CH668649A5 - Procede pour determiner la concentration d'igg specifique dans les serums humains. - Google Patents

Description

DESCRIPTION

La présente invention concerne un procédé pour déterminer la concentration d'IgG spécifique dans les sérums humains.

Par «IgG spécifique» on désigne la fraction de molécules IgG du sérum qui identifie un antigène (ou allergène) déterminé.

L'obtention de lignes cellulaires capables de produire en permanence un anticorps spécifique contre un immunogène prédéfini fut décrite pour la première fois en 1975 (Koller & Mulstein, 1975). Cette méthode est basée sur la fusion entre cellules myémateuses et des cellules de rate provenant d'animaux convenablement immunisés. Les hybrides résultants peuvent être sélectionnés de façon que ce soient les seules cellules qui se multiplient activement. De ces hybrides en croissance, on peut sélectionner des clones sécrétant l'anticorps souhaité. Ces anticorps sont donc d'origine monoclonale et peuvent se maintenir indéfiniment.

Cette méthodologie a été utilisée pour préparer des anticorps contre une grande variété d'antigènes comme produits naturels avec activité biologique, neuropeptides, hormones peptidiques, enzymes, Polysaccharides, glycoprotéines, lypo-polysaccharides, antigènes d'histocompatibilité, antigènes de différentiation et d'autres antigènes cellulaires, virus, etc. Ils sont aussi très utiles dans le champ du diagnostic.

La présente invention a pour but de proposer un procédé in vitro simple et fiable évitant les procédés in vivo tout en améliorant les procédés in vitro traditionnels. Le procédé selon l'invention est caractérisé par la clause caractéristique de la revendication 1.

Dans la présente invention, on détaille la méthode d'évaluation de l'IgG spécifique. Pour cela, des antigènes obtenus par des techniques originales sont absorbés ou unis d'une façon covalente à des plaques de microtitulation ou une autre superficie plastique, nitrocellulose, etc. Ensuite on ajoute l'échantillon de sérum et après une période d'incubation déterminée, l'IgG non spécifique est éliminée par des lavages successifs. L'IgG qui reste dans les puits (unie spécifiquement aux allergènes) est détectée en ajoutant l'anticorps monoclonal préalablement marqué avec un isotope radioactif ou une enzyme. Après une période d'incubation l'excès d'anti-IgG est éliminé et on mesure-la radioactivité ou l'activité enzymatique associée aux puits. On emploie donc des anticorps monoclonaux, fabriqués par les inventeurs, qui reconnaissent spécifiquemment l'IgG sérique et ne reconnaissent pas d'autres immoglobulines ou substances présentes dans le sérum ou plasma sanguin. L'originalité de l'invention consiste en ce que les anticorps monoclonaux utilisés peuvent être considérés comme uniques, dans le sens qu'ils n'existaient pas auparavant dans la nature, car ils sont produits par une cellule hybride artificiellement préparée au laboratoire à partir de deux cellules naturelles. Les produits synthétisés par les hybrides, anticorps monoclonaux reconnaissant l'IgG humaine, ne survivraient pas dans un milieu naturel et, par conséquent, ne peuvent être homologués aux anticorps polyclonaux produits dans les animaux par des techniques standard, bien qu'ils conservent quelques-unes de leurs propriétés.

Dans l'évaluation d'IgG spécifique in vitro, on a généralement utilisé des anticorps polyclonaux et la limitation principale de ces méthodes est leur basse sensibilité. Un autre problème dans l'utilisation des anticorps polyclonaux c'est que la fraction spécifique qui reconnaît l'antigène n'est que le 1 -10% de la fraction y-globulinique total. Cette limitation dans la quantité d'immoglobuline spécifique n'existe pas dans les anticorps monoclonaux, car presque les 100% de la protéine est spécifique contre l'antigène. Par conséquent, si on utilise des anticorps polyclonaux, il y a beaucoup de possibilités de réactions croisées avec des substances non spécifiques.

D'autres avantages des anticorps monoclonaux par rapport à ceux polyclonaux sont: la facilité de leur purification et pouvoir disposer de quantités illimitées de réactifs standardisés. On peut affirmer qu'une fois qu'une ligne cellulaire hybride (Hybridome) a été établie, on peut préparer des quantités illimitées de l'anticorps monoclonal. On assure ainsi la disponibilité de réactifs avec des propriétés permanentes (homogénéité, spécificité et affinité) et l'on garantit l'obtention de résultats reproduisibles et par conséquent comparables entre différents laboratoires.

Quand on la compare aux méthodes in vitro connues, la nouvelle invention a l'avantage additionnel qu'il n'est pas besoin d'isoler et purifier l'IgG sérique (Galfre & Milstein), du moins dans les quantités ou proportions requises dans les premières. On a besoin de beaucoup moins de temps pour obtenir des résultats fiables et on n'a pas à centrifuger les échantillons dans les différentes phases de l'analyse.

Pour mesurer l'IgG spécifique dans le sérum, il faut utiliser des extraits bien caractérisés biologique- et/ou immunochi-miquement (Carreira J. y col., Clin. Allergy, 14, 503,1984; Corbi y Carreira, Int. Archs. Allergy Appi. Immun. 76,156, 1985).

Les extraits utilisés dans cette invention, bien que commercialement accessibles, sont soumis dans tous les cas à un procès préalable de purification pour augmenter l'efficacité de l'union, la reproductibilité de la méthode et la corrélation avec les épreuves à vif. On y mesure l'activité biologique à vif, leur puissance allergénique in vitro et on identifie et évalue l'activité relative des différents composants de l'extrait (Stan-

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dardization of allergen extracts, Alergia e Inmunologi'a Abelló, S.A.).

Bien que le mécanisme par lequel il se produit une liaison non covalente entre une protéine dans une solution aqueuse et le plastique à laquelle elle est exposée soit peu connue (Par-sons, Methods of Enzymology, 73,224, 1981) la liaison est extrêmement forte et ce qui est plus important, l'activité biologique de l'échantillon se maintient. La plupart des auteurs sont d'accord en ce que l'union des protéines aux superficies plastiques se produit par des interactions hydrophobiques non spécifiques. Il semble que le seul réactif nécessaire pour la préparation des plastiques recouverts de protéine c'est le plastique lui-même. Plusieurs auteurs (Catt. et col., Science 158, 1570, 1967 ; Crosignani et col., J. Clin Endocrinal Metab. 30, 153, 1970) ont examiné l'effet de divers paramètres dans l'union des anticorps au plastique et son arrivés à la conclusion que la température, pH, force ionique n'influent pas outre mesure. Dans notre expérience, aussi bien le polystyrène, polyéthylène, polypropylène ou polyvinyle peuvent être utilisés presque indistinctement. On peut utiliser des tubes en plastique, des plaques de titulation ou puits individuels de différentes formes et grandeurs.

D'autre part, les forces qui maintiennent les protéines unies à la nitrocellulose sont peu connues, mais il est très probable que les interactions hydrophobiques jouent un rôle très important.

Cependant, malgré ce qui précède, la protéine absorbée peut se séparer du plastique pendant les procès d'incubation et lavage. Pour l'éviter, les antigènes peuvent être unis d'une façon covalente à la phase solide plastique par modification chimique de celle-ci.

La séparation de ce qui est uni au plastique de ce qui reste libre en solution peut être réalisée par simple aspiration ou décantation. La reproductibilité de la méthode augmente si au liquide de lavage on ajoute une protéine non relationnée, par example albumine sérique et un détergent (Triton,

Tvveen, etc.).

Le marché des anticorps monoclonaux avec des isotopes radioactifs ou avec des enzymes se réalise par des procédés conventionnels en sélectionnant par exemple: 125I (Fraker & Speck, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 849) ou ß-galac-tosidase (O'Sullivan et Marks. Methods Enzymol, 74, 147, 1978).

Les procédés de détermination de la radioactivité ou enzyme unie sont aussi réalisés par des méthodes conventionnelles en utilisant dans le premier cas des compteurs de rayonnements y, et dans le second il faut procéder à une incubation avec différents substrats enzymatiques ce qui dépendra de la méthode de détection dont on dispose.

L'invention est illustrées ci-après à l'aide de deux exemples que l'on peut considérer explicatifs et non limitatifs de celle-ci.

Exemple 1

Détermination de l'IgG spécifique contre antigènes présents dans les pollens des plantes (L. pérennante).

a) Préparation des anticorps monoclonaux. On a inyecté intrapéritoinement 100 ug d'IgG purifiée à des souris en adjuvant complet de Freund les jours —45 et —30. Le jour —3 on leur injecta la même quantité d'IgG dans 200 (il de tampon phosphate salin (PBS) par voie intraveineuse. Le jour zéro on fusionna les cellules de myélome de souris avec deux lymphocites de rate des animaux immunisés en utilisant du polyéthylèneglycolle à 50%. Les cellules furent distribuées en six plaques de puits et furent cultivées dans un milieu sélectif HAT.

b) Sélection: Après deux semaines on recueillait les surnageants de la culture et on analysait la possible spécificité

contre IgG. Pour éviter la sélection d'hybridomes sécrétant des anticoprs avec spécificité contre les chaînes légères ou contre des déterminateurs idiotypiques on a utilisé une autre IgG de myélome différente. Dans les clones positifs on analysa la possible réactivité croisée avec IgE, IgM ou IgA. Les hybridomes qui reconnaissaient IgG étaient clonés et sous-clonés en agar mi-solide. Ceux qui reconnaissaient différents épitopes dans l'IgG furent cultivés en grande échelle pour les purifier et les marquer.

c) Marquage: Après avoir purifié les anticorps monoclonaux par des méthodes standard, ils furent marqués avec l25I d'accord avec la méthode décrite par Fraker et Speck, 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80. 849. Dans d'autres cas on les marquant enzymatiquement avec de la ß-galactosidase par la méthode O'Sullivan et Marks, 1978, Methods in Enzymol. 74,147.

d) Détermination d'IgG spécifique: Les analyses ont été effectuées indistinctement en plaques de microtitulation de différentes grandeurs et matériau plastique, en tubes en plastique, ou en disques de nitrocellulose.

1) Les plaques en polystyrène furent nitrées puis réduites afin d'obtenir des plaques stables en polyaminostyrène. On a rempli les puits d'une plaque modifiée avec 200 jxl de l'antigène à 0,01% (p/v) en présence d'EDC à 0,1% (p/v) dans un tampon de MES 0,25 M pH 6.0.

2) La protéine non unie fut retirée en aspirant ou en décantant le contenu des puits et en lavant avec une solution saline qui contenait de l'albumine sérique bovine à 1% (PBS-BSA).

3) Pour saturer les lieux d'union encore libres, les puits on été incubés avec du PBS-BSA pendant 1H à température ambiante.

4) On lava ensuite les puits trois fois au PBS en présence de Tween à 0,1% (PBS-Tween), en décantant soigneusement le liquide des puits à chaque pas.

5) On a ajouté à chaque puits 50-200 |il du sérum humain en dilutions successives.

6) Dans d'autres puits on a ajouté des volumes similaires de sérums étalon préalablement étalonné dans leur contenu d'IgG spécifique.

7) Le contenu de ces puits a été incubé pendant 1 -2 h à température ambiante.

8) On a lavé les puits trois fois avec du PBS-Tween et ensuite on les incuba avec 50-200 ul d'un des anticorps monoclonaux marqués comme indiqué au point 7.

9) Si l'anticorps monoclonal ajouté au point 8 avait été marqué avec l25I à ce point on procédait à couper les puits pour mesurer la radioactivité au compteur à rayonnement gamma.

Si l'anticorps monoclonal avait été marqué enzymatiquement à ce point on ajoutait le substrat enzymatique ONPG (3 mM ortho-nitrophönyle-ß-D-galactopyranoside) à du PBS contenant 10 mM MgCk et 0,1 mM 2-mercaptoéthanol. Ensuite, on incube le contenu des puits à 37 °C pendant 2 h. A ce moment-là on procédait à arrêter la réaction en ajoutant 100 jil de 1 M Na2C03 et on mesurait l'absorbance à 410 nm.

10) Les comptes par minute (cpm) ou l'absorbance obtenue dans les puits étalon, a été représentée sur un diagramme sur lequel les ordonnées représentent cpm ou Abs 410 nm et les abscisses le logarithme de l'inverse de la dilution employée. Par ce diagramme, on a classé chaque échantillon en comparant ses cpm ou Abs 410 aux valeurs obtenues avec les sérums étalon.

Exemple 2

Détermination de l'IgG spécifique contre les antigènes présents dans les pollens des plantes (L. pérennante). a) Préparation des anticorps monoclonaux:

On a injecté intrapéritoinement 100 (ig d'IgG pu ri fiée à des

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souris dans un adjuvant complet de Freund, les jours -45 et -30. Le jour -3, on leur injecta la même quantité d'IgG (e, K) dans 200 (il de tampon phosphaté salin (PBS) par voie intraveineuse. Le jour zéro, on a fusionné les cellules de myélome de souris avec les lymphocytes des animaux immunisés en utilisant du polyéthylèneglycol à 50%. Les cellules ont été distribuées en six plaques de puits y elles ont été cultivées dans un milieu sélectif HAT.

b) Sélection : Après deux semaines on recueillait les surnageants de la culture et on analysait la possible spécificité contre IgG. Pour éviter la sélection d'hybridomes sécrétant des anticorps avec spécificité contre les chaînes légères ou contre les déterminants idiotypiques, on utilise une autre IgG à myélome différent (e, A.). Dans les clones positifs on analysa la possible réactivité croisée avec IgE, IgM ou IgA. Les hybri-domes qui reconnaissaient l'IgG étaient clonés et sousclonés en agar mi-solide. Ceux qui reconnaissaient différents épi-topes dans l'IgG furent cultivés en grande échelle pour les purifier et les marquer.

c) Marquage : Une fois purifiés les anticorps monoclonaux par des méthodes standard on les marqua avec l25I d'accord avec la méthode décrite par Fraker et Speck, 1978, Biochem, Biophys. Res. Commun. 80, 849. Dans d'autres on les marquait enzymatiquement avec de la ß-galactosidase par la méthode de O'Sullivan et Marks 1978, Methods in Enzymol. 74,147.

d) Détermination d'IgG spécifique:

Les analyses furent effectuées indistinctement sur des plaques de microtitulation de différentes grandeurs et du matériau plastique, en tubes de plastique, ou en disques de nitrocellulose.

1 ) A chacun des puits, tubes ou disques on ajouta un volume (50 à 200 jil) d'une solution avec des extraits protéiques préparés selon les méthodes préalablement décrites et on les laissa en incubation pendant toute la nuit à 4 °C.

2) La protéine non absorbée se retira en aspirant ou en décantant le contenu des puits et en lavant avec une solution saline contenant de l'albumine sérique bovine à 1% (PBS-BSA).

3) Pour saturer les lieux d'union encore libres, les puits furent incubés avec du PBS-BSA pendant 1 h a température ambiante.

4) Ensuite on lava les puits trois fois au PBS en présence de

Tween à 0,1% (PBS-Tween), en décantant soigneusement le liquide des puits à chaque pas.

5) On ajouta à chaque puits 50-200 jxl de sérum humain en dilutions successives.

s 6) Dans d'autres puits on ajoute des volumes similaires de sérums étalon préalablement calibrés dans leur contenu d'IgG spécifique.

7) Le contenu de ces puits fut incubé pendant 1-2 h à température ambiante.

io 8) On a lavé les puits trois fois avec du PBS-Tween et on les a incubés ensuite avec 50-200 (il d'un des anticorps monoclonaux marqués comme indiqué sous c.

9) Le contenu des puits fut incubé comme indiqué au point 7.

10) Si l'anticorps monoclonal ajouté au point 8 avait été 15 marqué avec '-5I à ce point on procédait à couper les puits pour mesurer la radioactivité sur un compteur à rayonnements gamma.

Si l'anticorps monoclonal avait été marqué enzymatique-20 ment à ce point on ajoutait le substrat enzymatique ONPG (3 mM ortho-nitrophényle-P-D-galactopyranoside) en PBS contenant 10 mM MgCh et 0,1 mM 2-mercaptoéthanol. Ensuite on incube le contenu des puits à 37 °C pendant 2 h. A ce moment-là on procédait à arrêter la réaction en ajoutant 25 100 [il de lMNa2C03 et on mesurait l'absorbance à 410 nm. 11) Les comptes par minute (cpm) ou l'absorbance obtenue sur les puits étalon a été représentée sur un diagramme (voir graphique 1) dans lequel les ordonnées représentent cpm ou Abs 410 nm et les abscisses le logarithme de 30 l'inverse de la dilution employée. Par ce diagramme on a classé chaque échantillon en comparant ses cpm ou Abs 410 aux valeurs obtenues avec les sérums étalon.

Traduction des légendes du graphique 1 correspondant à la courbe standard pour l'IgG spécifique.

35 Détermination d'IgG spécifique en utilisant d'anticorps monoclonaux (AcM) anti-IgG dans des puits de polystyrène.

L'échelle d'ordonnées à gauche représente l'union spécifique d'un AcM marqué enzymatiquement avec une IgG sérique anti-Lolium perenne. L'échelle d'ordonnées à droite 40 représente l'union spécifique du même AcM quand l'on l'a marqué radioactivement avec 125I. La ligne discontinue représente de différentes dilutions du sérum en échelle logarithmique.

B

1 feuille dessins

Claims (9)

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   REVENDICATIONS

   1. Procédé pour déterminer la concentration d'IgG spécifique dans les sérums humains, caractérisée en ce qu'un anticorps humain monoclonal anti-IgG est utilisé et qu'il comprend les étapes suivantes:

   - Fixation d'antigènes à un support solide suivi de l'incubation de l'échantillon de sérum avec ces antigènes fixés; lavage du support pour éliminer des protéines non spécifiques de l'antigène; incubation du support avec l'anticorps monoclonal anti-IgG marqué avec1251 ou avec un enzyme; lavage du support solide et détermination de la radioactivité inhérente, ou de l'activité enzymatique.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'anticorps monoclonal a été marqué avec un enzyme, par exemple: ß-galactosidase.
3. 3. Procédé selon les revendications 1 et 2 dans lequel on fixe le sucre à un plastique, comme support solide.
4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1,2 et 3, dans lequel on a uni au support solide une glycoprotéine.
5. 5. Procédé selon les revendications 1,2,3 et 4, dans lequel on a uni à la nitrocellulose comme support solide, une glycoprotéine, un sucre ou une protéine.
6. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel les valeurs obtenues sont comparées semiquantitativement avec un sérum étalon.
7. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel l'union de l'antigène au support solide se produit d'une façon covalente.
8. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel l'union de l'antigène au support solide se produit d'une façon non covalente.
9. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequelle le support solide est le récipient lui-même dans lequel est effectué le procédé.