimitées (par exemple des spots) comprenant les dits anticorps ou fragments d’anticorps du support solide sont espacées entre elles d’au moins 100 µm, ce qui peut englober notamment au moins 200, 300, 400500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 µm.
Selon certains modes de réalisation, les dites zones d’adsorption définissent une aire d’au moins 10000 µm2, ce qui peut englober notamment au moins 100000, 20000, 30000, 40000, ou 50000 µm2.
Selon certains modes de réalisation, les dites zones d’adsorption comprennent ou consistent en des zones (notamment des spots) de 50 à 500 µm de dimension maximale (notamment de diamètre), ce qui comprend, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 µm.
Selon un mode de réalisation, au moins deux des zones d’adsorption du support solide soient espacées entre elles d’au moins 100 µm, et/ou que les dites zones d’adsorption définissent une aire d’au moins 10000 µm2.
Selon un mode de réalisation, les dites zones d’adsorption sont hydrophiles ou hydrophobes.
Selon un mode de réalisation, le dit support solide est un support plastique, et les dites zones d’adsorption sont hydrophiles.
Selon certains modes de réalisation, le procédéin vitrode détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que la dite pluralité de zones d’absorption délimitées est plane, conique ou hémisphérique.
Selon un mode de réalisation, les anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier les déterminants antigéniques sont fixés aux zones d’adsorption délimitées, de manière covalente.
Selon un mode de réalisation, les anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier les déterminants antigéniques sont fixés aux zones d’adsorption délimitées, de manière non-covalente.
Selon certains modes de réalisation particuliers, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison, le ou les dit(s) polymère(s) de liaison immobilisant les dits anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier les déterminants antigéniques.
Ainsi, selon certains modes de réalisation particuliers, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison, de manière covalente ou non-covalente.
De manière non-exhaustive, de tels polymères de liaison peuvent être par exemple être constitués de polymères de liaison mentionnés dansWO2012/052874.
Aussi, selon certains modes de réalisation, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un squelette polysaccharidique.
Le terme «squelette polysaccharidique» tel que défini ici englobe toute structure formée par un ensemble de sucres (ou unités saccharidiques), liés entre eux par des liaisons osidiques, en particulier O-osidiques.Ce squelette polysaccharidique peut notamment être linéaire ou ramifié. Selon certains modes de réalisation, il comprend de 80 à 600 unités saccharidiques, et en particulier de 150 à 350 unités saccharidiques.
Selon certains modes de réalisation, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un squelette polysaccharidique pourvu de groupements aromatiques et/ou de groupements acides carboxyliques, substitués ou non.
Selon certains modes de réalisation, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un squelette polysaccharidique pourvu :
- de groupements aromatiques de la forme -X-CONH-Z, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et Z représente une fonction aryle ; et/ou
- de groupements acides carboxyliques de la forme -X-COOH, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone.
Selon certains modes de réalisation particuliers, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison fixés au dit substrat (en particulier à la dite zone d’adsorption délimitée) de manière non-covalente, et comportant un squelette polysaccharidique pourvu :
- de groupements aromatiques de la forme -X-CONH-Z, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et Z représente une fonction aryle ; et/ou
- de groupements acides carboxyliques de la forme -X-COOH, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone.
Selon certains modes de réalisation particuliers, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison fixés au dit substrat (en particulier à la dite zone d’adsorption délimitée) de manière non-covalente, et comportant un squelette polysaccharidique pourvu :
- de groupements aromatiques de la forme -X-CONH-Z, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et Z représente une fonction aryle ; et/ou
- de groupements acides carboxyliques de la forme -X-COOH, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone; et
- le dit ou les dit(s) polymère(s) de liaison immobilisant les dits anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier les dits déterminants antigéniques.
Selon certains modes de réalisation, le dit support solide est, au moins en partie, fonctionnalisé par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un ou plusieurs groupements chargés positivement au pH du dit mélange réactionnel.
Exemple
de préparation des plaques et de mise en œuvre du procédé
pour l’épreuve de Simonin
Des anticorps anti-A (ABO1) et anti-B (ABO2) ont été déposés au fond des puits de plaques de microtitration pour former une pluralité de zones d’adsorption délimitées.
Les échantillons (plasmas humains) à tester sont mis en contact avec des hématies tests dans les puits. Les puits contenant les hématies tests et les échantillons sont alors centrifugés 2 min à 2000g. A l’issue de la centrifugation, le surnageant est retiré puis le fond des puits est imagé.
La présence ou l’absence d’agglutination pourra être détectée ou non au niveau de chaque dépôts d’anticorps par analyse visuelle ou par analyse d’image.
96 échantillons plasmatiques ont été testés dans le cadre de la détection d’anticorps anti ABO.
La simple analyse visuelle de la répartition des agglutinats sur les différents anticorps montre une corrélation de 100% avec les techniques standards.
Exemple
de préparation des plaques et de mise en œuvre du
procédé
pour la RAI
Trois anticorps anti-D différents ont été déposés au fond du puits de plaques de microtitration pour former une pluralité de zone d’adsorption délimitées. Les échantillons (plasma humains) à tester sont mis en contact avec une ou plusieurs hématies tests dans des puits de plaques source. Les puits contenant les hématies tests et les échantillons sont alors centrifugés 2 min à 800g.
A l’issue de la centrifugation, le surnageant est retiré, puis 2 lavages en PBS sont effectués.
A l’issue de la dernière centrifugation, le surnageant est retiré.
Le culot résultant est re-suspendu dans du tampon LISS. A ce mélange est ajouté de l’anti globuline humaine avant le dépot dans le puits de la biopuce.
Les puits sont alors centrifugés 2 minutes à 2000g.
A l’issue de la centrifugation, le surnageant est retiré, un lavage au PBS-Tween (PBST) est effectué puis le fond des puits est imagé.
32 échantillons plasmatiques ont été testés dans le cadre de la détection d’anticorps irrégulier.
La simple analyse visuelle de la séparation montre une corrélation de 87% avec les techniques standards.
Matériel & méthodes.
Fabrication des biopuces
Des anticorps anti-A (ABO1), anti-B (ABO2) et 3 anti-D, issus de milieux de cultures ont été préalablement purifiés. Chaque puit d’une plaque de microtitration préalablement fonctionnalisée a été imprimée avec ces anticorps dilués en tampon PBS.
Un robot de dépôt sans contact utilisant une technologie piézoélectrique) avec un système de dépôt générant des gouttes de 500pL est utilisé. Les plaques sont ensuite séchées à l’aide d’un thermo ventilateur 10 minutes à 80°C puis directement saturées par 200µL d’une solution de lait à 5% dans du PBS pendant1 heure à température ambiante. Les plaques sont ensuite lavées 3 fois avec 200µL de PBS.
Les puits sont finalement vidés, séchés 1h à 37°C avant d’être emballés et sellés en présence d’un sachet de desséchant dans un sac d’aluminium.
Le plan des biopuces fabriquées (ou réseau de dépôts) au fond de chaque puits des microplaques est présenté enfigure 2.
Détection d’anticorps réguliers dans des plasmas humains
Pour le test, 100µL de plasma humain non dilué sont mélangés à 50µL d’une suspension globulaire contenant 0,5% de globules issu d’un patient A (hématies tests A) et 0,5% de globules issu d’un patient B (hématies tests B). Le mélange est transféré dans un puits dans lequel des anticorps ont été préalablement déposés.
Les plaques sont centrifugées 2 minutes à 2000g à 4°C.
Le surnageant est éliminé puis une étape de lavage en PBS est effectuée. Les fonds des puits de la plaque de microtitration sont ensuite imagés.
Détection
d’anticorps irréguliers dans des plasmas humains
Pour le test, 50µL de plasma humain non dilué sont mélangés à 40µL d’hématies O test à 0,8%. Le mélange est incubé 15min à 37°C puis centrifugé 2min à 800g. Le surnageant est retiré. Deux fois successives, le culot est re-suspendu dans 100µL de PBS et centrifugé.
Après la dernière centrifugation, le surnageant est retiré et les hématies sont re-suspendues dans 60µL de tampon LISS, mélange auquel est additionné 60µL d’anti globuline humaine.
Ce mélange est déposé dans le puits de la biopuce qui est ensuite centrifugé 2min à 2000g.
Le surnageant est retiré, puis le puits est lavé par 200µL de PBST à 0,1%.
Les fonds des puits de la plaque de microtitration sont ensuite imagés.
Résultats
L’analyse visuelle des résultats est possible en observant les photos des fonds de puits (Figure 3). Des spots circulaires et homogènes sont observés au niveau de zones d’adsorption délimitées. Ils montrent l’absence d’agglutination. A l’opposé, la présence de larges agglutinats très supérieurs à la taille des dépôts d’origine et très inhomogènes indiquent une agglutination positive.
Lafigure 3Acorrespond à une photo de biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient AB. Des spots réguliers et homogènes sont observés sur les dépôts d’anti-A et d’anti B, indiquant l’absence d’agglutination.
Lafigure 3Bcorrespond à une photo de biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient A. Des spots réguliers et homogènes sont observés sur les dépôts d’anti-A et des spots irréguliers et très intenses sont observés sur les dépôts d’anti B. Ceci indique l’absence d’agglutination des hématies tests A mais une agglutination des hématies tests B.
Lafigure 3Ccorrespond à une photo de biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient B. Des spots réguliers et homogènes sont observés sur les dépôts d’anti-B et des
spots irréguliers et très intenses sont observés sur les dépôts d’anti-A. Ceci indique l’absence d’agglutination des hématies tests B mais une agglutination des hématies tests A.
Lafigure 3Dcorrespond à une biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient O. Seuls des spots irréguliers et très intenses sont observés, à la fois sur les dépôts d’anti-A mais aussi d’anti-B. Ceci indique l’agglutination des hématies tests A et B.
Cette analyse a été effectuée sur 23 échantillons plasmatiques congelés et a montré une efficacité de 100% sur les 96 échantillons testés.
Détection d’anticorps
ir
réguliers dans des plasmas humains
Résultats
L’analyse visuelle des résultats est possible en observant les photos des fonds des puits (Figure 4). Des spots circulaires et homogènes sont observés au niveau de zones d’adsorption délimitées. Ils montrent l’absence d’agglutination. A l’opposé, la présence de larges agglutinats très supérieurs à la taille des dépôts d’origine et très inhomogènes et plus intenses indiquent une agglutination positive.
Lafigure 4 Acorrespond à une photo de biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient ne possédant pas d’anticorps irrégulier. Des spots réguliers et homogènes sont observés sur les dépôts d’anti-D, indiquant l’absence d’agglutination.
Lafigure 4 Bcorrespond à une photo de biopuce incubée en présence d’un deuxième échantillon issu d’un patient ne possédant pas d’anticorps irrégulier. Des spots réguliers et homogènes sont observés sur les dépôts d’anti-D, indiquant l’absence d’agglutination.
Lafigure 4 Ccorrespond à une photo de biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient possédant des anticorps irréguliers anti-K. Des spots irréguliers et très intenses sont observés sur les dépôts d’anti-D. Ceci indique une agglutination des hématies tests et donc la présence d’anticorps irréguliers.
Lafigure 4 Dcorrespond à une photo de biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient possédant des anticorps irréguliers anti-D. Des spots irréguliers et très intenses sont observés sur les dépôts d’anti-D. Ceci indique une agglutination des hématies tests et donc la présence d’anticorps irréguliers.
Cette analyse a été effectuée sur 32 échantillons plasmatiques congelés et a montré une efficacité de 87% sur les 32 échantillons testés.
Claims (15)
- Procédéin vitrode détection d’anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon, comprenant au moins les étapes suivantes :
a) mettre en contact le dit échantillon avec un ou plusieurs érythrocyte(s) test(s) ou suspension d’érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu, dans des conditions susceptibles d’induire une hémagglutination, de sorte à obtenir un mélange réactionnel ;
b) mettre en contact le dit mélange réactionnel avec un support solide contenant une pluralité de zones d’adsorption délimitées ayant préalablement fixé des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques présents sur les dits érythrocyte(s) test(s) ;
c) déterminer la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur au moins l’une des dites zones d’adsorption, de sorte à détecter la présence ou l’absence d’anticorps anti-érythrocytaires dans le dit échantillon ;
les dites étapes a) et b) étant réalisées séparément ou simultanément. - Le procédéin vitrode détection selon la revendication 1, caractérisé en ce que les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques choisis parmi les systèmes ou antigènes suivants : ABO, Rhésus, Kell, MNS, P, Lutheran, lewis, Duffy, Kidd, Diégo, Cartwright, Xg, Scianna, Dombrock, Colton, Landsteiner-Wiener, Chido/Rodgers, Hh, Kx, Gerbich, Cromer, Knops, Indian, OK, RAPH, John Milton Hagen, Li, Globoside, GIL, Rh-associated glycoprotein, Forssmann, JR, LAN, VEL, CD59.
- Le procédéin vitrode détection selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques du système ABO.
- Le procédéin vitrode détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les dits anticorps ou fragments d’anticorps de la zone d’adsorption sont des anticorps monoclonaux ou polyclonaux choisis parmi : des anticorps anti-A (ABO1), des anticorps anti-B (ABO2), des anticorps anti-AB (ABO3), des anticorps anti-D (RH1), des anticorps anti-C (RH2), des anticorps anti-c (RH4), des anticorps anti-E (RH3), des anticorps anti-e (RH5), des anticorps anti-K (KEL1), des anticorps anti-k (KEL2), des anticorps anti-Kpb (KEL4), des anticorps anti-Fya (FY1), des anticorps anti-Fyb (FY2), des anticorps anti-Jka (JK1), des anticorps anti-Jkb (JK2), des anticorps anti-S (MNS3), des anticorps anti-s (MNS4), des anticorps anti-Lea (LE1), des anticorps anti-Leb (LE2), des anticorps anti-M (MNS1), des anticorps anti-N (MNS2), des anticorps anti-P1, des anticorps anti-Kpa (KEL3), des anticorps anti-Lua (LU1), des anticorps anti-Lub (LU2), des anticorps anti-Cw (RH8).
- Le procédéin vitrode détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’au moins deux des zones d’adsorption du support solide fixent chacune une pluralité d’anticorps et/ou fragment(s) d’anticorps apte(s) à lier un déterminant antigénique érythrocytaire distincts.
- Le procédéin vitrode détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’échantillon est un échantillon biologique choisi parmi : un sérum humain, un plasma humain, un échantillon humain de sang total.
- Le procédéin vitrode détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’au moins deux des zones d’adsorption du support solide soient espacées entre elles d’au moins 100 µm, et/ou que les dites zones d’adsorption définissent une aire d’au moins 10000 µm2.
- Le procédéin vitrode détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le dit support solide est un support plastique, et les dites zones d’adsorption sont hydrophiles.
- Le procédéin vitrode détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la dite pluralité de zones d’absorption délimitées forme une paroi inclinée par rapport au reste de toute ou partie du dit support solide.
- Le procédéin vitrode détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier les déterminants antigéniques sont fixés aux zones d’adsorption délimitées, de manière non-covalente.
- Le procédéin vitrode détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un squelette polysaccharidique pourvu :
- de groupementsaromatiquesde la forme -X-CONH-Z, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et Z représente une fonction aryle ;et/ou
- de groupementsacides carboxyliquesde la forme -X-COOH, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone. - Le procédéin vitrode détection selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le dit support solide est, au moins en partie, fonctionnalisé par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un ou plusieurs groupementschargés positivementau pH du dit mélange réactionnel.
- Le procédéin vitrode détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur la dite zone d’adsorption est déterminée par comparaison avec une zone de référence distincte du dit support solide.
- Le procédéin vitrode détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape c) de détermination est réalisée après une étape de sédimentation du dit mélange réactionnel sur le dit support solide.
- Le procédéin vitrode détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape c) de détermination est réalisée après une étape de centrifugation du dit support solide.
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