CH668650A5

CH668650A5 - Procede pour determiner la concentration d'ige specifique dans les serums humains.

Info

Publication number: CH668650A5
Application number: CH3048/86A
Authority: CH
Inventors: Lopez Jaime Sancho; Garea Jose Carreira; Campo Gloria Morago; Francisco Sanchez
Original assignee: Abello Alergia & Inmunologia
Priority date: 1985-07-31
Filing date: 1986-07-30
Publication date: 1989-01-13
Also published as: ES545787A0; PT83105A; FR2585837B1; IT1213466B; IT8621272A0; ES8606500A1; PT83105B; FR2585837A1

Description

DESCRIPTION

La présente invention concerne un procédé pour déterminer la concentration d'IgE spécifique dans les sérums humains.

Par (IgE spécifique) on désigne la fraction de molécules IgE du sérum qui identifie un antigène (ou allergène) déterminé.

L'obtention de lignes cellulaires capables de produire en permanence un anticorps spécifique contre un immunogène prédéfini a été décrite pour la première fois en 1875 (Koller & Mulstein, 1975). Cette méthode est basée sur la fusion entre cellules myélomateuses et des cellules de rate provenant d'animaux convenablement immunisés. Les hybrides résultants peuvent être sélectionnés de façon que ce soient les seules cellules qui se multiplient activement. De ces hybrides en croissance, on peut sélectionner des clones sécrétant l'anticorps souhaité. Ces anticorps sont donc d'origine monoclonale et peuvent se maintenir indéfiniment.

Cette méthodologie a été utilisée pour préparer des anticorps contre une grande variété d'antigènes comme produits naturels avec activité biologique, neuropeptides, hormones peptidiques, enzymes, Polysaccharides, glycoprotéines, lypo-polysaccharides, antigènes d'histocompatibilité, antigènes de différenciation et d'autres antigènes cellulaires, virus, etc. Ils sont aussi très utiles dans le champ du diagnostic.

La présente invention a pour but de proposer un procédé in vitro simple et fiable évitant les procédés in vivo tout en améliorant les procédés in vitro traditionnels.

Le procédé selon l'invention est caractérisé par la clause caractéristique de la revendication 1.

Dans la présente invention, on détaille la méthode d'évaluation de l'IgE spécifique. Pour cela, des antigènes obtenus par des techniques originales sont absorbés ou reliés d'une manière convalente à des puits de plaques de microtitulation ou une autre surface plastique, nitrocellulose, etc. Ensuite on ajoute l'échantillon de sérum puis, après une période d'incubation déterminée, l'IgE non spécifique est éliminée par des lavages successifs. L'IgE restant dans les puits (liée spécifiquement aux alergènes) est détectée en ajoutant l'anticorps monoclonal préalablement marqué avec un isotope radiactif ou une enzyme. Après une période d'incubation, l'excès d'anti-IgE est éliminé et on mesure la radiactivité ou l'activité enzymatique associée aux puits. On utilise donc des anticorps monoclonaux, fabriqués par les sollicitants, qui reconnaissent spécifiquement l'IgE sérique et ne reconnaissent pas d'autres immunoglobulines ou substances présentes dans le sérum ou plasma sanguin. L'originalité de l'invention réside dans le fait que les anticorps monoclonaux utilisés peuvent être considérés comme seuls dans le sens qu'ils n'existaient pas préalablement dans la nature, car ils sont produits par une cellule hybride artificiellement préparée au laboratoire à partir de deux cellules naturelles. Les produits synthétisés par les hybrides, anticorps monoclonaux qui reconnaissent l'IgE humaine, ne survivraient pas dans un milieu naturel et ne peuvent par conséquent être homologués aux anticorps poly-clonaux produits sur les animaux par des techniques standard, bien qu'ils conservent certaines de leurs propriétés.

Dans l'évaluation d'IgE spécifique in vitro, on a généralement utilisé des anticorps polyclonaux (Sepulveda y Co. Clin. Allerg. 9:359,1979) et la limitation principale de ces méthodes dans leur basse sensibilité comparé aux épreuves cutanées (Gleich et col., 1980, J. Alleg Clin Inmunol. 65:20). Un autre problème de l'utilisation des anticorps polyclonaux est que la fraction spécifique qui reconnaît l'antigène n'est que le 1-10% de la fraction y-globulinique totale. Cette limitation dans la quantité d'immunoglobuline spécifique n'existe pas dans les anticorps monoclonaux, car presque les 100% de la protéine sont spécifiques contre l'antigène. Par conséquent, si on utilise des anticorps polyclonaux, il y a beaucoup de possibilités de reactions croisées avec substances non spécifiques.

D'autres avantages des anticorps monoclonaux par rapport à ceux polyclonaux sont: la facilité de leur purification et le fait de pouvoir disposer de quantités illimitées de réactifs standardisés. On peut affirmer qu'une fois qu'une ligne cellulaire hybride (hybridome) a été établie, on peut préparer des quantités illimitées de l'anticorps monoclonal. Avec cela on garantit la disponibilité de réactifs avec des propriétés permanentes (homogénéité, spécifique et affinité) et l'on garantit l'obtention de résultats reproduisibles et par là même comparables entre différents laboratoires.

Quand on la compare aux méthodes in vitro connues, la nouvelle invention a l'avantage additionnel qu'il n'est pas nécessaire d'isoler et purifier l'IgE sérique (Galgre & Mils-tein) du moins dans les quantités ou proportions requises dans celles-là. On a besoin de beaucoup moins de temps pour obtenir des résultats fiables et il n'est pas besoin de centrifuger les échantillons dans les différentes phases de l'analyse.

La présence d'IgE spécifique dans le sérum peut être utilisée comme base pour le diagnostic de maladies alergiques qui se produisent par l'exposition ou le contact avec l'aler-gène. Pour cela il faut utiliser des extraits bien caractérisés biologique- et/ou immunochimiquement (Cerreira J. y col., Clin. Allergy, 14,503,1984; Corbi y Carreira, Int. Archs. Allergy appi. Immun. 76,156, 1985). Les extraits utilisés dans cette invention, bien que commercialement accessibles, sont s

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soumis dans tous les cas à un procès préalable de purification pour augmenter l'efficacité de la liaison, la reproduisibilité de la méthode et la corrélation avec les épreuves à vif. On y mesure l'activité biologique à vif, leur puissance alergénique in vitro et on identifie et évalue l'activité relative des différents composants de l'extrait (Standardization of allergen extracts, Alergia e Immunologia Abelló, S.A.).

Bien que le mécanisme par lequel se produit une union non covalente entre une protéine dans une solution aqueuse et le plastique est peu connu (Parsons, Methods of Enzymology, 73,224, 1981) l'union est extrêmement forte et, ce qui est plus important, l'activité biologique de l'échantillon se maintient. La plupart des auteurs sont d'accord que l'union des protéines aux superficies plastiques se produit par des interactions hydrofobiques non spécifiques. Il paraît que le seul réactif nécessaire pour la préparation des plastiques recouverts de protéine, est le plastique lui-même. Plusieurs auteurs (Catt y col., Science 158,1570,1967 ; Crosignani y col., J. Clin Endo-crinal Metab. 30,153, 1970) ont examiné l'effet de plusieurs paramètres dans l'union des anticorps au plastique et sont arrivés à la conclusion que la température, pH, force ionique n'influent pas forte mesure. Les demandeurs ont constaté que le polystyrène, polyéthylène, polypropilène ou polyvinyle peuvent être utilisés presque indistinctement. On peut utiliser des tubes en plastique, des plaques de titulation ou puits individuels de différentes formes et grandeurs.

Par ailleurs, les forces qui maintiennent les protéines unies a nitrocellulose sont peu connues mais il est très probable que les interactions hydrofobiques jouent un rôle très important.

Cependant et malgré ce qui précède la protéine adsorbée peut se détacher du plastique pendant les procès d'incubation et de lavage. Pour l'éviter, les antigènes peuvent être unis d'une façon covalente à la phase solide plastique par modification chimique de celle-ci.

La séparation de ce qui est uni au plastique de ce qui demeure libre en solution peut être réalisée par simple aspiration ou décantation. La reproduisibilité de la méthode augmente si au liquide de lavage on ajoute une protéine non rela-tionnée, par exemple albumine sérique et un détergent (Triton, Tween, etc.).

Le marcage des anticorps monoclonaux avec des isotopes radiactifs ou avec des enzymes, est réalisé par des procédés conventionnels, en sélectionnant par exemple: l25I (Fraker and Speck, Biochem. Biophys. Res. Commun 80,849) ou ß-galactosidase (O'Sullivan et Mark, Methods Enzymol, 74, 147, 1978).

Les procès de détermination de la radiactivité ou enzyme unie sont aussi réalisés par des méthodes conventionnelles en utilisant dans le premier cas des compteurs de radiations y, et dans le second il faut procéder à une incubation avec différents substrats enzymatiques, ce qui dépendra de la méthode de détection dont on dispose.

L'invention sera illustrée ci-après à l'aide des exemples suivants, qui devront être considérés comme explicatifs mais non pas limitatifs de celle-ci.

Exemple 1

Détermination de l'IgE spécifique contre antigènes présents dans les polens des plantes (L. Perence)

A) Préparation des anticorps monoclonaux:

On a injecté intrapéritonéellement 100 jag d'IgE purifiée à des souris en adjuvant complet de Freund les jours -45 et -30. Le jour -3, on leur injecta la même quantité d'IgE (e, K) dans 200 ]xl de tampon de phosphate salin (PBS) par voie intraveineuse. Le jour zéro, on a fusionné des cellules de myélome de souris avec les lymphocytes de rate des animaux immunisés en utilisant du polyéthylenglicol à 50%. Les cellules furent distribuées dans six plaques de puits et furent cultivées dans un milieu sélectif HAT.

B) Sélection:

Après deux semaines on a recueilli les surnageants de la culture et on a analysé la spécificité eventuelle contre IgE. Pour éviter la sélection d'hybridomes sécrétant des anticorps avec une spécificité contre les chaînes légères ou contre les déterminants idiotypiques on a utilisé une autre IgE de myélome différente (e, 1). Dans les clones positifs on a analysé la possible réactivité croisée avec IgE. Les hybridomes qui reconnaissaient IgE étaient clonés et sousclonés en agar miso-lide. Ceux qui reconnaissaient différents épitopes dans l'IgE furent cultivés en grande échelle pour les purifier et marquer.

C) Marcage : Après avoir purifié les anticorps monoclonaux par des méthodes standard, ils furent marqués avec l25I d'accord avec la méthode décrite par Fraker et Speck, 1978, Biochem., Biophys. Res. Commun. 80, 849. Dans d'autres cas ils étaient marqués enzymatiquement avec ß-galactosidase par la méthode de O'Sullivan et marks 1978, Methods in Enzymol, 74, 147.

D) Détermination d'IgE spécifique :

Les analyses ont été effectuées indistinctement en plaques de microtitulation de différentes tailles et matériau plastique, en tuyaux de plastique, ou en disques de nitrocellulose.

1. Les plaques en polystyrène furent nitrées puis réduites en vue d'obtenir des plaques stables en polyaminostyrène. On a rempli les puits d'une plaque modifiée avec 200 |j.l de l'antigène à 0,01% (p/v) en présence d'EDC à 0,1% (p/v) dans un tampon MES 0,25 M pH 6,0.

2. La protéine non unie a été retirée en aspirant ou en décantant le contenu des puits et en lavant avec une solution saline qui contenait de l'albumine sérique bovine à 1% (PBS-BSA).

3. Pour saturer les lieux de liaison encore libres, les puits ont été incubés avec du PBS-BSA pendant 1 heure à température ambiante.

4. Ensuite on a lavé les puits trois fois avec du PBS en présence de Twenn à 0,1% (PBS/Tween), en décantant soigneusement le liquide des puits à chaque pas.

5. On a ajouté a chaque puits 50-200 ul de sérum humain en solutions successives.

6. Dans d'autres puits on a ajouté des volumes similaires de sérum étalon préalablement calibré dans son contenu d'IgE spécifique.

7. Le contenu de ces puits a été incubé pendant 1-2 h à température ambiante.

8. On a lavé les puits trois fois de suite avec du PBS-Tween puis ils ont été incubés avec 50-200 jj.1 d'un des anticorps monoclonaux marqués comme indiqué sous C.

9. Le contenu des puits a été incubé comme indiqué au point 7.

10. Si l'anticorps monoclonal ajouté au point 8 avait été marqué avec 125I, dans ce point on procédait à couper les puits pour mesurer la radioactivité au compteur de rayonnement gamma.

Si l'anticorps monoclonal avait été marqué enzymatiquement à ce point on ajoutait le substrat enzymatique ONPG (3mM ortho-nitrofénil-B-D-galactopyranoside) en PBS contenant 10 mM MgCk et 0,1 mM 2-mercaptoetanol. Ensuite on incube le contenu des puits à 37 °C pendant 2 h. A ce moment, on procède à arrêter la réaction en ajoutant 100 p.1 de M Na2Œ>3 et l'on mesure l'absorbance à410 nm:

11. Les comptes par minute (cpm) ou l'absorbance obtenue dans les puits étalon a été représentée sur un diagramme (Voir graphique 1) sur lequel les ordonnées représentent cpm ou Abs 410 n, et les abscisses le logarithme de l'inverse de la dilution employée. Par ce diagramme on a s

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classé chaque échantillon en comparant ses cpm ou Abs 410 aux valeurs obtenues avec les sérums étalon.

Exemple 2

Détermination de d'IgE spécifique contre les antigènes présents sur les polens des plantes (L. pérennant)

A) Préparation des anticorps monoclonaux.

On a injecté intrapéritoinement 100 |ig d'IgE purifiée a des souris en adjuvant complet de Freund les jours -45 et -30. Le jour -3, on leur a injecté la même quantité d'IgE (E, K) de 200 ,ul de tampon phosphaté salin (PBS) par voie intraveineuse. Le jour zéro, on a fusionné les cellules de myélome de souris avec les lymphocites du rate des animaux immunisés, en utilisant du polyéthylenglicol à 50%. Les cellules furent distribuées en six plaques de puits et elles ont été cultivées dans un milieu sélectif HAT.

B) Sélection

Après deux semaines on recueillait les surnageants de la culture et on analysait la possible spécificité contre IgE. Pour é viter la sélection d'hybridomes qui sécréteraient des anticorps avec spécificité contre les chaînes légères ou contre des déterminants idiotypiques, on utilisa une autre IgE de myélome différent (E, I). Sur les clones positifs on analysa la possible réactivité croisée avec IgE. Les hybridomes que l'on reconnaissait IgE étaient clonés et sous-clonés en agar miso-lide: Ceux qui reconnaissaient différents épitopes dans l'IgE furent cultivés en grande échelle pour les purifier et marquer.

C) Marcage: après avoir purifié les anticorps monoclonaux par des méthodes standard, ils furent marqués avec l25I d'accord avec la méthode décrite par Fraker et Speck, 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 849. Dans d'autres cas, ils étaient marqués enzymatiquement avec de la B-galactosi-dase par la méthode d'O'Sullivan et Marks, 1978, Methods in Enzymol., 74, 147.

D) Détermination d'IgE spécifique : Les analyses ont été effectuées indistinctement sur des plaques de microtitulation de différentes grandeurs et matériau plastique, en tubes en plastique, ou dans des disques en nitrocellulose.

1. A chacun des puits, tubes ou disques on a ajouté un volume (50 à 200 (il) d'une solution avec des extraits protéi-ques préparés selon des méthodes préalablement décrites et on l'a laissé en incubation toute la nuit à 4 °C;

2. La protéine non absorbée fut retirée en aspirant ou en décantant le contenu des puits et en lavant avec une solution saline contenant de l'albuine sérique bovine à 1% (PBS-BSA).

3. Pour saturer les lieux de liaison encore libres, les puits ont été incubés avec du PBS-BSA pendant 1 h à température ambiante.

4. Ensuite, on a lavé les puits trois fois avec du PBS en présence de Tween à 0,1 % (PBS-Tween), en décantant soigneuse-

s ment le liquide des puits à chaque pas.

5. On a ajouté à chaque puits 50-200 [il du sérum humain en dilutions successives.

6. Dans d'autres puits on a ajouté des volumes similaires de sérum étalon préalablement calibré dans son contenu io d'IgE spécifique.

7. Le contenu de ces puits a été incubé pendant 1 -2 h à température ambiante.

8. On a lavé les puits trois fois avec du PBS-Tween et ensuite on les a incubés avec 50-200 (il d'un des anticorps

îs monoclonaux marqués comme indiqué sous C.

9. Le contenu des puits a été incubé comme indiqué au point 7.

10. Si l'anticorps monoclonal ajouté au point 8 avait été marqué avec 125I, dans ce point on procédait à couper les puits

20 pour mesurer la radioactivité sur un compteur à rayonnement gamma.

Si l'anticorps monoclonal avait été marqué enzymatiquement à ce point on ajoutait le substrat enzymatique ONPG (3 mM ortho-nitrofenil-ß-D-galactopyranoside) en PBS conte-

25 nant 10 mM MgCh et 0,1 mM 2-mercaptoethanol. Ensuite on incube le contenu des puits à 37 °C pendant 2 H. A ce moment-là on procédait à arrêter la réaction en ajoutant 100 ul de 1 M Na^CO: et on mesurait l'absorbance à 410 nm.

11. Les comptes par minute (cpm) ou l'absorbance

30 obtenue dans les puits étalon ont été représentés sur un diagramme (Voir Graphique 1) sur lequel les ordonnées représentent cpm ou Abs 410 nm et les abscisses le logarithme de l'inverse de la dilution employée. Par ce diagramme, on a classé chaque échantillon en comparant ses cpm ou Abs 410

35 aux valeurs obtenues avec les sérum étalon.

Traduction des légendes du graphique 1 correspondant à la courbe standard pour d'IgE spécifique

Détermination d'IgE spécifique par l'usage d'anticorps monoclonaux (M Ab) anti-IgE dans des puits en polystyrène.

40 L'échelle d'ordonnées à gauche représente l'union spécifique d'un AcM marqué enzymatiquement à une IgE sérique anti-=Lolium pérennante°°. L'échelle d'ordonnées à droite représente l'union spécifique du même AcM quand il a été marqué radiactivement avec l25I. La ligne discontinue représente

45 l'union non spécifique. L'échelle d'abscisses représente différentes dilutions du sérum en échelle logarithmique.

B

1 feuille dessins

Claims

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REVENDICATIONS

1. Procédé pour déterminer la concentration d'IgE spécifique dans les sérums humains caractérisée en ce qu'un anticorps humain monoclonal anti-IgE est utilisé et qu'il comprend les étapes suivantes: fixation d'antigènes, à un support solide suivi de l'incubation de l'échantillon de sérum avec ces antigènes fixés; lavage du support solide pour éliminer des protéines non spécifiques de l'antigène ; incubation du support avec l'anticorps monoclonal anti-IgE marqué avec l25I ou avec une enzyme ; lavage du support solide et détermination de la radioactivité inhérente, ou de l'activité enzymatique.
2. Procédé selon la revendicaiton 1, dans lequel l'anticorps monoclonal a été marqué avec un enzyme, par ex. : ß-galacto-sidase.
3. Procédé selon les revendicaitons 1 et 2, dans laquelle on fixe un sucre à un plastique comme support solide.
4. Procédé selon l'une des revendications 1,2 et 3, dans lequel on a uni au support solide une glycoprotéine.
5. Procédé selon les revendications 1,2,3, et 4, dans lequel on a uni à la nitrocellulose, comme support solide, une glycoprotéine, un sucre ou une protéine.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel les valeurs obtenues sont comparées semi-quantitativement avec un sérum étalon.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel l'union de l'antigène au support'solide se produit sous forme covalente.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel l'union de l'antigène au support solide se produit d'une façon non covalente.
9. Procédé selon les revendications 1 à 8, dans lequel le support solide est le récipient lui-même dans lequel le procédé est effectué.