JPS6353511B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固相サンドイツチ法による副腎皮質刺
激ホルモン前駆体の免疫学的測定法に関するもの
である。

近年、癌の診断、治療効果の判定および再発の
発見のために、癌の生化学的マーカーを測定する
方法が検討され、既に一部の方法は臨床的に利用
されている。このような癌の生化学的マーカーと
しては、アルフアーフエトプロテイン（AFP）、
癌胎児性抗原（CEA）、絨毛性ゴナドトロピン
（HCG）、フエリチン、γ−グルタミル酸トラン
スペプチダーゼ（γ−GTP）、〓癌胎児抗原
（POA）、核酸分解酵素（RNase）などがあり、
血液、組織抽出液などの体液中のこれらのマーカ
ーを測定することにより、癌の診断の可能性は高
く、このような方法はスクリーニングにも適した
方法として期待されている。

ところで、原発性肺癌は早期治療の困難な腫瘍
であり、根治率が低い癌の一つである。この肺癌
の生化学的マーカーとして、アミラーゼアイソザ
イム、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、抗利尿
ホルモン（ADH）をはじめとして、多くの物質
が検討されたが、いずれも実用に供されるには不
充分なものであつた。

また血中のACTHは肺癌などの異所性ACTH
産生腫瘍に特異的高値を示すばかりでなく、クツ
シング症候群、アジソン病、先天性副腎過形成な
どの疾患においても高値を示す。従つて肺癌の鑑
別診断のためには単に血中の免疫活性ACTHを
測定するだけでは不充分である。

大分子ACTHはACTH前駆体、プロACTHま
たはACTH−β−LPH共通前駆体とも呼ばれ、
ACTHの前駆体であるとともに、β−エンドル
フイン、γ−MSHなどのホルモン類の共通前駆
体である（臨床科学16590（1980））。

最近、Yalowらは切除可能な肺癌患者の血漿
および腫瘍組織中の大分子副腎皮質刺激ホルモン
（大分子ACTH）を免疫学的手法によつて測定し
た結果、ほとんど全ての肺癌患者に大分子
ACTHが高値で検出され、大分子ACTHが肺癌
のマーカーとして極めて有用であることを明らか
にした（Cancer、44 1789（1979））。Yalowらの
免疫学的手段とはゲル濾過法により試料中の大分
子ACTHを免疫学的に大分子ACTHと交差反応
する物質、例えばACTHおよびそのフラグメン
トと分離した後、抗ACTH抗体を用いる放射免
疫測定法により、大分子ACTHを分別定量して
いる。

しかしながら、この分子量の差を利用したゲル
濾過法による大分子ACTHの放射免疫測定法は
一般の臨床検査、特にスクリーニングに適用する
には、操作が繁雑であり、長時間を要するために
実際問題として実施が不可能である。

ところで大分子ACTHはACTHとしての生物
活性をほとんど有していないので、まず、免疫活
性ACTHを測定し、別にバイオアツセイにより
生物活性ACTH様物質を測定して、その差から
大分子ACTHの量を求める方法が考えられるが、
操作が複雑であり、手間がかかる上、誤差が大き
く、一般検査には到底適用することができない。

本発明者らはこのような状況に鑑み、一般臨床
検査に容易に適用でき、肺癌のスクリーニングな
どに有効な大分子ACTH（ACTH前駆体）の測定
法について鋭意検討したところ、本発明に到達し
た。すなわち本発明は固定化抗体と試料を液相中
にて反応させ、固相と液相を分離し、分離した固
相と標識抗体を反応させるか、あるいは固定化抗
体、試料および標識抗体を反応させた後、固相と
液相を分離し、分離した固相又は液相中の標識物
質を測定する固相サンドイツチ法により試料中の
副腎皮質刺激ホルモン前駆体（ACTH前駆体）
を免疫学的に測定する方法において、固定化抗体
として下記Ａ群から選ばれた少なくとも１種の抗
体を用い、標識用抗体として下記Ｂ群から選ばれ
た少なくとも１種の抗体を用いるか、あるいは固
定化用抗体として下記Ｂ群から選ばれた少なくと
も１種の抗体を用い、標識用抗体として下記Ａ群
から選ばれた少なくとも１種の抗体を用いること
を特徴とする副腎皮質刺激ホルモン前駆体
（ACTH前駆体）の免疫学的測定法である。

Ａ群： 抗ACTH−16Kフラグメント抗体 抗16Kフラグメント抗体 抗ACTH抗体 抗Ｎ−ペプチド抗体 抗γ−MSH抗体 抗α−MSH抗体 抗CLIP抗体 Ｂ群： 抗β−LPH抗体 抗γ−LPH抗体 抗β−エンドルフイン抗体 抗β−MSH抗体 抗α−エンドルフイン抗体 本発明では血液中のACTH前駆体をゲル濾過
などの手段により、そのフラグメントと分離する
ことなしに、直接免疫学的に測定することができ
る。従つて、本発明の方法は操作が簡単で再現性
が高く、一般の臨床検査室において容易に実施す
ることが可能であり、肺癌などのスクリーニング
に適している。さらに血清蛋白などによる非特異
的結合が少なく、バツクグラウンドが小さい特異
性の高い方法であり、測定感度が高く、且つ測定
濃度範囲が極めて広いために測定試料が少なくて
よい。さらに固相としてマイクロタイタープレー
トやプラスチツクチユーブを用いることにより、
自動化装置に適用して、多検体の測定を可能とす
るのに適した方法である。

現在までに明らかにされている下垂体での
ACTH前駆体、ACTHなどのホルモンの生合成
経路は第１図に示す通りである。すなわち
ACTH前駆体からACTH−16Kフラグメントお
よびβ−LPH（β−リポトロピン）が生成され、
ACTH−16Kフラグメントから16Kフラグメント
とACTHが生成され、β−LPHからγ−LPH
（γ−リポトロピン）とβ−エンドルフインが生
成され、16KフラグメントからＮ−ペプチドおよ
びγ−MSH（γ−色素細胞刺激ホルモン）が生成
され、ACTHからα−MSH（α−色素細胞刺激
ホルモン）およびCLIP（Corticotropin−like
intermediate lobe pept、de）が生成され、γ−
LPHからβ−MSH（β−色素細胞刺激ホルモン）
が生成され、β−エンドルフインからα−エンド
ルフインが生成される。

第１図から明らかなように、ACTH前駆体は
蛋白質分解酵素により、ACTH−16Kフラグメ
ント、16Kフラングメント、ACTH、Ｎ−ペプ
チド、γ−MSH、α−MSHおよびCLIPからな
る群およびβ−LPH、γ−LPH、β−エンドル
フイン、β−MSHおよびα−エンドルフインか
らなる群のフラグメントへと分解され、血中へ放
出される。

したがつて、本願発明では前者の群のフラグメ
ントに対する抗体（Ａ群）と後者の群のフラグメ
ントに対する抗体（Ｂ群）を用いて、血中の
ACTH前駆体のみを固相サンドイツチ法によつ
て免疫学的に測定する。

本発明に用いる固定化抗体とはＡ群またはＢ群
に属する抗体を固相に結合又は吸着させたもので
ある。

本発明の抗体としては、抗原であるペプチドま
たはそのフラグメントを動物に免疫して得た抗血
清または免疫グロブリン（Ig）フラクシヨンを用
いる。特にアフイニテイクロマトグラフイーによ
つて精製した単一抗原特異的Igを用いると高感度
の測定系を確立できる。さらに抗原を感作した抗
体産生細胞と骨髄腫リンパ球などの融合細胞の産
生するモノクロナル抗体を用いることができる。
モノクロナル抗体を使用する場合には異なつたク
ローンから産生される抗体を混合して抗原特異的
ポリクロナル抗体として用いることも可能であ
る。いずれの抗体においても、特異性がきわめて
重要であり、目的とする抗原以外の物質と交差反
応を示さないことが望ましい。

本発明で使用する固相としては、ガラス、シリ
カ、アルミナ、活性炭などの無機担体、ポリスチ
レン、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン
共重合体、ナイロン、ポリフエニレンオキサイ
ド、シリコンゴム、ポリプロピレンなどの合成高
分子担体、イオン交換樹脂、セルロースおよびそ
の誘導体などがある。形状としてはビーズ、板状
体、チユーブ、ロツド、粉末などがある。

固相への抗体結合法としては、吸着法、イオン
結合法、共有結合法などの公知の方法を用いるこ
とができる。その際、抗体を固相に直接結合させ
てもよいし、ビオチン−アビデイン系などを用い
て間接的に結合させてもよい。さらに抗体分子を
抗体あるいは免疫グロブリンの分解フラグメント
〔Ｆ（ab′）₂やFab′〕のように活性フラグメントと
した後、固相と結合させてもよい。

本発明に用いる標識抗体とはＡ群またはＢ群に
属する抗体に標識物を結合させたものである。

標識抗体に用いる抗体は固定化抗体に用いた抗
体と同様にして得る。

本発明の標識としては ¹²⁵I、 ¹³¹I、トリチユ
ームのような放射性同位元素、ペルオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフオスフア
ターゼ、ルシフエラーゼのような酵素、フルオレ
セイン、ローダミンなどの螢光物質または金属化
合物などがある。標識と抗体との結合方法は、公
知の方法が適用できる。

本発明方法はまず、固定化抗体と試料を液相中
にて反応させ、固相と液相を分離し、分離した固
相と標識抗体を反応させるか、あるいは固定化抗
体、試料および標識抗体を同時に反応させる。

上記反応は試験管、マイクロタイタープレー
ト、固相充填カラムなどの中で実施することがで
き、緩衝溶液を用いて液相のPHを３〜９の範囲に
調整することが望ましい。反応温度は蛋白質が変
性するのを避けるために50℃以下が望ましい。抗
体を固定化する担体としてチユーブ、マイクロタ
イタープレートなどの容器を使用する場合はそれ
らの中で反応を実施することができる。

次いで固相と液相を分離し、固相又は液相中の
標識物質を測定する。固相と液相の分離は通常の
方法、例えばデカンテーシヨン、遠心分離などの
方法により行なう。固定化抗体を充填したカラム
中で反応を行なつた場合には、緩衝液等で流出し
て分離することができる。標識物質の量は通常の
分光光度法、γ−カウンター、螢光光度法、発光
法など、標識物質の種類に応じて選択して測定す
ることができる。

具体的に固定化抗体としてＡ群の抗ACTH抗
体を用い、標識用抗体として抗β−エンドルフイ
ン抗体を用いた例について説明する。

抗ACTH抗体を水不溶性の固相に結合させた
固定化抗体と抗β−エンドルフイン抗体を放射性
同位元素又は酵素などで標識した標識抗体を用意
する。まず、試料、例えば血漿中の構造を有する
ペプチド類と固定化抗ACTH抗体を液相中にて
免疫学的に反応させる。この操作によりACTH
構造を有するペプチド類のみが抗原抗体反応によ
つて固相に結合する。

次いで固相を充分洗浄して固相に結合しなかつ
た物質を除去する。次に固相と標識抗−β−エン
ドルフイン抗体とを液相中にて反応させ、標識抗
−β−エンドルフイン抗体を固相に結合している
ACTH構造を有するペプチド類のうち、β−エ
ンドルフイン構造を持つACTH前駆体のみと抗
原抗体反応により結合する。未反応の標識抗−β
−エンドルフイン抗体と固相とを分離し、固相上
の標識物質、例えば放射性同位元素あるいは酵素
活性などを測定する。

このようにして測定される放射能あるいは酵素
活性は固相に結合した標識抗−β−エンドルフイ
ン抗体の量に比例し、ひいては固相に結合した、
試料中のACTH前駆体の量に比例する。したが
つて標識物質を測定することにより試料中の
ACTH前駆体のみを特異的に測定することがで
きる。

固相の標識物質を測定する代わりに液相の未反
応標識抗体中の標識物質の量を測定して、逆算す
ることによりACTH前駆体の量を求めることも
できる。

また抗−β−エンドルフイン抗体を固相に結合
させた固定化抗体と抗ACTH抗体に標識物質を
結合させた標識抗体を用いても、同様にACTH
前駆体を測定することができる。

さらに抗ACTH抗体をＡ群の他の抗体に置き
換えてもよいし、また抗−β−エンドルフイン抗
体をＢ群の他の抗体に置き換えてもよい。

本発明において免疫反応あるいは標識物質であ
る酵素の酵素反応を促進するために多価アルコー
ル類を反応系に添加したり、これらの反応に影響
を与える試料中の物質の作用を除く目的で血清蛋
白、界面活性剤などを添加することも可能であ
る。

本発明方法は血漿、組織抽出液などのACTH
前駆体を短時間に精度よく測定することができ、
肺癌をはじめとする各種疾患の診断、治療に極め
て有用である。

以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。

実施例 １ (1) 抗ACTH家兎IgG結合固相の調製 ACTH（シオノギ製薬）をフロインドの完全
アジユバンドとともに家兎に免疫して抗血清を
得た。得られた抗血清から33％硫安塩析により
免疫グロブリン分画を得た後、ACTHを結合
したセフアロース4Bカラムによるアフイニテ
イクロマトグラフイーにより精製し、ACTH
に特異的な免疫グロブリン（IgG）を得た。得
られたIgGを0.05M炭酸緩衝液（PH9.5）に
1000μｇ／mlの濃度に溶解し、この溶液に粗面
化直径６mmのポリスチレンビーズを室温で４時
間浸漬した後、４℃に保持した。

(2) β−ガラクトシダーゼ結合抗−β−エンドル
フイン家兎IgGの調製 β−エンドルフイン（ペプチド研究所製）に
牛血清アルブミンを結合させたものに、フロイ
ンドの完全アジユバンドを混合して家兎に免疫
して抗血清を得た。得られた抗血清から33％硫
安塩析により免疫グロブリン画分を得た後、β
−エンドルフインを結合したセフアロース4B
カラムによるアフイニテイクロマトグラフイー
により精製し、β−エンドルフインに特異的な
免疫グロブリン（IgG）を得た。得られたIgG
をペプシンで消化した後、２−メルカプトエチ
ルアミンにより還元して分解フラグメント
（Fab′）を作成した。次いでＮ，N′−Ｏ−フエ
ニレンジマレイミドをFab′に作用させて、
Fab′−マレイミド誘導体とし、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼの硫安懸濁液（ベーリンガー・マ
ンハイム製）との反応により、Fab′−β−Ｄ
ガラクトシダーゼ複合体を精製した。

(3) 標識ACTH前駆体の調製 肺癌患者（扁平上皮癌）の血漿を４℃のセフ
アデツクスＧ−50カラムによりゲル濾過して、
大分子ACTH（ACTH前駆体）（分子量約
30000）画分を得た。流出には10％の正常人血
漿および0.5％の２−メルカプトエタノールを
含有する0.1M食塩水を用いた。ACTH前駆体
画分に含有される免疫活性ACTH前駆体の量
を抗ACTH抗体を用いた放射免疫測定キツト
（ミドリ十字社製）により測定し、標準ACTH
前駆体の量とした。

(4) 人血漿中のACTH前駆体の測定 抗ACTH家兎IgG結合ポリスチレンビーズ１
個を0.9％食塩含有0.02Mリン酸緩衝液１mlで
２回洗浄した後、検体（または標識ACTH前
駆体）150μおよび0.9％食塩含有0.02Mリン
酸緩衝200μを入れた試験管に投入し、37℃
で５時間反応させた。次いで上記リン酸緩衝液
でビーズを２回洗浄した後、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ標識抗β−エンドルフイン家兎IgGを
0.02Mリン酸緩衝液で500倍に希釈した溶液
300μを入れた試験管に移し、室温で一夜反
応させた。次にビーズを0.9％食塩含有0.02M
リン酸緩衝液１mlで２回洗浄した後、同緩衝液
200μを入れた試験管に移し、これに３×
10^-4Mの４−メチルウンベリフエリル−β−Ｄ
−ガラクトシド50μの加えて37℃、30分間振
盪し、0.1Mグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液（PH10.3）を2.5ml加えて反応を停止した。
生成した４−メチルウンベリフエロンの螢光強
度を日立螢光分光光度計650−10型を用いて測
定した（励起波長360nｍ、螢光波長450nｍ）。

得られた螢光強度から標準曲線を作成し、被
検試料中のACTH前駆体の量を算出した。

標準曲線を第２図に示す。第２図から明らか
なように、20pｇ／ml〜800pｇ／mlの範囲での
測定が可能であつた。

実施例 ２ (1) 抗ACTH家兎IgG結合固相の調製 実施例１と同様な方法で、抗ACTH家兎IgG
結合固相を調製した。

(2) ¹²⁵I−標識抗β−色素細胞刺激ホルモン家
兎IgGの調製 β−色素細胞刺激ホルモン（β−MSH）に
牛血清アルブミンを結合させたものを、フロイ
ンドの完全アジユバンドと混合した後、家兎に
免疫して得た抗血清から50％硫安塩析によりイ
ムノグロブリン画分を得た。次いでβ−MSH
を結合したセフアロース4Bカラム処理により、
β−MSHに特異的なIgGを得た。得られたIgG
をGreenwoodらのクロシランＴを用いる方法
〔F.C.Greenwood etal Biochem.J.、89、114
（1963）〕で ¹²⁵Iを標識し、 ¹²⁵I標識抗β−
MSH家兎IgGを得た。

(3) 標準曲線作成用ACTH前駆体の調製 実施例１と同一のものをACTH前駆体標準
品として用いた。

(4) ヒト血漿中のACTH前駆体の測定 抗ACTH家兎IgG結合ポリスチレンビーズ１
ケを0.9％NaCl含有0.02Mリン酸緩衝液１mlで
２回洗浄後検体（又は、標準ACTH前駆体）
100μおよび0.9％NaCl含有0.02Mリン酸緩衝
液200μを入れた試験管に投入し、室温で24
時間反応した。次いで、上記リン酸緩衝液でビ
ーズを２回洗浄した後、2μｇの ¹²⁵I標識抗β
−MSH家兎IgGを含む0.05Mリン酸緩衝液
300μを加え、４℃で２日間反応させた。反
応後上清とビーズのそれぞれの放射能を自動γ
−カウンターで計測する。この操作と同時に別
の試験管に2μｇの ¹²⁵I標識抗β−MSH家兎
IgGを含む0.05Mリン酸緩衝液300μ中に抗
ACTH家兎IgG結合ビーズを入れ、４℃で２日
間反応させ、全放射能を自動γ−カウンターで
計測し、Toとする。

各標準ACTH前駆体濃度と、その時のビー
ズの放射能量ＢをToで除した値Ｂ／To×100
（％）との関係は第３図のような標準曲線が得
られ、ACTH前駆体10pｇ〜600pｇが測定可能
であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はACTH前駆体から各種ホルモンの生
成経路を示す。第２図および第３図はACTH前
駆体の標準曲線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 固定化抗体と試料を液相中にて反応させ、固
   相と液相を分離し、分離した固相と標識抗体を反
   応させるか、あるいは固定化抗体、試料および標
   識抗体を反応させた後、固相と液相を分離し、固
   相又は液相中の標識物質を測定する固相サンドイ
   ツチ法により試料中の副腎皮質刺激ホルモン前駆
   体を免疫学的に測定する方法において、固定化抗
   体として下記Ａ群から選ばれた少なくとも１種の
   抗体を用い、標識用抗体として下記Ｂ群から選ば
   れた少なくとも１種の抗体を用いるか、あるいは
   固定化用抗体として下記Ｂ群から選ばれた少なく
   とも１種の抗体を用い、標識用抗体として下記Ａ
   群から選ばれた少なくとも１種の抗体を用いるこ
   とを特徴とする副腎皮質刺激ホルモン前駆体の免
   疫学的測定法。 Ａ群： 抗ACTH−16Kフラグメント抗体 抗16Kフラグメント抗体 抗ACTH抗体 抗Ｎ−ペプチド抗体 抗γ−MSH抗体 抗α−MSH抗体 抗CLIP抗体 Ｂ群： 抗β−LPH抗体 抗γ−LPH抗体 抗β−エンドルフイン抗体 抗β−MSH抗体 抗α−エンドルフイン抗体