JPH08509289A

JPH08509289A - 無症候性患者における糖尿病可能性評価方法

Info

Publication number: JPH08509289A
Application number: JP6523340A
Authority: JP
Inventors: ベッケスコフ、スタイナン; アーンストゥート、ヘンク−ジャン
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1993-04-16
Filing date: 1994-04-08
Publication date: 1996-10-01
Anticipated expiration: 2018-07-07
Also published as: DE69431051D1; EP0693183A4; ATE221200T1; US6960448B2; EP0693183A1; US20050106633A1; JP3425149B2; US6316209B1; DE69431051T2; EP0693183B1; WO1994024564A1

Abstract

(57)【要約】ヒト患者がインスリン依存性真性糖尿病を発病する危険性を評価するための方法であって、当該方法は、患者の血清サンプル中の膵臓β細胞中に存在する３８ｋＤの自己抗原に対する自己抗体の検出に基づくものである。この特定の自己抗原に対する自己抗体は、糖尿病前症患者の多くの亜集団において臨床的発症のかなり前に産生されることが判明している。３８ｋＤの自己抗原に対する自己抗体の検出と、ＩＤＤＭの他の既知のマーカー例えば６４ｋＤの自己抗原（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）とを組み合わせることによって有用なアッセイとなる場合が多いであろう。

Description

【発明の詳細な説明】無症候性患者における糖尿病可能性評価方法発明の背景本発明は合衆国国立衛生研究所の登録番号ＤＫ４１８２２−０１−０４による合衆国政府の援助を受けてなされたものである。合衆国政府は本発明における一定の権利を有する。１．発明の分野本発明は一般的にはインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）を発病する危険性のある患者を同定するための方法に関する。さらに詳しくは、本発明はこの疾患の臨床的発症前の患者の血清中の糖尿病に関係する約３８ｋＤの自己抗体の検出に関わるものである。インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は主として若年者が罹患する。治療用にインスリンを入手することは可能ではあるが、この疾患の罹患率および死亡率は数倍も高いために早期の診断および予防法の開発が急がれている。ＩＤＤＭの臨床的発症に先行する膵臓β細胞の破壊は自己免疫機構が介在して起こる。この疾患に関する自己免疫異常で最も広範に研究されているのは、診断時に高頻度に見られる循環性β細胞特異性自己抗体である。家族歴調査によれば特定の膵臓 β細胞自己抗原に対する自己抗体はＩＤＤＭが明白となる何年も前に現われることが示されており、このことは臨床的症状が現われる前に、体液性自己免疫の長い前兆期間があることを示唆している。家族歴調査ではまた、診断前の何年かにわたって静脈内グルコースに対するインスリン応答性が徐々に、進行しながら消失することも記録されている。糖尿病前症の期間におけるβ細胞特異性自己抗体の存在は、最終的に致命的なβ細胞枯渇とインスリン依存性に到達することになる自己免疫ブロセスが進行していることを反映しているものと考えられる。臨床発症時には全β細胞量の僅か１０％だけが残っていると推測されている。したがって、発症可能性を有する患者を早期かつ正確に同定する方法が必要とされている。β細胞破壊を伴う初期の体液自己免疫に関わる自己抗体を検定することができるアッセイが特に望まれる。膵島細胞自己抗体（ＩＣＡ）を検出する古典的な方法は、凍結膵臓切片を免疫組織学的に用いるものである。しかしながら家族歴調査によれば、この方法で測定されるβ細胞の細胞質自己抗体は感受性検知のための単一マーカーとして供するには特異性が不充分であることが判明している。その上、ＩＣＡは標準化するのが非常に困難で、染色切片の解釈は観察者の主観に委ねられている。したがって、何が“陽性”の標本であるかを規定する方法がない。より特異的なマーカーを単独で、あるいはＩＣＣＡと併用することによって、一層正確なアッセイを確立することが可能となるであろう。他のマーカーとしては約６４ｋＤの自己抗原に対する自己抗体、インスリン自己抗体、およびＭＨＣクラスIIＤＲ/ＤＱβハプロタイプがある。６４ｋＤ自己抗原はＩＤＤＭ用の診断マーカーとして特に可能性を有するものである。６４ｋＤ自己抗原に対する自己抗体の出現率は、この疾患の臨床的発症および糖尿病前症期間の両方で、約７０％から８０％の範囲にある。自己抗体の存在は、明白なＩＤＤＭより数年も先行することが家族歴調査によって示されている。最近、本発明者らは別の研究グループとともに、ＩＤＤＭに関与する膵臓 β細胞の６４ｋＤ自己抗原が中枢神経系（ＣＮＳ）の中のＧＡＢＡ分泌ニューロンに豊富なタンパク質であるグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１５）であることを発見した。この発見に基づいて、患者のスクリーニング用として６４ｋＤ自己抗原（ＧＡＤ）に対する自己抗体を検出するのに、従来の多くのアッセイ方式を利用することができることとなった。しかしながら、６４ｋＤ自己抗原に対する自己抗体の同定は、ＩＤＤＭを発症する危険性のある患者を同定するためのスクリーニングテストとしてはそれ自体不充分なものである。上述のように、６４ｋＤ自己抗原に対する自己抗体は、後でＩＤＤＭを発症する患者のうち７０％から８０％に存在するだけであり、可能性のあるかなり多くの患者を同定することができないことになる。したがって、６４ｋＤ自己抗原に対する抗体を産生しない患者の少なくとも一部に、ＩＤＤＭ発症可能性を予知することができる別の代替マーカーを提供することが望ましい。そうしたマーカーはＩＤＤＭの臨床的発症に先立つβ細胞破壊の初期の段階から存在し、そうした初期の段階から臨床的発症の時点までずっと検出可能に維持されなければならない。このマーカーは患者の血清中で検出可能であり、それによってスクリーニングが容易にできるようなものであるべきであり、また６４ｋＤ自己抗原に対する自己抗体の検出と適合性のあるものであることが望ましい。２．背景技術の説明ヒトの膵島に存在する３８ｋＤ抗原に対する抗体は、インスリン依存性真性糖尿病に罹患している患者の血清との免疫沈降反応により検出されている。ベッケスコフ（Baekkeskov）ら、（１９８２）Nature、２９８；１６７−１６９およびアーンストゥート（Aanstoot）ら、（１９９１）アブストラクト、８９８、Diab etes、４０巻、補遺１、２２５Ａ頁、２２５Ａ頁。３８ｋＤ膵島細胞タンパク質はインスリン依存性真性糖尿病の動物モデルであるＢＢ−ラットで報告されている。コー（Ko）ら、（１９９１）Diabetologia、３４：５４８−５５４。約３８ｋＤのインスリノーマタンパク質に対するＴ細胞反応性は、新たに糖尿病と診断された患者において検出されている。ロープ（Roep）ら、（１９９０）Nature、３４５：６３２−６３４およびLancet（１９９１）３３７：１４３９−１４４１。グルタミン酸デカルボキシラーゼ酵素の６５ｋＤアイソフォーム（ＧＡＤ₆₅）に対する抗体は、β細胞破壊およびインスリン依存性真性糖尿病を起こしている患者の７０％から８０％において検出されている。ベッケスコフら、（１９９０）Nature、３４７；１５１−１５６およびＷＯ９２／０４６３２。凍結膵臓片の免疫蛍光法により検出された膵島細胞抗体（ＩＣＡ）を保有する患者のうち何人かはＧＡＤ₆₅に対する抗体を有していない。サイスラー（Seissler）ら、（１９９１）Diabetologia、３４：５４８−５５４。発明の概要本発明は無症候性の患者におけるインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）の発病の危険性を評価するための方法を包含する。この方法は５．６から６．１の範囲のｐＩ（等電点）を有する３８ｋＤの両媒性の膜結合膵島細胞タンパク質に対する自己抗体の存在を検出することに基づくものである。３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体は、後にＩＤＤＭを発症する患者の多くの亜集団（サブグループ）において見られるもので、この疾患の臨床的発症のかなり前、通常では臨床的発症の１年以上前、しばしば臨床的発症の２年あるいはそれ以上前から現われることが見出されている。また３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体は、６４ｋＤ自己抗原（ＧＡＤ₆₅）に対する自己抗体を示さない多くの患者に存在することも発見されている。したがって、本発明によるアッセイは、３８ｋＤ自己抗原および６４ｋＤ自己抗原（ＧＡＤ₆₅）の両自己抗体の存在がＩＤＤＭを予知させるものであるという観点から、この両者に対する自己抗体の検出に基づくものであることが好ましい。本発明の特性および利点についての理解は、本明細書の残りの部分および図面を参照することによってさらに深まるであろう。図面の簡単な説明図１Ａは、新たに糖尿病と診断された患者の血清Ｉ₁−Ｉ₁₆（レーン１−１８）、スティフマン症候群の血清（レーン１９）および健常対照者の血清Ｃ１−Ｃ３（レーン２０−２２）を用いた³⁵Ｓ−メチオニン標識化膵島細胞タンパク質の膜およびサイトゾル分画の免疫沈降を示したＳＤＳ−ポリアミドアクリルゲル（ＰＡＧＥ）蛍光間接像である。αおよびβの２つのバンドに分かれるＧＡＤ₆₅は、患者Ｉ₁₆（レーン１６および１８）からの血清による膜分画およびサイトゾル分画の両方の免疫沈降物中に認められるのに対し、３８ｋＤタンパク質は患者Ｉ₁₅ およびＩ₁₆からの血清による膜分画の免疫沈降物中においてのみ検出されている（レーン１５−１６とレーン１７−１８を比較されたい）。図１Ｂは、新たに糖尿病と診断された患者からの血清Ｉ₁₅およびＩ₆₂−Ｉ₈₀（レーン３−２１）と健常対照者Ｃ₁およびＣ₃₁−Ｃ₃₈からの血清とを用いた³⁵Ｓ −メチオニン標識化膵島細胞タンパク質の膜分画の免疫沈降を示したものである。糖尿病患者の血清は３８ｋＤタンパク質のみ、ＧＡＤ₆₅のみ、両方のタンパク質または非特異性のタンパク質のいずれかを認識する。図２は、抗−３８ｋＤタンパク質抗体および抗−ＧＡＤ₆₅抗体に対して陽性の血清を用いた³⁵Ｓ−メチオニン標識化ラット膵島の連続免疫沈降を示すＳＤＳ− ＰＡＧＥの蛍光間接像である。レーン１および４は抗−ＧＡＤ₆₅抗体陽性のスティフマン症候群の血清⁴（レーン１）および糖尿病患者の血清Ｉ₅（レーン４）による免疫沈降を示す。免疫沈降後の上澄みは次に、抗−３８ｋＤ抗体陽性の糖尿病患者の血清Ｉ₁₅およびＩ₄（レーン２および５）による二次免疫沈降に付した。レーン２の免疫沈降後の上澄みは次に、抗−３８ｋＤおよび抗−ＧＡＤ₆₅抗体陽性の血清Ｉ₁₆（レーン３）による三次免疫沈降に付した。ＧＡＤ₆₅および３８ｋＤタンパク質は互いの免疫沈降に影響を及ぼさないことが判明した。具体的実施態様の説明本発明は、膵臓β細胞（ランゲルハンス島のインスリン分泌細胞）の特定の３８ｋＤタンパク質に対する自己抗体が、糖尿病前症のヒト患者の多くの亜集団の血清中に放出されるという発見に基づいたものである。特に、そのような抗体は糖尿病前症患者の少なくとも約１０％の血清中に、β細胞破壊の初期の段階で検知可能な自己抗体レベルとなり、通常はインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）の臨床的発症の少なくとも１年以上前、あるいはしばしばこの疾患の発症の２年あるいはそれ以上前から現われることが判明している。したがって３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体の存在は、後にＩＤＤＭを発病する可能性のある無症候性の患者をも検知するための有用なマーカーとして使用できるものである。特に、３８ｋＤ自己抗原に対する血清自己抗体は、その他の血清マーカー、特に６４ｋＤ膵臓β細胞自己抗原（ＧＡＤ₆₅）に対する自己抗体の検出と併用した場合に糖尿病のスクリーニングに有用である。３８ｋＤ自己抗原は、ヒトやラットのような哺乳類の膵臓中の島あるいはβ細胞に存在する膜結合性の両親媒性タンパク質であり、約５．４から６．１の範囲のｐＩ（等電点）により特徴付けられる。これらの名目的な分子量およびｐＩの範囲は本明細書の実験の節に記述したように、既知のタンパク質との比較に基づいたものである。こうして決定された分子量およびｐＩの範囲には実験誤差があり、本発明は当然、こうしたタンパク質の名目的な特性に制限されるものではないことは、勿論、理解されることであろう。むしろ本発明は、以下の実験の節で述べるように、図１および２で単離、同定された自己抗原に対する自己抗体の検出に関するものである。タンパク質自己抗原の正確な物性が問題ではなく、これらの自己抗体が患者の血清中に存在するという発見そのものが本発明にとって決定的に重要なことなのである。実験の節で報告されている実施例は、界面活性剤（デタージェント）中で³⁵Ｓ −メチオニン標識のラット膵島細胞タンパク質を強力に抽出することに基づいたものである。本発明の３８ｋＤ自己抗原タンパク質は水性媒体に比較的不溶で、従来は免疫沈降実験用に適する細胞抽出物を得ることは困難であった。しかしながら実験の節で教示している特別な抽出方法は、３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体の存在を検出するための信頼できる基盤を提供するものである。効果的に可溶化した膵島細胞タンパク質を使用することによって、免疫蛍光法により膵島細胞抗体（ＩＣＡ）陽性である糖尿病前症患者に、６４ｋＤ自己抗原（ＧＡＤ₆₅）に対する自己抗体に対して認められる場合とは異なる分布で、この自己抗原に対する自己抗体が存在することが判明した。したがって、血清中の３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体の検出がＩＤＤＭを発病する危険性のある無症候性患者に対する予知マーカーとして有用であることが示されたものである。本発明の方法は無症候性患者が糖尿病前症、すなわち、将来ＩＤＤＭを発病する危険性のある患者であるかどうかについて選別するために使用することができる。“無症候性”という用語は、患者に糖尿病の臨床症状がなく、ＩＤＤＭと臨床的に認定されるほど大きなインスリン産生β細胞に対するダメージを、まだ受けていない患者を意味する。“糖尿病前症”という用語は、３８ｋＤ自己抗原のような膵臓β細胞における自己抗原に対する循環性自己抗体が検知できるレベルに達している患者で、かつ将来ＩＤＤＭを発病する顕著な危険性がある患者を意味する。ＩＤＤＭの臨床的発症は医学文献にも詳しく説明されているような従来の各種臨床指標によって決定される。本発明の原理によれば、３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体を検出するためには非常に多くの適当なアッセイ方式がある。以下の実験の節に詳細を説明しているように、患者血清中の自己抗体の存在は、標識化３８ｋＤ自己抗体を用いた免疫沈降により決定することができる。標識化自己抗原は、ラットやヒト膵島のような適当な哺乳類の膵島細胞を、³⁵Ｓ−メチオニンのような標識化アミノ酸前駆体の存在下で成育させることによって得ることができる。得られた標識化３８ｋＤ抗原は、次に実験の節に記述したプロトコール、あるいは比較的不溶性の自己抗原を可溶化させる他の同等に強力な方法を使用することによって抽出することができる。抽出された自己抗原を次いで患者の血清と反応させ、得られた反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥなどのような従来の技法を用いて分離する。このような免疫沈降プロトコールは３８ｋＤ自己抗原を精製する必要がなく、また６４ｋＤ自己抗原（ＧＡＤ₆₅）に対する自己抗体の同定も同時に行うことができるという利点がある。しかしながら、一般的には免疫学的アッセイ（イムノアッセイ）、酵素アッセイなどのような、より簡便なアッセイ方式を使用することが望ましい。そのようなイムノアッセイや酵素アッセイは、典型的には、精製した３８ｋＤ自己抗原、または３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体に結合可能なリガンドを血清サンプルに曝露させ、リガンドと血清中に存在するであろう３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体との特異結合を検出することに基づくものである。自己抗体と３８ｋＤ自己抗原あるいは等価なリガンドとの間の結合は、自己抗体が血清サンプル中に存在することを示し、またこの疾患の臨床的発症前の無症候性患者の糖尿病前症状態の診断指標となることを示している。特定のアッセイプロトコールの選択そのものは重要なことではなく、そのアッセイが自己抗体の閾値レベルを検知するのに充分な感度を持っていることが必要なだけである。そのような閾値レベルは可能なかぎり低いものであるべきだが、唯一の下限といえは３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体が存在しない陰性の血清を、存在する場合と判別できなければならないことである。β細胞破壊のかなり初期の段階において極く低いレベルの自己抗体が存在し得るということを考慮しておかねばならない。このように、陰性バックグラウンドまたは対照レベル以上の全ての自己抗体の存在は糖尿病前症状態の診断指標となり得る。適当なアッセイ方式としては固体相（異種）および非固体相（同種）両方のプロトコールがある。アッセイは競合方式または非競合方式を利用し、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、化学的発光物、スピン標識など広範な種の標識を使用して行うことができる。適当なアッセイの多くは異種プロトコールに準拠したもので、血清サンプル中に自己抗体が存在する場合に形成されるリガンド−自己抗体複合物を分離するために用いた固体相にリガンドを結合させる方式である。精製したリガンドを使用する場合の特別な利点は、アッセイに使用する固体相の調製を容易にすることである。つまり、リガンドを浸漬棒（ディップスティック）、粒状体、微小球体、磁性粒体、試験管、マイクロタイターウェルなど種々の固体相に固定化することが簡単にできる。固体相を血清サンブルに曝露すると、もし存在すれば自己抗体がリガンドに捕捉される。その後固体相を血清サンプルから取り出すことによって、捕捉された自己抗体を血清サンプル中の結合されなかった自己抗体やその他の夾雑物から取り出すことができる。そして捕捉された自己抗体を非競合性の“サンドイッチ” 技法を用いて検出することができ、ここで自己抗体のための標識化リガンドは、洗浄済固体相に曝露される。また、競合性のアッセイは、血清サンプルへ溶解性の標識化自己抗体を予め投入しておき、標識化物と非標識化物の固体相への結合を競合させ得ることに基づく。こうしたアッセイ技法については特許文献や科学文献の双方に詳細な記述がある。血清中の自己抗体を検知するのに適当なイムノアッセイの例としては、米国特許第３，７９１，９３２；３，８１７，８３７；３，８３９，１５３；３，８５０，７５２；３，８５０，５７８；３，８５３，９８７；３，８６７，５１７；３，８７９，２６２；３，９０１，６５４；３，９３５，０７４；３，９８４，５３３；３，９９６，３４５；４，０３４，０７４；および４，０９８，８７６号に記載されているものがあり、これらの開示を援用して本願明細書の一部とする。特に好ましい方法は高感度な固体相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で、その詳細は米国特許第３，７９１，９３２；３，８３９，１５３；３，８５０，７５２：３，８７９，２６２；および４，０３４，０７４号に記載されている。このようなＥＬＩＳＡ検定法は非常に低力価の自己抗体の測定に適用できるものである。好ましいＥＬＩＳＡ技法では、精製したリガンドを共有的ないしは非共有的に固体表面に結合させる。この固体表面を血清サンプルに曝露すると、もしサンプル中に自己抗体が存在すれば捕捉されて固体相表面に結合する。通常、固体相上のリガンドは過剰に存在するので自己抗体は全量が結合し得る。固体相を分離してその表面を洗浄した後は、捕捉した自己抗体に特異的に結合可能な標識化試薬に固体相を曝露することができる。この標識化試薬は、標識化精製リガンド、あるいは自己抗体と結合可能なその他のリガンド、たとえば標識化抗−ヒト抗体、とし得る。このようにして、標識は血清中に自己抗体がある場合にのみ固体相に結合する。酵素標識は従来の視覚化手法、たとえば着色染料、化学的発光、蛍光などによって検出することができる。第二の好ましい実施態様は、上述のようにして調製した固体相を用いて行うラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を包含するものである。固定化されたリガンドへの結合に関して競合することのできる放射性標識化自己抗体の存在下で、固体相を血清サンプルに曝露させる。このようにすると、固体相に結合される放射性標識の量は血清サンプル中に最初から存在する自己抗体の量に反比例することになる。固体相を分離した後、非特異的に結合した放射性標識は洗浄によって除去することができ、固体相に結合した放射性標識の量が決定できる。結合した放射性標識の量は、結局、サンプル中に当初から存在する自己抗体の量に相関し得る。本発明による方法では、３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体の検出と、他の既知のＩＤＤＭマーカー例えば、その他のβ細胞自己抗原に対する自己抗体、特に６４ｋＤ自己抗原（ＧＡＤ₆₅）に対する自己抗体およびインスリン自己抗体の検出を併用するのが望ましく、とりわけ６４ｋＤ自己抗原（ＧＡＤ₆₅）に対する自己抗体の併用が望ましい。３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体の存在は、糖尿病前症患者の血清中において６４ｋＤ自己抗原に対する自己抗体の存在とオーバーラップするが、同一の範囲で重なり合うものではないことが判明している。したがって、３８ｋＤ自己抗原および６４ｋＤ自己抗原（ＧＡＤ₆₅）のいずれか、または両方に対する自己抗体の存在は糖尿病前症状態の診断指標となる。患者の血清中の６４ｋＤ自己抗原（ＧＡＤ₆₅）に対する自己抗体の検出に適した方法および組成物については、同時係属出願第０７／７５６，２０７（これはＰＣＴ出願ＷＯ９２／０４６３２として発行されているものに相当する）および０７／９８４，９３５に詳しく記述されており、それらの開示をすべてここで援用して本明細書の一部とする。６４ｋＤ自己抗原（特に、ＧＡＤ₆₅のαおよびβ 型）に対する自己抗体の免疫沈降による検出については、以下の実験の節で説明している。以下の実施例は、発明を制限するものではなく、説明のために供するものである。実験方法新生児ラットの膵島を単離し、ベッケスコフら、（１９８９）Diabetes、３８、１１３３−１１４１に記述されているように、³⁵Ｓ−メチオニンで標識化した。膵島は氷の上で１０分間、ＨＥＭＡＰ緩衝液（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭアミノエチル−イソチオルニウムブロマイドハイドロブロマイド、および０．２ｍＭピリドキサルリン酸）中で膨潤させ、ガラス製ホモジナイザー中で２０ストロークで均質化した。この均質化物を１００，０００ｇで１時間遠心分離してサイトゾルおよび粒状の膜分画を得た。２％トライトンＸ−１１４を加えたＨＥＭＡＰ緩衝液中で２時間、屈曲ピペットチップを通して繰り返し分散させることによって特定の膜分画を抽出し、破砕片を取り除くために１００，０００ｇで遠心分離した。サイトゾル分画および膜抽出物両方の中の両親媒性タンパク質を温度誘発によるＴＸ−１１４相分離により精製した。ベッケスコフら、（１９９０）Nature、３４７：１５１−１５６参照。この膜またはサイトゾル分画のデタージェント相を、前掲のベッケスコフら（１９８９）の記述のように、指定の血清による免疫沈降の前に正常なヒト血清で事前処理（プレクリア）した。１回の免疫沈降に２５０匹のラットの膵島抽出物（図１Ａおよび１Ｂ）および５００匹のラットの膵島抽出物（図２）を使用した。免疫沈降物はベッケスコフら、（１９８９）前掲、に記載の通り１５％ゲルを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、フルオログラフィーのために処理した。３８ｋＤタンパク質はｐＩ５．４−６．１の両親媒性β細胞膜タンパク質であるサイトゾルおよび粒状の各膵島細胞分画中における不溶性３８ｋＤタンパク質の分布を分析し、また３８ｋＤタンパク質の両親媒性を評価するためにサイトゾルおよび膜タンパク質をトライトンＸ−１１４相分離に付した（図２）。クリストガウ（Christgau）ら、（１９９２）J.Cell Biol.、１１８：３０９−３２０およびクリストガウら、（１９９１）J.Biol.Chem.、２６６：２１２５７−２１２６４に記載されているように、可溶親水性、可溶両親媒性、および膜結合両親媒性の形で認められるＧＡＤ自己抗原と対照的に（図１Ａのレーン１６と１８を比較されたい）、３８ｋＤタンパク質はデタージェント相に区画されている粒状分画においてのみ検出された（図１Ａ、レーン１５および１６）。したがって、３８ｋＤタンパク質は両親媒性の膜タンパク質である。３８ｋＤタンパク質はＳＤＳ−ゲルのフルオログラフィーにおいて広いバンドとして検出されており（図１および２）、そのサイズおよび／または電荷における異質性が示唆されている。前掲のベッケスコフら（１９８９）に記述されているように、一次元に等電点分離、二次元にＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した二次元ゲル電気泳動によって類似した７つの比分子量点が認められた。対応するｐＩ５．４−６．１は、カルバミン化クレアチンホスホキナーゼの電荷鎖のマーカーおよび既知のＨｅＬａ細胞タンパク質を用いた同時電気泳動により決定した。神経内分泌細胞系および非内分泌細胞系の分析において、エフラット（Efrat ）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.、（１９８８）８５：９０３７−９０４１に記述されている通り、３８ｋＤ抗原はトランスジェニックマウスβ細胞腫瘍由来βＴＣ３細胞の免疫沈降物にのみ検出されたのに対し、パワーズ（Powers）ら、（１９９０）Diabetes、３９：４０６−４１４に記述されているようにグルカゴン産生 αＴＣ細胞、およびその他この研究で試験したすべての細胞は陰性であった（表１）。したがって、３８ｋＤタンパク質の発現は膵臓β細胞に拘束されると考えられる。３８ｋＤタンパク質はＧＡＤのフラグメントではないタイプ１の糖尿病患者由来の血清中の自己抗体は、クリスティー（Christie）ら、（１９９０）J.Exp.Med.、１７２：７８９−７９４およびクリスティーら、（１９９２）Diabetes、４１：７８２−８７８に記述の通り、ＧＡＤ₆₅の３７ｋＤトリプシンフラグメントを認識する。そのような血清は未変性ＧＡＤ分子の全長を常に認識するわけではなく、トリプシン処理によって分離されたエピトープが露出することを示唆している。この報告に関し、われわれは３８ｋＤタンパク質がＧＡＤの断片か、さもなければＧＡＤに関係するものかという疑問を追究した。膵島細胞膜抽出物を抗−ＧＡＤ₆₅または抗−３８ｋＤ抗体を含む血清を用いて連続免疫沈降を行った。免疫反応性のＧＡＤ₆₅を除いた上清はなお３８ｋＤタンパク質に対して陽性であった（図２）。同様に免疫反応性の３８ｋＤタンパク質を除いた上清にはなおＧＡＤ₆₅分子が含まれていた。このように、未変性３８ｋＤタンパク質および未変性ＧＡＤ₆₅分子は免疫学的交叉反応を示さない。次にわれわれは、抗−３８ｋＤ血清がいずれかのタンパク質の弱トリプシン消化で生成するＧＡＤ₆₅の３７／４０ｋＤフラグメントを認識するかどうかを解析した。いくつかの抗−ＧＡＤ血清は３７／４０ｋＤのＧＡＤ₆₅トリプシンフラグメントを認識するが、試験をした唯一の抗−３８ｋＤ抗体陽性血清は陰性であった。最後に２つの３７ｋＤ抗体陽性血清は３８ｋＤ抗原を免疫沈降させなかった。これらの結果は３８ｋＤタンパク質がＧＡＤとは別物であることを示している。３８ｋＤ抗原に対する自己抗体は糖尿病前症および糖尿病患者の１つの亜集団（サブグループ）に存在し、ＧＡＤ自己抗体を補完するものである３８ｋＤ抗体の出現率を解析し、次の３グループにおけるＧＡＤ抗体およびＩＣＡの保有率と比較した（図１および表２）：（ｉ）糖尿病を発病している５才以下の子供３７人および同年令グループの対照群３８人、（ii）糖尿病を発病している５才を越えた４９人および同年令グループの対照群２５人、（iii）タイプ１糖尿病の臨床的発症の前に各々の血清が入手されていた４４人（臨床発症時の年令２．６−４９．９才）。３グループで得られた結果を表２に示す。糖尿病前症期間あるいは糖尿病の臨床的発症のいずれかと診断された患者合計１３０人において、抗−ＧＡＤ₆₅抗体陽性の１００人（７７％）に対し、抗−３８ｋＤ抗体陽性は２２人（１７％）であった。６人の患者は抗−３８ｋＤ抗体のみに陽性であったが、１６人は抗−３８ｋＤ抗体および抗−ＧＡＤ₆₅抗体の両方を有していた。したがって、１０６人（８２％）はこれらの抗原のいずれかまたは両方に対する抗体が陽性であった。抗−３８ｋＤ抗体ならびに抗−ＧＡＤ₆₅抗体は、それぞれ年令１．３才および０．８才の子供がタイプ１糖尿病を臨床発症した時点で検出された。こうした非常に幼い子供のβ細胞の自己免疫性の持続期間は非常に短いので、この両方のタンパク質はおそらくヒトの疾患におけるβ細胞に向けられた二次自己免疫プロセスではなく一次自己免疫プロセスの標的になっているのであろう。この状態は両方の抗原に対する抗体が、タイプ１糖尿病の臨床的発症の数年前に現われることによって裏付けられている。したがって糖尿病前症グループの抗−３８ｋＤ抗体陽性の６人はその非常に初期のサンプル（それぞれ臨床的発症の３、９、２５、３３、５３、および７４か月前）においてすべて陽性であり、３／６の患者の糖尿病前症期間から得られたその後の追跡サンプルでも抗体は持続していた。同様に、抗−ＧＡＤ₆₅抗体も臨床的発症前３−８５か月に得られたサンプルにおいて検出され、この結果は、ベッケスコフら、J.Clin.Invest.、７９（３）、９２６−９３４（１９８７）、およびアトキンソン（Atkinson）ら、Lancet、３３５：１３５７−１３６０（１９９０）に記述されている通り、われわれの以前の研究とも一致している。したがって、抗−３８ｋＤ抗体ならびに抗−ＧＡＤ₆₅抗体の両方を臨床的発症の数年前から血清中において検出することができ、このことはこれらが初期のβ細胞破壊のマーカーであることを示している。ヒト膵臓の凍結切片の免疫蛍光法によるＩＣＡの検出率は７５％（９８／１３０）であった。３つのグループにおいて、抗−３８ｋＤおよび／または抗−ＧＡＤ₆₅免疫沈降アッセイによって、免疫蛍光法ではＩＣＡ陰性であった人合計１８人を検出しており、これはこれらの抗原に対する抗体の検出において免疫蛍光法は低感度であることを示している。ブロッキング実験によりＩＣＡ応答は、何人かの患者で糖尿病前症期間にＧＡＤ拘束から非ＧＡＤ拘束に進行することが明らかとなっており、アトキンソンら、（１９９３）J.Clin.Invest.、９１：３５０ −３５６に記述されているように、このことは長期間のβ細胞破壊期間中に抗原反応性が広がることを示唆している。興味深いことに糖尿病前症グループのすべてのＩＣＡ陽性患者は抗−３８ｋＤ抗体および抗−ＧＡＤ₆₅抗体のいずれか、または両方に陽性であった。これに対し、新たに糖尿病と診断された若年および高齢者グループのそれぞれ４人および６人のＩＣＡ陽性患者は、抗−３８ｋＤ抗体および抗−ＧＡＤ₆₅抗体の両方に対して陰性であり、これはこれらの患者の体液自己免疫応答には臨床的発症の時点でその他の標的分子を含み得ることを示唆している。免疫沈降ではこれらの血清によって特異的に認識される膵島細胞タンパク質は明らかにならなかった（結果は表示していない）。これらの抗−３８ｋＤ抗体ならびに抗−ＧＡＤ₆₅抗体陰性の血清におけるＩＣＡ反応性は、ナヤック（ Nayak）ら、（１９８５）Diabetes、３４：６１７−６１９に記述されているように、ガングリオシドのような非タンパク質分子に向けられるのであろうと考えられる。最後に、糖尿病前症グループの８人、および新たに糖尿病と診断された若年および高齢者グループのそれぞれ２人および３人は、この３つの試験すべてにおいて抗体陰性であった。この研究で解析された抗−３８ｋＤ抗体はその標的を未変性状態では認識しなかったが天然（未処理）状態で認識し、これは抗−ＧＡＤ₆₅抗体はもちろんのこと抗−３８ｋＤ抗体は主として立体配座のエピトープに向けられていることを示唆している。β細胞の破壊は抗体や補体によるものではなくて基本的にＴ細胞の介在によるものと考えられているが、β細胞破壊の早期の段階に存在する膵島細胞抗体は、病原性Ｔ細胞と同じ抗原に向けられているように考えられる。われわれはタイプＩ糖尿病の自己抗体によって特異的に認識される別の膵島細胞タンパク質を検出するべく、糖尿病血清および対照群血清を用いた³⁵Ｓ−メチオニン標識化膵島のデタージェント溶解物の免疫沈降物を、一次元および二次元ゲル電気泳動により幅広く解析した。厳格な免疫沈降条件においては、抗体は（１）ＩｇＧアイソタイプであること（プロテインＡ−セファロース（登録商標）への結合のため）、（２）他の膵島細胞タンパク質が豊富な中でその標的タンパク質を認識するために充分な親和性と特異性を備えていること、が要求される。我々はこのアッセイを用いて、ＧＡＤおよび３８ｋＤタンパク質以外に糖尿病の血清の大多数によって定常的かつ特異的に認識されるタンパク質を検出することはできなかった。特に、パーマー（Palmer）ら、（１９８３）Science、２２２：１３３７−１３３９およびカルハライネン（Karjalainen）ら、（１９９２）N.Eng.J.M ed.、３２７：３０２−３０７に記述されているような、糖尿病血清中の抗体の標的になると各所で報告されているインスリン、およびウシ血清アルブミンと相同性のある６９ｋＤタンパク質は免疫沈降では検出されなかった（ベッケスコフら、（１９８９）前掲）。したがって、タンパク質抗原に対する強いＩｇＧ応答はヒトの疾患においてＧＡＤ₆₅および３８ｋＤ分子に限られたものであろう。高力価の抗−ＧＡＤ₆₅および抗−３８ｋＤＩｇＧ抗体がβ細胞自己免疫性の早い段階で検出されることから、これらの分子各々を認識する活性化されたＣＤ４⁺ ヘルパーＴ細胞が存在するであろうとわれわれは推測する。事実、ＧＡＤおよび３８ｋＤβ細胞タンパク質に対する反応性は両方とも、アトキンソンら、（１９９２）Lancet、３３９：４５８−４５９；ディアズ（Diaz）ら、（１９９２）Di abetes、４１：１１８−１２１；ロープら、（１９９０）Nature、３４５：６３２−６３４；ロープら、（１９９１）Lancet、３３７：１４３９−１４４１に記述されているように、新たに糖尿病と診断された患者のＴ細胞株を使って示されている。ここで述べてきた３８ｋＤ抗原と３８ｋＤＴ細胞剌激性タンパク質（ロープら、（１９９０）前掲、およびロープら、（１９９１）前掲）の関係の解明は今後に残された課題である。本発明を読者が明確に理解出来るよう、例示によってある程度詳細に説明してきたが、添付の請求の範囲内である程度の変更や修正が可能であることはいうまでもない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アーンストゥート、ヘンク−ジャンアメリカ合衆国 94122 カリフォルニア州サンフランシスコナンバー３テンスアベニュ 1428

Claims

【特許請求の範囲】１．無症候性のヒト患者におけるインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）の発病の危険性評価方法であって、患者の血清サンプル中の３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体の存在を検出することを含み、ここで該３８ｋＤ自己抗原は５．６から６．１の範囲のｐＩを有する両親媒性の膜結合膵島細胞タンパク質であり、該自己抗体の存在が患者のＩＤＤＭ発病の可能性を示すものである方法。２．前記自己抗体を標識化自己抗原を用いた免疫沈降によって検出する請求項１に記載の方法。３．前記自己抗体を、固体相上に固定化された自己抗原との反応、血清サンプルからの該固体相の分離、および該固体相に結合した自己抗体の検出によって検出する請求項１に記載の方法。４．無症候性のヒト患者におけるインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）の発病の危険性評価方法であって、患者からの血清サンプル中の３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体を、該自己抗体に結合するリガンドに接触させること、ここで、該３８ｋＤ自己抗原は５．６から６．１の範囲のｐＩを有する両親媒性の膜結合膵島細胞タンパク質であること、血清サンブル中の６５ｋＤ自己抗原に対する自己抗体を、該自己抗体に結合するリガンドに接触させること、ここで、該６５ｋＤ自己抗原はグルタミン酸デカルボキシラーゼであること、前記３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体を検出すること、ならびに、前記６５ｋＤ自己抗原に対する自己抗体を検出することを含み、ここで、これらのいずれかまたは両方の自己抗体の存在がインスリン依存性真性糖尿病を発病する可能性を示すものである方法。５．前記３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体を標識化３８ｋＤ自己抗原を用いた免疫沈降によって検出する請求項４に記載の方法。６．前記６５ｋＤＧＡＤに対する自己抗体を標識化６５ｋＤＧＡＤを用いた免疫沈降によって検出する請求項５に記載の方法。７．前記３８ｋＤ自己抗原に対する自己抗体を、固体相上に固定化された３８ｋＤ自己抗原との反応、血清サンプルからの該固体相の分離、および該固体相に結合した自己抗体の検出によって検出する請求項４に記載の方法。８．前記６５ｋＤＧＡＤに対する自己抗体を、固体相上に固定化された６５ｋＤＧＡＤとの反応、血清サンプルからの該固体相の分離、および該固体相に結合した自己抗体の検出によって検出する請求項７に記載の方法。９．無症候性のヒト患者におけるインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）の発病の危険性評価方法であって、患者から血清サンプルを採取すること、その血清サンプルを、５．６から６．１の範囲のｐＩを有する３８ｋＤ膜結合膵島細胞タンパク質に対する自己抗体と特異的に結合する第１のリガンドに曝露すること、並びに、該リガンドと自己抗体との結合を検出することを包み、ここでこの結合が患者のＩＤＤＭ発病の可能性を示すものである方法。１０．請求項９に記載の方法であって、その血清サンプルを６５ｋＤＧＡＤ自己抗原に対する自己抗体と特異的に結合する第２のリガンドに曝露することを更に含む方法。１１．前記３８ｋＤタンパク質に対する自己抗体に結合する第１のリガンドが３８ｋＤタンパク質を包含する、請求項１０に記載の方法。１２．前記６５ｋＤＧＡＤに対する自己抗体に結合する第２のリガンドが６５ｋＤＧＡＤを包含する、請求項１１に記載の方法。１３．前記第１および第２の物質がそれぞれ検出可能な標識に結合され、かつ前記検出が免疫沈降を包含する、請求項１２に記載の方法。１４．前記第１および第２の物質がそれぞれ固体相に結合されており、該固体相を血清サンプルから分離すること、および固体相に結合した自己抗体を検出することを更に含む請求項１２に記載の方法。１５．前記検出のステップを疾患の臨床的発症の少なくとも１年前に行う請求項１に記載の方法。１６．前記検出のステップを疾患の臨床的発症の少なくとも２年前に行う請求項１に記載の方法。