JP3162438B2 - 高感度特異的抗体測定法 - Google Patents
高感度特異的抗体測定法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は抗原特異抗体の高感度測
定法に関する。
定法に関する。
【従来の技術】特異的抗体定量のためのサンドイッチイ
ムノアッセイとして従来より、抗原と抗抗体を担体と標
識に結合させる方法があった。しかし、これらの方法は
抗抗体の特異性が低いために感度を上げにくい欠点を有
していた。これを改善するため、近年、抗原で特異抗体
をはさむ方法が開発されている。即ち、標識化抗原とハ
プテン結合抗原と被検液中の特異抗体の三種で液相中、
複合体を形成させた後、これを抗ハプテン抗体で担体上
にトラップして測定する方法が報告されている〔石川
ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリィ・ア
ナリシス ( J. Clin. Lab. Anal.) 、第３巻、第２５２
頁、（１９８９）〕。
ムノアッセイとして従来より、抗原と抗抗体を担体と標
識に結合させる方法があった。しかし、これらの方法は
抗抗体の特異性が低いために感度を上げにくい欠点を有
していた。これを改善するため、近年、抗原で特異抗体
をはさむ方法が開発されている。即ち、標識化抗原とハ
プテン結合抗原と被検液中の特異抗体の三種で液相中、
複合体を形成させた後、これを抗ハプテン抗体で担体上
にトラップして測定する方法が報告されている〔石川
ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリィ・ア
ナリシス ( J. Clin. Lab. Anal.) 、第３巻、第２５２
頁、（１９８９）〕。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】上記の技術により、飛
躍的に高感度化がなされたが、標識化抗原（Ｘ）と担体
結合にかかわる抗原（Ｙ）を同時に被検液に添加するた
め測定条件設定が難しく、特に抗体大過剰の状態では抗
原（Ｘ）−抗体−抗原（Ｙ）という複合体の形成が阻害
されて、かえって測定値が低くなるいわゆるプロゾーン
現象が起こる欠点があった。本発明の目的は、より簡便
な高感度アッセイ法を確立すると共に、プロゾーン現象
を解消する改良法を提供することにある。
躍的に高感度化がなされたが、標識化抗原（Ｘ）と担体
結合にかかわる抗原（Ｙ）を同時に被検液に添加するた
め測定条件設定が難しく、特に抗体大過剰の状態では抗
原（Ｘ）−抗体−抗原（Ｙ）という複合体の形成が阻害
されて、かえって測定値が低くなるいわゆるプロゾーン
現象が起こる欠点があった。本発明の目的は、より簡便
な高感度アッセイ法を確立すると共に、プロゾーン現象
を解消する改良法を提供することにある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】発明者は、特定比率の標
識化抗原（Ｘ）と担体結合抗原（Ｙ）を同時に被検液に
添加することによって、石川らの方法よりさらに簡便な
方法で同程度高感度にアッセイができること、ならび
に、担体洗浄後に再度標識化抗原を系に添加することに
より、プロゾーン現象を解消できることを見い出し、本
発明を完成した。
識化抗原（Ｘ）と担体結合抗原（Ｙ）を同時に被検液に
添加することによって、石川らの方法よりさらに簡便な
方法で同程度高感度にアッセイができること、ならび
に、担体洗浄後に再度標識化抗原を系に添加することに
より、プロゾーン現象を解消できることを見い出し、本
発明を完成した。
【０００４】即ち、本発明は、下記の（Ａ）、（Ｂ）お
よび（Ｃ）工程を含む特異的抗体の測定法である。 （Ａ）：予め標識化した抗原（標識化抗原）および予め
担体に結合させた抗原（担体結合抗原）を同時に被検液
に加え、標識化抗原−測定すべき特異的抗体−担体結合
抗原なる複合体を形成させる工程。 （Ｂ）：工程（Ａ）で形成された複合体を被検液から分
離してから、当該複合体に標識化抗原を含む反応液を添
加する工程。（Ｃ）：工程（Ｂ）で形成された複合体を反応液から分
離し、洗浄してから複合体を測定する工程。
よび（Ｃ）工程を含む特異的抗体の測定法である。 （Ａ）：予め標識化した抗原（標識化抗原）および予め
担体に結合させた抗原（担体結合抗原）を同時に被検液
に加え、標識化抗原−測定すべき特異的抗体−担体結合
抗原なる複合体を形成させる工程。 （Ｂ）：工程（Ａ）で形成された複合体を被検液から分
離してから、当該複合体に標識化抗原を含む反応液を添
加する工程。（Ｃ）：工程（Ｂ）で形成された複合体を反応液から分
離し、洗浄してから複合体を測定する工程。
【０００５】以下、本発明について工程順に説明する。工程（Ａ）について 被検液としては、例えば、血清、血漿、髄液、唾液、尿
等の体液、緩衝液が挙げられる。測定すべき特異的抗体
としては、実質上、従来の免疫学的測定法で測定し得た
全ての抗体が挙げられる。例を挙げれば、抗核抗体、抗
ＤＮＡ抗体抗ＥＮＡ抗体、リウマトイド因子、抗赤血球
抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗筋抗体、抗甲状腺抗体
（抗ミクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、抗Ｔ
ＳＨレセプター抗体）、抗インスリン抗体、抗インスリ
ンレセプター抗体、抗アセチルコリンレセプター抗体等
の自己抗体やウィルス、微生物に対する抗体、インター
フェロンやヒト成長ホルモン等の蛋白製剤に対する抗
体、アレルギー疾患におけるアレルゲン抗体等である。
これら抗体は被検液中で遊離した状態のみではなく免疫
複合体、結合蛋白と結合した状態でも測定可能である。
等の体液、緩衝液が挙げられる。測定すべき特異的抗体
としては、実質上、従来の免疫学的測定法で測定し得た
全ての抗体が挙げられる。例を挙げれば、抗核抗体、抗
ＤＮＡ抗体抗ＥＮＡ抗体、リウマトイド因子、抗赤血球
抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗筋抗体、抗甲状腺抗体
（抗ミクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、抗Ｔ
ＳＨレセプター抗体）、抗インスリン抗体、抗インスリ
ンレセプター抗体、抗アセチルコリンレセプター抗体等
の自己抗体やウィルス、微生物に対する抗体、インター
フェロンやヒト成長ホルモン等の蛋白製剤に対する抗
体、アレルギー疾患におけるアレルゲン抗体等である。
これら抗体は被検液中で遊離した状態のみではなく免疫
複合体、結合蛋白と結合した状態でも測定可能である。
【０００６】本発明で言う抗原とは、測定すべき抗体と
抗原抗体反応を生じうる特異抗原、イディオタイプ抗体
のような成分をいう。
抗原抗体反応を生じうる特異抗原、イディオタイプ抗体
のような成分をいう。
【０００７】標識を結合した抗原における標識として
は、免疫学的測定において測定に利用されるいずれの物
質でも良く、酵素、放射性物質、発光物質、蛍光物質、
金属化合物等が挙げられる。例えば、酵素ではペルオキ
シダーゼ、β―Ｄ―ガラクトシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、放射性物質としてはヨウ素、水素、蛍光物質
としては、フルオレセインイソチオシアネート、発光物
質としては、アクリジウム塩、金属化合物としては、ユ
ーロピウム（Ｅｕ３＋）等が挙げられる。これらの標識
は、（Ａ）から（Ｃ）の工程に影響を及ぼさないキャリ
アーを介在させて抗原に結合させてもよい。抗原が低分
子の場合には、特にこの様な介在が好ましい。キャリア
ーとしては、例えば非特異ウサギＩｇＧ、ウシ血清アル
ブミン、デキストラン等が挙げられる。標識を結合させ
る方法としては、従来免疫学的測定法において、抗体、
抗原に標識を結合させるために用いられるいずれの方法
でもよい。
は、免疫学的測定において測定に利用されるいずれの物
質でも良く、酵素、放射性物質、発光物質、蛍光物質、
金属化合物等が挙げられる。例えば、酵素ではペルオキ
シダーゼ、β―Ｄ―ガラクトシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、放射性物質としてはヨウ素、水素、蛍光物質
としては、フルオレセインイソチオシアネート、発光物
質としては、アクリジウム塩、金属化合物としては、ユ
ーロピウム（Ｅｕ３＋）等が挙げられる。これらの標識
は、（Ａ）から（Ｃ）の工程に影響を及ぼさないキャリ
アーを介在させて抗原に結合させてもよい。抗原が低分
子の場合には、特にこの様な介在が好ましい。キャリア
ーとしては、例えば非特異ウサギＩｇＧ、ウシ血清アル
ブミン、デキストラン等が挙げられる。標識を結合させ
る方法としては、従来免疫学的測定法において、抗体、
抗原に標識を結合させるために用いられるいずれの方法
でもよい。
【０００８】担体は、本発明の目的をそこなわない限
り、特に制限はなく、従来の免疫学的測定法において使
用されているものを使用すれば十分である。例えば、ポ
リスチレン、ポリアクリル、テフロン、紙、ガラス、ア
ガロース等が挙げられる。また、その形状にも特に制限
はない。担体への抗原の結合は、免疫学的測定における
担体作成の公知の方法で行われる。抗原が低分子の場
合、これらの結合は（Ａ）から（Ｃ）の工程に影響を及
ぼさないキャリアーを介在させて担体に結合させる。キ
ャリアーとしては、非特異ウサギＩｇＧ、ウシ血清アル
ブミン、デキストラン、あるいはハプテンと抗体、ビオ
チンとアビジンなどが挙げられる。
り、特に制限はなく、従来の免疫学的測定法において使
用されているものを使用すれば十分である。例えば、ポ
リスチレン、ポリアクリル、テフロン、紙、ガラス、ア
ガロース等が挙げられる。また、その形状にも特に制限
はない。担体への抗原の結合は、免疫学的測定における
担体作成の公知の方法で行われる。抗原が低分子の場
合、これらの結合は（Ａ）から（Ｃ）の工程に影響を及
ぼさないキャリアーを介在させて担体に結合させる。キ
ャリアーとしては、非特異ウサギＩｇＧ、ウシ血清アル
ブミン、デキストラン、あるいはハプテンと抗体、ビオ
チンとアビジンなどが挙げられる。
【０００９】工程（Ａ）における被検液中の特異抗体と
標識化抗原と担体に結合した抗原とからなる複合体の担
体上での形成は、通常の抗原抗体反応に用いられる条件
下に行われる。一般には、０〜４５ OＣ、数時間〜数１
０時間、好ましくは２０〜３７ OＣ、１〜６時間で複合
体が形成される。
標識化抗原と担体に結合した抗原とからなる複合体の担
体上での形成は、通常の抗原抗体反応に用いられる条件
下に行われる。一般には、０〜４５ OＣ、数時間〜数１
０時間、好ましくは２０〜３７ OＣ、１〜６時間で複合
体が形成される。
【００１０】系に加える標識化抗原の量は、被検液中の
抗体との反応速度が、抗体と担体に結合した抗原との反
応速度とほぼ等しくなるような条件に設定する。通常の
免疫学的測定の場合では、標識化抗原の量は、担体に結
合した抗原の量に対して分子モル比で１／１００〜１／
２０となる。
抗体との反応速度が、抗体と担体に結合した抗原との反
応速度とほぼ等しくなるような条件に設定する。通常の
免疫学的測定の場合では、標識化抗原の量は、担体に結
合した抗原の量に対して分子モル比で１／１００〜１／
２０となる。
【００１１】被検液と担体を分離する方法としては、従
来担体を用いた免疫学的測定法で用いられるいずれの方
法でも良い。さらに、複合体に標識化抗原を含む反応液
を添加する前に、担体を洗浄するのが好ましい。洗浄は
サンドイッチ法で通常用いられる条件で行えばよい。洗
浄液を加えた後、数分間インキュベートした後、洗浄液
を除去するのが好ましい。
来担体を用いた免疫学的測定法で用いられるいずれの方
法でも良い。さらに、複合体に標識化抗原を含む反応液
を添加する前に、担体を洗浄するのが好ましい。洗浄は
サンドイッチ法で通常用いられる条件で行えばよい。洗
浄液を加えた後、数分間インキュベートした後、洗浄液
を除去するのが好ましい。
【００１２】工程（Ｂ）は、プロゾーン現象を解消する
ために設けられたステップであり、本発明に特徴的な工
程である。
ために設けられたステップであり、本発明に特徴的な工
程である。
【００１３】即ち、工程（Ａ）、（Ｃ）のみでは、次の
ような現象が生じうる。被検液中の抗体量が担体に結合
した抗原量に比し過剰になっているとき、この過剰量の
抗体は、担体に結合できないが標識化抗原を消費する。
その結果、標識化抗原は、担体に結合した抗体量に比し
不足することになり、担体の結合した抗体についての測
定値は実際の値より低めにでることになる（本来、測定
されるべきマキシマムの測定値が得られないことにな
る）。そこで、工程（Ｂ）により被検液中の過剰量の抗
体により消費された標識化抗原を補うことによって担体
に結合した抗体の量を正しく測ることができるのであ
る。
ような現象が生じうる。被検液中の抗体量が担体に結合
した抗原量に比し過剰になっているとき、この過剰量の
抗体は、担体に結合できないが標識化抗原を消費する。
その結果、標識化抗原は、担体に結合した抗体量に比し
不足することになり、担体の結合した抗体についての測
定値は実際の値より低めにでることになる（本来、測定
されるべきマキシマムの測定値が得られないことにな
る）。そこで、工程（Ｂ）により被検液中の過剰量の抗
体により消費された標識化抗原を補うことによって担体
に結合した抗体の量を正しく測ることができるのであ
る。
【００１４】工程（Ｃ）における、反応液と複合体とを
分離する方法としては、従来担体を用いた免疫学的測定
法で用いられるいずれの方法でもよい。担体に結合した
複合体を測る工程に移る前に担体を洗浄するのが好まし
い。洗浄は、サンドイッチ法で通常用いられる条件で行
えばよい。
分離する方法としては、従来担体を用いた免疫学的測定
法で用いられるいずれの方法でもよい。担体に結合した
複合体を測る工程に移る前に担体を洗浄するのが好まし
い。洗浄は、サンドイッチ法で通常用いられる条件で行
えばよい。
【００１５】工程（Ｂ）における標識化抗原の量は特に
限定されないが、過剰量の添加は担体への非特異的結合
を増加させ、バックグラウンドを上昇させることによる
感度の低下につながるので、反応を完結させるには十分
なできるだけ少ない量を用いるのが好ましい。通常に
は、工程（Ａ）に用いた量の１０分の１から等量の範囲
である。工程（Ｂ）における標識化抗原と担体上の不完
全な複合体との反応は、通常の抗原抗体反応に用いられ
る条件下に行われる。一般には、０〜４５℃、数十分か
ら数時間、好ましくは２０〜３７℃、３０分から２時間
で複合体が形成される。
限定されないが、過剰量の添加は担体への非特異的結合
を増加させ、バックグラウンドを上昇させることによる
感度の低下につながるので、反応を完結させるには十分
なできるだけ少ない量を用いるのが好ましい。通常に
は、工程（Ａ）に用いた量の１０分の１から等量の範囲
である。工程（Ｂ）における標識化抗原と担体上の不完
全な複合体との反応は、通常の抗原抗体反応に用いられ
る条件下に行われる。一般には、０〜４５℃、数十分か
ら数時間、好ましくは２０〜３７℃、３０分から２時間
で複合体が形成される。
【００１６】以下、本発明を実施例で説明するが、本発
明はこれに限られるものではない。
明はこれに限られるものではない。
実施例１ 〔サイログロブリンの精製〕ヒト−サイログロブリン
（ＵＣＢバイオプロダクツ社、ベルギー）１０ｍｇをＤ
Ｅ−５２セルロース（ワットマン社、ケント州、イギリ
ス）カラムを用いる方法〔大滝ら、ジャーナル・オブ・
クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボライ
ト（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａ
ｂ．）第５２巻、第２３９頁（１９８１）〕にて精製し
た。更に上述の精製サイログロブリン７．０ｍｇをウサ
ギ（抗ヒトＩｇＧγ鎖）ＩｇＧ不溶化セファロース４Ｂ
カラム（１．０×４．５ｃｍ）を用いて、０．１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で溶出した。次いでウ
ルトロゲルＡｃＡ２２（ＬＫＢ、ストックホルム、スウ
ェーデン）（１．６×４５ｃｍ）を用い、同緩衝液でゲ
ル濾過を行った。精製の純度は、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で確認した。サイログロブリンの濃
度は、２８０ｎｍの吸光度から吸光係数１．０ｌ／ｇ・
ｃｍとして求めた。
（ＵＣＢバイオプロダクツ社、ベルギー）１０ｍｇをＤ
Ｅ−５２セルロース（ワットマン社、ケント州、イギリ
ス）カラムを用いる方法〔大滝ら、ジャーナル・オブ・
クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボライ
ト（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａ
ｂ．）第５２巻、第２３９頁（１９８１）〕にて精製し
た。更に上述の精製サイログロブリン７．０ｍｇをウサ
ギ（抗ヒトＩｇＧγ鎖）ＩｇＧ不溶化セファロース４Ｂ
カラム（１．０×４．５ｃｍ）を用いて、０．１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で溶出した。次いでウ
ルトロゲルＡｃＡ２２（ＬＫＢ、ストックホルム、スウ
ェーデン）（１．６×４５ｃｍ）を用い、同緩衝液でゲ
ル濾過を行った。精製の純度は、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で確認した。サイログロブリンの濃
度は、２８０ｎｍの吸光度から吸光係数１．０ｌ／ｇ・
ｃｍとして求めた。
【００１７】〔サイログロブリン−ペルオキシダーゼの
調製〕 １．メルカプトサクシニル−サイログロブリンの調製 精製サイログロブリンにＳ−アセチルメルカプトサクシ
ニック・アンハイドライドを用いる公知の方法〔石川
ら、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏａｓｓａｙ）、第４巻、第２０９頁（１９８３）〕
によりチオール基を導入した。サイログロブリン１分子
あたり導入されたチオール基の数は３．８個であった。 ２．マレイミド−ペルオキシダーゼの調製 Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエートを
用いる公知の方法〔橋田ら、ジャーナル・オブ・アプラ
イド・バイオケミストリー（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．）、第６巻、第５６頁（１９８４）〕により、西
洋ワサビ・ペルオキシダーゼにマレイミド基を導入し
た。導入されたマレイミド基の数は、ペルオキシダーゼ
１分子あたり１．３個であった。 ３．サイログロブリン−ペルオキシダーゼの調製 メルカプトサクシニル−サイログロブリン３１０μｇを
溶解した５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ６．０、７０μｌとマレイミド−ペル
オキシダーゼ９３μｇを溶解した５ｍＭ ＥＤＴＡを含
む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、５μ
ｌとを４°Ｃにて２０時間反応させた。反応液はウルト
ロゲルＡｃＡ２２カラム（１．６×４５ｃｍ）を用い、
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５によりゲ
ル濾過を行った。サイログロブリン１分子あたり導入さ
れたペルオキシダーゼの数は１．７個であった。
調製〕 １．メルカプトサクシニル−サイログロブリンの調製 精製サイログロブリンにＳ−アセチルメルカプトサクシ
ニック・アンハイドライドを用いる公知の方法〔石川
ら、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏａｓｓａｙ）、第４巻、第２０９頁（１９８３）〕
によりチオール基を導入した。サイログロブリン１分子
あたり導入されたチオール基の数は３．８個であった。 ２．マレイミド−ペルオキシダーゼの調製 Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエートを
用いる公知の方法〔橋田ら、ジャーナル・オブ・アプラ
イド・バイオケミストリー（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．）、第６巻、第５６頁（１９８４）〕により、西
洋ワサビ・ペルオキシダーゼにマレイミド基を導入し
た。導入されたマレイミド基の数は、ペルオキシダーゼ
１分子あたり１．３個であった。 ３．サイログロブリン−ペルオキシダーゼの調製 メルカプトサクシニル−サイログロブリン３１０μｇを
溶解した５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ６．０、７０μｌとマレイミド−ペル
オキシダーゼ９３μｇを溶解した５ｍＭ ＥＤＴＡを含
む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、５μ
ｌとを４°Ｃにて２０時間反応させた。反応液はウルト
ロゲルＡｃＡ２２カラム（１．６×４５ｃｍ）を用い、
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５によりゲ
ル濾過を行った。サイログロブリン１分子あたり導入さ
れたペルオキシダーゼの数は１．７個であった。
【００１８】〔サイログロブリン−β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼの調製〕 １．マレイミド−サイログロブリンの調製 ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０（２．０
ｍｌ）に溶解した精製サイログロブリン（１．０８ｍ
ｇ）にジメチルホルムアミドに溶解した０．５５ｍＭの
Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミド−ヘキサノエート
（０．２ｍｌ）を加え、３０°Ｃにて３０分間反応させ
た。反応後、５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ６．０で平衡化したセファデック
スＧ−２５カラム（１×３０ｃｍ）を用いてゲル濾過を
行い、マレイミド化サイログロブリンを得た。サイログ
ロブリンに導入されたマレイミド基は１分子あたり４個
であった。 ２．サイログロブリン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼの調
製 ５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ６．０（５０μｌ）に溶解したマレイミド化サ
イログロブリン（０．５５ｍｇ）に同緩衝液（８５μ
ｌ）に溶解したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（０．４５ｍ
ｇ）を加え、４°Ｃ、２時間反応させた。反応液は、
０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミ
ン、０．１ｍＭのＭｇＣｌ2 および０．１％ＮａＮ3 を
含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で
平衡化したウルトロゲルＡｃＡ２２カラム（１．６×７
０ｃｍ）を用いてゲル濾過を行い、サイログロブリン−
β−Ｄ−ガラクトシダーゼを得た。導入されたβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼはサイログロブリン１分子あたり１個
であった。
ダーゼの調製〕 １．マレイミド−サイログロブリンの調製 ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０（２．０
ｍｌ）に溶解した精製サイログロブリン（１．０８ｍ
ｇ）にジメチルホルムアミドに溶解した０．５５ｍＭの
Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミド−ヘキサノエート
（０．２ｍｌ）を加え、３０°Ｃにて３０分間反応させ
た。反応後、５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ６．０で平衡化したセファデック
スＧ−２５カラム（１×３０ｃｍ）を用いてゲル濾過を
行い、マレイミド化サイログロブリンを得た。サイログ
ロブリンに導入されたマレイミド基は１分子あたり４個
であった。 ２．サイログロブリン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼの調
製 ５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ６．０（５０μｌ）に溶解したマレイミド化サ
イログロブリン（０．５５ｍｇ）に同緩衝液（８５μ
ｌ）に溶解したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（０．４５ｍ
ｇ）を加え、４°Ｃ、２時間反応させた。反応液は、
０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミ
ン、０．１ｍＭのＭｇＣｌ2 および０．１％ＮａＮ3 を
含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で
平衡化したウルトロゲルＡｃＡ２２カラム（１．６×７
０ｃｍ）を用いてゲル濾過を行い、サイログロブリン−
β−Ｄ−ガラクトシダーゼを得た。導入されたβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼはサイログロブリン１分子あたり１個
であった。
【００１９】〔サイログロブリン不溶化固相の調製〕精
製サイログロブリン溶液（０．０１ｇ／ｌ）を用いてマ
イクロプレート〔３３ｍｍ2 ×１１．３ｍｍ、マキシソ
ープＦ８（ヌンク社、デンマーク）〕の各ウェル表面上
に公知の方法で〔石川ら、スカンジナビヤン・ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．）、第８巻（補７）、第４３頁（１９７８）〕物
理的吸着により不溶化した。
製サイログロブリン溶液（０．０１ｇ／ｌ）を用いてマ
イクロプレート〔３３ｍｍ2 ×１１．３ｍｍ、マキシソ
ープＦ８（ヌンク社、デンマーク）〕の各ウェル表面上
に公知の方法で〔石川ら、スカンジナビヤン・ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．）、第８巻（補７）、第４３頁（１９７８）〕物
理的吸着により不溶化した。
【００２０】〔ペルオキシダーゼ活性の測定〕各ウェル
に基質溶液（０．０１７％過酸化水素、０．６ｍｇ／ｍ
ｌ オルトフェニレンジアミンを含む０．０５Ｍリン酸
・クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．８）を１５０μ
ｌ加え、室温で３０分静置した後、５０μｌの２Ｎ硫酸
で反応を停止した。各ウェル中の反応液の４９２ｎｍの
吸光度を測定することによって結合したペルオキシダー
ゼの活性を求めた。
に基質溶液（０．０１７％過酸化水素、０．６ｍｇ／ｍ
ｌ オルトフェニレンジアミンを含む０．０５Ｍリン酸
・クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．８）を１５０μ
ｌ加え、室温で３０分静置した後、５０μｌの２Ｎ硫酸
で反応を停止した。各ウェル中の反応液の４９２ｎｍの
吸光度を測定することによって結合したペルオキシダー
ゼの活性を求めた。
【００２１】〔β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の測定〕
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性は、４−メチルウンベリ
フェリルβ−Ｄ−ガラクトシドを基質として、室温、３
０分間の反応で測定した〔今川ら、アナルス・クリニカ
ル・バイオケミストリー（Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．）、第２１巻、第３１０頁（１９８４）〕。蛍
光光度は、１０-8Ｍの４−メチルウンベリフェロンを溶
解した０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．
３を標準として測定した。
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性は、４−メチルウンベリ
フェリルβ−Ｄ−ガラクトシドを基質として、室温、３
０分間の反応で測定した〔今川ら、アナルス・クリニカ
ル・バイオケミストリー（Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．）、第２１巻、第３１０頁（１９８４）〕。蛍
光光度は、１０-8Ｍの４−メチルウンベリフェロンを溶
解した０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．
３を標準として測定した。
【００２２】〔ヒト抗サイログロブリン抗体の測定〕予
め抗サイログロブリン抗体濃度を定量したバセドー病患
者の血清を健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体
０．０５ｍｌと、サイログロブリン−ペルオキシダーゼ
（あるいはサイログロブリン−β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ）１００ｆｍｏｌ、０．５５Ｍ塩化ナトリウム、０．
１％ウシ血清アルブミンおよび１．５％Ｔｗｅｅｎ２０
を含む、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．
０、０．１ｍｌとをサイログロブリン不溶化プレートの
各ウェル内に添加し室温で３時間静置して反応させた。
各ウェルを０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．３ｍｌで３回
洗浄した後、固相に結合したペルオキシダーゼ（あるい
はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）活性を測定した。結果を
図１及び図２に示す。
め抗サイログロブリン抗体濃度を定量したバセドー病患
者の血清を健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体
０．０５ｍｌと、サイログロブリン−ペルオキシダーゼ
（あるいはサイログロブリン−β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ）１００ｆｍｏｌ、０．５５Ｍ塩化ナトリウム、０．
１％ウシ血清アルブミンおよび１．５％Ｔｗｅｅｎ２０
を含む、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．
０、０．１ｍｌとをサイログロブリン不溶化プレートの
各ウェル内に添加し室温で３時間静置して反応させた。
各ウェルを０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．３ｍｌで３回
洗浄した後、固相に結合したペルオキシダーゼ（あるい
はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）活性を測定した。結果を
図１及び図２に示す。
【００２３】実施例２ サイログロブリンの精製、サイログロブリン−ペルオキ
シダーゼの調製、サイログロブリン−β−Ｄ−ガラクト
シダーゼの調製、ペルオキシダーゼ活性の測定β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ活性の測定は、実施例１の方法に従っ
た。
シダーゼの調製、サイログロブリン−β−Ｄ−ガラクト
シダーゼの調製、ペルオキシダーゼ活性の測定β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ活性の測定は、実施例１の方法に従っ
た。
【００２４】〔ジニトロフェニル−サイログロブリン結
合ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン）
ＩｇＧ不溶化固相の調製〕 １．ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミ
ン）ＩｇＧ不溶化固相の調製 ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン）抗
血清（生化学工業、東京）４．２３ｇに０．７４７ｇの
硫酸ナトリウムを少しずつ加え、室温、３０分間攪拌し
た後、１０，０００×ｇで１５分間遠心した。沈澱を
４．０ｍｌの０．０１７５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ６．３、に溶解し、同緩衝液で透析した後、ＤＥ−
５２セルロース（ワットマン、ケント州、イギリス）カ
ラム（１．６×８．０ｃｍ）を用いて、塩化ナトリウム
の直線濃度勾配による陰イオン交換クロマトグラフィー
を行った。次いで、この溶液を用いてマイクロプレート
〔３３ｍｍ2 ×１１．３ｍｍ、マキシソープＦ８（ヌン
ク社、デンマーク）〕表面上に公知の方法〔石川ら、ス
カンジナビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（前
出）〕で、物理的吸着により不溶化した。
合ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン）
ＩｇＧ不溶化固相の調製〕 １．ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミ
ン）ＩｇＧ不溶化固相の調製 ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン）抗
血清（生化学工業、東京）４．２３ｇに０．７４７ｇの
硫酸ナトリウムを少しずつ加え、室温、３０分間攪拌し
た後、１０，０００×ｇで１５分間遠心した。沈澱を
４．０ｍｌの０．０１７５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ６．３、に溶解し、同緩衝液で透析した後、ＤＥ−
５２セルロース（ワットマン、ケント州、イギリス）カ
ラム（１．６×８．０ｃｍ）を用いて、塩化ナトリウム
の直線濃度勾配による陰イオン交換クロマトグラフィー
を行った。次いで、この溶液を用いてマイクロプレート
〔３３ｍｍ2 ×１１．３ｍｍ、マキシソープＦ８（ヌン
ク社、デンマーク）〕表面上に公知の方法〔石川ら、ス
カンジナビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（前
出）〕で、物理的吸着により不溶化した。
【００２５】２．ジニトロフェニル−サイログロブリン
の調製 (1) サクシニミジル−２，４−ジニトロフェニル−ε−
カプロン酸の合成 ２，４−ジニトロフェニル−ε−カプロン酸（シグマ
社、ミズーリ州）と、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（和
光純薬工業、大阪）をジクロロカルボジイミド（和光純
薬工業）により縮合される公知の方法〔Ｆ．レビ・シェ
ーファー（Ｆ．ｌｅｖｉ−ｓｃｈａｆｆｅｒ）ら、アメ
リカン・ジャーナル・オブ・トロピカル・メディスン・
アンド・ハイジーン（Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈ
ｙｇ．）、第３２巻、第３４３頁（１９８３）〕により
サクシニミジル−２，４−ジニトロフェニル−ε−カプ
ロン酸を合成した。次いで、シリカゲル（４０ｇ）カラ
ムを用い、クロロホルム／メタノール〔４０／１（Ｖ／
Ｖ）〕の系で精製を行った後ＮＭＲ（核磁気共鳴法）お
よび質量スペクトル法により構造を確認した。 (2) ジニトロフェニル−サイログロブリンの調製 精製サイログロブリン０．５ｍｇを溶解した０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０、０．６ｍｌに、(1)
で調製したサクシニミジル−２，４−ジニトロフェニル
−ε−カプロン酸６６ｎｍｏｌを含むＮ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド６０μｌを加え、３０°Ｃ、３０分反応さ
せた。反応後、セファデックスＧ−２５（ファルマシ
ア、スウェーデン）カラム（１．０×３０ｃｍ）を用
い、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０でゲ
ル濾過を行った。サイログロブリン１分子あたり導入さ
れたジニトロフェニル基の数は、１１個であった。ジニ
トロフェニル基の定量は、３６０ｎｍの吸光度から吸光
係数１７４００／Ｍ・ｃｍとして求めた。
の調製 (1) サクシニミジル−２，４−ジニトロフェニル−ε−
カプロン酸の合成 ２，４−ジニトロフェニル−ε−カプロン酸（シグマ
社、ミズーリ州）と、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（和
光純薬工業、大阪）をジクロロカルボジイミド（和光純
薬工業）により縮合される公知の方法〔Ｆ．レビ・シェ
ーファー（Ｆ．ｌｅｖｉ−ｓｃｈａｆｆｅｒ）ら、アメ
リカン・ジャーナル・オブ・トロピカル・メディスン・
アンド・ハイジーン（Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈ
ｙｇ．）、第３２巻、第３４３頁（１９８３）〕により
サクシニミジル−２，４−ジニトロフェニル−ε−カプ
ロン酸を合成した。次いで、シリカゲル（４０ｇ）カラ
ムを用い、クロロホルム／メタノール〔４０／１（Ｖ／
Ｖ）〕の系で精製を行った後ＮＭＲ（核磁気共鳴法）お
よび質量スペクトル法により構造を確認した。 (2) ジニトロフェニル−サイログロブリンの調製 精製サイログロブリン０．５ｍｇを溶解した０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０、０．６ｍｌに、(1)
で調製したサクシニミジル−２，４−ジニトロフェニル
−ε−カプロン酸６６ｎｍｏｌを含むＮ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド６０μｌを加え、３０°Ｃ、３０分反応さ
せた。反応後、セファデックスＧ−２５（ファルマシ
ア、スウェーデン）カラム（１．０×３０ｃｍ）を用
い、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０でゲ
ル濾過を行った。サイログロブリン１分子あたり導入さ
れたジニトロフェニル基の数は、１１個であった。ジニ
トロフェニル基の定量は、３６０ｎｍの吸光度から吸光
係数１７４００／Ｍ・ｃｍとして求めた。
【００２６】３．ジニトロフェニル−サイログロブリン
結合ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミ
ン）ＩｇＧ不溶化固相の調製 １．で調製したウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清
アルブミン）ＩｇＧ不溶化固相に、２．で調製したジニ
トロフェニル−サイログロブリン５００ｆｍｏｌを溶解
した０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブ
ミンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含む０．０１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．１５ｍｌを
添加し、４°Ｃで１６時間反応させた。反応後、同緩衝
液で洗浄し、０．３ｍｌを添加した状態で保存した。
結合ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミ
ン）ＩｇＧ不溶化固相の調製 １．で調製したウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清
アルブミン）ＩｇＧ不溶化固相に、２．で調製したジニ
トロフェニル−サイログロブリン５００ｆｍｏｌを溶解
した０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブ
ミンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含む０．０１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．１５ｍｌを
添加し、４°Ｃで１６時間反応させた。反応後、同緩衝
液で洗浄し、０．３ｍｌを添加した状態で保存した。
【００２７】〔ヒト抗サイログロブリン抗体の測定〕予
め抗サイログロブリン抗体濃度を定量したバセドー病患
者の血清を、健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体
０．０５ｍｌと、サイログロブリン−ペルオキシダーゼ
（あるいはサイログロブリン−β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ）１００ｆｍｏｌ、０．５５Ｍ塩化ナトリウム、０．
１％ウシ血清アルブミン、および１．５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含む、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
７．０、０．１ｍｌとを、ジニトロフェニル−サイログ
ロブリン結合ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清ア
ルブミン）ＩｇＧ不溶化プレートの各ウェル内に添加
し、室温で３時間静置して反応させた。各ウェルを０．
１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７．０、０．３ｍｌで３回洗浄した後、固
相に結合したペルオキシダーゼ（あるいはβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ）活性をを測定した。結果を図１及び図２
に示す。
め抗サイログロブリン抗体濃度を定量したバセドー病患
者の血清を、健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体
０．０５ｍｌと、サイログロブリン−ペルオキシダーゼ
（あるいはサイログロブリン−β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ）１００ｆｍｏｌ、０．５５Ｍ塩化ナトリウム、０．
１％ウシ血清アルブミン、および１．５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含む、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
７．０、０．１ｍｌとを、ジニトロフェニル−サイログ
ロブリン結合ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清ア
ルブミン）ＩｇＧ不溶化プレートの各ウェル内に添加
し、室温で３時間静置して反応させた。各ウェルを０．
１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７．０、０．３ｍｌで３回洗浄した後、固
相に結合したペルオキシダーゼ（あるいはβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ）活性をを測定した。結果を図１及び図２
に示す。
【００２８】比較例１ サイログロブリンの精製、サイログロブリン−ペルオキ
シダ−ゼの調製、サイログロブリン不溶化固相の調製、
ペルオキシダ−ゼ活性の測定は実施例１の方法に従っ
た。 〔ヒト抗サイログロブリン抗体の測定〕予め抗サイログ
ロブリン抗体濃度を定量したバセドー病患者の血清を、
健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体０．０５ｍ
ｌ、０．５５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アル
ブミン及び１．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．１ｍｌとを
サイログロブリン不溶化プレートの各ウエル内に添加し
室温で２時間静置して反応させた。各ウェル内を０．１
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１リン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．０で２回洗浄した後ペルオキシダーゼ標識
アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ（カッペル社．メリ
ーランド州）７．５ｎｇ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、
０．１％ウシ血清アルブミン及び１％Ｔｗｅｅｎ２０を
含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０、
０．１５ｍｌを添加し、室温で２時間静置して反応させ
た。各ウェルを上記洗浄液で３回洗浄した後、固相に結
合したペルオキシダーゼ活性を測定した。結果を図１に
示す。
シダ−ゼの調製、サイログロブリン不溶化固相の調製、
ペルオキシダ−ゼ活性の測定は実施例１の方法に従っ
た。 〔ヒト抗サイログロブリン抗体の測定〕予め抗サイログ
ロブリン抗体濃度を定量したバセドー病患者の血清を、
健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体０．０５ｍ
ｌ、０．５５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アル
ブミン及び１．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．１ｍｌとを
サイログロブリン不溶化プレートの各ウエル内に添加し
室温で２時間静置して反応させた。各ウェル内を０．１
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１リン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．０で２回洗浄した後ペルオキシダーゼ標識
アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ（カッペル社．メリ
ーランド州）７．５ｎｇ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、
０．１％ウシ血清アルブミン及び１％Ｔｗｅｅｎ２０を
含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０、
０．１５ｍｌを添加し、室温で２時間静置して反応させ
た。各ウェルを上記洗浄液で３回洗浄した後、固相に結
合したペルオキシダーゼ活性を測定した。結果を図１に
示す。
【００２９】比較例２ サイログロブリンの精製、サイログロブリン−ペルオキ
シダーゼの調製、サイログロブリン−β−Ｄ−ガラクト
シダ−ゼの調製、サイログロブリン不溶化固相の調製、
ペルオキシダーゼ活性の測定、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ活性の測定は実施例１の方法に従った。 〔ヒト抗サイログロブリン抗体の測定〕予め抗サイログ
ロブリン抗体濃度を定量したバセドー病患者の血清を、
健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体０．０５ｍｌ
と０．５５Ｍ塩化ナトリウム０．１％ウシ血清アルブミ
ン及び１．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．１ｍｌとをサイロ
グロブリン不溶化プレートの各ウェル内に添加し、室温
で２時間静置して反応させた。各ウェルを０．１Ｍ塩化
ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７．０で２回洗浄した。各ウェルにサイログロブリ
ン−ペルオキシダーゼ（あるいはサイログロブリン−β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ）１００ｆｍｏｌ、０．１Ｍ塩
化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミンおよび１％
Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．０、０．１５ｍｌを添加し室温で２時間静
置して反応させた。各ウエルを上記洗浄液で３回洗浄し
た後、固相に結合したペルオキシダーゼ（あるいはβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ）活性を測定した。結果を図１及
び図２に示す。
シダーゼの調製、サイログロブリン−β−Ｄ−ガラクト
シダ−ゼの調製、サイログロブリン不溶化固相の調製、
ペルオキシダーゼ活性の測定、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ活性の測定は実施例１の方法に従った。 〔ヒト抗サイログロブリン抗体の測定〕予め抗サイログ
ロブリン抗体濃度を定量したバセドー病患者の血清を、
健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体０．０５ｍｌ
と０．５５Ｍ塩化ナトリウム０．１％ウシ血清アルブミ
ン及び１．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．１ｍｌとをサイロ
グロブリン不溶化プレートの各ウェル内に添加し、室温
で２時間静置して反応させた。各ウェルを０．１Ｍ塩化
ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７．０で２回洗浄した。各ウェルにサイログロブリ
ン−ペルオキシダーゼ（あるいはサイログロブリン−β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ）１００ｆｍｏｌ、０．１Ｍ塩
化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミンおよび１％
Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．０、０．１５ｍｌを添加し室温で２時間静
置して反応させた。各ウエルを上記洗浄液で３回洗浄し
た後、固相に結合したペルオキシダーゼ（あるいはβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ）活性を測定した。結果を図１及
び図２に示す。
【００３０】実施例３ サイログロブリンの精製、サイログロブリン−ペルオキ
シダーゼの調製、サイログロブリン不溶化固相の調製、
ペルオキシダーゼ活性の測定は実施例１の方法に従っ
た。 〔ヒト抗サイログロブリン抗体の測定〕予め抗サイログ
ロブリン抗体濃度を定量したバセドー病患者の血清を、
健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体０．０５ｍｌ
と、サイログロブリンーペルオキシダーゼ１００ｆｍｏ
ｌ、０．５５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アル
ブミンおよび１．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ、７．０、０．１ｍｌとを
サイログロブリン不溶化プレートの各ウェル内に添加し
室温で２時間静置して反応させた。各ウェルを０．１Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．０１リン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．０、０．３ｍｌで１回洗浄した後、サイロ
グロブリン−ペルオキシダーゼ５０ｆｍｏｌ、０．１Ｍ
塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミンおよび１
％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ７．０、０．１５ｍｌを加え室温で１時間静
置して反応させた。各ウェルを上記洗浄液で３回洗浄し
た後、固相に結合したペルオキシダーゼ活性を測定し
た。結果を図３に示す。
シダーゼの調製、サイログロブリン不溶化固相の調製、
ペルオキシダーゼ活性の測定は実施例１の方法に従っ
た。 〔ヒト抗サイログロブリン抗体の測定〕予め抗サイログ
ロブリン抗体濃度を定量したバセドー病患者の血清を、
健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体０．０５ｍｌ
と、サイログロブリンーペルオキシダーゼ１００ｆｍｏ
ｌ、０．５５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アル
ブミンおよび１．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ、７．０、０．１ｍｌとを
サイログロブリン不溶化プレートの各ウェル内に添加し
室温で２時間静置して反応させた。各ウェルを０．１Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．０１リン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．０、０．３ｍｌで１回洗浄した後、サイロ
グロブリン−ペルオキシダーゼ５０ｆｍｏｌ、０．１Ｍ
塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミンおよび１
％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ７．０、０．１５ｍｌを加え室温で１時間静
置して反応させた。各ウェルを上記洗浄液で３回洗浄し
た後、固相に結合したペルオキシダーゼ活性を測定し
た。結果を図３に示す。
【００３１】比較例３ サイログロブリンの精製、サイログロブリン−ペルオキ
シダーゼの調製、ペルオキシダーゼ活性の測定は実施例
１の方法に、ジニトロフェニル−サイログロブリンの調
製、ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミ
ン）ＩｇＧ不溶化固相の調製は実施例２の方法にそれぞ
れ従った。 〔ヒト抗サイログロブリン抗体の測定〕予め抗サイログ
ロブリン抗体濃度を定量したバセドー病患者の血清を、
健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体０．０５ｍｌ
とサイログロブリン−ペルオキシダーゼ、ジニトロフェ
ニル−サイログロブリンともに１００ｆｍｏｌ、０．５
５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミンおよ
び１．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．１ｍｌとを、抗ジニト
ロフェニル−ウシ血清アルブミンＩｇＧ不溶化プレート
の各ウェルに添加し室温で３時間静置して反応させた。
ウェル内を０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で３回洗浄した後、
固相に結合したペルオキシダーゼ活性を測定した。結果
を図３に示す。
シダーゼの調製、ペルオキシダーゼ活性の測定は実施例
１の方法に、ジニトロフェニル−サイログロブリンの調
製、ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミ
ン）ＩｇＧ不溶化固相の調製は実施例２の方法にそれぞ
れ従った。 〔ヒト抗サイログロブリン抗体の測定〕予め抗サイログ
ロブリン抗体濃度を定量したバセドー病患者の血清を、
健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体０．０５ｍｌ
とサイログロブリン−ペルオキシダーゼ、ジニトロフェ
ニル−サイログロブリンともに１００ｆｍｏｌ、０．５
５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミンおよ
び１．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．１ｍｌとを、抗ジニト
ロフェニル−ウシ血清アルブミンＩｇＧ不溶化プレート
の各ウェルに添加し室温で３時間静置して反応させた。
ウェル内を０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で３回洗浄した後、
固相に結合したペルオキシダーゼ活性を測定した。結果
を図３に示す。
【００３２】
【発明の効果】本発明の測定法によれば、従来の抗原と
抗抗体とでサンドイッチする測定法（比較例１）に比し
て約１００倍、抗原と抗原とで２ステップでサンドイッ
チする測定法（比較例２）に比して約１０倍高感度であ
り、また標識抗原を再添加する系では、従来の高感度測
定法（比較例３）の有していたプロゾーン現象という問
題点を解消することができた。
抗抗体とでサンドイッチする測定法（比較例１）に比し
て約１００倍、抗原と抗原とで２ステップでサンドイッ
チする測定法（比較例２）に比して約１０倍高感度であ
り、また標識抗原を再添加する系では、従来の高感度測
定法（比較例３）の有していたプロゾーン現象という問
題点を解消することができた。
図１〜図３は、すべて抗サイログロブリン抗体の検量曲
線を示したものであり、横軸は検体中の抗サイログロブ
リン抗体の濃度、縦軸は各固相に結合した標識酵素の活
性に由来するシグナル量を示している。
線を示したものであり、横軸は検体中の抗サイログロブ
リン抗体の濃度、縦軸は各固相に結合した標識酵素の活
性に由来するシグナル量を示している。
【図１】図１の各曲線は、実施例１、２および比較例２
のサイログロブリン−ペルオキシダーゼを標識化抗原と
して用いた場合、ならびに比較例１を表す。
のサイログロブリン−ペルオキシダーゼを標識化抗原と
して用いた場合、ならびに比較例１を表す。
【図２】図２の各曲線は、実施例１、２および比較例２
のサイログロブリン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを標識
化抗原として用いた場合を表す。
のサイログロブリン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを標識
化抗原として用いた場合を表す。
【図３】図３の各曲線は、実施例３および比較例３をそ
れぞれ表すものである。
れぞれ表すものである。
Claims (2)
- 【請求項１】下記の工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を
含む特異的抗体の測定方法。 （Ａ）：予め標識化した抗原（標識化抗原）および予め
担体に結合させた抗原（担体結合抗原）を同時に被検液
に加え、標識化抗原−測定すべき特異的抗体−担体結合
抗原なる複合体を形成させる工程。 （Ｂ）：工程（Ａ）で形成された複合体を被検液から分
離してから、当該複合体に標識化抗原を含む反応液を添
加する工程。（Ｃ）：複合体を反応液から分離し、洗浄してから複合
体を測定する工程。 - 【請求項２】工程（Ａ）において、担体結合抗原と標識
化抗原のモル比が、１００：１〜２０：１であることを
特徴とする請求項１記載の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26290291A JP3162438B2 (ja) | 1991-09-12 | 1991-09-12 | 高感度特異的抗体測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26290291A JP3162438B2 (ja) | 1991-09-12 | 1991-09-12 | 高感度特異的抗体測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0572204A JPH0572204A (ja) | 1993-03-23 |
| JP3162438B2 true JP3162438B2 (ja) | 2001-04-25 |
Family
ID=17382199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26290291A Expired - Fee Related JP3162438B2 (ja) | 1991-09-12 | 1991-09-12 | 高感度特異的抗体測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3162438B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104698172A (zh) * | 2015-02-10 | 2015-06-10 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 检测乙肝病毒表面抗原的试剂盒及其检测方法和应用 |
| CN104698184A (zh) * | 2015-02-10 | 2015-06-10 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 检测糖类抗原的试剂盒及其检测方法和应用 |
| KR200480088Y1 (ko) * | 2015-05-29 | 2016-04-11 | 박춘배 | 농작물 지지구 |
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|---|---|---|---|---|
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| JP4210454B2 (ja) | 2001-03-27 | 2009-01-21 | 日本たばこ産業株式会社 | 炎症性腸疾患治療剤 |
| JP3543966B2 (ja) * | 2000-05-18 | 2004-07-21 | 日本たばこ産業株式会社 | 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途 |
| JP3597140B2 (ja) | 2000-05-18 | 2004-12-02 | 日本たばこ産業株式会社 | 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途 |
| JP4212278B2 (ja) | 2001-03-01 | 2009-01-21 | 日本たばこ産業株式会社 | 移植片拒絶反応抑制剤 |
| JP4748542B2 (ja) * | 2006-02-24 | 2011-08-17 | 古河電気工業株式会社 | フローサイトメトリーによる生体分子の定量システム、及び定量方法 |
| US20080213797A1 (en) * | 2007-03-01 | 2008-09-04 | Abbott Laboratories | Immunoassays exhibiting a reduction in prozone phenomena |
-
1991
- 1991-09-12 JP JP26290291A patent/JP3162438B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104698172A (zh) * | 2015-02-10 | 2015-06-10 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 检测乙肝病毒表面抗原的试剂盒及其检测方法和应用 |
| CN104698184A (zh) * | 2015-02-10 | 2015-06-10 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 检测糖类抗原的试剂盒及其检测方法和应用 |
| CN104698172B (zh) * | 2015-02-10 | 2017-02-22 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 检测乙肝病毒表面抗原的试剂盒 |
| CN104698184B (zh) * | 2015-02-10 | 2017-03-01 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 检测糖类抗原的试剂盒 |
| KR200480088Y1 (ko) * | 2015-05-29 | 2016-04-11 | 박춘배 | 농작물 지지구 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0572204A (ja) | 1993-03-23 |
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