JP2657672B2 - 超高感度特異的抗体の測定法 - Google Patents
超高感度特異的抗体の測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原特異抗体の超高感度測定方法に関する。
抗体の測定は感染症、自己免疫疾患等の検査に広く用
いられており、また、既に被検液中で抗原抗体複合体を
形成させた成分の測定は自己免疫疾患等の検査において
重要である。
いられており、また、既に被検液中で抗原抗体複合体を
形成させた成分の測定は自己免疫疾患等の検査において
重要である。
従前、前述のごとき抗体の微量測定は、免疫学的測定
法によつて行われている。近年、免疫学的測定法におい
て、担体を用いる方法が広く行われている。ELISA法、I
RMA法のごときサンドイツチ型測定法や競合型測定法が
ある。
法によつて行われている。近年、免疫学的測定法におい
て、担体を用いる方法が広く行われている。ELISA法、I
RMA法のごときサンドイツチ型測定法や競合型測定法が
ある。
従来行われている抗体測定法は、抗原を不溶化した担
体の上に、被検液中の特異抗体をトラツプし、これを標
識抗イムノグロブリン抗体により測定する方法がある
（第１の技術）。また、抗イムノグロブリン抗体を不溶
化した担体の上に特異抗体をトラツプし、これを標識抗
原を用いて測定する方法がある（第２の技術）。
体の上に、被検液中の特異抗体をトラツプし、これを標
識抗イムノグロブリン抗体により測定する方法がある
（第１の技術）。また、抗イムノグロブリン抗体を不溶
化した担体の上に特異抗体をトラツプし、これを標識抗
原を用いて測定する方法がある（第２の技術）。
第１の技術の例としては、抗インスリン抗体の測定に
おけるL.J.ネル（L.J.Nell）ら〔ダイアビーチス（Diab
etes）第34巻、第60頁（1985）〕のインスリンを不溶化
した担体に被検体液を加え、結合したヒト抗インスリン
抗体を酵素標識抗ヒトイムノグロブリン抗体を用いて定
量した報告がある。第２の技術として、抗トキソプラズ
マIgM抗体の測定における、A.M.ジヨンソン（A.M.Johns
on）ら〔パソロジー（Pathology）第17巻、第586頁（19
85）〕の抗IgM抗体不溶化固相を用いた報告がある。
おけるL.J.ネル（L.J.Nell）ら〔ダイアビーチス（Diab
etes）第34巻、第60頁（1985）〕のインスリンを不溶化
した担体に被検体液を加え、結合したヒト抗インスリン
抗体を酵素標識抗ヒトイムノグロブリン抗体を用いて定
量した報告がある。第２の技術として、抗トキソプラズ
マIgM抗体の測定における、A.M.ジヨンソン（A.M.Johns
on）ら〔パソロジー（Pathology）第17巻、第586頁（19
85）〕の抗IgM抗体不溶化固相を用いた報告がある。
第１の技術では、被検体液中に通常多量の非特異イム
ノグロブリンが含まれており、これが固相に非特異的に
吸着するため標識イムノグロブリン抗体が結合し、測定
のバツクグラウンドが高くなり測定感度が悪くなるとい
う欠点がある。第２の技術では、抗イムノグロブリン抗
体不溶化固相のイムノグロブリンをトラツプする能力に
限定がある。もし、担体の能力を大きくすれば、その結
果、バツクグラウンドが大きくなる。いずれにしても高
感度化が困難である。
ノグロブリンが含まれており、これが固相に非特異的に
吸着するため標識イムノグロブリン抗体が結合し、測定
のバツクグラウンドが高くなり測定感度が悪くなるとい
う欠点がある。第２の技術では、抗イムノグロブリン抗
体不溶化固相のイムノグロブリンをトラツプする能力に
限定がある。もし、担体の能力を大きくすれば、その結
果、バツクグラウンドが大きくなる。いずれにしても高
感度化が困難である。
本発明の目的は、このような状況下、従前にない高感
度の測定法を提供することにある。
度の測定法を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明は特異的抗体の測定法に
関する発明であって、下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及
び（Ｄ）工程： 工程（Ａ）：次の（ａ）又は（ｂ）工程。
関する発明であって、下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及
び（Ｄ）工程： 工程（Ａ）：次の（ａ）又は（ｂ）工程。
（ａ）被検液の測定すべき特異的抗体と、１種又は２種
以上の官能基が結合した活性成分とから構成される複合
体を形成させた後、この複合体を担体に結合させる工
程。ここで、 （１） 少なくとも一つの活性成分には１種又は２種以
上の官能基が結合しており、活性成分は測定すべき特異
的抗体と結合することができ、活性成分に結合した官能
基は担体に結合した反応基と結合することができ、 （２） 担体には反応基が結合しており、この反応基は
活性成分に結合した官能基と結合することができる。
以上の官能基が結合した活性成分とから構成される複合
体を形成させた後、この複合体を担体に結合させる工
程。ここで、 （１） 少なくとも一つの活性成分には１種又は２種以
上の官能基が結合しており、活性成分は測定すべき特異
的抗体と結合することができ、活性成分に結合した官能
基は担体に結合した反応基と結合することができ、 （２） 担体には反応基が結合しており、この反応基は
活性成分に結合した官能基と結合することができる。
（ｂ）当該複合体を担体上で形成させる工程。
工程（Ｂ）：複合体が結合した担体を洗浄した後、担体
から前記複合体を解離させる工程。
から前記複合体を解離させる工程。
工程（Ｃ）：この複合体を他の担体に結合させた後、こ
の担体を洗浄する工程。ここで、該担体は該複合体に結
合することができる反応基を有し、該反応基は工程
（Ａ）における反応基と異なる。
の担体を洗浄する工程。ここで、該担体は該複合体に結
合することができる反応基を有し、該反応基は工程
（Ａ）における反応基と異なる。
工程（Ｄ）：（Ｃ）に記載の担体上の複合体を測定する
工程。
工程。
を包含することを特徴とする。
以下本発明について工程順に従い説明する。
工程（Ａ）について 被検液としては、例えば、血清、血漿、髄液、唾液、
尿等の体液、緩衝液が挙げられる。測定すべき特異的抗
体としては、実質上、従来の免疫学的測定法で測定し得
たすべての抗体が挙げられる。例を挙げれば、抗核抗
体、抗DNA抗体、抗ENA抗体、リウマトイド因子、抗赤血
球抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗筋抗体、抗甲状腺抗
体（抗ミクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、抗
TSHレセプター抗体）、抗インスリン抗体、抗インスリ
ンレセプター抗体、抗アセチルコリンレセプター抗体等
の自己抗体やウイルス、微生物に対する抗体、インター
フエロンやヒト成長ホルモン等の蛋白製剤に対する抗
体、アレルギー疾患におけるアレルゲン抗体等である。
これら抗体は被検液中で遊離した状態のみではなく免疫
複合体、結合蛋白と結合した状態でも測定可能である。
尿等の体液、緩衝液が挙げられる。測定すべき特異的抗
体としては、実質上、従来の免疫学的測定法で測定し得
たすべての抗体が挙げられる。例を挙げれば、抗核抗
体、抗DNA抗体、抗ENA抗体、リウマトイド因子、抗赤血
球抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗筋抗体、抗甲状腺抗
体（抗ミクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、抗
TSHレセプター抗体）、抗インスリン抗体、抗インスリ
ンレセプター抗体、抗アセチルコリンレセプター抗体等
の自己抗体やウイルス、微生物に対する抗体、インター
フエロンやヒト成長ホルモン等の蛋白製剤に対する抗
体、アレルギー疾患におけるアレルゲン抗体等である。
これら抗体は被検液中で遊離した状態のみではなく免疫
複合体、結合蛋白と結合した状態でも測定可能である。
活性成分とは、下記の１又は、１及び２である。
1. 抗原。ここで言う抗原とは、測定すべき抗体と抗原
抗体反応を生じさせる特異抗原、イデイオタイプ抗体の
様な成分をいう。
抗体反応を生じさせる特異抗原、イデイオタイプ抗体の
様な成分をいう。
2. 上記抗原と抗原抗体反応を生じさせる成分。（例え
ば測定すべき抗体とエピトープの異なる抗体等） これらの活性成分は通常、工程（Ａ）又は／及び工程
（Ｃ）での複合体と担体との結合に関与する官能基の１
種又は２種以上を結合させて用いても良い。
ば測定すべき抗体とエピトープの異なる抗体等） これらの活性成分は通常、工程（Ａ）又は／及び工程
（Ｃ）での複合体と担体との結合に関与する官能基の１
種又は２種以上を結合させて用いても良い。
ここで官能基としては、例えば、ジニトロフエニル基
又はトリニトロフエニル基等のハプテン、ビオチン、−
Ｓ−Ｓ−結合を介して結合した測定すべき抗体及び対応
する抗原以外の抗体又は抗原、前記ハプテン又は前記ビ
オチン、等が挙げられる。
又はトリニトロフエニル基等のハプテン、ビオチン、−
Ｓ−Ｓ−結合を介して結合した測定すべき抗体及び対応
する抗原以外の抗体又は抗原、前記ハプテン又は前記ビ
オチン、等が挙げられる。
官能基は、工程（Ａ）で被検液中の成分で担体との結
合を阻害されず、工程（Ｂ）の洗浄で脱離しにくく、解
離の際には容易に解離するものが好ましい。工程（Ｃ）
の結合に関与する官能基は、工程（Ｂ）で解離した溶液
中から効率良く他の担体に結合しうる官能基が好まし
い。
合を阻害されず、工程（Ｂ）の洗浄で脱離しにくく、解
離の際には容易に解離するものが好ましい。工程（Ｃ）
の結合に関与する官能基は、工程（Ｂ）で解離した溶液
中から効率良く他の担体に結合しうる官能基が好まし
い。
また、これらの活性成分の一つは、工程（Ｄ）の測定
の際に利用される標識を結合させて用いても良い。標識
としては免疫学的測定において測定に利用されるいずれ
の物質でも良く、酵素、放射性物質、発光物質、蛍光物
質、金属化合物等が挙げられる。
の際に利用される標識を結合させて用いても良い。標識
としては免疫学的測定において測定に利用されるいずれ
の物質でも良く、酵素、放射性物質、発光物質、蛍光物
質、金属化合物等が挙げられる。
例えば、酵素ではペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、アルカリホスフアターゼ、放射性物質とし
てはヨウ素、水素、蛍光物質としてはフルオレセインイ
ソチオシアネート、発光物質としては、アクエリジウム
塩等が挙げられる。
トシダーゼ、アルカリホスフアターゼ、放射性物質とし
てはヨウ素、水素、蛍光物質としてはフルオレセインイ
ソチオシアネート、発光物質としては、アクエリジウム
塩等が挙げられる。
標識は必ずしも必要ではないが工程（Ｄ）の測定が簡
単にできるので望ましい。
単にできるので望ましい。
これらの官能基、標識は、（Ａ）から（Ｄ）の工程に
影響を及ぼさないキヤリヤーを介在させて抗原に結合さ
せても良い。活性成分が低分子の場合には、特にこの様
な介在が好ましい。キヤリヤーとしては、例えば非特異
ウサギIgG、ウシ血清アルブミン、デキストラン等が挙
げられる。
影響を及ぼさないキヤリヤーを介在させて抗原に結合さ
せても良い。活性成分が低分子の場合には、特にこの様
な介在が好ましい。キヤリヤーとしては、例えば非特異
ウサギIgG、ウシ血清アルブミン、デキストラン等が挙
げられる。
標識を結合させる方法としては、従来免疫学的測定法
において抗体、抗原に標識を結合するいずれの結合方法
でも良い。
において抗体、抗原に標識を結合するいずれの結合方法
でも良い。
抗体と活性成分から構成される複合体の形成は、被検
液に１種又は２種以上の活性成分を加えて、通常の抗原
抗体反応に用いられる条件下に行われる。
液に１種又は２種以上の活性成分を加えて、通常の抗原
抗体反応に用いられる条件下に行われる。
一般には０〜45℃、数時間〜数10時間、好ましくは、
20〜37℃、１〜６時間で形成される。
20〜37℃、１〜６時間で形成される。
このようにして形成された複合体は、担体に結合され
る。
る。
担体としては、従来の免疫学的測定法において使用さ
れている物すべてを使用しうる。例えば、ポリスチレ
ン、ポリアクリル、テフロン、紙、ガラス、アガロース
等が挙げられる。また、その形状はどのようなものであ
つても良い。
れている物すべてを使用しうる。例えば、ポリスチレ
ン、ポリアクリル、テフロン、紙、ガラス、アガロース
等が挙げられる。また、その形状はどのようなものであ
つても良い。
担体は、工程（Ａ）で形成される複合体を結合するた
め、又は、担体上で複合体を形成させるための、反応基
を有する必要がある。
め、又は、担体上で複合体を形成させるための、反応基
を有する必要がある。
担体に結合する反応基は、複合体中の測定すべき抗
体、活性成分、官能基、標識又は、複合体形成により新
たに生じた免疫活性部位に結合するものなら、いずれも
反応基として用いられる。
体、活性成分、官能基、標識又は、複合体形成により新
たに生じた免疫活性部位に結合するものなら、いずれも
反応基として用いられる。
反応基としては、工程（Ｂ）で複合体を容易に解離し
得る反応基が好ましい。
得る反応基が好ましい。
この様な反応基としては官能基に対応した通常のもの
が挙げられるが、例えば、 １） 官能基がジニトロフエニル基又はトリニトロフエ
ニル基等のハプテンのときは、これらに対する抗体が挙
げられる。
が挙げられるが、例えば、 １） 官能基がジニトロフエニル基又はトリニトロフエ
ニル基等のハプテンのときは、これらに対する抗体が挙
げられる。
２） 官能基がビオチンのときは、アビジン又はストレ
プトアビジンが挙げられる。
プトアビジンが挙げられる。
３） 官能基が−Ｓ−Ｓ−結合を介した抗原又は抗体の
ときは、対応する抗体又は抗原が挙げられる。
ときは、対応する抗体又は抗原が挙げられる。
反応基の担体への結合は、免疫学的測定における担体
作成の公知の方法で行われる。
作成の公知の方法で行われる。
複合体の担体への結合は、担体を用いる前記免疫学的
測定に通常用いられる条件が採用される。
測定に通常用いられる条件が採用される。
被検液中に活性成分と、担体を同時に加えて、複合体
形成を担体上で行わせることは、工程を簡略にできるの
で望ましい。
形成を担体上で行わせることは、工程を簡略にできるの
で望ましい。
工程（Ｂ）について 洗浄は担体を用いる免疫学的測定に通常用いられる条
件が採用される。複合体の解離は、複合体を分離させず
に行うことが好ましく、複合体と担体との結合が抗原抗
体反応による時は、該抗原抗体反応の結合定数を複合体
形成の結合定数より小さくすることにより、酸、アルカ
リ、高濃度無機塩等で複合体を解離することができる。
件が採用される。複合体の解離は、複合体を分離させず
に行うことが好ましく、複合体と担体との結合が抗原抗
体反応による時は、該抗原抗体反応の結合定数を複合体
形成の結合定数より小さくすることにより、酸、アルカ
リ、高濃度無機塩等で複合体を解離することができる。
複合体を分離させずに担体より解離するより好ましい
方法は、複合体と担体との結合に関与する官能基と同一
反応部位を有する物質を加えることである。
方法は、複合体と担体との結合に関与する官能基と同一
反応部位を有する物質を加えることである。
例えば、官能基がジニトロフエニルの時には、ジニト
ロフエニルアミノ酸（例：ジニトロフエニルリジン）、
官能基がビオチンの時はビオチン、官能基が−Ｓ−Ｓ−
を介して結合した抗原、又は抗体、ハプテン又はビオチ
ン等の時は−Ｓ−Ｓ−を切断する試薬が用いられる。
ロフエニルアミノ酸（例：ジニトロフエニルリジン）、
官能基がビオチンの時はビオチン、官能基が−Ｓ−Ｓ−
を介して結合した抗原、又は抗体、ハプテン又はビオチ
ン等の時は−Ｓ−Ｓ−を切断する試薬が用いられる。
工程（Ｃ）について 担体は工程（Ａ）で挙げたものを用いる。
担体に結合する反応基は、複合体中の測定すべき抗
体、活性成分、官能基、標識又は、複合体形成により新
たに生じた免疫活性部位に結合するものなら、いずれも
反応基として用いられる。好ましい反応基としては、工
程（Ａ）で示した反応基のほか複合体中の測定すべき抗
体、活性成分、標識又は、複合体形成により新たに生じ
た免疫活性部位に結合する反応基が挙げられる。
体、活性成分、官能基、標識又は、複合体形成により新
たに生じた免疫活性部位に結合するものなら、いずれも
反応基として用いられる。好ましい反応基としては、工
程（Ａ）で示した反応基のほか複合体中の測定すべき抗
体、活性成分、標識又は、複合体形成により新たに生じ
た免疫活性部位に結合する反応基が挙げられる。
複合体中の測定すべき成分、活性成分と抗原抗体反応
で結合する反応基は官能基の導入を１つ省略できるので
特に好ましい。
で結合する反応基は官能基の導入を１つ省略できるので
特に好ましい。
反応基の選択は、工程（Ａ）で用いる反応基と同一の
反応基を用いた場合は、工程（Ｂ）で解離した溶液から
複合体を分離する必要があり、この分離操作を省略する
ためには工程（Ａ）と異なる反応基を用いるのが好まし
い。この場合は（Ｂ）の解離させる工程と（Ｃ）の担体
に結合させる工程を同時に行うことができる。
反応基を用いた場合は、工程（Ｂ）で解離した溶液から
複合体を分離する必要があり、この分離操作を省略する
ためには工程（Ａ）と異なる反応基を用いるのが好まし
い。この場合は（Ｂ）の解離させる工程と（Ｃ）の担体
に結合させる工程を同時に行うことができる。
複合体の担体への結合に際しては、工程（Ａ）と同
様、担体を用いる前記免疫学的測定に通常用いられる条
件が採用される。
様、担体を用いる前記免疫学的測定に通常用いられる条
件が採用される。
上記の（Ｂ）と（Ｃ）の工程に関しては、必要に応じ
て繰返してもよい。
て繰返してもよい。
工程（Ｄ）について 担体上の複合体を測定するには、複合体中の測定すべ
き抗体、活性成分、官能基、標識、複合体形成により新
たに生じた免疫活性部位に着目し既知の方法で測定す
る。
き抗体、活性成分、官能基、標識、複合体形成により新
たに生じた免疫活性部位に着目し既知の方法で測定す
る。
例えば、複合体中の測定すべき抗体、活性成分、官能
基に対する酵素、放射性物質、蛍光物質等を標識した抗
体を加え、洗浄後標識を測定する方法。
基に対する酵素、放射性物質、蛍光物質等を標識した抗
体を加え、洗浄後標識を測定する方法。
工程（Ａ）で記した活性成分に導入した標識を測定す
る方法。
る方法。
等が挙げられる。
後者の方法は操作が簡略で好ましい。
以上、説明したように本発明は従来の免疫学的測定法
で測定しうる抗体を従来より高感度で測定しうる。
で測定しうる抗体を従来より高感度で測定しうる。
代表的な実施の態様として次のものが挙げられる。
1. 活性成分として抗原を用いて、２種の官能基を結合
させておき、工程（Ａ）で官能基により担体に結合さ
せ、工程（Ｃ）で別の官能基で担体に結合させることに
より、非特異イムノグロブリンの担体への非特異結合
を、従来法より少なくし、工程（Ｄ）で担体上の複合体
中の抗体を標識した抗抗体によつて測定する。この時抗
抗体をイムノグロブリンのクラスを認識できるものにす
ると、抗体のイムノグロブリンのクラスを区別して測定
できる。
させておき、工程（Ａ）で官能基により担体に結合さ
せ、工程（Ｃ）で別の官能基で担体に結合させることに
より、非特異イムノグロブリンの担体への非特異結合
を、従来法より少なくし、工程（Ｄ）で担体上の複合体
中の抗体を標識した抗抗体によつて測定する。この時抗
抗体をイムノグロブリンのクラスを認識できるものにす
ると、抗体のイムノグロブリンのクラスを区別して測定
できる。
2. 活性成分として抗原を用いて、官能基と標識を結合
させておき、工程（Ａ）で官能基により担体に結合さ
せ、工程（Ｃ）で抗抗体が結合した担体を用いることに
より、標識を結合した抗原の担体への非特異結合を少な
くし、工程（Ｄ）で担体上の複合体中の標識を測定す
る。この時抗抗体をイムノグロブリンのクラスを認識で
きるものにすると、抗体のイムノグロブリンのクラスを
区別して測定できる。
させておき、工程（Ａ）で官能基により担体に結合さ
せ、工程（Ｃ）で抗抗体が結合した担体を用いることに
より、標識を結合した抗原の担体への非特異結合を少な
くし、工程（Ｄ）で担体上の複合体中の標識を測定す
る。この時抗抗体をイムノグロブリンのクラスを認識で
きるものにすると、抗体のイムノグロブリンのクラスを
区別して測定できる。
3. 抗体の一部が被検液中で抗原−抗体複合体を形成し
ている時は、活性成分として抗原と抗体を用いる。抗原
を加え遊離の抗体も含めて抗原−抗体複合体を形成せし
め、官能基と標識を結合した抗体を加えて抗体−抗原−
抗体複合体を形成せしめ、工程（Ａ）で官能基により担
体に結合させ、工程（Ｃ）で測定すべき抗体に対する抗
抗体を結合した担体を用いることにより、標識を結合し
た抗体の担体への非特異結合を少なくし、工程（Ｄ）で
担体上の複合体中の標識を測定する。この時抗抗体をイ
ムノグロブリンのクラスを認識できるものにすると、抗
体のイムノグロブリンのクラスを区別して測定できる。
ている時は、活性成分として抗原と抗体を用いる。抗原
を加え遊離の抗体も含めて抗原−抗体複合体を形成せし
め、官能基と標識を結合した抗体を加えて抗体−抗原−
抗体複合体を形成せしめ、工程（Ａ）で官能基により担
体に結合させ、工程（Ｃ）で測定すべき抗体に対する抗
抗体を結合した担体を用いることにより、標識を結合し
た抗体の担体への非特異結合を少なくし、工程（Ｄ）で
担体上の複合体中の標識を測定する。この時抗抗体をイ
ムノグロブリンのクラスを認識できるものにすると、抗
体のイムノグロブリンのクラスを区別して測定できる。
また、被検液中の抗原−抗体複合体のみを測定したい
場合、抗原を加えずに上記の操作を行えば良い。
場合、抗原を加えずに上記の操作を行えば良い。
以下、本発明を実施例で説明するが、本発明はこれに
限られるものではない。
限られるものではない。
実施例−１ A. ジニトロフエニル−ビオチニル−非特異ウサギIgG
−インスリン結合物の調製 （１） マレイミド−非特異ウサギIgGの調製 非特異ウサギIgGにＮ−サクシニミジル−６−マレイ
ミドヘキサノエートを用い、公知の方法〔橋田ら、ジヤ
ーナル・オブ・アプライド・バイオケミストリー（J.Ap
pl.Bio−chem）第６巻、第56頁（1984）〕に従つて、マ
レイミド基を導入した。導入されたマレイミド基の数
は、非特異ウサギIgG1分子当り16個であつた。
−インスリン結合物の調製 （１） マレイミド−非特異ウサギIgGの調製 非特異ウサギIgGにＮ−サクシニミジル−６−マレイ
ミドヘキサノエートを用い、公知の方法〔橋田ら、ジヤ
ーナル・オブ・アプライド・バイオケミストリー（J.Ap
pl.Bio−chem）第６巻、第56頁（1984）〕に従つて、マ
レイミド基を導入した。導入されたマレイミド基の数
は、非特異ウサギIgG1分子当り16個であつた。
（２） Ｎ−ビオチニル−２−メルカプトエチルアミン
の調製 44mM ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド〔ザイ
ムド ラボラトリーズ社（Zymed Laborator−ies In
c.）、サンフランシスコ、カリフオルニア州〕N,N−ジ
メチルホルムアミド液0.1mlと4.4mM ２−メルカプトエ
チルアミンと5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩
衝液、pH 7.0、1.0mlとを30℃、30分反応させ、1Mトリ
ス・塩酸緩衝液、pH 7.0、0.1mlを加えた。
の調製 44mM ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド〔ザイ
ムド ラボラトリーズ社（Zymed Laborator−ies In
c.）、サンフランシスコ、カリフオルニア州〕N,N−ジ
メチルホルムアミド液0.1mlと4.4mM ２−メルカプトエ
チルアミンと5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩
衝液、pH 7.0、1.0mlとを30℃、30分反応させ、1Mトリ
ス・塩酸緩衝液、pH 7.0、0.1mlを加えた。
（３） ビオチニル−非特異ウサギIgGの調製 （１）で調製したマレイミド−非特異ウサギIgG10mg
と5mM EDTAを含む、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0、2.0mlに（２）で調製したＮ−ビオチニル−２−メ
ルカプトエチルアミン液0.22mlを加えて、30℃、30分反
応させた。更に、0.1M2−メルカプトエチルアミン0.05m
lを加え、セフアデツクスＧ−25（フアルマシア社）に
よりゲルろ過を行つた。
と5mM EDTAを含む、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0、2.0mlに（２）で調製したＮ−ビオチニル−２−メ
ルカプトエチルアミン液0.22mlを加えて、30℃、30分反
応させた。更に、0.1M2−メルカプトエチルアミン0.05m
lを加え、セフアデツクスＧ−25（フアルマシア社）に
よりゲルろ過を行つた。
マレイミド基の減少から導入されたビオチン分子の数
を計算すると、IgG1分子当り9.7個であつた。
を計算すると、IgG1分子当り9.7個であつた。
（４） メルカプトサクシニル−ビオチニル−非特異ウ
サギIgGの調製 （３）で調製したビオチニル−非特異ウサギIgGにＳ
−アセチルメルカプトサクシニツク・アンハイドライド
（半井化学、京都）を用いて、公知の方法〔石川ら、ジ
ヤーナル・オブ・イムノアツセイ（J.Immunoassay）第
４巻、第209頁（1983）〕に従つてチオール基を導入し
た。導入されたチオール基の数は、ビオチニル−非特異
ウサギIgG1分子当り17個であつた。
サギIgGの調製 （３）で調製したビオチニル−非特異ウサギIgGにＳ
−アセチルメルカプトサクシニツク・アンハイドライド
（半井化学、京都）を用いて、公知の方法〔石川ら、ジ
ヤーナル・オブ・イムノアツセイ（J.Immunoassay）第
４巻、第209頁（1983）〕に従つてチオール基を導入し
た。導入されたチオール基の数は、ビオチニル−非特異
ウサギIgG1分子当り17個であつた。
（５） マレイミド−ジニトロフエニル−Ｌ−リジンの
調製 5.5mM ジニトロフエニル−Ｌ−リジン塩酸塩（東京化
成、東京）を含む0.1M リン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0、1.0mlと5.5mM Ｎ−サクシニミジル−６−マレイ
ミドヘキサノエートを溶かしたN,N−ジメチルホルムア
ミド0.1mlとを30℃、30分反応させた。
調製 5.5mM ジニトロフエニル−Ｌ−リジン塩酸塩（東京化
成、東京）を含む0.1M リン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0、1.0mlと5.5mM Ｎ−サクシニミジル−６−マレイ
ミドヘキサノエートを溶かしたN,N−ジメチルホルムア
ミド0.1mlとを30℃、30分反応させた。
（６） ジニトロフエニル−ビオチニル−非特異ウサギ
IgGの調製 （５）で調製したマレイミド−ジニトロフエニル−Ｌ
−リジン0.59mlと（４）で調製したメルカプトサクシニ
ル−ビオチニル−非特異ウサギIgG4.4mgと5mM EDTAを
含む、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0、3.1mlと
を30℃、30分反応させた後、セフアデツクスＧ−25を用
いてゲルろ過を行つた。導入されたジニトロフエニルの
数は、非特異ウサギIgG1分子当り7.3個であつた。
IgGの調製 （５）で調製したマレイミド−ジニトロフエニル−Ｌ
−リジン0.59mlと（４）で調製したメルカプトサクシニ
ル−ビオチニル−非特異ウサギIgG4.4mgと5mM EDTAを
含む、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0、3.1mlと
を30℃、30分反応させた後、セフアデツクスＧ−25を用
いてゲルろ過を行つた。導入されたジニトロフエニルの
数は、非特異ウサギIgG1分子当り7.3個であつた。
（７） マレイミド−インスリンの調製 （１）と同様に調製した。
（８） ジニトロフエニル−ビオチニル−非特異ウサギ
IgG−インスリン結合物の調製 （７）で調製したマレイミド−インスリン（1.2mg）
と5mM EDTAを含む、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0、0.3mlと（６）で調製したメルカプトサクシニル
−ジニトロフエニル−ビオチニル−非特異ウサギIgG
（0.73mg）と5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩
衝液、pH 6.0、0.2mlとを４℃、20時間反応させて、ウ
ルトロゲルAcA 34（LKB社製、スエーデン）によりゲル
ろ過を行つた。
IgG−インスリン結合物の調製 （７）で調製したマレイミド−インスリン（1.2mg）
と5mM EDTAを含む、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0、0.3mlと（６）で調製したメルカプトサクシニル
−ジニトロフエニル−ビオチニル−非特異ウサギIgG
（0.73mg）と5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩
衝液、pH 6.0、0.2mlとを４℃、20時間反応させて、ウ
ルトロゲルAcA 34（LKB社製、スエーデン）によりゲル
ろ過を行つた。
B. 本発明方法による抗インスリン抗体の測定 ウサギ（抗ジニトロフエニル−ウシ血清アルブン）Ig
G不溶化ポリスチレンボール（直径3.2mm:プレシジヨン
社、シガゴ、イリノイ州）を従来法〔石川ら、スカンジ
ナビアン・ジヤーナル・オブ・イムノロジー（Scand.J.
Immunol.）第８巻（補７）、第43頁（1978）〕に従つて
調製し、これを非特異ウサギIgG 2mg/ml、1g/ ウシ
血清アルブミン、0.1M NaCl、1g/ NaN3を含む0.01M
リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0（Ａ液）中に、20
℃、３時間放置した。このポリスチレン・ボールを、ヒ
ト血清（検体）0.01ml、ジニトロフエニル−ビオチニル
−非特異ウサギIgG−インスリン結合物30fmolと非特異
ウサギIgG 0.3mgを含む上記Ａ液0.09ml、1M NaClと1g/
ウシ血清アルブミンとを含む0.01Mリン酸ナトリウム
緩衝液、pH 7.0、0.05mlとを20℃、４時間反応させ
た。その後、ポリスチレン・ボールを0.1M NaClを含む
0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0（Ｂ液）で２回
洗浄した後、1mM ジニトロフエニル−Ｌ−リジンと非
特異ウサギIgG 0.3mgを含むＡ液0.15mlを加えて室温で
一夜放置した。ポリスチレン・ボールを除去した後の液
に、上記と同様に調製したアビジン不溶化ポリスチレン
・ボールを入れて、20℃、３時間反応させた。その後、
ポリスチレン・ボールをＢ液で２回洗浄した。この固相
に結合した抗インスリンIgGを西洋ワサビ・ペルオキシ
ダーゼ標識ウサギ抗ヒトIgG Fab′を用いて測定した。
標識Fab′50ng、0.1M NaCl、1g/ウシ血清アルブミン
を含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.15ml
中で20℃、30分反応させた後、Ｂ液で２回洗浄して、固
相に結合したペルオキシダーゼ活性を従来法〔今川ら、
アナリテイカル・レターズ（Anal.Lett.）第16巻、第15
09頁（1983）〕により測定した。結果を第１図に示す。
G不溶化ポリスチレンボール（直径3.2mm:プレシジヨン
社、シガゴ、イリノイ州）を従来法〔石川ら、スカンジ
ナビアン・ジヤーナル・オブ・イムノロジー（Scand.J.
Immunol.）第８巻（補７）、第43頁（1978）〕に従つて
調製し、これを非特異ウサギIgG 2mg/ml、1g/ ウシ
血清アルブミン、0.1M NaCl、1g/ NaN3を含む0.01M
リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0（Ａ液）中に、20
℃、３時間放置した。このポリスチレン・ボールを、ヒ
ト血清（検体）0.01ml、ジニトロフエニル−ビオチニル
−非特異ウサギIgG−インスリン結合物30fmolと非特異
ウサギIgG 0.3mgを含む上記Ａ液0.09ml、1M NaClと1g/
ウシ血清アルブミンとを含む0.01Mリン酸ナトリウム
緩衝液、pH 7.0、0.05mlとを20℃、４時間反応させ
た。その後、ポリスチレン・ボールを0.1M NaClを含む
0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0（Ｂ液）で２回
洗浄した後、1mM ジニトロフエニル−Ｌ−リジンと非
特異ウサギIgG 0.3mgを含むＡ液0.15mlを加えて室温で
一夜放置した。ポリスチレン・ボールを除去した後の液
に、上記と同様に調製したアビジン不溶化ポリスチレン
・ボールを入れて、20℃、３時間反応させた。その後、
ポリスチレン・ボールをＢ液で２回洗浄した。この固相
に結合した抗インスリンIgGを西洋ワサビ・ペルオキシ
ダーゼ標識ウサギ抗ヒトIgG Fab′を用いて測定した。
標識Fab′50ng、0.1M NaCl、1g/ウシ血清アルブミン
を含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.15ml
中で20℃、30分反応させた後、Ｂ液で２回洗浄して、固
相に結合したペルオキシダーゼ活性を従来法〔今川ら、
アナリテイカル・レターズ（Anal.Lett.）第16巻、第15
09頁（1983）〕により測定した。結果を第１図に示す。
C. 従来法による抗インスリン抗体の測定 既報〔河野ら、ジヤーナル・オブ・バイオケミストリ
ー（J.Biochem.）第98巻、第379頁、（1986）〕の方法
に従い、インスリン−ウシ血清アルブミン不溶化ポリス
チレン・ボール（直径3.2mm,ブレシジヨン社、シカゴ、
イリノイ州）と検体血清とを37℃、３時間反応させ、洗
浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識（抗ヒトIg
G）Fab′と反応させて測定した。結果を第１図に示す。
ー（J.Biochem.）第98巻、第379頁、（1986）〕の方法
に従い、インスリン−ウシ血清アルブミン不溶化ポリス
チレン・ボール（直径3.2mm,ブレシジヨン社、シカゴ、
イリノイ州）と検体血清とを37℃、３時間反応させ、洗
浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識（抗ヒトIg
G）Fab′と反応させて測定した。結果を第１図に示す。
すなわち第１図はインスリンによる治療を受けた患者
の血清を健常者の血清で希釈して、本発明方法及び従来
法で抗インスリン抗体を測定した結果、健常者血清によ
るインスリン治療患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に
結合したベルオキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）
との関係で示すグラフである。
の血清を健常者の血清で希釈して、本発明方法及び従来
法で抗インスリン抗体を測定した結果、健常者血清によ
るインスリン治療患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に
結合したベルオキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）
との関係で示すグラフである。
第１図に示すように、本発明方法では前述の第１の技
術による従来法に比べ、約１千倍の超高感度で抗インス
リン抗体の測定が可能である。
術による従来法に比べ、約１千倍の超高感度で抗インス
リン抗体の測定が可能である。
実施例−２ IgG,F（ab′）2,Fab′の調製 IgGは硫酸ナトリウムによる塩析とDEAEセルローズを
用い、Ｆ（ab′）２はIgGのペプシン消化により、Fab′
はＦ（ab′）２の還元により、それぞれ公知の方法
〔（石川ら、ジヤーナル・オブ・イムノアツセイ（前
出）〕により調製した。
用い、Ｆ（ab′）２はIgGのペプシン消化により、Fab′
はＦ（ab′）２の還元により、それぞれ公知の方法
〔（石川ら、ジヤーナル・オブ・イムノアツセイ（前
出）〕により調製した。
ペルオキシダーゼ活性の測定 ペルオキシダーゼ活性は、３−（４−ヒドロキシフエ
ニル）プロピオン酸を基質として、公知の方法で蛍光光
学的に測定した〔今川ら、アナリテイカル・レターズ
（前出）〕。蛍光光度は、50mM硫酸に溶解した1mg/キ
ニーネを標準として測定した。
ニル）プロピオン酸を基質として、公知の方法で蛍光光
学的に測定した〔今川ら、アナリテイカル・レターズ
（前出）〕。蛍光光度は、50mM硫酸に溶解した1mg/キ
ニーネを標準として測定した。
ジニトロフエニル−ジオチニル−非特異ウサギIgG−イ
ンスリン結合物の調製 1. マレイミド−非特異ウサギンIgGの調製 非特異ウサギIgG12mgを溶解した0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH 7.0、20mlと27.5mM Ｎ−サクシニミジ
ル−６−マレイミドヘキサノエート（前出）を含むN,N
−ジメチルホルムアミド0.2mlとを30℃、30分反応させ
た。反応後セフアデツクスＧ−25（フアルマシア社）に
よりゲルろ過を行つた。カラムサイズは1.0×30cm、溶
出液には5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH6.0を用いた。導入されたマレイミド基の数は、
非特異ウサギIgG1分子当り16個であつた。
ンスリン結合物の調製 1. マレイミド−非特異ウサギンIgGの調製 非特異ウサギIgG12mgを溶解した0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH 7.0、20mlと27.5mM Ｎ−サクシニミジ
ル−６−マレイミドヘキサノエート（前出）を含むN,N
−ジメチルホルムアミド0.2mlとを30℃、30分反応させ
た。反応後セフアデツクスＧ−25（フアルマシア社）に
よりゲルろ過を行つた。カラムサイズは1.0×30cm、溶
出液には5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH6.0を用いた。導入されたマレイミド基の数は、
非特異ウサギIgG1分子当り16個であつた。
2. Ｎ−ビオチニル−２−メルカプトエチルアミンの調
製 44mM ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシミド（ザイム
ド ラボラトリー社（Zymed Laboratories Inc.）、サ
ンフランシスコ、カリフオルニア州）を含むN,N−ジメ
チルホルムアミド液0.1mlと4.4mM ２−メルカプトエチ
ルアミン、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH 7.0、1.0mlとを30℃、30分反応させ、1Mトリス
・塩酸緩衝液、pH7.0、0.1mlを加えた。
製 44mM ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシミド（ザイム
ド ラボラトリー社（Zymed Laboratories Inc.）、サ
ンフランシスコ、カリフオルニア州）を含むN,N−ジメ
チルホルムアミド液0.1mlと4.4mM ２−メルカプトエチ
ルアミン、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH 7.0、1.0mlとを30℃、30分反応させ、1Mトリス
・塩酸緩衝液、pH7.0、0.1mlを加えた。
3. ビオチニル−非特異ウサギIgGの調製 1.で調製したマレイミド−非特異ウサギIgG 10mgを溶
解した5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 6.0、2.0ムに2.で調製したＮ−ビオチニル−２−メ
ルカプトエチルアミン液0.22mlを加えて30℃、30分反応
させた。更に、0.1M ２−メルカプトエチルアミンと5m
M EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0、
0.05mlを加え、セフアデツクスＧ−25（フアルマシア
社）によりゲルろ過を行つた。カラムサイズは1.0×30c
m、溶出液には0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.5を
用いた。マレイミド基の減少から導入されたビオチン基
の数を計算すると、非特異ウサギIgG 1分子当り9.7個で
あつた。
解した5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 6.0、2.0ムに2.で調製したＮ−ビオチニル−２−メ
ルカプトエチルアミン液0.22mlを加えて30℃、30分反応
させた。更に、0.1M ２−メルカプトエチルアミンと5m
M EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0、
0.05mlを加え、セフアデツクスＧ−25（フアルマシア
社）によりゲルろ過を行つた。カラムサイズは1.0×30c
m、溶出液には0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.5を
用いた。マレイミド基の減少から導入されたビオチン基
の数を計算すると、非特異ウサギIgG 1分子当り9.7個で
あつた。
4. メルカプトサクシニル−ビオチニル−非特異ウサギ
IgGの調製 3.で調製したビオチニル−非特異ウサギIgGにＳ−ア
セチルメルカプトサクシニツク・アンハイドライド（半
井化学、京都）を用いて、公知の方法〔石川ら、ジヤー
ナル・オブ・イムノアツセイ（前出）〕に従つてチオー
ル基を導入した。導入されたチオール基の数は、ビオチ
ニル−非特異ウサギIgG 1分子当り17個であつた。
IgGの調製 3.で調製したビオチニル−非特異ウサギIgGにＳ−ア
セチルメルカプトサクシニツク・アンハイドライド（半
井化学、京都）を用いて、公知の方法〔石川ら、ジヤー
ナル・オブ・イムノアツセイ（前出）〕に従つてチオー
ル基を導入した。導入されたチオール基の数は、ビオチ
ニル−非特異ウサギIgG 1分子当り17個であつた。
5. マレイミド−ジニトロフエニル−Ｌ−リジンの調製 5.5mM ジニトロフエニル−Ｌ−リジン塩酸塩（東京
化成、東京）を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0、1.0mlと5.5mM Ｎ−サクシニミジル−６−マレイ
ミドヘキサノエートを含むN,N−ジメチルホルムアミド
0.1mlとを30℃、30分反応させた。
化成、東京）を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0、1.0mlと5.5mM Ｎ−サクシニミジル−６−マレイ
ミドヘキサノエートを含むN,N−ジメチルホルムアミド
0.1mlとを30℃、30分反応させた。
6. メルカプトサクシニル−ジニトロフエニル−ビオチ
ニル−非特異ウサギIgGの調製 5.で調製したマレイミド−ジニトロフエニル−Ｌ−リ
ジン0.59mlと4.で調製したメルカプトサクシニル−ビオ
チニル−非特異ウサギIgG4.4mgを溶解した5 mM EDTAを
含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0、3.1mlとを
30℃、30分反応させた。反応後セフアデツクスＧ−25
（フアルマシア社）によりゲルろ過を行つた。カラムサ
イズは1.0×30cm、溶出液には5 mM EDTAを含む0.1Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0を用いた。導入された
ジニトロフエニル基の数は、メルカプトサクシニル−ビ
オチニル−非特異ウサギIgG 1分子当り7.3個であつた。
ジニトロフエニル基の数は、360nmでの吸光度から、モ
ル吸光係数17,400mol-1.l.cm-1として求めた。
ニル−非特異ウサギIgGの調製 5.で調製したマレイミド−ジニトロフエニル−Ｌ−リ
ジン0.59mlと4.で調製したメルカプトサクシニル−ビオ
チニル−非特異ウサギIgG4.4mgを溶解した5 mM EDTAを
含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0、3.1mlとを
30℃、30分反応させた。反応後セフアデツクスＧ−25
（フアルマシア社）によりゲルろ過を行つた。カラムサ
イズは1.0×30cm、溶出液には5 mM EDTAを含む0.1Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0を用いた。導入された
ジニトロフエニル基の数は、メルカプトサクシニル−ビ
オチニル−非特異ウサギIgG 1分子当り7.3個であつた。
ジニトロフエニル基の数は、360nmでの吸光度から、モ
ル吸光係数17,400mol-1.l.cm-1として求めた。
7. マレイミド−インスリンの調製 ブタインスリン（40 IU/ml、アクトラピドMC,ノボ
社）1mlと4.4mM Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミド
ヘキサノエートを含むN,N−ジメチルホルムアミド0.1ml
とを30℃、30分反応させた。反応後セフアデツクスＧ−
25（フアルマシア社）によりゲルろ過を行つた。カラム
サイズは1.0×30cm、溶出液には5 mM EDTAを含む0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0を用いた。導入され
たマレイミド基の数は、ブタインスリン１分子当り0.23
個であつた。インスリンの数は、280nmでの吸光度か
ら、吸光係数0.9g-1・ｌ・cm-1、分子量5,778として求
めた。
社）1mlと4.4mM Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミド
ヘキサノエートを含むN,N−ジメチルホルムアミド0.1ml
とを30℃、30分反応させた。反応後セフアデツクスＧ−
25（フアルマシア社）によりゲルろ過を行つた。カラム
サイズは1.0×30cm、溶出液には5 mM EDTAを含む0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0を用いた。導入され
たマレイミド基の数は、ブタインスリン１分子当り0.23
個であつた。インスリンの数は、280nmでの吸光度か
ら、吸光係数0.9g-1・ｌ・cm-1、分子量5,778として求
めた。
8. ジニトロフエニル−ビオチニル−非特異ウサギIgG
−インスリン結合物の調製 7.で調製したマレイミド−インスリン1.2mgを溶解し
た5 mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0、0.3mlと6.で調製したメルカプトサクシニル−ジニ
トロフエニル−ビオチニル−非特異IgG（１分子当りチ
オール基７個）0.73mgを溶解した5mM EDTAを含む0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0、0.2mlとを４℃、20
時間反応させた。反応後、ウルトロゲルAcA34（LKB,ス
トツクホルム、スエーデン）によりゲルろ過を行つた。
カラムサイズは1.5×45cm、溶出液は0.1Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH 6.5を用いた。導入されたインスリン
は、ジニトロフエニル−ビオチニル−非特異ウサギIgG
分子当り5.8個であつた。ジニトロフエニル−ビオチニ
ル−非特異ウサギIgGの数は360nmの吸光度から、インス
リンの数は280nmの吸光度から求めた。
−インスリン結合物の調製 7.で調製したマレイミド−インスリン1.2mgを溶解し
た5 mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0、0.3mlと6.で調製したメルカプトサクシニル−ジニ
トロフエニル−ビオチニル−非特異IgG（１分子当りチ
オール基７個）0.73mgを溶解した5mM EDTAを含む0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0、0.2mlとを４℃、20
時間反応させた。反応後、ウルトロゲルAcA34（LKB,ス
トツクホルム、スエーデン）によりゲルろ過を行つた。
カラムサイズは1.5×45cm、溶出液は0.1Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH 6.5を用いた。導入されたインスリン
は、ジニトロフエニル−ビオチニル−非特異ウサギIgG
分子当り5.8個であつた。ジニトロフエニル−ビオチニ
ル−非特異ウサギIgGの数は360nmの吸光度から、インス
リンの数は280nmの吸光度から求めた。
ウサギ（抗ジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン）Ig
G、アビジン不溶化固相の調製 ウサギ（抗ジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン）
IgG溶液（0.1g/）又はアビジン溶液（0.1g/）を用
いてポリスチレンボール〔直径3.2mm（プレシジヨン・
プラステツクボール社、シカゴ）〕表面上に公知の方法
で〔石川ら、スカンジナビヤン・ジヤーナル・オブ・イ
ムノロジー（前出）〕物理的吸着により不溶化した。
G、アビジン不溶化固相の調製 ウサギ（抗ジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン）
IgG溶液（0.1g/）又はアビジン溶液（0.1g/）を用
いてポリスチレンボール〔直径3.2mm（プレシジヨン・
プラステツクボール社、シカゴ）〕表面上に公知の方法
で〔石川ら、スカンジナビヤン・ジヤーナル・オブ・イ
ムノロジー（前出）〕物理的吸着により不溶化した。
不溶化固相の前処理 不溶化固相は公知の方法〔河野ら、ジヤーナル・オブ
・バイオケミストリー（前出）〕で非特異ウサギIgGで
前処理して用いた。
・バイオケミストリー（前出）〕で非特異ウサギIgGで
前処理して用いた。
ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fab′−ペルオキシダーゼの調
製 ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fab′は、Ｎ−サクシニミジ
ル−６−マレイミドヘキサノエートを架橋剤として、公
知の方法で〔橋田ら、ジヤーナル・オブ・アプライド・
バイオケミストリー（前出）〕ペルオキシダーゼ標識し
た。
製 ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fab′は、Ｎ−サクシニミジ
ル−６−マレイミドヘキサノエートを架橋剤として、公
知の方法で〔橋田ら、ジヤーナル・オブ・アプライド・
バイオケミストリー（前出）〕ペルオキシダーゼ標識し
た。
デキストラン・チヤーコールの調製 デキストラン・チヤーコールの調製は、デイクソンの
方法〔デイクソン（Dickson）、クリニカル ケミスト
リー（Clin.Chem.）第20巻、第1275頁（1974）〕に以下
の改良を加えて調製したヒト血清アルブミン及びノーリ
ツトNKを、それぞれウシ血清アルブミン及びノーリツト
Ａ（半井化学、京都）に変更した。デキストラン・チヤ
ーコール サスペンジヨン1mlには乾燥重量6mgのデキス
トラン・チヤーコールを含んでいた。
方法〔デイクソン（Dickson）、クリニカル ケミスト
リー（Clin.Chem.）第20巻、第1275頁（1974）〕に以下
の改良を加えて調製したヒト血清アルブミン及びノーリ
ツトNKを、それぞれウシ血清アルブミン及びノーリツト
Ａ（半井化学、京都）に変更した。デキストラン・チヤ
ーコール サスペンジヨン1mlには乾燥重量6mgのデキス
トラン・チヤーコールを含んでいた。
被検血清のデキストラン・チヤーコール処理 インスリンによる治療を受けた糖尿病患者血清を健常
者の血清で種々の倍率に希釈した検体0.075mlに0.2M H
Cl、0.015mlを加えてpH 6.0調製した。デキストラン・
チヤーコール サスペンジヨン0.037mlを加え、５分か
くはん後、50mM NaOH 0.015mlを加えて中和した。反
応液を1,500×g,15分遠心分離した。その後、上澄液を
同様の条件で遠心分離した。
者の血清で種々の倍率に希釈した検体0.075mlに0.2M H
Cl、0.015mlを加えてpH 6.0調製した。デキストラン・
チヤーコール サスペンジヨン0.037mlを加え、５分か
くはん後、50mM NaOH 0.015mlを加えて中和した。反
応液を1,500×g,15分遠心分離した。その後、上澄液を
同様の条件で遠心分離した。
抗インスリン抗体の測定 デキストラン・チヤーコール処理した検体0.095ml
を、0.3％NaN3、3.1M NaCl、0.3％ウシ血清アルブミン
を含む0.03Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.015m
lと、1.5％非特異ウサギIgG、0.1％NaN3、0.1M NaCl、
及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH 7.0、0.02mlと、ジニトロフエニル−
ビオチニル非特異ウサギIgG−インスリン結合物30fmol
を溶解した0.1％NaN3、0.1M NaCl及び0.1％ウシ血清ア
ルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.
0、0.02mlと共に37℃、８時間反応後、更に室温で一夜
放置した。ウサギ（抗ジニトロフエニル−ウシ血清アル
ブミン）IgG不溶化ポリスチレンボールを加えて更に20
℃、４時間反応させた。その後ポリスチレンボールを2m
lの0.1M NaClを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0にて２度洗浄した後、0.1％NaN3、0.1M NaCl、0.
2％非特異ウサギIgG及び0.1％ウシ血清アルブミンを含
む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.15mlに溶
解したジニトロフエニル−Ｌ−リジン150nmolを加え室
温で一夜放置した。ポリスチレンボールを除去した後の
液に、アビジン不溶化ポリスチレンボールを入れて、20
℃、３時間反応させた。その後、ポリスチレンボールを
2mlの0.1M NaClを含む0.01mリン酸ナトリウム緩衝液、
pH 7.0にて２度洗浄した。0.1M NaCl及び0.1％ウシ血
清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0 、0.15mlに溶解したウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fa
b′−ペルオキシダーゼ50ngを加えて20℃にて３時間反
応させた。上述と同様にポリスチレンボールを洗浄後、
ポリスチレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を
30℃にて10分反応後測定した。103倍希釈まで測定可能
であつた。結果を第２図に示す。
を、0.3％NaN3、3.1M NaCl、0.3％ウシ血清アルブミン
を含む0.03Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.015m
lと、1.5％非特異ウサギIgG、0.1％NaN3、0.1M NaCl、
及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH 7.0、0.02mlと、ジニトロフエニル−
ビオチニル非特異ウサギIgG−インスリン結合物30fmol
を溶解した0.1％NaN3、0.1M NaCl及び0.1％ウシ血清ア
ルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.
0、0.02mlと共に37℃、８時間反応後、更に室温で一夜
放置した。ウサギ（抗ジニトロフエニル−ウシ血清アル
ブミン）IgG不溶化ポリスチレンボールを加えて更に20
℃、４時間反応させた。その後ポリスチレンボールを2m
lの0.1M NaClを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0にて２度洗浄した後、0.1％NaN3、0.1M NaCl、0.
2％非特異ウサギIgG及び0.1％ウシ血清アルブミンを含
む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.15mlに溶
解したジニトロフエニル−Ｌ−リジン150nmolを加え室
温で一夜放置した。ポリスチレンボールを除去した後の
液に、アビジン不溶化ポリスチレンボールを入れて、20
℃、３時間反応させた。その後、ポリスチレンボールを
2mlの0.1M NaClを含む0.01mリン酸ナトリウム緩衝液、
pH 7.0にて２度洗浄した。0.1M NaCl及び0.1％ウシ血
清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0 、0.15mlに溶解したウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fa
b′−ペルオキシダーゼ50ngを加えて20℃にて３時間反
応させた。上述と同様にポリスチレンボールを洗浄後、
ポリスチレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を
30℃にて10分反応後測定した。103倍希釈まで測定可能
であつた。結果を第２図に示す。
比較例−２ ペルオキシダーゼ活性の測定、ウサギ（抗ヒトIgG
鎖）Fab′−ペルオキシダーゼの調製、被検血清のデキ
ストラン・チヤーコール処理は実施例−２の方法に従つ
た。
鎖）Fab′−ペルオキシダーゼの調製、被検血清のデキ
ストラン・チヤーコール処理は実施例−２の方法に従つ
た。
インスリン−ウシ血清アルブミン不溶化固相の調製 実施例−２の方法と同様の方法でウシ血清アルブミン
（1.0g/）をポリスチレンボールに不溶化し、グルタ
ルアルデヒドを用いる公知の方法〔河野ら、ジヤーナル
・オブ・バイオケミストリー（前出）で活性化した後、
インスリンを反応させて調製した。
（1.0g/）をポリスチレンボールに不溶化し、グルタ
ルアルデヒドを用いる公知の方法〔河野ら、ジヤーナル
・オブ・バイオケミストリー（前出）で活性化した後、
インスリンを反応させて調製した。
抗インスリン抗体の測定 実施例−２でデキストラン・チヤーコール処理した検
体を、0.1％NaN3、0.1M NaCl、及び0.1％ウシ血清アル
ブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0で
5.3×104倍希釈した。この希釈血清0.15mlと、インスリ
ン−ウシ血清アルブミン不溶化ポリスチレンボールとを
37℃、３時間反応させた。次に、ポリスチレンボールを
2mlの0.1M NaClを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、
pH 7.0にて２度洗浄した後、0.1M NaCl、及び0.1％ウ
シ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH 7.0に溶解したウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fab′
−ペルオキシダーゼ50ngを加えて37℃にて３時間反応さ
せた。上述と同様にポリスチレンボールを洗浄後、ポリ
スチレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を30℃
にて10分反応後測定した。１倍希釈まで測定可能であつ
た。結果を第２図に示す。
体を、0.1％NaN3、0.1M NaCl、及び0.1％ウシ血清アル
ブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0で
5.3×104倍希釈した。この希釈血清0.15mlと、インスリ
ン−ウシ血清アルブミン不溶化ポリスチレンボールとを
37℃、３時間反応させた。次に、ポリスチレンボールを
2mlの0.1M NaClを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、
pH 7.0にて２度洗浄した後、0.1M NaCl、及び0.1％ウ
シ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH 7.0に溶解したウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fab′
−ペルオキシダーゼ50ngを加えて37℃にて３時間反応さ
せた。上述と同様にポリスチレンボールを洗浄後、ポリ
スチレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を30℃
にて10分反応後測定した。１倍希釈まで測定可能であつ
た。結果を第２図に示す。
すなわち第２図は本発明方法及び従来法で抗インスリ
ン抗体を測定した結果を、健常者血清によるインスリン
治療患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に結合したペル
オキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）との関係で示
すグラフである。
ン抗体を測定した結果を、健常者血清によるインスリン
治療患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に結合したペル
オキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）との関係で示
すグラフである。
血清中の抗インスリン抗体の測定において本発明によ
る実施例−２は、従来法である比較例−２により高感度
で測定可能である。
る実施例−２は、従来法である比較例−２により高感度
で測定可能である。
実施例−３ ペルオキシダーゼ活性の測定、IgG不溶化固相の調
製、不溶化固相の前処理、デキストラン−チヤーコール
の調製は実施例−２の方法に従つた。
製、不溶化固相の前処理、デキストラン−チヤーコール
の調製は実施例−２の方法に従つた。
ジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン−インスリン−
ペルオキシダーゼ結合物の調製 1. メルカプトサクシニル−ウシ血清アルブミンの調製 ウシ血清アルブミン（フラクシヨンＶ、アーマー社、
カンカキー、イリノイ州）にＳ−アセチルメルカプトサ
クシニツク・アンハイドライドを用いる公知の方法
〔（石川ら、ジヤーナル・オブ・イムノアツセイ（前
出）〕によりチオール基を導入した。ウシ血清アルブミ
ン１分子当り導入された、チオール基の数は8.2個であ
つた。
ペルオキシダーゼ結合物の調製 1. メルカプトサクシニル−ウシ血清アルブミンの調製 ウシ血清アルブミン（フラクシヨンＶ、アーマー社、
カンカキー、イリノイ州）にＳ−アセチルメルカプトサ
クシニツク・アンハイドライドを用いる公知の方法
〔（石川ら、ジヤーナル・オブ・イムノアツセイ（前
出）〕によりチオール基を導入した。ウシ血清アルブミ
ン１分子当り導入された、チオール基の数は8.2個であ
つた。
2. マレイミド−ジニトロフエニル−Ｌ−リジンの調製 5.5mM ジニトロフエニル−Ｌ−リジン塩酸塩、5mM
EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、1.5
mlと5.5mM Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキ
サノエートを含むN,N−ジメチルホルムアミド0.15mlと
を30℃、30分反応させた。
EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、1.5
mlと5.5mM Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキ
サノエートを含むN,N−ジメチルホルムアミド0.15mlと
を30℃、30分反応させた。
3. ジニトロフエニル−ウシ血清アルブミンの調製 メルカプトサクシニル−ウシ血清アルブミン5mg、5mM
EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0、
1.0mlとマレイミド−ジニトロフエニル−Ｌ−リジン溶
液1.5mlとを30℃、30分反応させた。反応液をセフアデ
ツクスＧ−25カラムによりゲルろ過した。カラムサイズ
は、1.5×45cm、溶出液は0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH 7.5を用いた。ウシ血清アルブミン１分子当り
導入されたジニトロフエニル基の数は5.5個であつた。
EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0、
1.0mlとマレイミド−ジニトロフエニル−Ｌ−リジン溶
液1.5mlとを30℃、30分反応させた。反応液をセフアデ
ツクスＧ−25カラムによりゲルろ過した。カラムサイズ
は、1.5×45cm、溶出液は0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH 7.5を用いた。ウシ血清アルブミン１分子当り
導入されたジニトロフエニル基の数は5.5個であつた。
4. メルカプトサクシニル−ジニトロフエニル−ウシ血
清アルブミンの調製 Ｓ−アセチルメルカプトサクシニツク・アンハイドラ
イドを用いる公知の方法〔石川ら、ジヤーナル・オブ・
イムノアツセイ（前出）〕により、ジニトロフエニル−
ウシ血清アルブミンにチオール基を導入した。導入した
チオール基の数はウシ血清アルブミン１分子当り7.0個
であつた。
清アルブミンの調製 Ｓ−アセチルメルカプトサクシニツク・アンハイドラ
イドを用いる公知の方法〔石川ら、ジヤーナル・オブ・
イムノアツセイ（前出）〕により、ジニトロフエニル−
ウシ血清アルブミンにチオール基を導入した。導入した
チオール基の数はウシ血清アルブミン１分子当り7.0個
であつた。
5. マレイミド−インスリンとマレイミド−ペルオキシ
ダーゼの調製 Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエート
を用いる公知の方法〔橋田ら、ジヤーナル・オブ・アプ
ライド・バイオケミストリー（前出）により、インスリ
ン（アクトラピドMC.、ノボ社、コペンハーゲン、デン
マーク）及び西洋ワサギ・ペルオキシダーゼ（グレード
Ｉ、ベーリンガー・マンハイム社、マンハイム、西ドイ
ツ）にマレイミド基を導入した。導入されたマレイミド
基の数は、インスリン１分子当り0.9個、ペルオキシダ
ーゼ１分子当り、1.1個であつた。
ダーゼの調製 Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエート
を用いる公知の方法〔橋田ら、ジヤーナル・オブ・アプ
ライド・バイオケミストリー（前出）により、インスリ
ン（アクトラピドMC.、ノボ社、コペンハーゲン、デン
マーク）及び西洋ワサギ・ペルオキシダーゼ（グレード
Ｉ、ベーリンガー・マンハイム社、マンハイム、西ドイ
ツ）にマレイミド基を導入した。導入されたマレイミド
基の数は、インスリン１分子当り0.9個、ペルオキシダ
ーゼ１分子当り、1.1個であつた。
6. ジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン−インスリ
ン−ペルオキシダーゼ結合物の調製 メルカプトサクシニル−ジニトロフエニル−ウシ血清
アルブミン1.9mg、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH 6.0、0.5mlとマレイミド−インスリン1.
7mg、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0、0.3mlとマレイミド−ペルオキシダーゼ1.7mg、5
mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.
0、0.2mlとを30℃、２時間反応させた。反応液をウルト
ロゲルAcA44のカラムによりゲルろ過した。カラムサイ
ズは1.5×45cm、溶出液は0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液p
H 6.5を用いた。ウシ血清アルブミン１分子当り導入さ
れたインスリン分子及びペルオキシダーゼ分子の数はそ
れぞれ3.8個と2.0個であつた。
ン−ペルオキシダーゼ結合物の調製 メルカプトサクシニル−ジニトロフエニル−ウシ血清
アルブミン1.9mg、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH 6.0、0.5mlとマレイミド−インスリン1.
7mg、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0、0.3mlとマレイミド−ペルオキシダーゼ1.7mg、5
mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.
0、0.2mlとを30℃、２時間反応させた。反応液をウルト
ロゲルAcA44のカラムによりゲルろ過した。カラムサイ
ズは1.5×45cm、溶出液は0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液p
H 6.5を用いた。ウシ血清アルブミン１分子当り導入さ
れたインスリン分子及びペルオキシダーゼ分子の数はそ
れぞれ3.8個と2.0個であつた。
蛋白−セフアローズ4Bの調製 ジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン及びヒトIgG
（10mg）各々は、フアルマシアの手引書に従つてCNBr−
活性化セフアローズ4B（1g）に不溶化した。
（10mg）各々は、フアルマシアの手引書に従つてCNBr−
活性化セフアローズ4B（1g）に不溶化した。
IgGのアフイニテイー精製 ウサギ（抗ジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン）
IgG（マイルズ社、エルクルト、インデイアナ州）及び
ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG（医学生物学研究所）はそ
れぞれジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン及びヒト
IgG不溶化セフアローズ4Bカラムを用い、pH 2.5で溶出
する公知の方法〔河野ら、ジヤーナル・オブ・バイオケ
ミストリー、第100巻、第1247頁（1986）〕によりアフ
イニテイー精製した。
IgG（マイルズ社、エルクルト、インデイアナ州）及び
ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG（医学生物学研究所）はそ
れぞれジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン及びヒト
IgG不溶化セフアローズ4Bカラムを用い、pH 2.5で溶出
する公知の方法〔河野ら、ジヤーナル・オブ・バイオケ
ミストリー、第100巻、第1247頁（1986）〕によりアフ
イニテイー精製した。
被検血清のデミストラン・チヤーコール処理 インスリンによる治療を受けた糖尿病患者血清を健常
者の血清で種々の倍率に希釈した検体1.0mlに0.2M HCl
0.2mlを加えてpH 6.0に調製した。デキストラン・チ
ヤーコール サスペンジヨン0.5mlを加え、５分かくは
ん後、50mM NaOH 0.2mlを加えて中和した。反応液
を、1,500×g,15分遠心分離した。その後、上澄液を同
様の条件で遠心分離した。
者の血清で種々の倍率に希釈した検体1.0mlに0.2M HCl
0.2mlを加えてpH 6.0に調製した。デキストラン・チ
ヤーコール サスペンジヨン0.5mlを加え、５分かくは
ん後、50mM NaOH 0.2mlを加えて中和した。反応液
を、1,500×g,15分遠心分離した。その後、上澄液を同
様の条件で遠心分離した。
抗インスリン抗体の測定 デキストラン・チヤーコール処理した検体0.019mlを
ジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン−インスリン−
ペルオキシダーゼ結合物15fmolと0.37％非特異ウサギIg
Gを溶解した0.1M NaCl、及び0.1％ウシ血清アルブミン
を含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0、0.081ml
と、1M NaCl、及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.0
1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.05mlと、アフ
イニテイー精製ウサギ（抗ジニトロフエニル−ウシ血清
アルブミン）IgG不溶化ポリスチレンボール２個と共に2
0℃、３時間反応させた。ポリスチレンボールを0.1M N
aClを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、2ml
で２回洗浄した後、0.1M NaCl、及び0.1％ウシ血清ア
ルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.
0、0.15mlに溶解したジニトロフエニル−Ｌ−リジン150
nmolとアフイニテイー精製ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG
不溶化ポリスチレンボール２個と共に20℃、３時間反応
させた。アフイニテイー精製ウサギ（抗ヒトIgG）IgG不
溶化ポリスチレンボールを上述と同様に洗浄後、ポリス
チレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を、30
℃、10分反応後測定した。103倍希釈まで測定可能であ
つた。結果を第３図に示す。
ジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン−インスリン−
ペルオキシダーゼ結合物15fmolと0.37％非特異ウサギIg
Gを溶解した0.1M NaCl、及び0.1％ウシ血清アルブミン
を含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0、0.081ml
と、1M NaCl、及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.0
1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.05mlと、アフ
イニテイー精製ウサギ（抗ジニトロフエニル−ウシ血清
アルブミン）IgG不溶化ポリスチレンボール２個と共に2
0℃、３時間反応させた。ポリスチレンボールを0.1M N
aClを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、2ml
で２回洗浄した後、0.1M NaCl、及び0.1％ウシ血清ア
ルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.
0、0.15mlに溶解したジニトロフエニル−Ｌ−リジン150
nmolとアフイニテイー精製ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG
不溶化ポリスチレンボール２個と共に20℃、３時間反応
させた。アフイニテイー精製ウサギ（抗ヒトIgG）IgG不
溶化ポリスチレンボールを上述と同様に洗浄後、ポリス
チレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を、30
℃、10分反応後測定した。103倍希釈まで測定可能であ
つた。結果を第３図に示す。
比較例−３ ペルオキシダーゼ活性の測定、IgG不溶化固相の調製
は実施例−２の方法に従つた。ウサギ（抗ヒトIgGγ
鎖）IgGのアフイニテイー精製、被検血清のデキストラ
ン・チヤーコール処理は実施例−３の方法に従つた。
は実施例−２の方法に従つた。ウサギ（抗ヒトIgGγ
鎖）IgGのアフイニテイー精製、被検血清のデキストラ
ン・チヤーコール処理は実施例−３の方法に従つた。
インスリン−ペルオキシダーゼの調製 1. メルカプトサクシニル−インスリンの調製 インスリンに、Ｓ−アセチルメルカプトサクシニツク
・アンハイドライドを用いて実施例−２と同様の方法
で、チオール基を導入した。導入したチオール基はイン
スリン１分子に0.46個であつた。
・アンハイドライドを用いて実施例−２と同様の方法
で、チオール基を導入した。導入したチオール基はイン
スリン１分子に0.46個であつた。
2. インスリン−ペルオキシダーゼの調製 5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0、5.7mlに溶解したメルカプトサクシニル−インスリ
ンに4mlと、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH6.0、0.6mlに溶解した、実施例−３で調製したマ
レイミド−ペルオキシダーゼ2.4mgを４℃、20時間反応
させた。反応混合物をウルトロゲルAcA 44のカラムによ
りゲルろ過した。カラムサイズは2.0×40cm、溶出液は
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5を用いた。ペルオ
キシダーゼ１分子に1.6個のインスリンが結合した。
6.0、5.7mlに溶解したメルカプトサクシニル−インスリ
ンに4mlと、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH6.0、0.6mlに溶解した、実施例−３で調製したマ
レイミド−ペルオキシダーゼ2.4mgを４℃、20時間反応
させた。反応混合物をウルトロゲルAcA 44のカラムによ
りゲルろ過した。カラムサイズは2.0×40cm、溶出液は
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5を用いた。ペルオ
キシダーゼ１分子に1.6個のインスリンが結合した。
抗インスリン抗体の測定 実施例−３でデキストラン・チヤーコール処理した検
体を、0.1％NaN3、0.1M NaCl、及び0.1％ウシ血清アル
ブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0で
2.6×104倍希釈した。この希釈血清0.15mlと、アフイニ
テイー精製ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化ポリスチ
レンボールと共に37℃、３時間反応させた。ポリスチレ
ンボールを0.1M NaClを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩
衝液、pH 7.0、2mlで２回洗浄した後、0.1M NaCl、及
び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH 7.0、0.15mlに溶解したインスリン−ペ
ルオキシダーゼ結合物50ngを加えて37℃、３時間反応さ
せた。ポリスチレンボールを上述と同様に洗浄後、ポリ
スチレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を30℃
にて10分反応後測定した。３×10倍希釈まで測定可能で
あつた。結果を第３図に示す。
体を、0.1％NaN3、0.1M NaCl、及び0.1％ウシ血清アル
ブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0で
2.6×104倍希釈した。この希釈血清0.15mlと、アフイニ
テイー精製ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化ポリスチ
レンボールと共に37℃、３時間反応させた。ポリスチレ
ンボールを0.1M NaClを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩
衝液、pH 7.0、2mlで２回洗浄した後、0.1M NaCl、及
び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH 7.0、0.15mlに溶解したインスリン−ペ
ルオキシダーゼ結合物50ngを加えて37℃、３時間反応さ
せた。ポリスチレンボールを上述と同様に洗浄後、ポリ
スチレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を30℃
にて10分反応後測定した。３×10倍希釈まで測定可能で
あつた。結果を第３図に示す。
すなわち第３図は本発明方法及び従来法で抗インスリ
ン抗体を測定した結果を、健常者血清によるインスリン
治療患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に結合したペル
オキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）との関係で示
すグラフである。
ン抗体を測定した結果を、健常者血清によるインスリン
治療患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に結合したペル
オキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）との関係で示
すグラフである。
血清中の抗インスリン抗体の測定において本発明によ
る実施例−３は、従来法である比較例−２、３より高感
度で測定可能である。
る実施例−３は、従来法である比較例−２、３より高感
度で測定可能である。
実施例−４ ペルオキシダーゼ活性の測定、IgG不溶化固相の調
製、不溶化固相の前処理、IgG、Ｆ（ab′）２、Fab′の
調製、ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fab′−ペルオキシダー
ゼの調製は実施例−２の方法に従つた。ジニトロフエニ
ル−ウシ血清アルブミンの調製、蛋白−セフアローズ4B
の調製、IgGのアフイニテイー精製は実施例−３の方法
に従つた。
製、不溶化固相の前処理、IgG、Ｆ（ab′）２、Fab′の
調製、ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fab′−ペルオキシダー
ゼの調製は実施例−２の方法に従つた。ジニトロフエニ
ル−ウシ血清アルブミンの調製、蛋白−セフアローズ4B
の調製、IgGのアフイニテイー精製は実施例−３の方法
に従つた。
サイログロブリンの精製 粗精製サイログロブリンは甲状腺により、硫酸アンモ
ニウムによる塩析〔ロイツト（Roitt）ら、ランセツト
（Lancet）第15巻、第1027頁（1958）〕とDEAEセルロー
ズによる〔大滝ら、ジヤーナル・オブ・クリニカル・エ
ンドクリノロジー・アンド・メタボライト（J.Clin.End
crinol.Metab.）第52巻、第239頁（1981）〕にて精製し
た。
ニウムによる塩析〔ロイツト（Roitt）ら、ランセツト
（Lancet）第15巻、第1027頁（1958）〕とDEAEセルロー
ズによる〔大滝ら、ジヤーナル・オブ・クリニカル・エ
ンドクリノロジー・アンド・メタボライト（J.Clin.End
crinol.Metab.）第52巻、第239頁（1981）〕にて精製し
た。
更に上述の精製サイログロブリン3.0mgをウサギ（抗
ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化セフアローズ4Bカラム（0.9×
5.5cm）を用いて、0.1％NaN3を含む0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH 7.0で溶出した。次いでウルトロゲルAcA
22（1.5×45cm）を用い、同様の緩衝液で溶出した。精
製の純度は、尿素を含むSDSポリアクリルアミド電気泳
動で確認した。サイログロブリン含量は、280nmでの吸
光度から、吸光係数1.0g-1・ｌ・cm-1として求めた。
ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化セフアローズ4Bカラム（0.9×
5.5cm）を用いて、0.1％NaN3を含む0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH 7.0で溶出した。次いでウルトロゲルAcA
22（1.5×45cm）を用い、同様の緩衝液で溶出した。精
製の純度は、尿素を含むSDSポリアクリルアミド電気泳
動で確認した。サイログロブリン含量は、280nmでの吸
光度から、吸光係数1.0g-1・ｌ・cm-1として求めた。
ジニトロフエニル−サイログロブリンの調製 1. メルカプトサクシニル−サイログロブリンの調製 精製サイログロブリンにＳ−アセチルメルカプトサク
シニツク・アンハイドライドを用いる公知の方法〔石川
ら、ジヤーナル・オブ・イムノアツセイ（前出）〕によ
りチオール基を導入した。１分子当り導入された、チオ
ール基の数は20個であつた。
シニツク・アンハイドライドを用いる公知の方法〔石川
ら、ジヤーナル・オブ・イムノアツセイ（前出）〕によ
りチオール基を導入した。１分子当り導入された、チオ
ール基の数は20個であつた。
2. マレイミド−ジニトロフエニル−Ｌ−リジンの調製 実施例−３と同様の方法で調製した。
3. ジニトロフエニル−サイログロブリンの調製 メルカプトサクシニル−サイログロブリン0.5mgを溶
解した5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 6.0、1.0mlと、マレイミド−ジニトロフエニル−Ｌ
−リジン溶液0.03mlとを30℃、30分反応させた後、同緩
衝液に溶解した0.1M Ｎ−エチルマレイミド５μを加
えて30℃15分保温した。反応液をセフアデツクスＧ−25
カラムによりゲルろ過した。カラムサイズは、1.0×30c
m、溶出液は0.1％NaN3を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液pH 7.0を用いた。サイログロブリン１分子当り導入
されたジニトロフエニル基の数は16個であつた。
解した5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 6.0、1.0mlと、マレイミド−ジニトロフエニル−Ｌ
−リジン溶液0.03mlとを30℃、30分反応させた後、同緩
衝液に溶解した0.1M Ｎ−エチルマレイミド５μを加
えて30℃15分保温した。反応液をセフアデツクスＧ−25
カラムによりゲルろ過した。カラムサイズは、1.0×30c
m、溶出液は0.1％NaN3を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液pH 7.0を用いた。サイログロブリン１分子当り導入
されたジニトロフエニル基の数は16個であつた。
抗サイログロブリン抗体の測定 抗サイログロブリン抗体を含む血清を健常者の血清で
種々の倍率に希釈した検体0.02mlを、0.375％非特異ウ
サギIgG、0.1％NaN3、0.1M NaCl及び0.1％ウシ血清ア
ルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.
0、0.08mlに溶解したジニトロフエニル−サイログロブ
リン50fmolと、0.1％NaN3、1M NaCl、及び0.1％ウシ血
清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0、0.05mlと、アフイニテイー精製ウサギ（抗ジニ
トロフエニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化ポリス
チレンボール共に20℃、20時間反応させた。その後ポリ
スチレンボールを2mlの0.1M NaClを含む0.01Mリン酸ナ
トリウム緩衝液、pH 7.0にて２度洗浄した。0.2％非特
異ウサギIgG、0.1％NaN3、0.1M NaCl、及び0.1％ウシ
血清アブルミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 7.0、0.15mlに溶解したジニトロフエニル−Ｌ−リジ
ン150nmolを加え20℃、３時間反応させた。ポリスチレ
ンボールを除去した後の液に、ウサギ（抗サイログロブ
リン）IgG不溶化ポリスチレンボールを入れて、20℃、
３時間反応させた。その後、ポリスチレンボールを上述
と同様に洗浄した。0.1M NaCl、及び0.1％ウシ血清ア
ルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.
0、0.15mlに溶解したウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fab′−
ペルオキシダーゼ50ngを加えて20℃、３時間反応させ
た。上述と同様にポリスチレンボールを洗浄後、ポリス
チレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を30℃に
て10分反応後測定した。105倍希釈まで測定可能であつ
た。結果を第４図に示す。
種々の倍率に希釈した検体0.02mlを、0.375％非特異ウ
サギIgG、0.1％NaN3、0.1M NaCl及び0.1％ウシ血清ア
ルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.
0、0.08mlに溶解したジニトロフエニル−サイログロブ
リン50fmolと、0.1％NaN3、1M NaCl、及び0.1％ウシ血
清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0、0.05mlと、アフイニテイー精製ウサギ（抗ジニ
トロフエニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化ポリス
チレンボール共に20℃、20時間反応させた。その後ポリ
スチレンボールを2mlの0.1M NaClを含む0.01Mリン酸ナ
トリウム緩衝液、pH 7.0にて２度洗浄した。0.2％非特
異ウサギIgG、0.1％NaN3、0.1M NaCl、及び0.1％ウシ
血清アブルミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 7.0、0.15mlに溶解したジニトロフエニル−Ｌ−リジ
ン150nmolを加え20℃、３時間反応させた。ポリスチレ
ンボールを除去した後の液に、ウサギ（抗サイログロブ
リン）IgG不溶化ポリスチレンボールを入れて、20℃、
３時間反応させた。その後、ポリスチレンボールを上述
と同様に洗浄した。0.1M NaCl、及び0.1％ウシ血清ア
ルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.
0、0.15mlに溶解したウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fab′−
ペルオキシダーゼ50ngを加えて20℃、３時間反応させ
た。上述と同様にポリスチレンボールを洗浄後、ポリス
チレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を30℃に
て10分反応後測定した。105倍希釈まで測定可能であつ
た。結果を第４図に示す。
比較例−４ ペルオキシダーゼの測定、IgG不溶化固相の調製、ウ
サギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fab′−ペルオキシダーゼの調製
は実施例−２の方法に従つた。サイログロブリンの精製
は実施例−４の方法に従つた。
サギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fab′−ペルオキシダーゼの調製
は実施例−２の方法に従つた。サイログロブリンの精製
は実施例−４の方法に従つた。
サイログロブリン不溶化固相の調製 サイログロブリン（0.1g/）を用いて実施例−２と
同様に、ポリスチレンボールに物理的吸着により不溶化
した。
同様に、ポリスチレンボールに物理的吸着により不溶化
した。
抗サイログロブリン抗体の測定 抗サイルグロブリン抗体を含む血清を健常者の血清で
種々の倍率に希釈した検体を、0.1％ NaN3、0.1M NaC
l、及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナ
トリウム緩衝液、pH 7.0で１×105倍希釈した。この希
釈血清0.15mlと、サイログロブリン不溶化ポリスチレン
ボールとを37℃、３時間反応させた。次に、2mlの0.1M
NaClを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0に
て２度洗浄した後、0.1M NaCl、及び0.1％ウシ血清ア
ルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0
（015ml）に溶解したウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fab′−
ペルオキシダーゼ50ngを加えて37℃にて３時間反応させ
た。上述と同様にポリスチレンボールを洗浄後、ポリス
チレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を30℃に
て10分反応後測定した。５×10倍希釈まで測定可能であ
つた。結果を第４図に示す。
種々の倍率に希釈した検体を、0.1％ NaN3、0.1M NaC
l、及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナ
トリウム緩衝液、pH 7.0で１×105倍希釈した。この希
釈血清0.15mlと、サイログロブリン不溶化ポリスチレン
ボールとを37℃、３時間反応させた。次に、2mlの0.1M
NaClを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0に
て２度洗浄した後、0.1M NaCl、及び0.1％ウシ血清ア
ルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0
（015ml）に溶解したウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）Fab′−
ペルオキシダーゼ50ngを加えて37℃にて３時間反応させ
た。上述と同様にポリスチレンボールを洗浄後、ポリス
チレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を30℃に
て10分反応後測定した。５×10倍希釈まで測定可能であ
つた。結果を第４図に示す。
すなわち第４図は本発明方法及び従来法で抗サイログ
ロブリン抗体を測定した結果、健常者血清によるバセド
ー病患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に結合したペル
オキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）との関係で示
すグラフである。
ロブリン抗体を測定した結果、健常者血清によるバセド
ー病患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に結合したペル
オキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）との関係で示
すグラフである。
実施例−５ ペルオキシダーゼ活性の測定、IgG不溶化固相の調
製、ブオチニル−非特異ウサギIgGの調製、ウサギ（抗
ヒトIgGγ鎖）Fab′−ペルオキシダーゼの調製は実施例
−２の方法に従つた。蛋白−セフアローズ4Bの調製、Ig
Gのアフイニテイー精製は実施例−３の方法に従つた。
サイログロブリンの精製は実施例−４の方法に従つた。
製、ブオチニル−非特異ウサギIgGの調製、ウサギ（抗
ヒトIgGγ鎖）Fab′−ペルオキシダーゼの調製は実施例
−２の方法に従つた。蛋白−セフアローズ4Bの調製、Ig
Gのアフイニテイー精製は実施例−３の方法に従つた。
サイログロブリンの精製は実施例−４の方法に従つた。
ジニトロフエニル−ビオチニル−非特異ウサギIgG−ア
フイニテイー精製抗サイログロブリンFab′の調製 1. メルカプトサクシニル−非特異ウサギIgGの調製 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.5（1.5ml）に溶
解した非特異ウサギIgG（4.0mg）にN,N−ジメチルホル
ムアミド（0.15ml）に溶解した0.11M Ｓ−アセチルメ
ルカプトサクシニツク・アンハイドライド（半井化学、
京都）を添加し、30℃にて30分間保温した。保温後、0.
1Mトリス−塩酸緩衝液、pH 7.0（0.15ml）、0.1M EDT
A、pH 7.0（0.1ml）及び1Mヒドロキシルアミン、pH
7.0（0.25ml）を添加し、30℃にて15分間保温したの
ち、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0にて平衡化したセフアデツクスＧ−25カラム（1.0
×30cm）を用いたゲルろ過を行い、メルカプトサクシニ
ル−非特異ウサギIgGを得た。導入されたチオール基
は、非特異ウサギIgG 1分子当り16個であつた。
フイニテイー精製抗サイログロブリンFab′の調製 1. メルカプトサクシニル−非特異ウサギIgGの調製 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.5（1.5ml）に溶
解した非特異ウサギIgG（4.0mg）にN,N−ジメチルホル
ムアミド（0.15ml）に溶解した0.11M Ｓ−アセチルメ
ルカプトサクシニツク・アンハイドライド（半井化学、
京都）を添加し、30℃にて30分間保温した。保温後、0.
1Mトリス−塩酸緩衝液、pH 7.0（0.15ml）、0.1M EDT
A、pH 7.0（0.1ml）及び1Mヒドロキシルアミン、pH
7.0（0.25ml）を添加し、30℃にて15分間保温したの
ち、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0にて平衡化したセフアデツクスＧ−25カラム（1.0
×30cm）を用いたゲルろ過を行い、メルカプトサクシニ
ル−非特異ウサギIgGを得た。導入されたチオール基
は、非特異ウサギIgG 1分子当り16個であつた。
2. マレイイド−ジニトロフエニル−Ｌ−リジンの調製 5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0に溶解した8.8mM ジニトロフエニル−Ｌ−リジン
（1.5ml）（東京化成、東京）にN,N−ジメチルホルムア
ミドに溶解した8.8mM Ｎ−サクシニミジル−６−マレ
イミドヘキサノエート（0.15ml）に（同仁化学、熊本）
を加え、30℃にて30分間保温し、マレイミド−ジニトロ
フエニル−Ｌ−リジンを調製した。
7.0に溶解した8.8mM ジニトロフエニル−Ｌ−リジン
（1.5ml）（東京化成、東京）にN,N−ジメチルホルムア
ミドに溶解した8.8mM Ｎ−サクシニミジル−６−マレ
イミドヘキサノエート（0.15ml）に（同仁化学、熊本）
を加え、30℃にて30分間保温し、マレイミド−ジニトロ
フエニル−Ｌ−リジンを調製した。
3. ジニトロフエニル−非特異ウサギIgGの調製 5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0（1.8ml）に溶解したメルカプトサクシニル−非特異
ウサギIgG（3.0mg）にマレイミド−ジニトロフエニル−
Ｌ−リジン（1.5ml）を加え30℃にて30分間保温した。
保温後0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0にて平衡化
したセフアデツクスＧ−25カラム（1.0×30cm）を用い
たゲルろ過を行い、ジニトロフエニル−非特異ウサギIg
Gを得た。導入されたジニトロフエニル基は、非特異ウ
サギIgG 1分子当り11.9個であつた。なお、ジニトロフ
エニル基の定量は、分光光学的に行つた。
6.0（1.8ml）に溶解したメルカプトサクシニル−非特異
ウサギIgG（3.0mg）にマレイミド−ジニトロフエニル−
Ｌ−リジン（1.5ml）を加え30℃にて30分間保温した。
保温後0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0にて平衡化
したセフアデツクスＧ−25カラム（1.0×30cm）を用い
たゲルろ過を行い、ジニトロフエニル−非特異ウサギIg
Gを得た。導入されたジニトロフエニル基は、非特異ウ
サギIgG 1分子当り11.9個であつた。なお、ジニトロフ
エニル基の定量は、分光光学的に行つた。
4.マレイミド−ジニトロフエニル−非特異ウサギIgGの
調製 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0（3.0ml）に溶
解したジニトロフエニル−非特異ウサギIgG（2.4mg）に
N,N−ジメチルホルムアミド（0.3ml）に溶解した88mM
Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエートを
添加し、30℃にて30分間保温したのち、5mM EDTAを含
む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0にて平衡化し
たセフアデツクスＧ−25カラム（1.0×30cm）を用いた
ゲルろ過を行い、マレイミド−ジニトロフエニル−非特
異ウサギIgGを得た。導入されたマレイミド基は、ジニ
トロフエニル−非特異ウサギIgG1分子当り18個であつ
た。
調製 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0（3.0ml）に溶
解したジニトロフエニル−非特異ウサギIgG（2.4mg）に
N,N−ジメチルホルムアミド（0.3ml）に溶解した88mM
Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエートを
添加し、30℃にて30分間保温したのち、5mM EDTAを含
む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0にて平衡化し
たセフアデツクスＧ−25カラム（1.0×30cm）を用いた
ゲルろ過を行い、マレイミド−ジニトロフエニル−非特
異ウサギIgGを得た。導入されたマレイミド基は、ジニ
トロフエニル−非特異ウサギIgG1分子当り18個であつ
た。
5. Ｎ−ビオチニル−２−メルカプトエチルアミンの調
製 N,N−ジメチルホルムアミド（0.2ml）に溶解した44mM
ビオチン−Ｎ−ハイドロキシサクシミド（ザイムド
ラボラトリー社、サンフランシスコ、カリフオルニア
州）に5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 7.0に溶解した4.4mM メルカプトエチルアミン（2.0
ml）を加え、30℃にて30分間保温し、Ｎ−ビオチニル−
２−メルカプトエチルアミンを調製した。
製 N,N−ジメチルホルムアミド（0.2ml）に溶解した44mM
ビオチン−Ｎ−ハイドロキシサクシミド（ザイムド
ラボラトリー社、サンフランシスコ、カリフオルニア
州）に5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 7.0に溶解した4.4mM メルカプトエチルアミン（2.0
ml）を加え、30℃にて30分間保温し、Ｎ−ビオチニル−
２−メルカプトエチルアミンを調製した。
6. マレイミド−ジニトロフエニル−ジオチニル−非特
異ウサギIgGの調製 5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0（3.2ml）に溶解したマレイミド−ジニトロフエニル
−非特異ウサギIgG（2.0mg）にＮ−ビオチニル−２−メ
ルカプトエチルアミン（0.11mg）を加え、30℃にて30分
間保温した。保温後、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナト
リウム緩衝液、pH 6.0にて平衡化したセフアデツクス
Ｇ−25カラム（1.0×30cm）を用いたゲルろ過を行い、
マレイミド−ジニトロフエニル−ジオチニル−非特異ウ
サギIgGを得た。マレイミド−ジニトロフエニル−非特
異ウサギIgGのマレイミド基の減少より算出して、導入
されたビオチニル基はマレイミド−ジニトロフエニル−
非特異ウサギIgG 1分子当り14.4個であつた。
異ウサギIgGの調製 5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0（3.2ml）に溶解したマレイミド−ジニトロフエニル
−非特異ウサギIgG（2.0mg）にＮ−ビオチニル−２−メ
ルカプトエチルアミン（0.11mg）を加え、30℃にて30分
間保温した。保温後、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナト
リウム緩衝液、pH 6.0にて平衡化したセフアデツクス
Ｇ−25カラム（1.0×30cm）を用いたゲルろ過を行い、
マレイミド−ジニトロフエニル−ジオチニル−非特異ウ
サギIgGを得た。マレイミド−ジニトロフエニル−非特
異ウサギIgGのマレイミド基の減少より算出して、導入
されたビオチニル基はマレイミド−ジニトロフエニル−
非特異ウサギIgG 1分子当り14.4個であつた。
7. ジニトロフエニル−ビオチニル−非特異ウサギIgG
−ウサギ抗サイログロブリンFab′複合体の調製 5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0（0.1ml）に溶解したマレイミド−ジニトロフエニル
−ビオチニル−非特異ウサギIgG（1.3mg）に同緩衝液
（0.1ml）に溶解したウサギ抗サイログロブリンFab′
（0.4mg）を加え４℃にて20時間保温した。保温後、0.1
％NaN3、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0にて平
衡化したウルトロゲル AcA22カラム（1.5×45cm）を用
いたゲルろ過を行い、ジニトロフエニル−ビオチニル−
非特異ウサギIgG−ウサギ抗サイログロブリンFab′複合
体を得た。導入されたウサギ抗サイログロブリンFab′
は、ジニトロフエニル−ビオチニル−非特異ウサギIgG
1分子当り0.8個であつた。
−ウサギ抗サイログロブリンFab′複合体の調製 5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0（0.1ml）に溶解したマレイミド−ジニトロフエニル
−ビオチニル−非特異ウサギIgG（1.3mg）に同緩衝液
（0.1ml）に溶解したウサギ抗サイログロブリンFab′
（0.4mg）を加え４℃にて20時間保温した。保温後、0.1
％NaN3、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0にて平
衡化したウルトロゲル AcA22カラム（1.5×45cm）を用
いたゲルろ過を行い、ジニトロフエニル−ビオチニル−
非特異ウサギIgG−ウサギ抗サイログロブリンFab′複合
体を得た。導入されたウサギ抗サイログロブリンFab′
は、ジニトロフエニル−ビオチニル−非特異ウサギIgG
1分子当り0.8個であつた。
8. ジニトロフエニル−ビオチニル−非特異ウサギIgG
−アフイニテイー精製ウサギ抗サイログロブリンFab′
複合体の調製 0.1％NaN3を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0（0.5ml）に溶解したジニトロフエニル−ビオチニル
−非特異ウサギンIgG−ウサギ抗サイログロブリンFab′
（0.5mg）を同緩衝液にて平衡化したサイログロブリン
不溶化−セフアローズ4Bカラム（3.5×2.6mm）に結合さ
せた後、3.2mM 塩酸、pH 2.5にて溶出してジニトロフ
エニル−ビオチニル−ウサギ非特異IgG−アフイニテイ
ー精製ウサギ抗サイログロブリンFab′（0.06mg）を得
た。
−アフイニテイー精製ウサギ抗サイログロブリンFab′
複合体の調製 0.1％NaN3を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0（0.5ml）に溶解したジニトロフエニル−ビオチニル
−非特異ウサギンIgG−ウサギ抗サイログロブリンFab′
（0.5mg）を同緩衝液にて平衡化したサイログロブリン
不溶化−セフアローズ4Bカラム（3.5×2.6mm）に結合さ
せた後、3.2mM 塩酸、pH 2.5にて溶出してジニトロフ
エニル−ビオチニル−ウサギ非特異IgG−アフイニテイ
ー精製ウサギ抗サイログロブリンFab′（0.06mg）を得
た。
アビジン−ビオチニル−非特異ウサギIgG不溶化ポリス
チレンボールの調製 実施例−１と同様にしてビオチニル−非特異ウサギIg
G（0.1g/）をポリスチレンボールに物理的に吸着後ビ
オチニル−非特異ウサギIgG不溶化ポリスチレンボール
と0.％アビジン、及び0.1％ NaN3を含む0.1Mリン酸ナト
リウム緩衝液、pH 7.0とを37℃、４時間反応させた。
チレンボールの調製 実施例−１と同様にしてビオチニル−非特異ウサギIg
G（0.1g/）をポリスチレンボールに物理的に吸着後ビ
オチニル−非特異ウサギIgG不溶化ポリスチレンボール
と0.％アビジン、及び0.1％ NaN3を含む0.1Mリン酸ナト
リウム緩衝液、pH 7.0とを37℃、４時間反応させた。
抗サイログロブリン抗体の測定 抗サイログロブリン抗体を含む血清を健常者の血清で
種々の倍率に希釈した検体0.02mlと、0.1M NaCl、及び
0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム
緩衝液、pH 7.0、0.06mlに溶解したサイログロブリン3
0fmolと、1M NaCl及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む
0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.05mlとを、
混合し37℃、４時間反応させた。更に0.1M NaCl、及び
0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム
緩衝液、pH 7.0、0.01mlに溶解したジニトロフエニル
−ビオチニル−非特異ウサギIgG−アフイニテイー精製
ウサギ（抗サイログロブリン）Fab′結合物100fmolを加
え37℃、４時間反応後、更に４℃で一夜放置した。その
後、３％非特異ウサギIgG、0.1M NaCl、及び0.1％ウシ
血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 7.0、0.01mlを加え、アフイニテイー精製ウサギ（抗
ジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化ポ
リスチレンボールを加えて、24℃、４時間反応させた。
その後、ポリスチレンボールを2mlの0.1M NaClを含む
0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0にて２度洗浄し
た後、0.2％非特異ウサギIgG、0.1M NaCl及び0.1％ウ
シ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH 7.0、0.15mlに溶解したジニトロフエニル−Ｌ
−リジン150nmolを加え室温で一夜放置した。ポリスチ
レンボールを除去した後の液に、アビジン−ビオチニル
−非特異ウサギIgG不溶化ポリスチレンボールを入れ
て、20℃、３時間反応させた。その後、ポリスチレンボ
ールを2mlの0.1M NaClを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩
衝液、pH 7.0、にて２度洗浄した。0.1M NaCl、及び
0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム
緩衝液、pH 7.0、0.15mlに溶解したウサギ（抗ヒトIgG
γ鎖）Fab′−ペルオキシダーゼ（50ng）を加えて20℃
にて３時間反応させた。上述と同様にポリスチレンボー
ルを洗浄後、ポリスチレンボールに結合したペルオキシ
ダーゼ活性を30℃にて10分反応後測定した。103倍希釈
まで測定可能であつた。結果を第５図に示す。
種々の倍率に希釈した検体0.02mlと、0.1M NaCl、及び
0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム
緩衝液、pH 7.0、0.06mlに溶解したサイログロブリン3
0fmolと、1M NaCl及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む
0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.05mlとを、
混合し37℃、４時間反応させた。更に0.1M NaCl、及び
0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム
緩衝液、pH 7.0、0.01mlに溶解したジニトロフエニル
−ビオチニル−非特異ウサギIgG−アフイニテイー精製
ウサギ（抗サイログロブリン）Fab′結合物100fmolを加
え37℃、４時間反応後、更に４℃で一夜放置した。その
後、３％非特異ウサギIgG、0.1M NaCl、及び0.1％ウシ
血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 7.0、0.01mlを加え、アフイニテイー精製ウサギ（抗
ジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化ポ
リスチレンボールを加えて、24℃、４時間反応させた。
その後、ポリスチレンボールを2mlの0.1M NaClを含む
0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0にて２度洗浄し
た後、0.2％非特異ウサギIgG、0.1M NaCl及び0.1％ウ
シ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH 7.0、0.15mlに溶解したジニトロフエニル−Ｌ
−リジン150nmolを加え室温で一夜放置した。ポリスチ
レンボールを除去した後の液に、アビジン−ビオチニル
−非特異ウサギIgG不溶化ポリスチレンボールを入れ
て、20℃、３時間反応させた。その後、ポリスチレンボ
ールを2mlの0.1M NaClを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩
衝液、pH 7.0、にて２度洗浄した。0.1M NaCl、及び
0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム
緩衝液、pH 7.0、0.15mlに溶解したウサギ（抗ヒトIgG
γ鎖）Fab′−ペルオキシダーゼ（50ng）を加えて20℃
にて３時間反応させた。上述と同様にポリスチレンボー
ルを洗浄後、ポリスチレンボールに結合したペルオキシ
ダーゼ活性を30℃にて10分反応後測定した。103倍希釈
まで測定可能であつた。結果を第５図に示す。
実施例−６ ペルオキシダーゼ活性の測定、IgG不溶化固相の調
製、IgG不溶化固相の前処理は実施例−２の方法に従つ
た。蛋白−セフアローズ4Bの調製、IgGのアフイニテイ
ー精製は実施例−３の方法に従つた。サイログロブリン
の精製は実施例−１の方法に従つた。
製、IgG不溶化固相の前処理は実施例−２の方法に従つ
た。蛋白−セフアローズ4Bの調製、IgGのアフイニテイ
ー精製は実施例−３の方法に従つた。サイログロブリン
の精製は実施例−１の方法に従つた。
ジニトロフエニル−サイログロブリン−ペルオキシダー
ゼ複合体の調製 1. メルカプトサクシニル−サイログロブリンの調製 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.5（2.8ml）に溶
解したサイログロブリン（1.4mg）にN,N−ジメチルホル
ムアミド（0.28ml）に溶解した55mM Ｓ−アセチルメル
カプトサクシニツク・アンハイドライド（半井化学、京
都）を加え30℃にて30分間保温した。保温後5mM EDTA
を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0にて平衡
化したセフアデツクスＧ−25カラム（1.0×30cm）を用
いたゲルろ過を行つた。Ｓ−アセチルメルカプトサクシ
ニル−サイログロブリン（1.2mg）を含んだ分画（4.0m
l）を集め、1.0mヒドロキシルアミン、pH 7.0（0.4m
l）を加え30℃にて15分間保温し、5mM EDTAを含む0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0にて平衡化したセフ
アデツクスＧ−25カラム（1.0×30cm）を用いたゲルろ
過を行い、メルカプトサクシニル−サイログロブリンを
得た。導入されたチオール基は、サイログロブリン１分
子当り22個であつた。
ゼ複合体の調製 1. メルカプトサクシニル−サイログロブリンの調製 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.5（2.8ml）に溶
解したサイログロブリン（1.4mg）にN,N−ジメチルホル
ムアミド（0.28ml）に溶解した55mM Ｓ−アセチルメル
カプトサクシニツク・アンハイドライド（半井化学、京
都）を加え30℃にて30分間保温した。保温後5mM EDTA
を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0にて平衡
化したセフアデツクスＧ−25カラム（1.0×30cm）を用
いたゲルろ過を行つた。Ｓ−アセチルメルカプトサクシ
ニル−サイログロブリン（1.2mg）を含んだ分画（4.0m
l）を集め、1.0mヒドロキシルアミン、pH 7.0（0.4m
l）を加え30℃にて15分間保温し、5mM EDTAを含む0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0にて平衡化したセフ
アデツクスＧ−25カラム（1.0×30cm）を用いたゲルろ
過を行い、メルカプトサクシニル−サイログロブリンを
得た。導入されたチオール基は、サイログロブリン１分
子当り22個であつた。
2. マレイミド−ジニトロフエニル−Ｌ−リジンの調製 実施例−５の方法に従つた。
3. メルカプトサクシニル−ジニトロフエニル−サイロ
グロブリンの調製 5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0（0.5ml）に溶解したメルカプトサクシニル−サイロ
グロブリン（1.05mg）にマレイミド−ジニトロフエニル
−Ｌ−リジン（0.05ml）を加え、30℃にて30分間保温し
た。保温後、同緩衝液にて平衡化したセフアデツクスＧ
−25カラム（1.0×30cm）を用いたゲルろ過を行い、メ
ルカプトサクシニル−ジニトロフエニル−サイログロブ
リンを得た。導入されたジニトロフエニル基は、メルカ
プトサクシニル−サイログロブリン１分子当り11個であ
つた。
グロブリンの調製 5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0（0.5ml）に溶解したメルカプトサクシニル−サイロ
グロブリン（1.05mg）にマレイミド−ジニトロフエニル
−Ｌ−リジン（0.05ml）を加え、30℃にて30分間保温し
た。保温後、同緩衝液にて平衡化したセフアデツクスＧ
−25カラム（1.0×30cm）を用いたゲルろ過を行い、メ
ルカプトサクシニル−ジニトロフエニル−サイログロブ
リンを得た。導入されたジニトロフエニル基は、メルカ
プトサクシニル−サイログロブリン１分子当り11個であ
つた。
4. ジニトロフエニル−サイログロブリン−ペルオキシ
ダーゼの調製 5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0（0.3ml）に溶解したメルカプトサクシニル−ジニト
ロフエニル−サイログロブリン（0.6mg）に同緩衝液
（0.03ml）に溶解した実施例−３で調製したマレイミド
−ペルオキシダーゼ（1.0mg）を加え、４℃にて20時間
保温し続いて同緩衝液（５μ）に溶解した0.1M Ｎ−
エチルマレイミドを加え30℃、15分間保温した。保温後
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.5にて平衡化した
ウルトロゲルAcA22カラム（1.5×45cm）を用いたゲルろ
過を行い、ジニトロフエニル−サイログロブリン−ペル
オキシダーゼ複合体を得た。導入されたペルオキシダー
ゼは、ジニトロフエニル−サイログロブリン１分子当り
1.4個であつた。
ダーゼの調製 5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.0（0.3ml）に溶解したメルカプトサクシニル−ジニト
ロフエニル−サイログロブリン（0.6mg）に同緩衝液
（0.03ml）に溶解した実施例−３で調製したマレイミド
−ペルオキシダーゼ（1.0mg）を加え、４℃にて20時間
保温し続いて同緩衝液（５μ）に溶解した0.1M Ｎ−
エチルマレイミドを加え30℃、15分間保温した。保温後
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.5にて平衡化した
ウルトロゲルAcA22カラム（1.5×45cm）を用いたゲルろ
過を行い、ジニトロフエニル−サイログロブリン−ペル
オキシダーゼ複合体を得た。導入されたペルオキシダー
ゼは、ジニトロフエニル−サイログロブリン１分子当り
1.4個であつた。
抗サイログロブリン抗体の測定 抗サイログロブリン抗体を含む血清を健常者の血清で
種々の倍率に希釈した検体0.01mlと、0.333％非特異ウ
サギIgG、0.1％ウシ血清アルブミン及び0.1M NaClを含
む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.09mlに溶
解したジニトロフエニル−サイログロブリン−ペルオキ
シダーゼ結合物15fmol及び1.0M NaCl、及び0.1％ウシ
血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 7.0、0.05mlと、アフイニテイー精製ウサギ（抗ジニ
トロフエニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化ポリス
チレンボール２個と共に20℃、３時間反応させた。ポリ
スチレンボールを0.1M NaClを含む0.01Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH 7.0、2mlで２回洗浄した後、0.1M Na
Cl、及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナ
トリウム緩衝液、pH 7.0、0.15mlに溶解したジニトロ
フエニル−Ｌ−リジン150nmolとアフイニテイー精製ウ
サギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化ポリスチレンボール２
個とを加えて、20℃、３時間反応させた。アフイニテイ
ー精製ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化ポリスチレン
ボールを上述と同様に洗浄後、ポリスチレンノールに結
合したペルオキシダーゼ活性を、30℃、10分間反応後測
定した。５×104倍希釈まで測定可能であつた。結果を
第５図に示す。
種々の倍率に希釈した検体0.01mlと、0.333％非特異ウ
サギIgG、0.1％ウシ血清アルブミン及び0.1M NaClを含
む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.09mlに溶
解したジニトロフエニル−サイログロブリン−ペルオキ
シダーゼ結合物15fmol及び1.0M NaCl、及び0.1％ウシ
血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 7.0、0.05mlと、アフイニテイー精製ウサギ（抗ジニ
トロフエニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化ポリス
チレンボール２個と共に20℃、３時間反応させた。ポリ
スチレンボールを0.1M NaClを含む0.01Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH 7.0、2mlで２回洗浄した後、0.1M Na
Cl、及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナ
トリウム緩衝液、pH 7.0、0.15mlに溶解したジニトロ
フエニル−Ｌ−リジン150nmolとアフイニテイー精製ウ
サギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化ポリスチレンボール２
個とを加えて、20℃、３時間反応させた。アフイニテイ
ー精製ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化ポリスチレン
ボールを上述と同様に洗浄後、ポリスチレンノールに結
合したペルオキシダーゼ活性を、30℃、10分間反応後測
定した。５×104倍希釈まで測定可能であつた。結果を
第５図に示す。
すなわち第５図は本発明方法及び従来法で抗サイログ
ロブリン抗体を測定した結果を、健常者血清によるバセ
ドー病患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に結合したペ
ルオキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）との関係で
示すグラフである。
ロブリン抗体を測定した結果を、健常者血清によるバセ
ドー病患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に結合したペ
ルオキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）との関係で
示すグラフである。
抗サイログロブリン抗体の測定において本発明の方法
である実施例4,5,6は従来の方法である比較例−４に比
べて高感度であつた。
である実施例4,5,6は従来の方法である比較例−４に比
べて高感度であつた。
実施例−７ IgGの調製、アフイニテイー精製ウサギ（抗ジニトロ
フエニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化固相、アフ
イニテイー精製ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化固相
の調製は実施例−２の方法に従つた。ペルオキシダーゼ
活性の測定は実施例−２の方法に準じて行い、50mM硫酸
に溶解した0.2mg/のキニーネを標準とした。IgGのア
フイニテイー精製、ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG−セフ
アローズ4Bの調製は実施例−３の方法に従つた。サイロ
グロブリンの精製、ジニトロフエニル−サイログロブリ
ンの調製は実施例−４の方法に従つた。
フエニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化固相、アフ
イニテイー精製ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化固相
の調製は実施例−２の方法に従つた。ペルオキシダーゼ
活性の測定は実施例−２の方法に準じて行い、50mM硫酸
に溶解した0.2mg/のキニーネを標準とした。IgGのア
フイニテイー精製、ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG−セフ
アローズ4Bの調製は実施例−３の方法に従つた。サイロ
グロブリンの精製、ジニトロフエニル−サイログロブリ
ンの調製は実施例−４の方法に従つた。
サイログロブリン−ペルオキシダーゼの調製 1. メルカプトサクシニル−サイログロブリンの調製 精製サイログロブリンにＳ−アセチルメルカプトサク
シニツク・アンハイドライドを用いる公知の方法〔石川
ら、ジヤーナル・オブ・イムノアツセイ（前出）〕によ
りチオール基を導入した。サイログロブリン１分子当り
導入されたチオール基の数は3.8個であつた。
シニツク・アンハイドライドを用いる公知の方法〔石川
ら、ジヤーナル・オブ・イムノアツセイ（前出）〕によ
りチオール基を導入した。サイログロブリン１分子当り
導入されたチオール基の数は3.8個であつた。
2. マレイミド−ペルオキシダーゼの調製 Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエート
を用いる公知の方法〔橋田ら、ジヤーナル・オブ・アプ
ライド・バイオケミストリー（前出）〕により、西洋ワ
サビ・ペルオキシダーゼにマレイミド基を導入した。導
入されたマレイミド基の数はペルオキシダーゼ１分子当
り1.3個であつた。
を用いる公知の方法〔橋田ら、ジヤーナル・オブ・アプ
ライド・バイオケミストリー（前出）〕により、西洋ワ
サビ・ペルオキシダーゼにマレイミド基を導入した。導
入されたマレイミド基の数はペルオキシダーゼ１分子当
り1.3個であつた。
3. サイログロブリン・ペルオキシダーゼの調製 メルカプトサクシニル−サイロブロブリン0.31mgを溶
解した5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 6.0、0.07mlとマレイミド−ペルオキシダーゼ93μｇ
溶解した5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH 6.0、0.005mlとを４℃にて20時間反応させた。
反応液はウルトロゲルAcA22（LKB ストツクホルム、ス
ウエーデン）カラム（1.5×45cm）を用いゲルろ過を行
つた。溶出液は0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.5
を用いた。サイログロブリン１分子当り導入されたペル
オキシダーゼの数は1.7個であつた。
解した5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 6.0、0.07mlとマレイミド−ペルオキシダーゼ93μｇ
溶解した5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH 6.0、0.005mlとを４℃にて20時間反応させた。
反応液はウルトロゲルAcA22（LKB ストツクホルム、ス
ウエーデン）カラム（1.5×45cm）を用いゲルろ過を行
つた。溶出液は0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.5
を用いた。サイログロブリン１分子当り導入されたペル
オキシダーゼの数は1.7個であつた。
ヒト抗サイログロブリンIgGの精製 バセドー病患者の血清をプールし、硫酸ナトリウムによ
る塩析とDEAEセルロースを用い、患者血清中のIgGを精
製した。IgG4mgを0.1％のNaN3を含む0.1Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH 7.0、0.5mlに溶解した。
る塩析とDEAEセルロースを用い、患者血清中のIgGを精
製した。IgG4mgを0.1％のNaN3を含む0.1Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH 7.0、0.5mlに溶解した。
実施例−３に準じ、サイログロブリン−セフアローズ
4B（１×3mm）を用いて、pH 2.5で溶出する公知の方法
〔河野ら、ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー、第
100巻、第1247頁（1986）〕によりアフイニテイー精製
を行い、ヒト抗サイログロブリンIgG5.1μｇを得た。
4B（１×3mm）を用いて、pH 2.5で溶出する公知の方法
〔河野ら、ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー、第
100巻、第1247頁（1986）〕によりアフイニテイー精製
を行い、ヒト抗サイログロブリンIgG5.1μｇを得た。
ヒト抗サイログロブリンIgG抗体の測定 ヒト抗サイログロブリンIgGを健常者の血清で種々の
濃度に希釈した検体0.02ml、ジニトロフエニル−サイロ
グロブリン複合体100fmol、サイログロブリン−ペルオ
キシダーゼ複合体100fmol、0.46M NaCl及び0.1％ウシ
血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 7.0、0.13mlを20℃、３時間反応させた。次にアフイ
ニテイー精製ウサギ（抗ジニトロフエニル−ウシ血清ア
ルブミン）IgG不溶化ポリスチレンボール（２個）と共
に20℃で３時間、４℃で一夜反応させた。反応後、その
ポリスチレンボールを2mlの0.1M NaClを含む0.01Mリン
酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0にて２回洗浄した後、0.1
M NaCl及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン
酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.15mlに溶解したジニ
トロフエニル−Ｌ−リジン150nmolとアフイニテイー精
製ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化ポリスチレンボー
ル２個と共に20℃、１時間反応させた。その後、アフイ
ニテイー精製ウサギ（抗ジニトロフエニル−ウシ血清ア
ルブミン）IgG不溶化ポリスチレンボールを除去し、更
に20℃で２時間反応させたアフイニテイー精製ウサギ
（抗ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化ポリスチレンボールを上述
と同様に洗浄後、ポリスチレンボールに結合したペルオ
キシダーゼ活性を、30℃、150分反応後測定した。測定
結果を第６図に示した。
濃度に希釈した検体0.02ml、ジニトロフエニル−サイロ
グロブリン複合体100fmol、サイログロブリン−ペルオ
キシダーゼ複合体100fmol、0.46M NaCl及び0.1％ウシ
血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、p
H 7.0、0.13mlを20℃、３時間反応させた。次にアフイ
ニテイー精製ウサギ（抗ジニトロフエニル−ウシ血清ア
ルブミン）IgG不溶化ポリスチレンボール（２個）と共
に20℃で３時間、４℃で一夜反応させた。反応後、その
ポリスチレンボールを2mlの0.1M NaClを含む0.01Mリン
酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0にて２回洗浄した後、0.1
M NaCl及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン
酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.15mlに溶解したジニ
トロフエニル−Ｌ−リジン150nmolとアフイニテイー精
製ウサギ（抗ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化ポリスチレンボー
ル２個と共に20℃、１時間反応させた。その後、アフイ
ニテイー精製ウサギ（抗ジニトロフエニル−ウシ血清ア
ルブミン）IgG不溶化ポリスチレンボールを除去し、更
に20℃で２時間反応させたアフイニテイー精製ウサギ
（抗ヒトIgGγ鎖）IgG不溶化ポリスチレンボールを上述
と同様に洗浄後、ポリスチレンボールに結合したペルオ
キシダーゼ活性を、30℃、150分反応後測定した。測定
結果を第６図に示した。
比較例−５ 既知量のヒト抗サイログロブリンIgGを健常者の血清
で、種々の濃度に希釈した検体を用いて、比較例４−と
同様にして、検体中のヒト抗サイログロブリンIgG抗体
を測定した。結果を第６図に示した。
で、種々の濃度に希釈した検体を用いて、比較例４−と
同様にして、検体中のヒト抗サイログロブリンIgG抗体
を測定した。結果を第６図に示した。
すなわち第６図は本発明方法及び従来方によるヒト抗
サイログロブリンIgG抗体濃度（mg/、横軸）と固相に
結合したペルオキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）
との関係を示すグラフである。
サイログロブリンIgG抗体濃度（mg/、横軸）と固相に
結合したペルオキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）
との関係を示すグラフである。
実施例−８ ペルオキシダーゼ活性の測定、IgG不溶化固相の調製
及びウサギ（抗サイログロブリン）Fab′−ペルオキシ
ダーゼの調製は実施例−２の方法に従つた。IgGのアフ
イニテイー精製は実施例−３の方法に従つた。サイログ
ロブリンの精製、ジニトロフエニル−サイログロブリン
の調製は実施例−４の方法に従つた。
及びウサギ（抗サイログロブリン）Fab′−ペルオキシ
ダーゼの調製は実施例−２の方法に従つた。IgGのアフ
イニテイー精製は実施例−３の方法に従つた。サイログ
ロブリンの精製、ジニトロフエニル−サイログロブリン
の調製は実施例−４の方法に従つた。
抗サイログロブリン抗体の測定 抗サイログロブリン抗体を含む血清を健常者の血清で
種々の倍率に希釈した検体（0.02ml）、ジニトロフエニ
ル−サイログロブリン複合体15fmol、0.375％非特異ウ
サギIgG、0.1％ NaN3、0.1M NaCl及び0.1％ウシ血清
アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0（0.08ml）、0.1m NaCl、0.1％ウシ血清アルブミン
及び0.1％ NaN3を含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、
pH 7.0（0.05ml）とアフイニテイー精製ウサギ（抗ジ
ニトロフエニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化ポリ
スチレンボール（２個）と共に20℃で３時間、４℃で一
夜反応させた。このポリスチレンボールは実施例−２の
方法で、非特異ウサギIgGにより前処理したものを用い
た。反応後、ポリスチレンボールを2mlの0.1M NaClを
含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、にて２回
洗浄し、0.1M NaCl、0.1％ NaN3及び0.1％ウシ血清ア
ルブミンに溶解したジニトロフエニル−Ｌ−リジン150n
molと20℃、１時間反応させた。ポリスチレンボール
（２個）を除去し、アフイニテイー精製ウサギ（抗ヒト
IgGγ鎖）IgG不溶化ポリスチレンボールを加え、20℃３
時間反応させた。反応後、ポリスチレンボールを2mの0.
1M NaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0
で２回洗浄し、このポリスチレンボールに0.1M NaCl及
び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH 7.0（0.15ml）に溶解したウサギ（抗サ
イログロブリン）Fab′−ペルオキシダーゼ（50g）を加
え、20℃、３時間反応させた。上記と同様に洗浄後、ポ
リスチレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を、
30℃、10分間の反応により測定した。105倍希釈まで測
定可能であつた。
種々の倍率に希釈した検体（0.02ml）、ジニトロフエニ
ル−サイログロブリン複合体15fmol、0.375％非特異ウ
サギIgG、0.1％ NaN3、0.1M NaCl及び0.1％ウシ血清
アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0（0.08ml）、0.1m NaCl、0.1％ウシ血清アルブミン
及び0.1％ NaN3を含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、
pH 7.0（0.05ml）とアフイニテイー精製ウサギ（抗ジ
ニトロフエニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化ポリ
スチレンボール（２個）と共に20℃で３時間、４℃で一
夜反応させた。このポリスチレンボールは実施例−２の
方法で、非特異ウサギIgGにより前処理したものを用い
た。反応後、ポリスチレンボールを2mlの0.1M NaClを
含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、にて２回
洗浄し、0.1M NaCl、0.1％ NaN3及び0.1％ウシ血清ア
ルブミンに溶解したジニトロフエニル−Ｌ−リジン150n
molと20℃、１時間反応させた。ポリスチレンボール
（２個）を除去し、アフイニテイー精製ウサギ（抗ヒト
IgGγ鎖）IgG不溶化ポリスチレンボールを加え、20℃３
時間反応させた。反応後、ポリスチレンボールを2mの0.
1M NaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0
で２回洗浄し、このポリスチレンボールに0.1M NaCl及
び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH 7.0（0.15ml）に溶解したウサギ（抗サ
イログロブリン）Fab′−ペルオキシダーゼ（50g）を加
え、20℃、３時間反応させた。上記と同様に洗浄後、ポ
リスチレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を、
30℃、10分間の反応により測定した。105倍希釈まで測
定可能であつた。
以上説明したように、本発明方法はどのようなハプテ
ン、抗原に対する抗体をも超高感度で、しかもイムノグ
ロブリンのクラスを区別して測定できるので、Ｂ型肝
炎、ATL、AIDSなどの感染症における抗体、自己免疫疾
患における自己抗体、アレルギー疾患の原因となる抗体
などの測定を通じて各種疾患の診断に貢献するものであ
る。
ン、抗原に対する抗体をも超高感度で、しかもイムノグ
ロブリンのクラスを区別して測定できるので、Ｂ型肝
炎、ATL、AIDSなどの感染症における抗体、自己免疫疾
患における自己抗体、アレルギー疾患の原因となる抗体
などの測定を通じて各種疾患の診断に貢献するものであ
る。
第１図〜第３図は、本発明方法及び従来法でインスリン
抗体を測定した結果を示すグラフ、第４図及び第５図
は、本発明方法及び従来法で抗サイログロブリン抗体を
測定した結果を示すグラフ、第６図はヒト抗サイログロ
ブリンIgG抗体を測定した結果を示すグラフである。
抗体を測定した結果を示すグラフ、第４図及び第５図
は、本発明方法及び従来法で抗サイログロブリン抗体を
測定した結果を示すグラフ、第６図はヒト抗サイログロ
ブリンIgG抗体を測定した結果を示すグラフである。
Claims (4)
- 【請求項１】下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）
工程を包含することを特徴とする特異的抗体の測定法。 工程（Ａ）：次の（ａ）又は（ｂ）工程。 （ａ）被検液の測定すべき特異的抗体と、１種又は２種
以上の官能基が結合した活性成分とから構成される複合
体を形成させた後、この複合体を担体に結合させる工
程。ここで、 （１） 少なくとも一つの活性成分には１種又は２種以
上の官能基が結合しており、活性成分は測定すべき特異
的抗体と結合することができ、活性成分に結合した官能
基は担体に結合した反応基と結合することができ、 （２） 担体には反応基が結合しており、この反応基は
活性成分に結合した官能基と結合することができる。 （ｂ）当該複合体を担体上で形成させる工程。 工程（Ｂ）：複合体が結合した担体を洗浄した後、担体
から前記複合体を解離させる工程。 工程（Ｃ）：この複合体を他の担体に結合させた後、こ
の担体を洗浄する工程。ここで、該担体は該複合体に結
合することができる反応基を有し、該反応基は工程
（Ａ）における反応基と異なる。 工程（Ｄ）：（Ｃ）に記載の担体上の複合体を測定する
工程。 - 【請求項２】少なくとも一つの活性成分が標識されてい
ることを特徴とする請求項１記載の測定法。 - 【請求項３】工程（Ｂ）が、複合体を結合した担体を洗
浄した後、工程（Ａ）における官能基と同一の反応部位
を有する物質を加えることにより、担体から前記複合体
を解離させる工程であることを特徴とする請求項１又は
２に記載の測定法。 - 【請求項４】工程（Ｂ）における複合体を解離させる工
程と、工程（Ｃ）における複合体を担体に結合させる工
程が、同時に行われることを特徴とする請求項１〜３の
いずれか１項に記載の測定法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-199149 | 1987-08-11 | ||
| JP19914987 | 1987-08-11 | ||
| JP63-82349 | 1988-04-05 | ||
| JP8234988 | 1988-04-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0228558A JPH0228558A (ja) | 1990-01-30 |
| JP2657672B2 true JP2657672B2 (ja) | 1997-09-24 |
Family
ID=26423385
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63197188A Expired - Fee Related JP2657672B2 (ja) | 1987-08-11 | 1988-08-09 | 超高感度特異的抗体の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2657672B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE920778A1 (en) * | 1991-03-12 | 1992-09-23 | Du Pont | Method for specific binding assays using a releasable ligand |
| WO2002044726A1 (fr) * | 2000-12-01 | 2002-06-06 | International Reagents Corporation | Procede de mesure ultrarapide et ultrasensible |
| JP2009085685A (ja) * | 2007-09-28 | 2009-04-23 | Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk | インスリン受容体αサブユニットの測定試薬 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE77700T1 (de) * | 1986-03-10 | 1992-07-15 | Imre Corp | Immunkomplextestverfahren. |
-
1988
- 1988-08-09 JP JP63197188A patent/JP2657672B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0228558A (ja) | 1990-01-30 |
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