JPH0634013B2 - 高感度免疫測定法 - Google Patents
高感度免疫測定法Info
- Publication number
- JPH0634013B2 JPH0634013B2 JP60058230A JP5823085A JPH0634013B2 JP H0634013 B2 JPH0634013 B2 JP H0634013B2 JP 60058230 A JP60058230 A JP 60058230A JP 5823085 A JP5823085 A JP 5823085A JP H0634013 B2 JPH0634013 B2 JP H0634013B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solid phase
- complex
- immunoassay
- fab
- antibody
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫測定法、更に詳細には高感度固相免疫測定
法に関する。
法に関する。
従来、生物由来の物質を検出するためには多数の方法が
知られている。方法論的に１つの大きな群をなすのは免
疫測定法である。免疫測定法の極めて重要な一方法は固
相免疫測定法である。固相免疫測定法としては、アツセ
イ構成上からサンドウイツチ法、直接免疫測定法、間接
免疫測定法があり、標識物質からは、ラジオイムノアツ
セイ、エンザイムイムノアツセイ、蛍光イムノアツセイ
が既に知られている。また、その高感度化について、色
々な試みが特に標識抗体の作製法からなされてきた。例
えば、本発明者らは、抗体をペプシン分解して得られる
Fab′のヒンジ部のチオール基を利用して酵素標識を行
う方法（ヒンジ法）を開発し（特開昭５８−１４９７０
０号）この製造方法が従来より行われてきた抗体のアミ
ノ基を利用する方法（ノンヒンジ法）より優れており、
高感度な測定を可能にすることを示した。
知られている。方法論的に１つの大きな群をなすのは免
疫測定法である。免疫測定法の極めて重要な一方法は固
相免疫測定法である。固相免疫測定法としては、アツセ
イ構成上からサンドウイツチ法、直接免疫測定法、間接
免疫測定法があり、標識物質からは、ラジオイムノアツ
セイ、エンザイムイムノアツセイ、蛍光イムノアツセイ
が既に知られている。また、その高感度化について、色
々な試みが特に標識抗体の作製法からなされてきた。例
えば、本発明者らは、抗体をペプシン分解して得られる
Fab′のヒンジ部のチオール基を利用して酵素標識を行
う方法（ヒンジ法）を開発し（特開昭５８−１４９７０
０号）この製造方法が従来より行われてきた抗体のアミ
ノ基を利用する方法（ノンヒンジ法）より優れており、
高感度な測定を可能にすることを示した。
しかしながら、固相免疫測定法で最も問題となるのは、
標識抗体の固相への非特異吸着であり、これによつてバ
ツクグランドが高くなり、高感度化の大きな障害となつ
ていた〔デイベロツクメンツ イン イムノロジー（De
velopments in Immunology）第１８巻、第２１９頁（１
９８３）〕。従来よりこの非特異吸着を防ぐためにウシ
血清アルブミンで固相をコーテイングする方法が用いら
れてきたが十分ではなかつた。
標識抗体の固相への非特異吸着であり、これによつてバ
ツクグランドが高くなり、高感度化の大きな障害となつ
ていた〔デイベロツクメンツ イン イムノロジー（De
velopments in Immunology）第１８巻、第２１９頁（１
９８３）〕。従来よりこの非特異吸着を防ぐためにウシ
血清アルブミンで固相をコーテイングする方法が用いら
れてきたが十分ではなかつた。
本発明の目的は、バツクグランドの低下により、感度よ
く被分析体を測定するための高感度固相免疫測定法を提
供することにある。
く被分析体を測定するための高感度固相免疫測定法を提
供することにある。
本発明を概説すれば、本発明は高感度免疫測定法に関す
る発明であつて、被分析体を標識抗体を用いる固相免疫
測定法により測定するに際して、非特異的抗体及び／又
はその修飾タンパクから選択した、標識抗体の固相への
非特異吸着を防ぐブロツカーを、標識抗体の固相への添
加と同時又は該添加前に固相に添加することを特徴とす
る。
る発明であつて、被分析体を標識抗体を用いる固相免疫
測定法により測定するに際して、非特異的抗体及び／又
はその修飾タンパクから選択した、標識抗体の固相への
非特異吸着を防ぐブロツカーを、標識抗体の固相への添
加と同時又は該添加前に固相に添加することを特徴とす
る。
本発明者らは前記した従来の技術の問題点にかんがみ、
より優れた感度で測定する方法について、特に標識抗体
の固相への被特異吸着を防ぐ方向から鋭意研究を重ね
た。
より優れた感度で測定する方法について、特に標識抗体
の固相への被特異吸着を防ぐ方向から鋭意研究を重ね
た。
そして本発明者らは、非特異抗体及び／又はその修飾タ
ンパク（以下ブロツカーと称す）が標識抗体の固相上で
の非特異吸着部位を覆い標識抗体の非特異吸着を減少さ
せ、バツクグランドを低下させ、ひいては高い測定感度
を得ることを見出し本発明を完成した。
ンパク（以下ブロツカーと称す）が標識抗体の固相上で
の非特異吸着部位を覆い標識抗体の非特異吸着を減少さ
せ、バツクグランドを低下させ、ひいては高い測定感度
を得ることを見出し本発明を完成した。
本発明で用いるブロツカーとしては、各種動物又はヒト
由来のあるいはそれらの細胞を培養して得られる非特異
的イムノグロブリン及びその化学的、酵素的修飾生成物
が用いられる。
由来のあるいはそれらの細胞を培養して得られる非特異
的イムノグロブリン及びその化学的、酵素的修飾生成物
が用いられる。
ブロツカーは具的的には以下の様にして提供される。正
常動物血清より、硫安分画、DEAE−セルロースクロマト
グラフイーにより非特異IgGが提供される。このIgGをベ
プシンで処理することで非特異F(ab′)２が提供され
る。このF(ab′)2を２−メルカプトエチルアミンで還元
した後、Ｎ−エチルマレイミド、若しくはモノヨードア
セテート等でチオール基をブロツクすることでFab′が
提供される。またこれらを牛血清アルブミン、不活性化
酵素などの他のタンパクと結合させた複合体として提供
される。
常動物血清より、硫安分画、DEAE−セルロースクロマト
グラフイーにより非特異IgGが提供される。このIgGをベ
プシンで処理することで非特異F(ab′)２が提供され
る。このF(ab′)2を２−メルカプトエチルアミンで還元
した後、Ｎ−エチルマレイミド、若しくはモノヨードア
セテート等でチオール基をブロツクすることでFab′が
提供される。またこれらを牛血清アルブミン、不活性化
酵素などの他のタンパクと結合させた複合体として提供
される。
ブロツカーの起源はいずれでもよいが中でも標識抗体Fa
b′の場合は、それを作成した種と同じ種から得られる
非特異的イムノグロブリンＧを化学的及び酵素的処理し
て作成されるFab′あるいはF(ab′)2が最も適してい
る。
b′の場合は、それを作成した種と同じ種から得られる
非特異的イムノグロブリンＧを化学的及び酵素的処理し
て作成されるFab′あるいはF(ab′)2が最も適してい
る。
またブロツカーの固相への添加は標識抗体の固相への添
加と同時又は該添加前のいずれでも良いが簡便さの点か
ら同時に添加することが望ましい。
加と同時又は該添加前のいずれでも良いが簡便さの点か
ら同時に添加することが望ましい。
なお、標識抗体とは、抗体又は抗体を化学的あるいは酵
素的処理によつて限定分解して生ずる分解物に、放射活
性物質、蛍光色素、酵素、又はそれらを二次的に結合さ
せるための構造を含む基（例えばビオチン）あるいは二
次的に活性化させるための構造を含む基（例えば補酵
素）を化学的に結合させた生成物である。
素的処理によつて限定分解して生ずる分解物に、放射活
性物質、蛍光色素、酵素、又はそれらを二次的に結合さ
せるための構造を含む基（例えばビオチン）あるいは二
次的に活性化させるための構造を含む基（例えば補酵
素）を化学的に結合させた生成物である。
本発明の方法は、多数の固相免疫測定法で実施される。
以下にこれらの可能な固相免疫測定法のいくつかにつき
説明する。
以下にこれらの可能な固相免疫測定法のいくつかにつき
説明する。
液体試料中の被分析体である抗原を測定するためのサン
ドウイツチ型アツセイにおいては、被分析体と反応する
抗体を固相に付着させることができる。得られた固相を
被分析体と反応させ、次いで、この成績体に被分析体に
反応する標識抗体と、ブロツカーとからなる混合物を添
加し、得られた標識抗体サンドウイツチを、該標識物質
に特異的な方法で測定することを特徴とする被分析体の
バツクグランドの低い高感度測定法に使用される。もち
ろん、標識抗体サンドウイツチは、公知の２ステツプ法
でも、１ステツプ法でも得られる。特に１ステツプサン
ドウイツチ型アツセイには認識部位の異なるモノクロー
ナル抗体が適している。
ドウイツチ型アツセイにおいては、被分析体と反応する
抗体を固相に付着させることができる。得られた固相を
被分析体と反応させ、次いで、この成績体に被分析体に
反応する標識抗体と、ブロツカーとからなる混合物を添
加し、得られた標識抗体サンドウイツチを、該標識物質
に特異的な方法で測定することを特徴とする被分析体の
バツクグランドの低い高感度測定法に使用される。もち
ろん、標識抗体サンドウイツチは、公知の２ステツプ法
でも、１ステツプ法でも得られる。特に１ステツプサン
ドウイツチ型アツセイには認識部位の異なるモノクロー
ナル抗体が適している。
他の方法として直接免疫測定法においては被分析体を固
相に付着させることができる。得られた固相に被分析体
と反応す標識抗体とブロツカーとからなる混合物を添加
し、標識物質に特異的な方法で測定することを特徴とす
る被分析体の高感度測定法が提供される。
相に付着させることができる。得られた固相に被分析体
と反応す標識抗体とブロツカーとからなる混合物を添加
し、標識物質に特異的な方法で測定することを特徴とす
る被分析体の高感度測定法が提供される。
上述したサンドウイツチ型アツセイ及び直接免疫測定法
において標識抗体の固相への添加の前にブロツカーの固
相への添加を行つてもよい。
において標識抗体の固相への添加の前にブロツカーの固
相への添加を行つてもよい。
更に、間接免疫測定法においては、固相化された被分析
体と反応する第１の抗体と、この第１の抗体と反応する
標識された第２の抗体が用いられる。この場合被分析体
と反応する第１の抗体を標識抗体様ブロツカーの固相へ
の添加後あるいは該ブロツカーの固相への添加と同時に
固相に添加することを特徴とする高感度測定法が提供さ
れる。この時、第１の抗体と異なる動物種由来のブロツ
カーを用いなければならず、特に標識された第２の抗体
と同一の動物種由来のブロツカーが最も適している。
体と反応する第１の抗体と、この第１の抗体と反応する
標識された第２の抗体が用いられる。この場合被分析体
と反応する第１の抗体を標識抗体様ブロツカーの固相へ
の添加後あるいは該ブロツカーの固相への添加と同時に
固相に添加することを特徴とする高感度測定法が提供さ
れる。この時、第１の抗体と異なる動物種由来のブロツ
カーを用いなければならず、特に標識された第２の抗体
と同一の動物種由来のブロツカーが最も適している。
なお、直接又は間接免疫測定法は、免疫組織化学染色、
ニトロセルロース膜上での被分析体の検出、免疫電顕に
応用される。
ニトロセルロース膜上での被分析体の検出、免疫電顕に
応用される。
以下本発明を更に詳細に実施例をもつて説明するが本発
明はこれら実施例により限定されるものではない。
明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例−１ ヒトIgEの高感度固相免疫測定法（ヤギ抗
ヒトIgE）IgG−固相及びアフイニテイ精製（ヤギ抗ヒト
IgE）Fab′−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ複合体を用いた
ヒトIgEのサンドウイツチ酵素免疫測定法の測定感度に
対するヤギあるいはウサギ非特異IgG，F(ab′)2，Fab′
の効果について検討した。抗原である標準ヒトIgE血清
はベーリングウエルケ社（西独国、マールブルグ）より
購入した。IgEの算出には２．４ng/IU〔ジヤーナル オ
ブ アレルギーアンドクリニカル イムノロジー（J.Al
lergyClin，Immunol.）第４９巻、第１８９頁、（１９
７２）〕分子量２００，０００を用いた。抗体としてヤ
ギ抗ヒトIgE血清は医学生物学研究所（名古屋）より購
入した。この血清をNa2SO４で塩析した後、DEAE−セル
ロースカラムを用いIgGを得、このIgGをペプシン消化し
てF(ab′)2を得、このF(ab′)2をアフイニテイ精製し、
更に還元した後、Fab′を得た〔クリニカ キミカ ア
クタ（Clin.Chim.Acta）第１１７巻、第１９９頁（198
1）、ジヤーナル オブ イムノアツセイ（J.Immunoass
ay）第４巻、第２０９頁（１９８３）〕。
ヒトIgE）IgG−固相及びアフイニテイ精製（ヤギ抗ヒト
IgE）Fab′−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ複合体を用いた
ヒトIgEのサンドウイツチ酵素免疫測定法の測定感度に
対するヤギあるいはウサギ非特異IgG，F(ab′)2，Fab′
の効果について検討した。抗原である標準ヒトIgE血清
はベーリングウエルケ社（西独国、マールブルグ）より
購入した。IgEの算出には２．４ng/IU〔ジヤーナル オ
ブ アレルギーアンドクリニカル イムノロジー（J.Al
lergyClin，Immunol.）第４９巻、第１８９頁、（１９
７２）〕分子量２００，０００を用いた。抗体としてヤ
ギ抗ヒトIgE血清は医学生物学研究所（名古屋）より購
入した。この血清をNa2SO４で塩析した後、DEAE−セル
ロースカラムを用いIgGを得、このIgGをペプシン消化し
てF(ab′)2を得、このF(ab′)2をアフイニテイ精製し、
更に還元した後、Fab′を得た〔クリニカ キミカ ア
クタ（Clin.Chim.Acta）第１１７巻、第１９９頁（198
1）、ジヤーナル オブ イムノアツセイ（J.Immunoass
ay）第４巻、第２０９頁（１９８３）〕。
抗体（IgG）の結合した固相はポリスチレンボール〔直
径３．２mm プレシジヨン プラスチツク ボール社
（イリノイ州シカゴ）製〕の表面上に抗体（IgG）を物
理的吸着によつて不溶化することで得られた〔スカンジ
ナビアン ジヤーナル オブ イムノロジイ（Scand.J.
Immunol）第８巻、第４３頁（１９７８）〕。β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ−Fab′複合体は大腸菌由来のβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼとFab′をＮ，Ｎ′−ｏ−フエニレ
ンジマレイミドを用いジヤーナル オブ イムノアツセ
イ、第４巻、第２０９頁（１９８３）記載の方法で結合
させた。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１分子に対するFa
b′の結合数は１．７−２．９であつた。複合体の量の
算定にはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を用いた〔ジヤ
ーナル オブ イムノアツセイ、第４巻、第２０９頁
（１９８３）〕。
径３．２mm プレシジヨン プラスチツク ボール社
（イリノイ州シカゴ）製〕の表面上に抗体（IgG）を物
理的吸着によつて不溶化することで得られた〔スカンジ
ナビアン ジヤーナル オブ イムノロジイ（Scand.J.
Immunol）第８巻、第４３頁（１９７８）〕。β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ−Fab′複合体は大腸菌由来のβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼとFab′をＮ，Ｎ′−ｏ−フエニレ
ンジマレイミドを用いジヤーナル オブ イムノアツセ
イ、第４巻、第２０９頁（１９８３）記載の方法で結合
させた。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１分子に対するFa
b′の結合数は１．７−２．９であつた。複合体の量の
算定にはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を用いた〔ジヤ
ーナル オブ イムノアツセイ、第４巻、第２０９頁
（１９８３）〕。
サンドウイツチ酵素免疫測定法は以下の様に行つた。す
なわち、抗体−ポリスチレンボールを抗原と３７℃で４
時間インキユベートした後、４℃で一夜放置した。抗原
はNaCl０．１Ｍ、MgCl２１ｍＭ、ウシ血清アルブミン１
ｇ／及びNaN３１ｇ／を含むリン酸ソーダバツフア
ー（１０ｍＭ、pH７．０）からなるバツフアーＡによつ
て希釈し、総容量０．１５mlとした。
なわち、抗体−ポリスチレンボールを抗原と３７℃で４
時間インキユベートした後、４℃で一夜放置した。抗原
はNaCl０．１Ｍ、MgCl２１ｍＭ、ウシ血清アルブミン１
ｇ／及びNaN３１ｇ／を含むリン酸ソーダバツフア
ー（１０ｍＭ、pH７．０）からなるバツフアーＡによつ
て希釈し、総容量０．１５mlとした。
その後ポリスチレンボールをバツフアーＡ２mlで２回洗
浄した。このポリスチレンボールをアフイニテイ精製Fa
b′−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ複合体〔１０ｆモル
（６．３ｎｇ）／チユーブ〕と２０℃４時間インキユベ
ートした。この時、ブロツカーすなわちヤギあるいはウ
サギの非特異IgG，F(ab′)2，Fab′を共存させ、総容量
０．１５mlとした。インキユベーシヨン後、一系列は、
反応液を除去後、２mlのバツフアーＡを加え吸引するこ
とにより２回洗浄した（イ法）。また他の系列は、反応
液を除去後、２mlのバツフアーＡを加え３０℃１０分イ
ンキユベートし、吸引して取去り、もう一度同じ操作を
繰返して洗浄した（ロ法）。以上の操作後、ポリスチレ
ンボールに吸着した酵素活性を測定した。β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ活性は４−メチルウンベリフエリルβ−Ｄ
−ガラクトシドを用いて３０℃で６０分反応し、１×１
０-8Ｍ ４−メチルウンベリフエロンを標準として測定
した〔アンナルス クリニカル バイオケミストリー
（Ann．Clin．Biochem．）第２１巻、第３１０頁（１９
８４）〕。なお、ブロツカーは以下の様に製造される。
すなわちヤギあるいはウサギの正常血清をNa2SO４で塩
析した後、ＤＥＡＥ−セルロースカラムを凭言いIgGを
得、このIgGをペプシン消化してF(ab′）2を得、このF
(ab′)2を還元した後Ｎ−エチルマレイミド（あるいは
モノヨードアセテート）でチオール基をブロツクしてFa
b′が各々調整される。
浄した。このポリスチレンボールをアフイニテイ精製Fa
b′−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ複合体〔１０ｆモル
（６．３ｎｇ）／チユーブ〕と２０℃４時間インキユベ
ートした。この時、ブロツカーすなわちヤギあるいはウ
サギの非特異IgG，F(ab′)2，Fab′を共存させ、総容量
０．１５mlとした。インキユベーシヨン後、一系列は、
反応液を除去後、２mlのバツフアーＡを加え吸引するこ
とにより２回洗浄した（イ法）。また他の系列は、反応
液を除去後、２mlのバツフアーＡを加え３０℃１０分イ
ンキユベートし、吸引して取去り、もう一度同じ操作を
繰返して洗浄した（ロ法）。以上の操作後、ポリスチレ
ンボールに吸着した酵素活性を測定した。β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ活性は４−メチルウンベリフエリルβ−Ｄ
−ガラクトシドを用いて３０℃で６０分反応し、１×１
０-8Ｍ ４−メチルウンベリフエロンを標準として測定
した〔アンナルス クリニカル バイオケミストリー
（Ann．Clin．Biochem．）第２１巻、第３１０頁（１９
８４）〕。なお、ブロツカーは以下の様に製造される。
すなわちヤギあるいはウサギの正常血清をNa2SO４で塩
析した後、ＤＥＡＥ−セルロースカラムを凭言いIgGを
得、このIgGをペプシン消化してF(ab′）2を得、このF
(ab′)2を還元した後Ｎ−エチルマレイミド（あるいは
モノヨードアセテート）でチオール基をブロツクしてFa
b′が各々調整される。
結果を第１図に示す。すなわち第１図は、ヒトIgEの固
相免疫測定法におけるブロツカーによる非特異吸着の低
下を固相へ吸着した酵素量（％、縦軸）とブロツカー量
（μｇ／チユーブ、横軸）の関係で示すグラフである。
相免疫測定法におけるブロツカーによる非特異吸着の低
下を固相へ吸着した酵素量（％、縦軸）とブロツカー量
（μｇ／チユーブ、横軸）の関係で示すグラフである。
第１図中、白丸はバツフアーＡでイ法により洗浄した時
の（ヤギ抗ヒドIgE）Fab′−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
複合体の固相への特異吸着を、白三角はバツフアーＡで
イ法により洗浄した時の同複合体の固相への非特異吸着
を、黒丸はバツフアーＡでロ法により洗浄した時の同複
合体の固相への特異吸着を、黒三角はバツフアーＡでロ
法により洗浄した時の同複合体の固相への非特異吸着を
各々示す。IgEは０．０３ＩＵ／チユーブで用いた。ま
た、Fab′−酵素複合体の特異吸着量の算定は抗原存在
下で固相に吸着した複合体量から、抗原非存在下で固相
に吸着した複合体量を差し引くことで求めた。複合体量
は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性より算出した。
の（ヤギ抗ヒドIgE）Fab′−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
複合体の固相への特異吸着を、白三角はバツフアーＡで
イ法により洗浄した時の同複合体の固相への非特異吸着
を、黒丸はバツフアーＡでロ法により洗浄した時の同複
合体の固相への特異吸着を、黒三角はバツフアーＡでロ
法により洗浄した時の同複合体の固相への非特異吸着を
各々示す。IgEは０．０３ＩＵ／チユーブで用いた。ま
た、Fab′−酵素複合体の特異吸着量の算定は抗原存在
下で固相に吸着した複合体量から、抗原非存在下で固相
に吸着した複合体量を差し引くことで求めた。複合体量
は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性より算出した。
固相を標識抗体と反応させる際に、ヤギ非特異IgG，F(a
b′)2あるいはFab′１００μｇ／チユーブを加えること
により、加えたFab′−酵素複合体の固相への非特異吸
着量が0.0055％から０．０００７〜０．００１０％へ減
少した。ウサギ非特異IgG，F(ab′)2，Fab′はヤギ非特
異IgG，F(ab′)2，Fab′に比べ効果が少なかつた。
b′)2あるいはFab′１００μｇ／チユーブを加えること
により、加えたFab′−酵素複合体の固相への非特異吸
着量が0.0055％から０．０００７〜０．００１０％へ減
少した。ウサギ非特異IgG，F(ab′)2，Fab′はヤギ非特
異IgG，F(ab′)2，Fab′に比べ効果が少なかつた。
他方、上記の方法でIgEの測定感度について検討した。
結果を第２図に示す。すなわち第２図は、ブロツカーに
よるバツクグランドの低下と高感度化を蛍光強度（縦
軸）とIgE量（ｍＩＵ／チユーブ、横軸）の関係で示す
グラフである。
結果を第２図に示す。すなわち第２図は、ブロツカーに
よるバツクグランドの低下と高感度化を蛍光強度（縦
軸）とIgE量（ｍＩＵ／チユーブ、横軸）の関係で示す
グラフである。
第２図中、白丸は複合体のインキユベートしバツフアー
Ａでイ法で洗浄した場合、白三角は、複合体をヤギの非
特異F(ab′)2（１００μｇ／チユーブ）存在下でインキ
ユベートし、ロ法でバツフアーＡを用いて洗浄した場合
の標準曲線を各々示す。測定感度は抗原存在下、及び非
存在下でポリスチレンボールに吸着したβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ活性の差からｔ−検定を用いて決定した。複
合体をヤギ非特異F(ab′)2存在下でインキユベートする
ことで、測定感度は０．１ｍＵ（１ａモル）／チユーブ
から０．０１ｍＵ（０．１ａモル）／チユーブへ１０倍
改善された。
Ａでイ法で洗浄した場合、白三角は、複合体をヤギの非
特異F(ab′)2（１００μｇ／チユーブ）存在下でインキ
ユベートし、ロ法でバツフアーＡを用いて洗浄した場合
の標準曲線を各々示す。測定感度は抗原存在下、及び非
存在下でポリスチレンボールに吸着したβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ活性の差からｔ−検定を用いて決定した。複
合体をヤギ非特異F(ab′)2存在下でインキユベートする
ことで、測定感度は０．１ｍＵ（１ａモル）／チユーブ
から０．０１ｍＵ（０．１ａモル）／チユーブへ１０倍
改善された。
実施例−２ ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）の高感
度固相免疫測定法 （ウサギ抗hCG）IgG−固相及びアフイニテイ精製（ウサ
ギ抗hCG）Fab′−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ又はアフイ
ニテイ精製（ウサギ抗hCG）Fab′−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ複合体を用いたhCGのサンドウイツチ酵素免疫
測定法の測定感度に対するウサギ非特異F(ab′)2，Fa
b′の効果について検討した。抗原であるhCGはカルビオ
ヘム ベーリング社（カリフオルニア州サンジエゴ）よ
り購入した。hCG量の算出には１２，０００ＩＵ／mg、
分子量37,700を用いた〔ジヤーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー（Ｊ．Biol．Chem.）第２４４巻、
第５６７頁（１９６９）〕。抗体として（ウサギ抗hC
G）IgGはダコ パツツ社（デンマーク国グロストラツ
プ）より購入した。この抗体IgGから実施例−１と同様
にF(ab′)2，Fab′を得た。抗体IgGの結合した固相は実
施例−１と同様にして製造した。β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ−Fab′複合体の製造は実施例−１と同様に行つ
た。他方、ベルオキシダーゼ−Fab′複合体はスクシン
イミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサ
ン−１−カルボキシレート〔ジーベン ケミカル社（東
京）製〕を用い、ジヤーナル オブ イムノアツセイ第
４巻、第２０９頁（１９８３）記載の方法で結合させ
た。ペルオキシダーゼ−Fab′複合体の量の算定には４
０３ｎｍの吸収を用い、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−Fa
b′複合体の量の算定は実施例−１と同様に行つた〔ジ
ヤーナル オブ イムノアツセイ第４巻、第２０９頁
（１９８３）〕。
度固相免疫測定法 （ウサギ抗hCG）IgG−固相及びアフイニテイ精製（ウサ
ギ抗hCG）Fab′−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ又はアフイ
ニテイ精製（ウサギ抗hCG）Fab′−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ複合体を用いたhCGのサンドウイツチ酵素免疫
測定法の測定感度に対するウサギ非特異F(ab′)2，Fa
b′の効果について検討した。抗原であるhCGはカルビオ
ヘム ベーリング社（カリフオルニア州サンジエゴ）よ
り購入した。hCG量の算出には１２，０００ＩＵ／mg、
分子量37,700を用いた〔ジヤーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー（Ｊ．Biol．Chem.）第２４４巻、
第５６７頁（１９６９）〕。抗体として（ウサギ抗hC
G）IgGはダコ パツツ社（デンマーク国グロストラツ
プ）より購入した。この抗体IgGから実施例−１と同様
にF(ab′)2，Fab′を得た。抗体IgGの結合した固相は実
施例−１と同様にして製造した。β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ−Fab′複合体の製造は実施例−１と同様に行つ
た。他方、ベルオキシダーゼ−Fab′複合体はスクシン
イミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサ
ン−１−カルボキシレート〔ジーベン ケミカル社（東
京）製〕を用い、ジヤーナル オブ イムノアツセイ第
４巻、第２０９頁（１９８３）記載の方法で結合させ
た。ペルオキシダーゼ−Fab′複合体の量の算定には４
０３ｎｍの吸収を用い、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−Fa
b′複合体の量の算定は実施例−１と同様に行つた〔ジ
ヤーナル オブ イムノアツセイ第４巻、第２０９頁
（１９８３）〕。
サンドウイツチ酵素免疫測定法は実施例−１と同様に行
つた。ただし、ペルオキシダーゼ−Fab′複合体の場合
は、固相の洗浄に０．１ＭNaClを含むリン酸ソーダバツ
フアー（１０mM、pH７．０）（バツフアーＢ）を用い、
複合体とインキユベーシヨンには、１ｇ／ウシ血清ア
ルブミンを含むバツフアーＢを用いた。また、ペルオキ
シダーゼ-Fab′は５８０ｆモル（５０ｎｇ）／チユーブ
となる様に加えた。酵素活性は３−（ｐ−ヒドロキシフ
エニル）プロピオン酸を用いて３０℃１００分アツセイ
し、０．２mg／キニンを標準として測定した〔アナリ
テイカルレターズ（Anal．Lett．）第１６巻、第１５０
９頁（１９８３）〕。
つた。ただし、ペルオキシダーゼ−Fab′複合体の場合
は、固相の洗浄に０．１ＭNaClを含むリン酸ソーダバツ
フアー（１０mM、pH７．０）（バツフアーＢ）を用い、
複合体とインキユベーシヨンには、１ｇ／ウシ血清ア
ルブミンを含むバツフアーＢを用いた。また、ペルオキ
シダーゼ-Fab′は５８０ｆモル（５０ｎｇ）／チユーブ
となる様に加えた。酵素活性は３−（ｐ−ヒドロキシフ
エニル）プロピオン酸を用いて３０℃１００分アツセイ
し、０．２mg／キニンを標準として測定した〔アナリ
テイカルレターズ（Anal．Lett．）第１６巻、第１５０
９頁（１９８３）〕。
結果を第３図に示す。すなわち第３図は、hCGの固相免
疫測定法におけるブロツカーによる非特異吸着の低下を
固相へ吸着した酵素量（％，縦軸）とブロツカー量（μ
ｇ／チユーブ、横軸）の関係で示すグラフである。
疫測定法におけるブロツカーによる非特異吸着の低下を
固相へ吸着した酵素量（％，縦軸）とブロツカー量（μ
ｇ／チユーブ、横軸）の関係で示すグラフである。
第３図中、白丸は、イ法で洗浄を行つた時の酵素−Fa
b′複合体の固相への特異吸着を、黒丸はロ法で洗浄を
行つた時の複合体の固相への特異吸着を、白三角はイ法
で洗浄を行つた時の、複合体の固相への非特異吸着を、
黒三角はロ法で洗浄を行つた時の複合体の固相への非特
異吸着を各々示す。
b′複合体の固相への特異吸着を、黒丸はロ法で洗浄を
行つた時の複合体の固相への特異吸着を、白三角はイ法
で洗浄を行つた時の、複合体の固相への非特異吸着を、
黒三角はロ法で洗浄を行つた時の複合体の固相への非特
異吸着を各々示す。
なお、hCGは０．１ｍＵ／チユーブとなるように添加し
た。
た。
ウサギ非特異F(ab′)2及びFab′１００μｇ／チユーブ
を加えることによりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−Fab′
複合体の固相への非特異吸着は０．０４０％から０．０
０２６−０．００３５％へ減少した。一方、ペルオキシ
ダーゼ−Fab′複合体の固相への非特異吸着もブロツカ
ーの添加により０．００１８％から０．００１％へ減少
した。他方、上記の方法でhCGの測定感度について検討
した。
を加えることによりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−Fab′
複合体の固相への非特異吸着は０．０４０％から０．０
０２６−０．００３５％へ減少した。一方、ペルオキシ
ダーゼ−Fab′複合体の固相への非特異吸着もブロツカ
ーの添加により０．００１８％から０．００１％へ減少
した。他方、上記の方法でhCGの測定感度について検討
した。
結果を第４図に示す。すなわち第４図は、ブロツカーに
よるバツクグランドの低下と高感度化を、蛍光強度（縦
軸）とhCG量（μＵ、横軸）の関係で示すグラフであ
る。第４図中白丸は、ペルオキシダーゼFab′複合体と
インキユベートしバツフアーＢでイ法で洗浄した場合、
白三角は、ペルオキシダーゼ−Fab′（複合体をウサギ
非特異F(ab′)2（１００μｇ／チユーブ）存在下でイン
キユベートし、ロ法でバツフアーＢを用いて洗浄した場
合の標準曲線を各々示す。測定感度は、複合体をウサギ
非特異F(ab′)2存在下でインキユベートすることで、１
μＵ（２ａモル）／チユーブから０．３μＵ（０．７ａ
モル）／チユーブへ３倍改善された。
よるバツクグランドの低下と高感度化を、蛍光強度（縦
軸）とhCG量（μＵ、横軸）の関係で示すグラフであ
る。第４図中白丸は、ペルオキシダーゼFab′複合体と
インキユベートしバツフアーＢでイ法で洗浄した場合、
白三角は、ペルオキシダーゼ−Fab′（複合体をウサギ
非特異F(ab′)2（１００μｇ／チユーブ）存在下でイン
キユベートし、ロ法でバツフアーＢを用いて洗浄した場
合の標準曲線を各々示す。測定感度は、複合体をウサギ
非特異F(ab′)2存在下でインキユベートすることで、１
μＵ（２ａモル）／チユーブから０．３μＵ（０．７ａ
モル）／チユーブへ３倍改善された。
実施例−３ ヒト−α−フエトプロテイン(AFP)の高感
度固相免疫測定法 （ヤギ抗ヒト−ＡＦＰ）IgG−固相及び、アフイニテイ
精製（ヤギ抗ヒトＡＦＰ）Fab′−β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ複合体を用いた。ヒトＡＦＰのサンドウイツチ酵
素免疫測定法の測定感度に対するヤギ非特異F(ab′)2の
効果について検討した。抗原であるヒトＡＦＰはベーリ
ングウエルケ社より購入した。ＡＦＰ量の算出には分子
量７０，０００を用いた〔クリニカ キミカ アクタ
（Clin．Chim．Acta）第８９巻、第１７３頁（１９７
８）〕。抗体としてヤギ抗ヒトＡＦＰ血清は医学生物学
研究所（名古屋）より購入した。このヤギ抗ヒトＡＦＰ
血清を実施例−１と同様の方法で精製し、ヤギ抗ヒトＡ
ＦＰIgG，F(ab′)2，Fab′を各々得た。抗体IgGの結合
した固相、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−Fab′複合体の
製造は実施例−１と同様の方法で行つた。サンドウイツ
チ酵素免疫測定法は実施例−１と同様に行つた。
度固相免疫測定法 （ヤギ抗ヒト−ＡＦＰ）IgG−固相及び、アフイニテイ
精製（ヤギ抗ヒトＡＦＰ）Fab′−β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ複合体を用いた。ヒトＡＦＰのサンドウイツチ酵
素免疫測定法の測定感度に対するヤギ非特異F(ab′)2の
効果について検討した。抗原であるヒトＡＦＰはベーリ
ングウエルケ社より購入した。ＡＦＰ量の算出には分子
量７０，０００を用いた〔クリニカ キミカ アクタ
（Clin．Chim．Acta）第８９巻、第１７３頁（１９７
８）〕。抗体としてヤギ抗ヒトＡＦＰ血清は医学生物学
研究所（名古屋）より購入した。このヤギ抗ヒトＡＦＰ
血清を実施例−１と同様の方法で精製し、ヤギ抗ヒトＡ
ＦＰIgG，F(ab′)2，Fab′を各々得た。抗体IgGの結合
した固相、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−Fab′複合体の
製造は実施例−１と同様の方法で行つた。サンドウイツ
チ酵素免疫測定法は実施例−１と同様に行つた。
結果を第５図に示す。すなわち第５図は、ヒトＡＦＰの
固相免疫測定法におけるブロツカーによるバツクグラン
ドの低下と高感度化を蛍光強度（縦軸）とＡＦＰ量（ａ
モル／チユーブ、横軸）の関係で示すグラフである。第
５図中白丸は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼFab′複合体
とインキユベートし、バツフアーＡを用いイ法で洗浄し
た場合、白三角はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−Fab′複
合体をヤギ非特異F(ab′)2（１００μｇ／チユーブ）存
在下でインキユベートし、バツフアーＡを用いロ法で洗
浄した場合の標準曲線を各々示す。
固相免疫測定法におけるブロツカーによるバツクグラン
ドの低下と高感度化を蛍光強度（縦軸）とＡＦＰ量（ａ
モル／チユーブ、横軸）の関係で示すグラフである。第
５図中白丸は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼFab′複合体
とインキユベートし、バツフアーＡを用いイ法で洗浄し
た場合、白三角はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−Fab′複
合体をヤギ非特異F(ab′)2（１００μｇ／チユーブ）存
在下でインキユベートし、バツフアーＡを用いロ法で洗
浄した場合の標準曲線を各々示す。
測定感度は、複合体をヤギ非特異F(ab′)2存在下でイン
キユベートすることで７０fg（１ａモル）／チユーブか
ら２１fg（０．３ａモル）／チユーブへ３倍改善され
た。
キユベートすることで７０fg（１ａモル）／チユーブか
ら２１fg（０．３ａモル）／チユーブへ３倍改善され
た。
実施例−４ ヒト・α−フエトプロテイン(AFP)の高感
度固相免疫測定法 （ヤギ抗ヒトＡＦＰ）IgG−固相及びアフイニテイ精製
（ヤギ抗ヒトＡＦＰ）Fab′−ペルオキシダーゼ複合体
を用いたヒトＡＦのサンドウイツチ酵素免疫測定法の測
定感度に対するヤギ非特異f(ab′)2の効果について実施
例−３と同様の方法で検討した。ただし、ペルオキシダ
ーゼ-Fab′複合体の調製とバツフアーは、実施例−２に
従つた。
度固相免疫測定法 （ヤギ抗ヒトＡＦＰ）IgG−固相及びアフイニテイ精製
（ヤギ抗ヒトＡＦＰ）Fab′−ペルオキシダーゼ複合体
を用いたヒトＡＦのサンドウイツチ酵素免疫測定法の測
定感度に対するヤギ非特異f(ab′)2の効果について実施
例−３と同様の方法で検討した。ただし、ペルオキシダ
ーゼ-Fab′複合体の調製とバツフアーは、実施例−２に
従つた。
結果を第６図に示す。すなわち、第６図は、第５図と同
様なグラフである。第６図中白丸は、ペルオキシダーゼ
Fab′複合体とインキユベートし、バツフアーＢを用い
イ法で洗浄した場合、白三角は、ペルオキシダーゼ−Fa
b′複合体をヤギ非特異F(ab′)2（１０００μｇ／チユ
ーブ）存在下でインキユベートし、バツフアーＢを用い
ロ法で洗浄した場合の標準曲線を各々示す。
様なグラフである。第６図中白丸は、ペルオキシダーゼ
Fab′複合体とインキユベートし、バツフアーＢを用い
イ法で洗浄した場合、白三角は、ペルオキシダーゼ−Fa
b′複合体をヤギ非特異F(ab′)2（１０００μｇ／チユ
ーブ）存在下でインキユベートし、バツフアーＢを用い
ロ法で洗浄した場合の標準曲線を各々示す。
測定感度は複合体をヤギ非特異F(ab′)2存在下でインキ
ユベートすることで１４０fg（２ａモル）／チユーブか
ら５６fg（０．８ａモル）／チユーブへ２．５倍改 善
された。
ユベートすることで１４０fg（２ａモル）／チユーブか
ら５６fg（０．８ａモル）／チユーブへ２．５倍改 善
された。
実施例−５ ヒト・インスリンの高感度固相免疫測定法 （モルモツト抗ブタ・インスリン）IgG−固相及びアフ
イニテイ精製（モルモツト抗ブタ・インスリン）Fab′
−ペルオキシダーゼ複合体を用いた。ヒト・インスリン
のサンドウイツチ酵素免疫測定法の測定感度に対するモ
ルモツト非特異F(ab′)2の効果について検討した。抗原
であるヒト・インスリンはＷＨＯ（１st．I.R.P.インス
リン、ヒト免疫測定用６６／３０４）より供与されたも
のを用いた。インスリンの量の算定には２３．５ＩＵ／
mg〔ＷＨＯテクニカル リポート シリーズ（ＷＨＯ
Technical Reportp Series）No.５６５（１９７５）〕
分子量５８０８〔ダイアビーチス ケア（Diabetes Ca
re）第４巻、第１４７頁（１９８１）〕を用いた。抗体
として、モルモツト抗ブタインスリン血清は医学生物学
研究所（名古屋）より購入した。このモルモツト抗ブタ
インスリン血清を実施例−１と同様の方法で精製し、モ
ルモツト抗ブタインスリンIgG，F(ab′)2，Fab′を各々
得た。ただし、アフイニテイ精製は、Fab′をペルオキ
シダーゼと結合した後に行つた。抗体IgGの結合した固
相は実施例−１と、ペルオキシダーゼ−Fab′複合体は
実施例−２と同様に製造した。サンドウイツチ酵素免疫
測定法は実施例−４と同様に行つた。
イニテイ精製（モルモツト抗ブタ・インスリン）Fab′
−ペルオキシダーゼ複合体を用いた。ヒト・インスリン
のサンドウイツチ酵素免疫測定法の測定感度に対するモ
ルモツト非特異F(ab′)2の効果について検討した。抗原
であるヒト・インスリンはＷＨＯ（１st．I.R.P.インス
リン、ヒト免疫測定用６６／３０４）より供与されたも
のを用いた。インスリンの量の算定には２３．５ＩＵ／
mg〔ＷＨＯテクニカル リポート シリーズ（ＷＨＯ
Technical Reportp Series）No.５６５（１９７５）〕
分子量５８０８〔ダイアビーチス ケア（Diabetes Ca
re）第４巻、第１４７頁（１９８１）〕を用いた。抗体
として、モルモツト抗ブタインスリン血清は医学生物学
研究所（名古屋）より購入した。このモルモツト抗ブタ
インスリン血清を実施例−１と同様の方法で精製し、モ
ルモツト抗ブタインスリンIgG，F(ab′)2，Fab′を各々
得た。ただし、アフイニテイ精製は、Fab′をペルオキ
シダーゼと結合した後に行つた。抗体IgGの結合した固
相は実施例−１と、ペルオキシダーゼ−Fab′複合体は
実施例−２と同様に製造した。サンドウイツチ酵素免疫
測定法は実施例−４と同様に行つた。
結果を第７図に示す。すなわち第７図は、ヒトインスリ
ンの固相免疫測定法におけるブロツカーにおけるバツク
グランドの低下と高感度化を、蛍光強度（縦軸）とイン
スリン量（ｎＵ／チユーブ、横軸）の関係で示すグラフ
である。第７図中白丸は、バツフアーＢを用いイ法で洗
浄した場合、白三角はペルオキシダーゼ−Fab′複合体
をモルモツト非特異F(ab′)2（１００μｇ／チユーブ）
存在下でインキユベートし、バツフアーＢを用いロ法で
洗浄した場合の標準曲線を各々示す。測定感度は、モル
モツト非特異F(ab′)2存在下で複合体と固相とインキユ
ベートすることで１ｎＵ（７ａモル）／チユーブから
０．６ｎＵ（４ａモル）／チユーブへ１．７倍改善され
た。
ンの固相免疫測定法におけるブロツカーにおけるバツク
グランドの低下と高感度化を、蛍光強度（縦軸）とイン
スリン量（ｎＵ／チユーブ、横軸）の関係で示すグラフ
である。第７図中白丸は、バツフアーＢを用いイ法で洗
浄した場合、白三角はペルオキシダーゼ−Fab′複合体
をモルモツト非特異F(ab′)2（１００μｇ／チユーブ）
存在下でインキユベートし、バツフアーＢを用いロ法で
洗浄した場合の標準曲線を各々示す。測定感度は、モル
モツト非特異F(ab′)2存在下で複合体と固相とインキユ
ベートすることで１ｎＵ（７ａモル）／チユーブから
０．６ｎＵ（４ａモル）／チユーブへ１．７倍改善され
た。
以上詳細に説明した様に、本発明により標識抗体の固相
への非特異吸着が減少し、その結果、固相免疫測定法に
おける超微量分析が可能となつた。
への非特異吸着が減少し、その結果、固相免疫測定法に
おける超微量分析が可能となつた。
第１図は、ヒトIgEの固相免疫測定法におけるブロツカ
ーによる非特異吸着の低下を示すグラフ、第２図は、ヒ
トIgEの固相免疫測定法におけるブロツカーによるバツ
クグランドの低下と高感度化を示すグラフ、第３図は、
hCGの固相免疫測定法におけるブロツカーによる非特異
吸着の低下を示すグラフ、第４図は、hCGの固相免疫測
定法におけるブロツカーによるバツクグランドの低下と
高感度化を示すグラフ、第５図及び第６図は、ヒトＡＦ
Ｐの固相免疫測定法におけるブロツカーによるバツクグ
ランドの低下と高感度化を示すグラフ、第７図は、ヒト
インスリンの固相免疫測定法におけるブロツカーによる
バツクグランドの低下と高感度化を示すグラフである。
ーによる非特異吸着の低下を示すグラフ、第２図は、ヒ
トIgEの固相免疫測定法におけるブロツカーによるバツ
クグランドの低下と高感度化を示すグラフ、第３図は、
hCGの固相免疫測定法におけるブロツカーによる非特異
吸着の低下を示すグラフ、第４図は、hCGの固相免疫測
定法におけるブロツカーによるバツクグランドの低下と
高感度化を示すグラフ、第５図及び第６図は、ヒトＡＦ
Ｐの固相免疫測定法におけるブロツカーによるバツクグ
ランドの低下と高感度化を示すグラフ、第７図は、ヒト
インスリンの固相免疫測定法におけるブロツカーによる
バツクグランドの低下と高感度化を示すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】被分析体を標識抗体を用いる固相免疫測定
法により測定するに際して、非特異的抗体及び／又はそ
の修飾タンパクから選択した、標識抗体の固相への非特
異吸着を防ぐブロツカーを、標識抗体の固相への添加と
同時又は該添加前に固相に添加することを特徴とする被
分析体の高感度免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60058230A JPH0634013B2 (ja) | 1985-03-25 | 1985-03-25 | 高感度免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60058230A JPH0634013B2 (ja) | 1985-03-25 | 1985-03-25 | 高感度免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61217762A JPS61217762A (ja) | 1986-09-27 |
| JPH0634013B2 true JPH0634013B2 (ja) | 1994-05-02 |
Family
ID=13078281
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60058230A Expired - Lifetime JPH0634013B2 (ja) | 1985-03-25 | 1985-03-25 | 高感度免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0634013B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL102495A (en) * | 1992-07-14 | 1998-06-15 | Patchornik Avraham | Universal standard reagents, method of preparing same and use thereof |
| JPH0968531A (ja) * | 1995-08-31 | 1997-03-11 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5570742A (en) * | 1978-11-22 | 1980-05-28 | Kyorin Pharmaceut Co Ltd | Measuring method of engyme immunity of hito placenta lactogen with sandwich method and kit used for it |
| JPS579723A (en) * | 1980-06-20 | 1982-01-19 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Stabilizing agent for immunological reaction and measuring method of antigen-antibody reaction |
| JPS57124253A (en) * | 1981-01-26 | 1982-08-03 | Toyobo Co Ltd | Immunological measuring method for adrenocorticotropic hormone precursor |
-
1985
- 1985-03-25 JP JP60058230A patent/JPH0634013B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61217762A (ja) | 1986-09-27 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |