JP2001505999A

JP2001505999A - Ｔｓｈレセプター自己抗体を検出するためのレセプター結合アッセイ

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Publication number: JP2001505999A
Application number: JP52617998A
Authority: JP
Inventors: ベルグマン，アンドレアス; ストラック，ジョアチム
Original assignee: ベー．アール．アー．ハー．エム．エスディアグノスティカゲーエムベーハー
Priority date: 1996-12-09
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 2001-05-08
Anticipated expiration: 2017-12-03
Also published as: DE59712224D1; US6537760B1; EP0943098B1; ATE290696T1; WO1998026294A1; JP3499570B2; DE19651093C2; DE19651093A1; EP0943098A1

Abstract

(57)【要約】生物試料中のＴＳＨレセプター自己抗体の測定の為の競争的レセプター結合アッセイに於て、その試料を、（i）ＴＳＨレセプター又はＴＳＨレセプター調製物、（ii）プライマリーコンペティター、例えば標識化ＴＳＨ、及び(iii)ＴＳＨレセプターとＴＳＨレセプターに結合されている反応混合物の成分との複合体を液相から分離するための試薬、を含有する反応混合物中で反応させる。本発明によれば、この反応はＴＳＨレセプターの部分ペプチド配列に対し特異的な少なくとも１種のモノクローナル又はポリクローナル抗体の存在下で実施される。この特異的抗体は、ＴＳＨレセプターとプライマリーコンペティターの複合体を固定する為に、及び／又は、試料中に存在することが予測されるＴＳＨレセプター自己抗体の別の部分に対するセカンダリーコンペテターとして、使用される。プライマリー又はセカンダリーコンペティターは、選択的に標識されているか、又は標識出来るものである。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ＴＳＨレセプター自己抗体を検出するためのレセプター結合アッセイ本発明は甲状腺の自己免疫病、特にグレーブス病において生じるＴＳＨレセプター自己抗体を測定するための競争的レセプター結合アッセイ（競合レセプター結合アッセイ）に関する。甲状腺が関与する多くの病気は甲状腺の分子構造に対する自己抗体が形成され、そして病気と関連して自己抗原として作用し始める自己免疫病であることが知られている。甲状腺の自己抗原として知られる最も重要なものはチログロブリン（Ｔｇ）、チロイドパオキシダーゼ（ＴＰＯ）そして特にＴＳＨレセプター（ＴＳＨｒ）である。（フルマニアックジェイ(Furmaniak J.)等、Autoimmunity １９９０，７巻６３−８０頁を参照）。ＴＳＨレセプターは甲状腺膜に局在し、脳下垂体腺によって分泌されるホルモンのＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン又はチロトロピン）がこれに結合し従って実際の甲状腺ホルモン特にチロキシンの分泌の引き金となるレセプターである。ＴＳＨレセプターは、大きなアミノ末端細胞外ドメインを有している、Ｇ−プロテイン結合糖蛋白質レセプターからなるレセプターファミリーに属し、このファミリーにＬＨ／ＣＧ及びＦＳＨレセプターも属している。ＴＳＨレセプターの化学構造すなわち、それをコードしているＤＮＡ及びそこから誘導されるレセプター自体のアミノ酸配列は１９８９年の終りに明らかにされた（リバートエフ等，Bi ochem．Biophys．Res．Commun．165: 1250-1255; ナガヤマワイ等． Biochem ．Biophys．Res．Commun．165:1184-1190;を参照、又 EP-A-0433509及びWO-A-9 1/09121; 及び WO-A-91/09137;WO-A-91/10735及び WO-A-91/03483も参照; 更にユージナガヤマ及びバシルラボポート：Molecular Endocrinology，６巻Ｎｏ．２、１４５−１５６頁及びそこに引用された文献も参照）。刺激性自己抗体は、グレーブス病としてしられる甲状腺自己免疫病に於て、ある役割を果たすことが一般に知られており、その自己抗体はＴＳＨレセプターに対して形成されそしてそれと相互作用をするので、甲状腺が刺激され甲状腺亢進症として現われる。従ってＴＳＨレセプターに対する自己抗体の測定はグレーブス病の診断のためにかなりの臨床的な重要性を有している。実験動物又は特別な細胞培養基が役割を果たすような、そしてまた現在となっては特には歴史的な興味しかない検定方法は別として（シムドライゲル等(Sch umm-Draeger)、Akt．Endokr．Stoffw．10(1989)，９０−１０２頁）、今日まで本質的に２つの基本的な方法に従ってＴＳＨレセプター自己抗体を測定することが可能である（モルゲンターラー(Morgenthaler) エヌジー等 Exp Clin End ocrinol Diabetes 104（1996）増補版(Suppl)４５６〜５９頁）。細胞刺激試験に於て、文献中ではしばしば省略記号ＴＳＩ（ＴＳＩ＝甲状腺刺激性イムノグロブリン）と呼ばれる刺激性ＴＳＨレセプター自己抗体の存在は次のような事実となってその正体が現われる。即ち、細胞膜中に天然又は組替えＴＳＨレセプターを有し、そして自己抗体を含有している試料と接触する適当な細胞の特定機能特にｃＡＭＰの形成（環状アデノシンモノフォスフェート）がその刺激によって引き金を引かれた如く現われるか又は強化されるということである。バイオアッセイとも呼ばれるこれらの試験に於て、刺激効果は選択的に測定されるが、測定は極めて複雑で従って通常の臨床診断には非常に適しているものとは言えない。別の方法として、自己抗体は競争的なレセプター結合アッセイ、特にラジオレセプターアッセイ、例えばベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカゲーエムベーハー．(B.R.A.H.M.S．Diagnostica GmbH)からのＴＲＡＫ −アッセイ^Rの使用によって測定することも出来る。この慣用方法によるＴＳＨレセプター自己抗体の測定の為には、測定されるべき血清試料に由来する自己抗体は、液相において、洗剤で可溶化されたブタＴＳＨレセプターの結合場所に対して放射性の標識が付けられたウシＨコンペティター（競争物質）と競争させられる（サウスゲート(Southgate) ケー等Clin．Endocrinol．（オックスフォード）２０，５３９−５４１（１９８４）；マツバティ等， J．Biochem. １１８，２６５−２７０頁（１９９５）；ＥＰ７１９８５８Ａ２；ベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカゲーエムベーハー． (B.R.A.H.M.S．Diagnostica GmbH)からのＴＲＡＫ−アッセイ^Rについての製品情報を参照）。レセプター調製物に対し結合した標識化されたＴＳＨを測定するために、培養が完了したのちにＴＳＨレセプターは沈殿試薬を用い、その後の遠心段階を用いて液相から分離される。レセプターに結合した標識化ＴＳＨは沈殿物中の結合した放射活性を測定することによって測定される。測定は標識化ＴＳＨと測定されるべき自己抗体の間のＴＳＨレセプターの共通した結合場所に対する競争に基づいているから、実際にＴＳＨと競争する自己抗体の全部のみがこの方法で測定される。ＴＳＨ結合を阻害することができるそのような競争性の自己抗体は文献でＴＢＩＩ（ＴＢＩＩ＝チロトロピン結合阻害性イムノグロブリン）とも呼ばれ、それらの活性の程度もいわゆるＴＢＩＩ活性％として述べられる。異なる組成の異質な自己抗体群が甲状腺の自己免疫病で形成されることが以前から知られている。刺激性自己抗体とＴＳＨと競争性の自己抗体とは部分的にしか一致しない。即ち、ＴＳＨと競争しない刺激性の自己抗体が存在し、又刺激効果を有しないＴＳＨと競争性の自己抗体が存在する。更に刺激効果も有さずＴＳＨとも競争しない自己抗体も存在する（例えばラドゲート(Ludgate)エム等Mol.C ell.Endocrinol.73(1990),R13-R18;フィレッティ(Filetti) エム等，J．Clin． Endocrinol．Metab．72，１０９６−１１０１頁1991; モルゲンサーラー(Morge n thaler) エヌ．ジー等， Exp Clin Endocrinol Diabetes 104(1996)Suppl４，５６−５９頁及びその中に援用された文献を参照）。この結果、ラジオレセプターアッセイによっても自己抗体はグレーブス病にかかっている患者の約８０〜９０％しか検出することができない（例えば「免疫学に於ける推論診断」［Rati onal Diagnostics in Endocrinology］， Thieme Verlag，４９頁パラグラフ： TSH Rezeptorautoantikorper（ＴＳＨ−ＲＡＫ）［ＴＳＨレセプター自己抗体（ＴＳＨ−ＲＡＢ）］；又はロパーズエー等，Cell．Immunol．161，２６２−２６９頁(1995)；オオモリエム等，Biochem．Biophys．Res．Commun．174，No.1(1991)，３３９−４０３頁；エンドウティ等，Biochem．Biophys．Res．Commun．181，No.3(1991)，１０３５−１０４１頁；グプタエム．ケー，Clin．Biochem．２５，１９３−１９９頁(1992)を参照）。グレーブス病で生じる自己抗体の一部を検出することが出来ないのは、今日まで競争的なラジオレセプターアッセイの測定原理のためであるから、グレーブス病にかかっている患者の臨床的な様子と、競争するＴＢＩＩ自己抗体の測定の結果との間の不一致が明らかであるかどうか、刺激性のＴＳＩ自己抗体を測定するための補充的なバイオアッセイ測定を実施することがかなりの複雑さにも拘らずすでに提案されている（デルウォールエム等，Ex p.Clin.Endocrinol.100(1992)，７５−７９頁）。記載されたように臨床的な価値が限られていることとは別に、ＴＳＨレセプター自己抗体の検出の為の今日まで知られている競争的なラジオレセプターアッセイは、ＴＳＨレセプター調製物の結合能力がレセプターの変化又はそれによって結合される生物分子の変化に対し、一般的に非常に感受性があるという事実の為に、実用性に於ける基本的な欠点を有している。例えばホルモン類又は自己抗体類等のペプチド性又は蛋白質性の生物分子の、レセプター類への結合は通常非常に複雑であり、レセプターと生物分子間の特異的な結合の形成はレセプターがなにも役割を果たさない多くのイムノアッセイの基礎となっている通常の抗原／抗体結合対の場合よりも、構造的な変化、特にレセプターの構造に於ける変化に対し、ずっと感受性が高い。ＴＳＨレセプターを固定する試み及び／又は標識する試みは、常に構造的な変化につながり、このことは非常にレセプターの機能を損なう。この結果、抗体／抗原結合を用いるイムノアッセイ、特に固定された結合パートナーが用いられ、そして測定の最後に固相に対するトレーサー結合の濃度が直接測定されるか又は酵素、酵素の基質又は化学発光トレーサーなどのかさばった分子が標識に使用されるイムノアッセイに於て利用出来る多くの基礎的なアッセイ型は、ＴＳＨレセプター自己抗体の測定のためにレセプター結合アッセイを実施するためには今日まで実際的には使用出来なかった。固相へのトレーサーの結合の測定は一連の測定に対する殆どの自動検定ユニットの基礎を形成するから、今日までそのような自動ユニット上でＴＳＨレセプター自己抗体の測定をするための既知の検定法を実施することは可能ではなかった。ＤＥ４３２８０７０Ｃ１特許は被覆されたチューブの技術に従って操作されるレセプター結合アッセイ法の一つの型を記載しており、ここでは標識又は固定された機能するレセプター調襞物を製造することの困難性が実際のレセプター結合反応のいわばシャドウ（影）を表わす競争反応系の固相成分に結合されることによって克服される。しかしながらこの方法の開示された原理は複雑すぎることが証明されており、従って通常の臨床診断に検定法を提供することは実現しそうはない。この特許の一般的なレセプター結合アッセイの問題についての一般的な記載及び特にＴＳＨレセプター自己抗体の測定についての問題に関する一般的な記載は参照によって本明細書に取り込まれることをここに明示する。更にＥＰ−Ｂ−０４８８１７０は、細胞のないレセプター結合試験を開示しており、ここではアミノ末端レセプター蛋白質及びキャリア蛋白質特にイムノグロブリンの重い鎖の一定断片（Ｆｃ）からなる組替え融合レセプターが使用され、この融合レセプター類は高血清又はモノクローナル抗体によって固相に結合される。議論されるレセプター類は高分子量Ｇ−蛋白質結合糖蛋白質レセプターからなるクラスには属しない。更に、イムノグロブリンのＦｃ断片であるキャリア蛋白質を結合させることによる固定化は、その固定化の助けによって自己抗体が測定されるべきレセプター結合アッセイには非常に適してはいない。なぜならば自己抗体それら自身がイムノグロブリン類に属し、固定系に結合し得るからである。更に、ＤＥ４１２０４１２Ｃ１は、固定された特異的自己抗体、適当な臓器抽出物の形態の粗製自己抗原、特にＴＰＯ、及び標識された更に別の抗体から構成されるサンドイッチの、試料中に存在する自己抗原に対する自己抗体による攪乱が測定の為に使用される自己抗体の測定法を開示している。攪乱の意味は、試料中に存在する自己抗体が、原則として各個々の免疫結合と、又は完成したサンドイッチの構造に関与する両方の免疫結合と相互作用できるということである。記載されたレセプターの感受性と要求される選択性を有している自己抗体が不足しているために、今日までこの原理を自己抗原がレセプターであり、標識された結合パートナーが標識されたホルモン例えばＴＳＨである場合に対し、応用することができなかった。ＴＳＨレセプターの分子構造が明らかにされた後に、ヒト組替えＴＳＨレセプター、そのようなレセプターの（シグナルペプチドなしの３９８個のアミノ酸からなる）Ｎ−末端細胞外断片、及びより短いレセプターペプチド部分配列のコンジュゲート類に対するモノクローナル及びポリクローナル自己抗体が、ＴＳＨ結合及び抗体結合の責任を担っているＴＳＨレセプターのエピトープを明らかにする目的で、数多くの研究グループによって製造された。（例えばエヌ．ジー．モルゲンサーラー(Morgenthaler)等，Exp Clin Endocrinol Diabetes 104(1996)Su ppl４ 56-59頁; シーサラマイアージー．エス．等，Endocrinology 134，No. 2，549-554頁(1994); デサイアール．ケー．等， J．Clin．Endocrinol．Me tab．77:658-663，1993; ダラスジェイ．エス．等， Endocrinology 134，No .3，1437-1445頁(1994);ジョンストンエー．ピー．等，Mol．Cell．Endocrino l．105(1994)，R1-R9; シーサラマイアージー．エス．等， Endocrinology1 36，No.7，2817-2824頁(1995); ニコルソンエル．ビー．等， J．Mol．Endo crinol．(1996)16，159-170頁; ロパースエー．等， Cell．Immunol．161，2 62-269頁(1995); オオモリエム．等， Biochem．Biophys．Res．Commun．17 4，No.1(1991)，399-403頁;エンドティ等，Biochem．Biophys．Res．Commun． 181，No.3(1991)，1035-1041頁; コスタグリオラエス．等， Endocrinology 128，No.3，1555-1562頁，1991; マリオンエス．等， Endocrinology 130 ，No.2，967-975頁(1992); ジェイ．サンダース等， J．Endocrinol．Invest ．19(Suppl６),1996及び更にこれらの刊行物に引用されている文献を参照）。ＴＳＨレセプター又は組替えによって造られたその部分配列に対する種々の自己抗体の結合挙動について、そして特にＴＳＨレセプターの種々の形態又は断片に対するＴＳＨの結合の乱れを生じる種々の抗体の能力に関して、種々の抗体が試験された。種々のポリクローナル又はモノクローナル抗体が異なる動物を免疫化することにより及び／又は異なる発現系からの組替え物質を使用することによって造られて以来、そして組替えで造られた異なる起源からのＴＳＨレセプター又はそのペプチド断片が、しばしば結合試験に使用されたあとでも、そして更にレセプターペプチドのグリコシル化及び／又は正しい折り曲げ(folding)が多くの抗体の結合に決定的に必要でありそうであることがわかって以来、天然のＴＳＨレセプターのエピトープ構造及びポリクローナル自己抗体の固体群中に生じる自己抗体のエピトープ特異的な結合挙動は未だ完全に説明されてはいない。例えばダラスジェイ．エス．等，Endocrinology 134，No.3，1437-1445頁(1 994)による刊行物中で、バクロウィルス／昆虫細胞発現系の助けにより造られたそして、Ｎ−末端シグナルペプチドのないヒトＴＳＨレセプターの細胞外ドメインのアミノ酸を有している部分的な組替えＴＳＨレセプターが、ウサギを免疫化するのに使用され、そして約２０個のアミノ酸を各々有している合成ペプチドを使用してアフィニティクロマトグラフィーによって生じるイムノグロフリンフラクションから、特異的な抗体フラクションが得られる。次に上記の特異的な抗体フラクションは、なかでも市販レセプター結合アッセイ中での可溶化されたブタＴＳＨレセプターに対するＴＳＨの結合を封鎖する適正について調べられる。この抗体は刺激活性を示さなかった。シーサラマイアージー．エス．等，Endocrinology 136，No.7，2817-2824頁 (1995)による刊行物は、上記の刊行物のものと同じ部分的な組替えＴＳＨレセプターが、マウスを免疫するのにどの様に使用されたか、そして標準技術に従ってＴＳＨレセプターの個々のエピトープに対するモノクローナル抗体を造るのにどの様に使用されたかを記載している。同様の手順がニコルソンエル．ビー．等，J．Mol．Endocrinol．(1996)16，159−170頁に記載されている。上に記載されたように造られたシーサラマイアージー．エス．等，Endocrin ology 134，No.2，549-554頁(1994)に従う部分的な組替えＴＳＨレセプターは、その後折り曲げられて放射性標識化ＴＳＨを結合する適性について試験された。この目的の為に、これは放射性標識化ＴＳＨと液相で反応させられる。次に、生じる複合体をできるだけ定量的に反応混合物から分離するために、完全なＴＳＨレセプター配列の３５７−３７２のアミノ酸を含有し、そして折り曲げられてない部分的な組替えＴＳＨレセプターに対しＴＳＨの結合を阻害しないことが示されているペプチド断片のコンジュゲートでウサギを免疫化することによって造られた抗体が、沈殿系の一部として加えられる（デサイアール．ケー．等，J．C lin．Endocrinol．Metab．77:658-663，1993）。次に加えられた抗体又はそれを含有している複合体及び結合されている放射性標識化ＴＳＨは任意の抗体と非特異的に結合するプロテインＡの助けにより沈殿させられる。試験条件下でプロテインＡのレセプター結合抗体に対する結合は、同時にＴＳＨ結合を損なうことがないように見える。組替えＴＳＨレセプター又はその部分に対する抗体を使用して得られた知識は、イムノプレシピテーションアッセイの形態に於て第３のそれ自体は知られている原理を使用することによってＴＳＨレセプター自己抗体を測定するという提案に導かれ、そこでは³⁵Ｓ−標識化メチオニンを組込むことによって標識される組替えＴＳＨレセプターの細胞外の部分の調製物が沈殿の為の試薬として使用される。そのような検定はＴＳＩにもＴＢＩＩにも選択性を有していない（エヌ．ジー．モルゲンサーラー等，Exp Clin Endocrinol Diabetes 104(1996)Suppl４５６−５９頁）。しかしながらインヴィトロの翻訳による標識化されたレセプターを調製することは極めて複雑で費用がかかり、³⁵Ｓによって放出される放射線のための通常の臨床的な測定に適した測定装置は存在しない。従ってこの方法は通常の臨床診断の為の測定方法としては適していない。本発明の目的は、先行技術のそのような競争的レセプター結合アッセイの記載された欠点を有しないＴＳＨレセプター自己抗体を測定するための競争的レセプター結合アッセイを提供することである。特に本発明の目的は、慣用の固相上での測定する検定方法の反応体から形成されたＴＳＨレセプター複合体を固定することが可能であり、そして適したトレーサーがないということに関する既存法の制限を克服することが可能であるので、そのようなレセプター結合アッセイの為の自動的方法を用いることが可能である、ＴＳＨレセプター自己抗体を測定するための改良された競争的レセプター結合アッセイを提供することである。特に本発明の更に別の目的は、先行技術の検定法と比較してより大きな臨床価値が得られるような方法で、ＴＳＨレセプター自己抗体の検出の為の改良された競争的レセプター結合アッセイを設計することである。本発明の更に別な目的は、そのような改良されたレセプター結合アッセイを通常の臨床診断に於て実施するための試薬キットを提供することである。上記の目的は請求項１のプレキャラクタライジングクローズ（前段）に従って、請求項１のキャラクタライジングクローズ（後段）に記載された特徴を有している、少なくとも一部はラジオレセプターアッセイによって達成される。（原文脱文あり）本発明に従う改良されたレセプター結合アッセイの有利な具体例はサブクレーム中に記載されており、特に本明細書の記載中の次の説明と組合せて記載される。対応した試薬キットを提供する目的は、各場合に於て請求項１５に従う成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の少なくとも一つを含有している本発明に従う方法を実施するための試薬キットによって達成される。本発明のレセプター結合アッセイの為の種々の可能な具体例をカバーするために、下にイントロダクションによって説明される一般的な表現のモードが、請求項１において、そのようなレセプター結合アッセイの既知の特徴を記載するためにも、そして本発明に従うレセプター結合アッセイが先行技術のものとは異なる特徴についても、用いられる。イントロダクション部分で説明されるように、全てがラジオレセプターアッセイとして設計されている既知の競争的レセプター結合アッセイは次の検定成分を含有している。可溶化されたＴＳＨレセプター（ｉ）、特に可溶化された天然の動物（ブタ）ＴＳＨレセプターであって動物の甲状腺膜から得られるもの。更に既知のラジオレセプターアッセイは放射標識されたウシＴＳＨ（ｉｉ）を含有し、これは、使用されるＴＳＨレセプター上の共通の結合場所について血清試料（ＴＢＩＩ）からのＴＳＨレセプター自己抗体と競争する。この競争は今日まで最も重要性を有するものであり、又存在する自己抗体の大部分、即ち８０〜９０％の測定を可能にもするものであるので、先行技術の標識化されたＴＳＨは、請求項１で使用される「プライマリーコンペティター」という定義によってカバーされる。しかしながらこの定義は又他の形態の「プライマリーコンペティターズ」を含むものであり、この場合の使用は本発明によって初めて許されるものである。即ちより詳しく下に記載するＴＳＨレセプターに対する標識化された選択的抗体も、ＴＢＩＩに対する競争者として、又必要ならば他の自己抗体フラクションに対する競争者として使用出来る。更にＴＢＩＩとの競争のため、固相に結合したＴＳＨも「プライマリーコンペティター」の定義を満たすことが出来るべきである。初めにも説明したように、ＴＳＨレセプターとこれと結合している反応混合物の成分即ち標識化されたＴＳＨと自己抗体との複合体は沈殿試薬によって反応混合物から沈殿され、そして遠心分離により反応混合物から分離される。請求項１のプレキャラクタライジングクローズ（プレアンブル）の意味に於て、沈殿試薬は（ｉｉｉ）に従う試薬としてみなされるべきである。本発明に従う競争的レセプター結合アッセイの場合に於ては、そのような試薬（ｉｉｉ）は固相に結合している反応体に対応し、そして固相上で固定されている主として特異的ＴＳＨレセプター抗体であるが、「鏡像」具体例に従うとこれは又固相に結合したＴＳＨでも有り得る。本発明に対し必須の発見は、ＴＢＩＩ自己抗体及び標識化されたＴＳＨに対するＴＳＨレセプターの結合能力が有為に損なわれることなしに、ＴＳＨレセプターの適当な部分配列に対し特異的となされている固定された選択的抗体の助けによって、任意の種類の可溶化されたＴＳＨレセプター調製物からの天然のＴＳＨレセプター（即ち折り曲げ／グリコシル化が、天然のＴＳＨレセプターに少なくとも本質的に対応している、ヒト、動物又は組替えＴＳＨレセプター）の固定も可能であるという発見である。従ってこの発見は、固相への結合が測定できるという形態に於て、例えばプライマリーコンペティター放射標識化ＴＳＨの、結合され標識化されたコンペティターの量が測定できる方法でＴＳＨレセプター自己抗体の測定の為のレセプター結合アッセイを実施するための前提条件を造りだす。しかし驚くべきことに、選択的ＴＳＨレセプター抗体の助けによって固相上にＴＳＨレセプターを固定することにより、ＴＳＨレセプター自己抗体の測定の為の競争的レセプター結合アッセイの臨床的価値をかなり改良することが可能であることが更にみいだされた。下により詳細に説明されるように、実際固相に結合される特異的抗体の適当な選択によって、この検定系は試料からの自己抗体が競争することができる少なくとも更に１つの結合場所を含有している。固相に結合された抗体が、「プライマリーコンペティター」による競争によって測定されるＴＢＩＩとは別の、試料中の自己抗体と競争する「セカンダリーコンペティター」として作用するように選択されるならば、臨床的な価値の増加が達成される。実際、生じる測定系は、患者の試料からの異質ポリクローナル自己抗体でのサンドイッチの異なる結合場所でダブルディスターバンス（２箇所の攪乱）が存在している。ＤＥ４１２０４１２の図３に図解される検定系と類似のものとみなすことが出来るものである。このようなディスターバンス（攪乱）はトレーサーが固相に結合することを防止するのに十分であり、測定範囲は広げられ感度が増加する。２つの抗体と粗製抗原を使用するそのような変形が米国特許５，５０１，９５５にも記載されている。本発明の方法に従って、例えば、（シグナルペプチドを含んでいる）完全なＴＳＨレセプターのアミノ酸配列の２０〜３９のアミノ酸を有する合成ペプチドに対し造られた特異的な抗体を使用することによって、臨床の症状に基づいてグレーブス病患者に分類される全ての患者は、慣用のラジオレセプターアッセイでは８０％しか陽性として測定されなかったにも拘らず、自己抗体陽性として全ての患者が測定された。グレーブス病の間に発生するＴＢＩＩ以外の自己抗体と競争する「第２の競争者（セカンダリーコンペティター）」を使用することによって、グレーブス病の診断の為のレセプター結合アッセイの臨床価値をかなり改良することが可能である。「セカンダリーコンペティター」は好ましくは細胞刺激試験中で刺激性と測定され、そしてＴＳＨとの競争性がないために慣用のラジオレセプターアッセイによっては検出されない自己抗体（ＴＳＩ）と競争することが好ましい。しかしながら「セカンダリーコンペティター」が競争する自己抗体は実際には刺激効果を有する必要が無く、従ってグレーブス病の臨床症候群を強める必要は無い。「セカンダリーコンペティター」と競争する自己抗体は、封鎖効果を有している自己抗体サブポピュレーションに属することも出来、又は実際の病理学的過程に対し重要でないもので有り得る。そのような自己抗体サブポピュレーションがグレーブス病にかかっている患者の血清中で常に又はしばしば存在する限り、このレセプターアッセイの臨床的価値は、ＴＢＩＩ自己抗体のみを検出する慣用のラジオレセプターアッセイのものよりも大きいものである。従って好ましい「セカンダリーコンペティター」を形成する適当な選択的抗体は、ＴＳＨ結合に参加しないがグレーブス病中で自己抗体が形成されるＴＳＨレセプターの断片に対する抗体である。アフィニティクロマトグラフィによって精製されたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として製造された抗体を使用する今日までの研究は、選択的な抗体として特に適した結合領域であるＴＳＨレセプターの幾つかの断片を生じている。しかしながら今日までの文献データーの解釈に於て、殆どの選択的抗体が組み替えによって造られたＴＳＨレセプターペプチド又は合成ペプチド断片に対し造られたものであって、従っておそらく配列を有する性質のものであるということが注意されるべきである。自然界に於て記載される抗体の主要な部分が細胞刺激試験において無効であることが更に証明されている。このことは血清からの自己抗体との競争にもかかわらず、合成によってつくられた抗体を測定されるべき自己抗体と同一視することができないことを示している。更に天然のＴＳＨレセプターの折り曲げ及びそのグリコシル化の為に、ネイティブなＴＳＨレセプター調製物に対する合成的に造られた抗体の結合挙動は、合成ペプチド又は組替えによって造られたＴＳＨレセプター断片の結合挙動とは異なり得る。しかし本発明の教える知識をもってすれば、特定の場合に於て比較的単純な通常の試験で本発明に従う方法のために特別な特異的抗体の適合性を決定し、そしてそれらの「セカンダリーコンペティター」として作用する能力を測定することが可能である。下に記載される試験は、完全なＴＳＨレセプターの２０〜３９のアミノ酸の範囲からのペプチドに結合することがしられている固定された特異的な抗体、及び慣用のトレーサーとして標識化標識化されたウシＴＳＨ「プライマリーコンペティター」を使用して実施された。使用された抗体は慣用のハイブリドーマー技術によって対応する合成ペプチドからのコンジュゲートの助けで免疫化された後に選択及び製造されたモノクローナル抗体であった。文献には同様にＴＳＨレセプターの細胞外ドメインのアミノ末端の同じ領域又は重複する領域に同様に結合する種々のポリクローナル又はモノクローナル特異的抗体が記載されている。（ダラスジェイ．エス．等 Endocrinology 134，No.3，1437-1445頁(1994); シーサラマイヤージー．エス．等， Endocrinology 136，No.7，2817-2824(199 5); ニコールソンエル．ビー．等， J．Mol．Endocrinol．(1996)16，259-2 70頁; オオモリエム．等， J．Endocrinol．(1992)135，479-484頁; エンドティ．等， Biochem．Biophys．Res．Commun．177，145-150頁(1991);ヒロオカワイ．等，Med．Sci．Res．1992，20，639-640頁参照）。上記刊行物中に記載される製造技術と抗体の型は原則として試験中で、特に使用された抗体を置き換えるのに適しているが、ＴＳＨレセプターの近い配列に対する抗体が非常に異なる抗体型に属し得ることが知られていることも注意されるべきである。実施例中で使用される抗体の代替物として、そしてヒトＴＳＨレセプターの２０〜３９のアミノ酸に対する抗体の代替物として、２８７〜３０１、３６１〜３８０又は７３９〜７５８の領域に対し造られた抗体も適している。しかし以下に記載される試験に基づいて、特別の場合に特別の性質がチェックされるべきである。慣用のラジオレセプターアッセイの最初の検定法（アッセイ）デザインが放射性標識されたＴＳＨとより大きな程度違ったもので、そして放射標識化ＴＳＨの変わりに別の標識化された選択的抗体が使用されるならば、「プライマリーコンペティター」と「セカンダリーコンペティター」の間の上記の区別は明確さがより少なくなるか又はその意味を完全に失うものと成り得る。これは本発明に従うレセプター結合アッセイの検定原理に関するなにものをも変化させず、そしてそのような検定も本発明によって保護されるという事実に関するなにものをも変化させないものである。測定溶液中に形成されるＴＳＨレセプター複合体の固定を、本発明に従う方法は複合体に直接結合されるトレーサーで又は固定後導入されるトレーサーで可能とするという事実の為、そして更に放射性同位体以外のトレーサーを有する試薬が使用できるから、ＴＳＨレセプター自己抗体アッセイの実際の操作は過去に可能であったものよりもずっとより良く臨床的な実施の要件に適合化できる。培養計画も変化されることができ、そして次の実施例中で記載される培養計画は最早必須ではないようである。プラスチック表面、ミクロ粒子、磁気粒子、フィルター、ポリマーゲル物質及び他の既知の固相基質を固相として使用できる。標識化された自己抗体を使用することが出来ること及び固定されたＴＳＨを使用することができること（固定されたＴＳＨに対する結合の為のＴＳＨレセプターの能力についてはリードマンピー．ジェイ．等J．Clin．Endocrinol．Metab．69，134-141頁1989を参照）は、かなりこの検定法の使用範囲を増加し、特に適当な直接又は間接のトレーサーの自由な選択に関して使用範囲を増加させるであろう。本発明の方法によって、ＴＳＨレセプター自己抗体アッセイを自動化することも可能である。従って検定法デザインは既知の自動システム上で実施することが出来るように適合化できる（例えばボーリンガーマンハイムからのエレクシスシステム又はチバコーニングからのＡＣＳ１８０システムを参照）。そのような自動化されたシステム中で、ピペット操作は試料の自動的取扱の過程で実施され、標識化されたＴＳＨとの又は自由に標識化された抗体（例えばルテニウム錯体標識化又はアクリジニウムエステル標識化）とのプレミックスとして、ＴＳＨレセプターに対する適当な特異的抗体で被覆されているか、又はＴＳＨで被覆された磁気粒子を次に混合することができ、そして最後に基本的に任意の適当なＴＳＨレセプター物質を加えることが出来る。培養後慣用の固相−液相分離が可能であり、そして信号を測定することができ、必要ならば適当な試薬を加えることによってシグナルの引き金を引いた後にこれを行うことができる。実施例に従って述べられたピペット操作の順序は変化し得る。本発明に従う方法は二つの図面を参照しながら、特定の具体例に基づいてより詳細に以下に説明される。図１は、以下の実施例で記載される本発明に従う方法の具体例について、常法で得られた標準曲線を示している。そして図２は、グレーブス病にかかっている患者群の測定の場合における本発明に従う方法によって得られた測定結果と慣用のラジオレセプターアッセイ（ベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカゲーエムベーハーからのＴＲＡＫ−アッセイ^R）によって得られた測定結果の比較を示している。実験の記載材料以下に記載される実験において、種々の市販物質が使用され、特にベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカゲーエムベーハー製ＴＲＡＫ−アッセイ^Rの成分、固定の為に造られた抗体を精製するためのファーマシア製ＮＡＰ２５デサリネーションカラム、固相基質物質としてピアース製カルボリンク材料及びフルカ製過ヨウ素酸ナトリウムが使用された。１．ＴＳＨレセプターに対するモノクローナル抗体の製造先行技術の方法によって（上を参照）、ｈＴＳＨレセプターの選ばれたペプチド類に対する種々のモノクローナル抗体が造られた。一つのペプチドに対するモノクローナル抗体であって完全なヒトＴＳＨレセプターの２０〜３９のアミノ酸（アミノ酸配列ＧＧＭＧＣＳＳＰＢＣＥＣＨＱＥＥＤＦＲＶ）を含有するモノクローナル抗体が、更に試験をするために用いられた。２．固相に結合されたモノクローナル抗体の製造。ＰＢＳ（リン酸塩緩衝化された塩溶液；50mM リン酸ナトリウム，100mM ＮａＣｌ，ｐＨ7.5）で１：１０に希釈されている、そして上記のモノクローナル抗体を含有している腹水溶液２０ミリリットル中に２５０ミリグラムの過ヨウ素酸塩を溶解し、培養を室温で３０分実施した。反応溶液をＮＡＰ２５脱塩カラム（ファルマシア）上で製造業者の方法によって脱塩した。脱塩された蛋白質をＰＢＳ中で洗浄されたカルボリンク(Carbolink)材料(10ミリリットル)と混合した。一定の振温をしながら４℃で一夜培養後、上にモノクローナル抗体が結合している生じるゲル０．５ミリリットルをプラスチックカラム(0.5X4cm)中に満たし、そして２５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５（洗浄容量2ml）で洗浄した。このカラムをＰＢＳ（2ml）で平衡化し、そして次に更に試験をするために使用した。３．上記カラムの助けによりＴＲＡＫ−アッセイ^R（ベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカゲーエムベーハー）の成分を使用してラジオレセプターアッセイを実施した。ラジオレセプターアッセイ（標準曲線の準備、患者試料の測定）をＴＲＡＫ− アッセイ^Rを実施するための方法に従って実施した。次のピペット操作計画が用いられた。５０μlの試料をピペットで取った。５０μlの可溶化されたウシＴＳＨレセプターを次にピペットで加えた。室温で１５分間培養を実施した。１００μlのトレーサー（放射性ヨウ素で標識したＴＳＨ）をピペットで加えた。得られた反応バッチを上記のようにモノクローナル抗体を負荷させた固相（カルボリンク材料を有するカラム）に移した。反応バッチを室温で１時間培養する。カラムを２mlのＰＢＳで洗浄する。固相に結合した放射能をガンマーカウンター中で測定し、これは固相を含有しているカラムを直接使用することにより又は結合した蛋白質を１mlの２５mMクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５で溶離した後のいずれかに行われる。患者の血清の測定の結果を評価するための標準曲線をつくるために対応する手順を使用し、２０００ＵＴＳＨ／mlを含有する標準と共に市販のＴＲＡＫ−アッセイ^Rからの標準が使用された。結果標準を使用して標準曲線（図１）が得られ、これは慣用のＴＲＡＫ−アッセイ^R のものに対応しており、即ち標識されないＴＳＨの添加量の濃度の増加と共に結合した放射能の減少が得られる。グレーブス病にかかっている患者の血清試料を市販のＴＲＡＫ−アッセイ^Rで本発明の方法に従って測定すると次の結果が得られた。４５人の健康な対照の人、及び３９人のグレーブス病にかかった患者からの血清を本発明の方法によって慣用のＴＲＡＫ−アッセイ^Rで測定した。測定の結果は表１にまとめられている。最初の治療前又は治療的な手段の開始後６週間以内の試料から生じるグレーブス病にかかった患者の血清。対照群（ｎ−４５）の自己抗体のない血清の測定についての平均値はＴＲＡＫ −アッセイ^Rについては４．１±６．４（２ｓ）Ｕ／ｍｌであり本発明の方法では４．８±８．８（２ｓ）Ｕ／ｍｌである。両方の試験中で９５．５％の比肩し得る特異性を維持するためにカットオフ（陰性の試料の値と陽性の試料の値の間の境界）を慣用方法については１１Ｕ／ｍｌに、そして本発明に従う方法については１４Ｕ／ｍｌに指定した。これらのカットオフ値を使用してグレーブス病にかかった患者の７９．５％（３９人中３１人）がすでに確立されているＴＲＡＫ−アッセイ^Rラジオレセプター方法中では陽性と評価された。本発明に従う方法による患者の同じグループの測定では驚くべきことに、グレーブス病にかかっている患者の１００％（３９人中３９人）が自己抗体陽性と測定された。慣用のＴＲＡＫ−アッセイ^Rで陰性（試料ナンバー２、３、１２、２９、３０、３４、３９）と測定された試料は、明らかに本発明に従う方法では陽性と評価された。その上、本発明に従う方法の更に別の利点は試料の主要部分がかなりより強い測定シグナルを有することが見出された。得られた結果は説明のために図２中にグラフで示される。固相に結合した特定の抗体と、ＴＳＨレセプター複合体に結合された放射標識されたＴＳＨを有するＴＳＨレセプター複合体との間の相互作用を試料中に存在する自己抗体によって乱すことが、本発明の方法では追加的に可能であるため、グレーブス病を診断する検定の臨床価値が増加するのみならず、両方の試験で陽性と同定された患者の場合に於ても、本発明の方法によって生じた実質的により強い、従ってより信頼性のある測定信号が生じる。グレーブス病の特徴として生じるＴＳＨレセプター自己抗体の測定の臨床的な価値は、従ってはっきりと高められる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１１月１７日（１９９８．１１．１７）【補正内容】請求の範囲（PCTチャプターIIの補正）１．反応混合物中の試料を、同時に又は順次、（i）可溶化された天然の人又は動物又は組替えＴＳＨレセプター調製物の形のＴＳＨレセプター、（ii）試料中にあることが予測されるＴＳＨレセプター自己抗体の少なくとも一部に対するプライマリーコンペティター、及び (iii)ＴＳＨレセプターとＴＳＨレセプターに結合されている反応混合物の成分との複合体を液相から分離するための試薬、と反応させ、そしてその生物試料中で測定されるべきＴＳＨレセプター自己抗体の存在及び／又は量が、該液相から分離された該ＴＳＨレセプター複合体中のコンペティターの量に基づいて、又は該液相中の結合していない該プライマリーコンペティターの残りの量に基づいて決定され、但し、上記目的の為に該コンペティターは標識化された形態で使用されるか又は固液分離後に標識化されるものである、生物試料中のＴＳＨレセプター自己抗体の測定の為の競争的レセプター結合アッセイ方法に於て、該反応が更に、該ＴＳＨレセプターの部分的なペプチド配列に対し特異的である少なくとも一つのモノクローナル又はポリクローナル抗体の存在下で実施されること、そしてこの特異的な抗体がＴＳＨレセプターとプライマリーコンペティターの複合体を固定するに際し、ＴＳＨ結合阻害能のある自己抗体（ＴＢＩＩ自己抗体）に対しまた標識化ＴＳＨに対しＴＳＨレセプターの結合能を有意に損なうことなく固定するための、固定剤として及び／又は試料中で存在することが予測されるＴＳＨレセプター自己抗体の更に別の部分に対するセカンダリーコンペティターとして使用されること、及び、上記のプライマリー及びセカンダリーコンペティターが、標識されているか又は選択的に標識されることができるものであること、を特徴とする競争的レセプター結合アッセイ方法。２．該少なくとも一つの特異的な抗体が、固相に結合した形で使用され、そしてプライマリーコンペティターが標識されたＴＳＨ又は標識された別のＴＳＨレセプター抗体であることによって特徴づけられ、該固相に対し結合されている特異的な抗体が、プライマリーコンペティターの結合によって影響を受けないでＴＳＨレセプターに結合することを特徴とする請求項１に記載のレセプター結合アッセイ法。３．同時に、該固相に結合された抗体が、プライマリーコンペティターのＴＳＨレセプターへの結合を妨げない、試料からのＴＳＨレセプター自己抗体と、プライマリーコンペティターによって認識されないエピトープについて競争するセカンダリーコンペティターであることを特徴とする請求項２に記載のレセプター結合アッセイ方法。４．該標識された更に別のＴＳＨレセプター抗体が、ＴＳＨレセプターのエピトープについてＴＳＨと競争することを特徴とする請求項２に記載のレセプター結合アッセイ方法。５．該固相に結合した抗体が、グレーブス病に特徴的に存在するが、ＴＳＨとは競争しない試料からのＴＳＨレセプター自己抗体と、セカンダリーコンペティターとして競争する、請求項３に記載のレセプター結合アッセイ方法。６．該セカンダリーコンペティターと競争するＴＳＨレセプター自己抗体が、刺激性の自己抗体（ＴＳＩ）に属することを特徴とする請求項５に記載のレセプター結合アッセイ方法。７．該少なくとも一つの抗体が、液相中でセカンダリーコンペティターとして標識された形態で使用され、そして該固相に結合したＴＳＨがＴＳＨレセプターとＴＳＨレセプターに結合した反応混合物の成分の複合体を分離するための分離剤としてそしてまたプライマリーコンペティターとして使用される請求項１に記載のレセプター結合アッセイ方法。８．該少なくとも一つの更に別の抗体が、組替え部分ＴＳＨレセプターを用いて、特にＴＳＨレセプターの膜にアンカーをした領域の細胞外ループ又は細胞外ドメインを用いて、適当な動物に対し、それ自体は知られている免疫化を行うこと、そして免疫化に使用した該部分ＴＳＨレセプターの固定部分ペプチドの使用によるアフィニティークロマトグラフィにより、生じる抗体を分画することによって造られたものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。９．該少なくとも一つの更に別の抗体が、組替え部分ＴＳＨレセプター、特にＴＳＨレセプターの組替え細胞外部分、又はそのより短い部分ペプチドを用いた、適当な動物に対するそれ自体知られている免疫化、骨髄球による抗体生産スプレノサイトのそれ自体知られている融合、そして個々の抗体生産ハイブリッド細胞のそれ自体は知られている選択、そしてその培養によって造られたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。１０．該少なくとも一つの更に別の抗体が、完全なＴＳＨレセプターのアミノ酸配列のアミノ酸２０〜３９、３２〜５４、２８７〜３０１、３６１〜３８１又は７３９〜７５８を有するペプチドから選択される部分ＴＳＨレセプターペプチドに対し形成された請求項８又は９いずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。１１．粒子、試験管又はプラスチック又はガラスのミクロタイタープレートの形態、又は磁性重合体粒子、ポリマーゲル、又はフィルターの形態の基体が固相として使用され、該少なくとも一つの抗体又はＴＳＨがそのような基体に対し直接又は間接的に結合した形態で使用される、請求項１〜１０のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。１２．プライマリー又はセカンダリーコンペティターを標識するために、放射性同位体、酵素及び酵素基質又は化学発光又は蛍光標識系の成分から選択され、それ自体は知られているトレーサーが使用されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。１３．特異的結合系の成分に結合しているプライマリー又はセカンダリーコンペティターが使用され、そして形成されるＴＳＨレセプター複合体が、検出可能なトレーサー又は固相に結合している、該特異的結合系の第２の成分を有している反応体との反応によって、標識又は固定されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。１４．測定されるべきＴＳＨレセプター自己抗体が、人の血清中に存在することがグレーブス病の特徴とされるレセプター刺激性自己抗体であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。１５．下記と別の試薬キットの慣用成分に加えて、（i）可溶化されたＴＳＨレセプター調製物、（ii）標識されたＴＳＨ又は標識された特異的ＴＳＨレセプター抗体、及び (iii)特異的ＴＳＨレセプター抗体又はＴＳＨが結合している固相基体、を含有していることを特徴としている請求項１〜１４のいずれか１に記載の競争的レセプター結合アッセイ法を実施するための試薬キット。モノクローナル抗体が異なる動物を免疫化することにより及び／又は異なる発現系からの組替え物質を使用することによって造られて以来、そして組替えで造られた異なる起源からのＴＳＨレセプター又はそのペプチド断片が、しばしば結合試験に使用されたあとでも、そして更にレセプターペプチドのグリコシル化及び／又は正しい折り曲げ(folding)が多くの抗体の結合に決定的に必要でありそうであることがわかって以来、天然のＴＳＨレセプターのエピトープ構造及びポリクローナル自己抗体の固体群中に生じる自己抗体のエピトープ特異的な結合挙動は未だ完全に説明されてはいない。例えばダラスジェイ．エス．等，Endocrinology 134，No.3，1437-1445頁(1 994)による刊行物中で、バクロウィルス／昆虫細胞発現系の助けにより造られたそして、Ｎ−末端シグナルペプチドのないヒトＴＳＨレセプターの細胞外ドメインのアミノ酸を有している部分的な組替えＴＳＨレセプターが、ウサギを免疫化するのに使用され、そして約２０個のアミノ酸を各々有している合成ペプチドを使用してアフィニティクロマトグラフィーによって生じるイムノグロフリンフラクションから、特異的な抗体フラクションが得られる。次に上記の特異的な抗体フラクションは、なかでも市販レセプター結合アッセイ中での可溶化されたブタＴＳＨレセプターに対するＴＳＨの結合を封鎖する適正について調べられる。この抗体は刺激活性を示さなかった。シーサラマイアージー．エス．等，Endocrinology 136，No.7，2817-2824頁 (1995)による刊行物は、上記の刊行物のものと同じ部分的な組替えＴＳＨレセプターが、マウスを免疫するのにどの様に使用されたか、そして標準技術に従ってＴＳＨレセプターの個々のエピトープに対するモノクローナル抗体を造るのにどの様に使用されたかを記載している。同様の手順がニコルソンエル．ビー．等，J．Mol．Endocrinol．(1996)16，159-170頁に記載されている。上に記載されたように造られたシーサラマイアージー．エス．等，Endocrin ology 134，No.2，549-554頁(1994)に従う部分的な組替えＴＳＨレセプターは、その後折り曲げられて放射性標識化ＴＳＨを結合する適性について試験された。この目的の為に、これは放射性標識化ＴＳＨと液相で反応させられる。次に、生じる複合体をできるだけ定量的に反応混合物から分離するために、完全なＴＳＨレセプター配列の３５７−３７２のアミノ酸を含有し、そして折り曲げられてない部分的な組替えＴＳＨレセプターに対しＴＳＨの結合を阻害しないことが示されているペプチド断片のコンジュゲートでウサギを免疫化することによって造られた抗体が、沈殿系の一部として加えられる（デサイアール．ケー．等，J．C lin．Endocrinol．Metab．77:658-663，1993）。次に加えられた抗体又はそれを含有している複合体及び結合されている放射性標識化ＴＳＨは任意の抗体と非特異的に結合するプロテインＡの助けにより沈殿させられる。試験条件下でプロテインＡのレセプター結合抗体に対する結合は、同時にＴＳＨ結合を損なうことがないように見える。組替えＴＳＨレセプター又はその部分に対する抗体を使用して得られた知識は、イムノプレシピテーションアッセイの形態に於て第３のそれ自体は知られている原理を使用することによってＴＳＨレセプター自己抗体を測定するという提案に導かれ、そこでは³⁵Ｓ−標識化メチオニンを組込むことによって標識される組替えＴＳＨレセプターの細胞外の部分の調製物が沈殿の為の試薬として使用される。そのような検定はＴＳＩにもＴＢＩＩにも選択性を有していない（エヌ．ジー．モルゲンサーラー等， Exp Clin Endocrinol Diabetes 104(1996)Suppl ４５６−５９頁）。しかしながらインヴィトロの翻訳による標識化されたレセプターを調製することは極めて複雑で費用がかかり、³⁵Ｓによって放出される放射線のための通常の臨床的な測定に適した測定装置は存在しない。従ってこの方法は通常の臨床診断の為の測定方法としては適していない。本発明の目的は、先行技術のそのような競争的レセプター結合アッセイの記載された欠点を有しないＴＳＨレセプター自己抗体を測定するための競争的レセプター結合アッセイを提供することである。特に本発明の目的は、慣用の固相上での測定する検定方法の反応体から形成されたＴＳＨレセプター複合体を固定することが可能であり、そして適したトレーサーがないということに関する既存法の制限を克服することが可能であるので、そのようなレセプター結合アッセイの為の自動的方法を用いることが可能である、ＴＳＨレセプター自己抗体を測定するための改良された競争的レセプター結合アッセイを提供することである。特に本発明の更に別の目的は、先行技術の検定法と比較してより大きな臨床価値が得られるような方法で、ＴＳＨレセプター自己抗体の検出の為の改良された競争的レセプター結合アッセイを設計することである。本発明の更に別な目的は、そのような改良されたレセプター結合アッセイを通常の臨床診断に於て実施するための試薬キットを提供することである。上記の目的は請求項１のプレキャラクタライジングクローズ（前段）に従って、請求項１中のキャラクタライジングクローズ（後段）に記載された特徴を有している、少なくとも一部はラジオレセプターアッセイによって達成される。本発明に従う改良されたレセプター結合アッセイの有利な具体例はサブクレーム中に記載されており、特に本明細書の記載中の次の説明と組合せて記載される。対応した試薬キットを提供する目的は、各場合に於て請求項１５に従う成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の少なくとも一つを含有している本発明に従う方法を実施するための試薬キットによって達成される。本発明のレセプター結合アッセイの為の種々の可能な具体例をカバーするために、下にイントロダクションによって説明される一般的な表現のモードが、請求項１において、そのようなレセプター結合アッセイの既知の特徴を記載するためにも、そして本発明に従うレセプター結合アッセイが先行技術のものとは異なる特徴についても、用いられる。イントロダクション部分で説明されるように、全てがラジオレセプターアッセイとして設計されている既知の競争的レセプター結合アッセイは次の検定成分を含有している。可溶化されたＴＳＨレセプター（ｉ）、特に可溶化された天然の動物（ブタ）ＴＳＨレセプターであって動物の甲状腺膜から得られるもの。更に既知のラジオレセプターアッセイは放射標識されたウシＴＳＨ（ｉｉ）を含有し、これは、使用されるＴＳＨレセプター上の共通の結合場所について血清試料（ＴＢＩＩ）からのＴＳＨレセプター自己抗体と競争する。この競争は今日まで最も重要性を有するものであり、又存在する自己抗体の大部分、即ち８０〜９０％の測定を可能にもするものであるので、先行技術の標識化されたＴＳＨは、請求項１で使用される「プライマリーコンペティター」という定義によってカバーされる。しかしながらこの定義は又他の形態の「プライマリーコンペティターズ」を含むものであり、この場合の使用は本発明によって初めて許されるものである。即ちより詳しく下に記載するＴＳＨレセプターに対する標識化された選択的抗体も、ＴＢＩＩに対する競争者として、又必要ならば他の自己抗体フラクションに対する競争者として使用出来る。更にＴＢＩＩとの競争のため、固相に結合したＴＳＨも「プライマリーコンペティター」の定義を満たすことが出来るべきである。初めにも説明したように、ＴＳＨレセプターとこれと結合している反応混合物の成分即ち標識化されたＴＳＨと自己抗体との複合体は沈殿試薬によって反応混合物から沈殿され、そして遠心分離により反応混合物から分離される。請求項１のプレキャラクタライジングクローズ（プレアンブル）の意味に於て、沈殿試薬は（ｉｉｉ）に従う試薬としてみなされるべきである。本発明に従う競争的レセプター結合アッセイの場合に於ては、そのような試薬（ｉｉｉ）は固相に結合している反応体に対応し、そして固相上で固定されている主として特異的ＴＳＨレセプター抗体であるが、「鏡像」具体例に従うとこれは又固相に結合したＴＳＨでも有り得る。本発明に対し必須の発見は、ＴＢＩＩ自己抗体及び標識化されたＴＳＨに対するＴＳＨレセプターの結合能力が有為に損なわれることなしに、ＴＳＨレセプターの適当な部分配列に対し特異的となされている固定された選択的抗体の助けによって、任意の種類の可溶化されたＴＳＨレセプター調製物からの天然のＴＳＨレセプター（即ち折り曲げ／グリコシル化が、天然のＴＳＨレセプターに少なくとも本質的に対応している、ヒト動物又は組替えＴＳＨレセプター）の固定も達成することが可能であるという発見である。従ってこの発見は、固相への結合が測定できるという形態に於て、例えばプライマリーコンペティター放射標識化ＴＳＨの、結合され標識化されたコンペティターの量が測定できる方法でＴＳＨレセプター自己抗体の測定の為のレセプター結合アッセイを実施するための前提条件を造りだす。しかし驚くべきことに、・・・上記刊行物中に記載される製造技術と抗体の型は原則として試験中で、特に使用された抗体を置き換えるのに適しているが、ＴＳＨレセプターの近い配列に対する抗体が非常に異なる抗体型に属し得ることが知られていることも注意されるべきである。実施例中で使用される抗体の代替物として、そしてヒトＴＳＨレセプターの２０〜３９のアミノ酸に対する抗体の代替物として、３２〜５４、２８７〜３０１、３６１〜３８１又は７３９〜７５８の領域に対し造られた抗体も適している。しかし以下に記載される試験に基づいて、特別の場合に特別の性質がチェックされるべきである。慣用のラジオレセプターアッセイの最初の検定法（アッセイ）デザインが放射性標識されたＴＳＨとより大きな程度違ったもので、そして放射標識化ＴＳＨの変わりに別の標識化された選択的抗体が使用されるならば、「プライマリーコンペティター」と「セカンダリーコンペティター」の間の上記の区別は明確さがより少なくなるか又はその意味を完全に失うものと成り得る。これは本発明に従うレセプター結合アッセイの検定原理に関するなにものをも変化させず、そしてそのような検定も本発明によって保護されるという事実に関するなにものをも変化させないものである。測定溶液中に形成されるＴＳＨレセプター複合体の固定を、本発明に従う方法は複合体に直接結合されるトレーサーで又は固定後導入されるトレーサーで可能とするという事実の為、そして更に放射性同位体以外のトレーサーを有する試薬が使用できるから、ＴＳＨレセプター自己抗体アッセイの実際の操作は過去に可能であったものよりもずっとより良く臨床的な実施の要件に適合化できる。培養計画も変化されることができ、そして次の実施例中で記載される培養計画は最早必須ではないようである。・・・そして図２は、グレーブス病にかかっている患者群の測定の場合における本発明に従う方法によって得られた測定結果と慣用のラジオレセプターアッセイ（ベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカゲーエムベーハーからのＴＲＡＫ−アッセイ^R）によって得られた測定結果の比較を示している。実験の記載材料以下に記載される実験において、種々の市販物質が使用され、特にベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカゲーエムベーハー製ＴＲＡＫ−アッセイ^Rの成分、固定の為に造られた抗体を精製するためのファーマシア製ＮＡＰ２５デサリネーションカラム、固相基質物質としてピアース製カルボリンク ^R 材料及びフルカ製過ヨウ素酸ナトリウムが使用された。１．ＴＳＨレセプターに対するモノクローナル抗体の製造先行技術の方法によって（上を参照）、ｈＴＳＨレセプターの選ばれたペプチド類に対する種々のモノクローナル抗体が造られた。一つのペプチドに対するモノクローナル抗体であって完全なヒトＴＳＨレセプターの２０〜３９のアミノ酸（アミノ酸配列ＧＧＭＧＣＳＳＰＢＣＥＣＨＱＥＥＤＦＲＶ）を含有するモノクローナル抗体が、更に試験をするために用いられた。２．固相に結合されたモノクローナル抗体の製造。ＰＢＳ（リン酸塩緩衝化された塩溶液；50mM リン酸ナトリウム，100mM ＮａＣｌ，ｐＨ7.5）で１：１０に希釈されている、そして上記のモノクローナル抗体を含有している腹水溶液２０ミリリットル中に２５０ミリグラムの過ヨウ素酸塩を溶解し、培養を室温で３０分実施した。反応溶液をＮＡＰ２５脱塩カラム（ファルマシア）上で製造業者の方法によって脱塩した。脱塩された蛋白質をＰＢＳ中で洗浄されたカルボリンク(Carbo1ink^R)材料(10ミリリットル)と混合した。一定の振温をしながら４℃で一夜培養後、上にモノクローナル抗体が結合している生じるゲル０．５ミリリットルをプラスチックカラム(0.5X4cm)中に満たし、そして２５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５（洗浄容量2ml）で洗浄した。このカラムをＰＢＳ（2ml）で平衡化し、そして次に更に試験をするために使用した。３．上記カラムの助けによりＴＲＡＫ−アッセイ^R（ベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカゲーエムベーハー）の成分を使用してラジオレセプターアッセイを実施した。ラジオレセプターアッセイ（標準曲線の準備、患者試料の測定）をＴＲＡＫ− アッセイ^Rを実施するための方法に従って実施した。次のピペット操作計画が用いられた。５０μlの試料をピペットで取った。５０μlの可溶化されたウシＴＳＨレセプターを次にピペットで加えた。室温で１５分間培養を実施した。１００μlのトレーサー（放射性ヨウ素で標識したＴＳＨ）をピペットで加えた。得られた反応バッチを上記のようにモノクローナル抗体を負荷させた固相（カルボリンク ^R 材料を有するカラム）に移した。反応バッチを室温で１時間培養する。

Claims

【特許請求の範囲】１．反応混合物中の試料を、同時に又は順次、（i）可溶化された天然の人又は動物又は組替えＴＳＨレセプター調製物の形のＴＳＨレセプター、（ii）試料中にあることが予測されるＴＳＨレセプター自己抗体の少なくとも一部に対するプライマリーコンペティター、及び (iii)ＴＳＨレセプターとＴＳＨレセプターに結合されている反応混合物の成分との複合体を液相から分離するための試薬、と反応させ、そしてその生物試料中で測定されるべきＴＳＨレセプター自己抗体の存在及び／又は量が、該液相から分離された該ＴＳＨレセプター複合体中のコンペティターの量に基づいて、又は該液相中の結合していない該プライマリーコンペティターの残りの量に基づいて決定され、但し、上記目的の為に該コンペティターは標識化された形態で使用されるか又は固液分離後に標識化されるものである、生物試料中のＴＳＨレセプター自己抗体の測定の為の競争的レセプター結合アッセイ方法に於て、該反応が更に、該ＴＳＨレセプターの部分的なペプチド配列に対し特異的である少なくとも一つのモノクローナル又はポリクローナル抗体の存在下で実施されること、そしてこの特異的な抗体がＴＳＨレセプターとプライマリーコンペティターの複合体を固定するための固定剤として及び／又は試料中で存在することが予測されるＴＳＨレセプター自己抗体の更に別の部分に対するセカンダリーコンペティターとして使用されること、及び、上記のプライマリー及びセカンダリーコンペティターが、標識されているか又は選択的に標識されることができるものであること、を特徴とする競争的レセプター結合アッセイ方法。２．該少なくとも一つの特異的な抗体が、固相に結合した形で使用され、そしてプライマリーコンペティターが標識されたＴＳＨ又は標識された別のＴＳＨレセプター抗体であることによって特徴づけられ、該固相に対し結合されている特異的な抗体が、プライマリーコンペティターの結合によって影響を本質的に受けないでＴＳＨレセプターに結合することを特徴とする請求項１に記載のレセプター結合アッセイ法。３．同時に、該固相に結合された抗体が、プライマリーコンペティターのＴＳＨレセプターへの結合を妨げない、試料からのＴＳＨレセプター自己抗体と、プライマリーコンペティターによって認識されないエピトープについて競争するセカンダリーコンペティターであることを特徴とする請求項２に記載のレセプター結合アッセイ方法。４．該標識された更に別のＴＳＨレセプター抗体が、ＴＳＨレセプターのエピトープについてＴＳＨと競争することを特徴とする請求項２に記載のレセプター結合アッセイ方法。５．該固相に結合した抗体が、グレーブス病に特徴的に存在するが、ＴＳＨとは競争しない試料からのＴＳＨレセプター自己抗体と、セカンダリーコンペティターとして競争する、請求項３に記載のレセプター結合アッセイ方法。６．該セカンダリーコンペティターと競争するＴＳＨレセプター自己抗体が、刺激性の自己抗体（ＴＳＩ）に属することを特徴とする請求項５に記載のレセプター結合アッセイ方法。７．該少なくとも一つの抗体が、液相中でセカンダリーコンペティターとして標識された形態で使用され、そして該固相に結合したＴＳＨがＴＳＨレセプターとＴＳＨレセプターに結合した反応混合物の成分の複合体を分離するための分離剤としてそしてまたプライマリーコンペティターとして使用される請求項１に記載のレセプター結合アッセイ方法。８．該少なくとも一つの更に別の抗体が、組替え部分ＴＳＨレセプターを用いて、特にＴＳＨレセプターの膜にアンカーをした領域の細胞外ループ又は細胞外ドメインを用いて、適当な動物に対し、それ自体は知られている免疫化を行うこと、そして免疫化に使用した該部分ＴＳＨレセプターの固定部分ペプチドの使用によるアフィニティークロマトグラフィにより、生じる抗体を分画することによって造られたものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。９．該少なくとも一つの更に別の抗体が、組替え部分ＴＳＨレセプター、特にＴＳＨレセプターの組替え細胞外部分、又はそのより短い部分ペプチドを用いた、適当な動物に対するそれ自体知られている免疫化、骨髄球による抗体生産スプレノサイトのそれ自体知られている融合、そして個々の抗体生産ハイブリッド細胞のそれ自体は知られている選択、そしてその培養によって造られたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。１０．該少なくとも一つの更に別の抗体が、完全なＴＳＨレセプターのアミノ酸配列のアミノ酸２０〜３９、３２〜５４、２８７〜３０１、３６１〜３８１又は７３９〜７５８を有するペプチドから選択される部分ＴＳＨレセプターペプチドに対し形成された請求項８又は９いずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。１１．粒子、試験管又はプラスチック又はガラスのミクロタイタープレートの形態、又は磁性重合体粒子、ポリマーゲル、又はフィルターの形態の基体が固相として使用され、該少なくとも一つの抗体又はＴＳＨがそのような基体に対し直接又は間接的に結合した形態で使用される、請求項１〜１０のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。１２．プライマリー又はセカンダリーコンペティターを標識するために、放射性同位体、酵素及び酵素基質又は化学発光又は蛍光標識系の成分から選択され、それ自体は知られているトレーサーが使用されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。１３．特定の結合系の成分に結合しているプライマリー又はセカンダリーコンペティターが使用され、そして形成されるＴＳＨレセプター複合体が、検出可能なトレーサー又は固相に結合している該特定結合系の第２の成分を有している反応体との反応によって、標識又は固定されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。１４．測定されるべきＴＳＨレセプター自己抗体が、人の血清中に存在することがグレーブス病の特徴とされるレセプター刺激性自己抗体であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。１５．下記と別の試薬キットの慣用成分に加えて、（i）可溶化されたＴＳＨレセプター調製物、（ii）標識されたＴＳＨ又は標識された特異的ＴＳＨレセプター抗体、及び (iii)特異的ＴＳＨレセプター抗体又はＴＳＨが結合している固相基体、を含有していることを特徴としている請求項１〜１４のいずれか１に記載の競争的レセプター結合アッセイ法を実施するための試薬キット。