JP2009085685A - インスリン受容体αサブユニットの測定試薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明者らは、上記の課題を解決するために、抗体の固相への捕捉効率を高めるために抗DNP基抗体またはストレプトアビジン結合ビオチン化BSAを固相に共有結合させて、従来のICT-EIA測定法の感度をさらに増加させ、尿中の遊離IRαSのICT-EIA測定法のためのIRαS測定試薬に応用した。その結果、本発明者らは初めて尿中、唾液、涙中また乾燥ろ紙血中のIRαSの測定を可能とし、2型糖尿病尿中にはIRαSが対照被験者より有意に高値に存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
【選択図】なし
Description
さらに、IRαS測定試薬を含む、IRαS測定キットの提供についても課題とする。
まず、抗体の固相への捕捉効率を高めるために抗DNP基抗体またはストレプトアビジン結合ビオチン化BSAを固相に共有結合させて、従来のICT-EIA測定法の感度をさらに増加させ、尿中ヒト遊離インスリン受容体α-サブユニット(以下、hIRαSとも記載する)の測定に応用した。また、hIRαSの存在を高感度で検出するために、S/N比が高い検出用抗体及び捕捉用抗体の組み合わせについて、選別を行った。
〔1〕次の(a)〜(d)を含むインスリン受容体αサブユニット測定試薬:
(a)抗原捕捉用の、DNP化及びビオチン化した第一の抗インスリン受容体αサブユニット抗体;
(b)抗原検出用の標識を有する第二の抗インスリン受容体αサブユニット抗体;
(c)抗DNP基抗体を共有結合させた不溶化固相担体;及び
(d)ストレプトアビジン結合ビオチン化BSAを共有結合させた不溶化固相担体。
〔2〕抗原捕捉用の抗IRαS抗体がクローン83−7、及び抗原検出用の抗インスリン受容体αサブユニット抗体がクローン5D9である〔1〕記載のインスリン受容体αサブユニット測定試薬。
〔3〕上記の不溶化固相担体が合成化合物ビーズである〔1〕又は〔2〕記載のインスリン受容体αサブユニット測定試薬。
〔4〕次の(a)〜(e)を含むインスリン受容体αサブユニット測定キット:
(a)抗原捕捉用の、DNP化及びビオチン化した第一の抗インスリン受容体αサブユニット抗体;
(b)抗原検出用の標識を有する第二の抗インスリン受容体αサブユニット抗体;
(c)抗DNP基抗体を共有結合させた不溶化固相担体;
(d)ストレプトアビジン結合ビオチン化BSAを共有結合させた不溶化固相担体;及び
(e)検体を採取し輸送するための用具。
〔5〕検体が尿または血液であり、かつ上記用具がろ紙である〔4〕記載のインスリン受容体αサブユニット測定キット。
〔6〕検体が尿または血液であり、かつ上記用具がBSAとNaN3とを保有する容器である〔4〕記載のインスリン受容体αサブユニット測定キット。
本発明は、IRαS測定試薬に関する。
(a)抗原捕捉用の、DNP化及びビオチン化した第一の抗IRαS抗体;
(b)抗原検出用の標識を有する第二の抗IRαS抗体;
(c)抗DNP基抗体を共有結合させた不溶化固相担体;及び
(d)ストレプトアビジン結合ビオチン化BSAを共有結合させた不溶化固相担体。
放射性同位元素:トリチウム、125I、あるいは181I等が挙げられる。
検体を採取し輸送する用具としては、上記乾燥ろ紙の他、検体を保存するための容器を挙げることができる。
検体が尿である場合には、上記容器はBSAとNaN3を保存剤として保有することができる。上記保存剤として使用されるBSAは検体中の最終濃度が0.05w/w〜0.5w/w、NaN3は検体中の最終濃度が0.05%〜0.5%となるように保存容器中に添加されていることが好ましい。
本発明は、糖尿病、あるいはがん患者のIRαS量が健常者と比較して有意に高いことに基づいている。インスリンレセプターは、インスリンに特異的に結合する糖タンパクで、分子量は約35〜40万と大きく、α2β2というサブユニット構造をとっている(α:分子量12〜13万,β:9万)。インスリンレセプターは、インスリン結合活性のみならずチロシン特異的プロテイン・キナーゼ活性を有しており、インスリンとの結合により活性化し、細胞内にシグナルを伝える。このためインスリンレセプターは、通常、筋肉などインスリンの標的組織の細胞膜上に局在する。骨格筋、脂肪組織、肝臓、脳などにインスリンレセプターが多く発現しているしていることが明らかになっている。しかしながら、尿、唾液、涙中には遊離のIRαSが存在するか否か不明であった。
試薬と方法
[抗原]
標準hIRαはMBL社(名古屋)より供与された。リコンビナント・ヒト・インスリン受容体(α+β)はR&D Systems Inc.(MN, USA)より購入した。
[抗体]
モノクローナル抗hIRα抗体(Ab-1;Clone 5D9)はMBL社より、供与された。また、モノクローナル抗hIRα抗体(Ab-2;Clone 83-7)は LAB VISION Corp.(CA、 USA)より購入した。ウサギ抗2,4-ジニトロフェニル基(DNP)-牛血清アルブミン(BSA) 血清はシバヤギ社(群馬)より購入した。
モノクローナル抗hIRαF(ab')2(Ab-1およびAb-2)を還元し得られたヒンジ部のSH基とマレイミド基を導入したβ-D-ガラクトシダーゼと反応させそれぞれ2種類の酵素標識抗体(検出用)コンジュゲートを調製した(Ishikawa E, et al., J Immunoassay 4 : 209-327,1983; 石川 栄治 著:超高感度酵素免疫測定法、学会出版センター、東京、1993.)。
0.1 M NaCl, 0.1% BSA, 1 mM MgCl2, 0.1% NaN3を含む0.01 M リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)を緩衝液Aとした。
[固相の調製]
アフィニティー精製した抗DNP-IgGまたはビオチン化-BSAは直径6.4mmのポリスチレンビーズ(イムノケミカル、岡山)と一夜室温で浸漬後、緩衝液Aで洗浄、4℃で保存する。ビオチン化-BSAを不溶化した固相はさらにストレプトアビジン溶液に一夜室温で浸漬後、緩衝液Aで洗浄、4℃で保存した(Hashida S, et al., Clin Biochem 37: 14-21, 2004)。
標準hIRαまたは希釈血清または透析尿 100μLに、酵素標識抗体及び捕捉用標識抗体を加え16時間4℃でインキュベーションした後、アフィニティー精製した抗DNP-IgGを不溶化したポリスチレンビーズ1個を加え0.5時間反応させた。ビーズを洗浄後、2mM DNP -L-リジンと0.5時間反応させビーズから免疫複合体を溶出後、ビーズを除去した。溶出液にストレプトアビジンを不溶化したポリスチレンビーズを加え0.5時間反応させた。 ビーズとの反応は全て室温で180回/分の振とう下に行った。再びビーズを洗浄後、ビーズ上に転移されたβ-D-ガラクトシダーゼ活性は蛍光基質(4MUG)を用いて測定した(Hashida S and Ishikawa E J Biochem 108 : 960-964, 1990; 石川 栄治 著:超高感度酵素免疫測定法、学会出版センター、東京、1993; Hashida S, et al., Clin Biochem 37: 14-21, 2004)。
血液サンプルの採取:ヒト血液サンプルは、12時間絶食後採取、室温30分静置後、3,000rpm、10分遠心し血清を得た。血清は-30℃に保存した。
尿サンプルの採取と透析:12時間絶食後の早朝第一尿尿(10 mL)に1/50容量の5 % BSAおよび5 % NaN3を加え、透析まで4℃で保存した。6時間以内に尿は、0.1 M NaClを含む0.01 M リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)に透析後、容量を測定し、希釈率を算出した。透析尿100μLは以降のICT-EIAによる測定に用いた。尚、尿中クレアチニン濃度は市販キット(クレアチニン-テストワコー、和光純薬、大阪)により測定した。
ヒト血清、尿はそれぞれ0.5 mL,また、希釈した標準hIRαおよびヒト・インスリン受容体はそれぞれ0.5 mLを、緩衝液Aで平衡化したSuperdex 200 (1.5x60cm)に添加し、溶出液は1.0 mLフラクションに分画した。それぞれ280nmの吸収を測定後、100μL をhIRαの測定に用いた。
一般的なICT-EIA法は、文献を参考にした(Hashida S and Ishikawa E J Biochem 108 : 960-964, 1990; Hashida S, et al., Biotechnology Annual Review Volume 1,(1995) pp403-451, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam)。
2種類の抗体からそれぞれ捕捉用、検出用コンジュゲートを調製し、それぞれ組み合わせを検討した結果、DNP化、ビオチン化BSA標識モノクローナル抗 IRα Fab'(Ab-2)を捕捉用抗体に、ガラクトシダーゼ標識モノクローナル抗 IRα Fab'(Ab-1)を検出用抗体として用いた(表1)。
hIRαICT-EIA法の測定感度は共に5 fg (0.04 amol)であった(図2)。100μLの透析尿を使用した場合、 測定範囲は0.05〜500 pg/mLであった。この方法により、抽出・濃縮の操作なしに直接pg/mL濃度の尿中IRα測定が可能となった。また、同じ抗体を用いたELISA比べ、測定感度は数百倍高感度であった(図3)。
hIRαICT-EIA はhIRαとヒト・インスリン受容体(α+β)と良く反応した。しかし、ヒト・インスリン受容体βとはほとんど反応しなかった(0.01%以下)(図4)。また、hIRαを還元し、チオール基をブロックするとほぼ30%に反応性が低下した(図4)。以上の結果から、hIRαのICT-EIAは2量体のインスリン受容体αを認識していることが示された。
ヒト透析尿(14.4〜200 pg/ml)を用い、添加回収試験、日差および同時再現性を検討した。100 μLを用いた場合の添加回収率は、92〜108 %と良好であった。日差、同時再現性は、それぞれヒトでは6.5〜9.5 % (n=10)、 2.8〜7.5% (n=10)と良好な結果を示した。
尿をSuperdex 200カラムに添加し、各分画の280nmの吸光度とhIRα濃度を測定した(図5)。その結果、尿中hIRαは標準や血中hIRαと同じ位置に溶出され、血中と同じ分子形態で尿中に排泄されていることが示された。
血中と尿中hIRα濃度を比較した結果、両者の間には有意な相関が見られた(p<0.05、図6)。非糖尿病者(63名;20-27歳)の12時間絶食後の血清中および早朝第一尿中hIRα濃度は、0.0015±0.0013 (SD) pg/mg creatinine (範囲;0.0002〜0.0083 pg/ pg/mg creatinine)であった(図7)。また、糖尿病患者(17名;50-81歳)の尿中濃度は、0.011±0.012 (SD) pg/mg creatinine (範囲;0.0009〜0.051 pg/mg creatinine)であった(図7)。その結果、糖尿病患者の血清中及び尿中hIRα濃度は共に、非糖尿病者のそれより有意に(p<0.001)高値を示した(図7)。
Claims (6)
- 次の(a)〜(d)を含むインスリン受容体αサブユニット測定試薬:
(a)抗原捕捉用の、DNP化及びビオチン化した第一の抗インスリン受容体αサブユニット抗体;
(b)抗原検出用の標識を有する第二の抗インスリン受容体αサブユニット抗体;
(c)抗DNP基抗体を共有結合させた不溶化固相担体;及び
(d)ストレプトアビジン結合ビオチン化BSAを共有結合させた不溶化固相担体。 - 抗原捕捉用の抗インスリン受容体α−サブユニット抗体がクローン83−7、及び抗原検出用の抗IRαS抗体がクローン5D9である請求項1記載のインスリン受容体αサブユニット測定試薬。
- 上記の不溶化固相担体が合成化合物ビーズである請求項1又は2記載のインスリン受容体αサブユニット測定試薬。
- 次の(a)〜(e)を含むインスリン受容体αサブユニット測定キット:
(a)抗原捕捉用の、DNP化及びビオチン化した第一の抗インスリン受容体αサブユニット抗体;
(b)抗原検出用の標識を有する第二の抗インスリン受容体αサブユニット抗体;
(c)抗DNP基抗体を共有結合させた不溶化固相担体;
(d)ストレプトアビジン結合ビオチン化BSAを共有結合させた不溶化固相担体;及び
(e)検体を採取し輸送するための用具。 - 検体が尿または血液であり、かつ上記用具がろ紙である請求項4記載のインスリン受容体αサブユニット測定キット。
- 検体が尿または血液であり、かつ上記用具がBSAとNaN3とを保有する容器である請求項4記載のインスリン受容体αサブユニット測定キット。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011137747A (ja) * | 2009-12-28 | 2011-07-14 | Sysmex Corp | 試料中のc型肝炎ウイルスの有無を判定する方法、及びc型肝炎ウイルスの有無を判定するための試薬キット |
WO2012121266A1 (ja) * | 2011-03-04 | 2012-09-13 | Hashida Seiichi | 糖尿病性疾患の進行度評価方法 |
WO2014171206A1 (ja) * | 2013-04-17 | 2014-10-23 | Yuasa Tomoyuki | 糖尿病治療薬の新規なスクリーニング方法 |
WO2017138497A1 (ja) * | 2016-02-08 | 2017-08-17 | シスメックス株式会社 | 被検物質の検出方法および被検物質の検出用試薬キット |
JP2020134329A (ja) * | 2019-02-20 | 2020-08-31 | シスメックス株式会社 | 被検物質の情報の取得方法及び被検物質の捕捉方法 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61133862A (ja) * | 1984-12-05 | 1986-06-21 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | 免疫測定用材料の不動化方法 |
JPH01254868A (ja) * | 1988-04-05 | 1989-10-11 | Eiji Ishikawa | 超高感度抗原物質の測定法 |
JPH0228558A (ja) * | 1987-08-11 | 1990-01-30 | Eiji Ishikawa | 超高感度特異的抗体の測定法 |
JPH08304397A (ja) * | 1995-05-11 | 1996-11-22 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 病原体感染の検出方法 |
JPH09119931A (ja) * | 1995-10-25 | 1997-05-06 | Eiken Chem Co Ltd | 糞便成分と共存する血液蛋白安定化方法 |
JP2000352565A (ja) * | 1999-06-10 | 2000-12-19 | Daiichi Radioisotope Labs Ltd | 尿検体中のアナライトの安定化方法およびこれに用いる保存剤 |
JP2002257826A (ja) * | 2001-02-28 | 2002-09-11 | Sanyo Chem Ind Ltd | 血液中の腫瘍マーカー定量方法 |
WO2004097414A1 (ja) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. | インスリンレセプターαサブユニットの測定方法 |
JP2006345722A (ja) * | 2005-06-13 | 2006-12-28 | Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk | 糖尿病の治療薬のスクリーニング方法 |
-
2007
- 2007-09-28 JP JP2007253814A patent/JP2009085685A/ja active Pending
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61133862A (ja) * | 1984-12-05 | 1986-06-21 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | 免疫測定用材料の不動化方法 |
JPH0228558A (ja) * | 1987-08-11 | 1990-01-30 | Eiji Ishikawa | 超高感度特異的抗体の測定法 |
JPH01254868A (ja) * | 1988-04-05 | 1989-10-11 | Eiji Ishikawa | 超高感度抗原物質の測定法 |
JPH08304397A (ja) * | 1995-05-11 | 1996-11-22 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 病原体感染の検出方法 |
JPH09119931A (ja) * | 1995-10-25 | 1997-05-06 | Eiken Chem Co Ltd | 糞便成分と共存する血液蛋白安定化方法 |
JP2000352565A (ja) * | 1999-06-10 | 2000-12-19 | Daiichi Radioisotope Labs Ltd | 尿検体中のアナライトの安定化方法およびこれに用いる保存剤 |
JP2002257826A (ja) * | 2001-02-28 | 2002-09-11 | Sanyo Chem Ind Ltd | 血液中の腫瘍マーカー定量方法 |
WO2004097414A1 (ja) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. | インスリンレセプターαサブユニットの測定方法 |
JP2006345722A (ja) * | 2005-06-13 | 2006-12-28 | Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk | 糖尿病の治療薬のスクリーニング方法 |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011137747A (ja) * | 2009-12-28 | 2011-07-14 | Sysmex Corp | 試料中のc型肝炎ウイルスの有無を判定する方法、及びc型肝炎ウイルスの有無を判定するための試薬キット |
WO2012121266A1 (ja) * | 2011-03-04 | 2012-09-13 | Hashida Seiichi | 糖尿病性疾患の進行度評価方法 |
WO2014171206A1 (ja) * | 2013-04-17 | 2014-10-23 | Yuasa Tomoyuki | 糖尿病治療薬の新規なスクリーニング方法 |
WO2017138497A1 (ja) * | 2016-02-08 | 2017-08-17 | シスメックス株式会社 | 被検物質の検出方法および被検物質の検出用試薬キット |
JPWO2017138497A1 (ja) * | 2016-02-08 | 2018-02-22 | シスメックス株式会社 | 被検物質の検出方法および被検物質の検出用試薬キット |
JP2020134329A (ja) * | 2019-02-20 | 2020-08-31 | シスメックス株式会社 | 被検物質の情報の取得方法及び被検物質の捕捉方法 |
JP7373286B2 (ja) | 2019-02-20 | 2023-11-02 | シスメックス株式会社 | 被検物質の情報の取得方法及び被検物質の捕捉方法 |
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