JPH01254868A - 超高感度抗原物質の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原物質の超高感度測定法に関する・〔従来の
技術〕 生体成分、特に人の体液中の抗原物質の測定は、臨床上
大変重要である。　抗原の測定はホルモンの測定による
内分泌検査、癌の診断、恣染症の診断等の検査に広く用
いられている。

従前、前述のごとき抗原物質の微量測定は、免疫学的測
定によって行われている。近年、免疫学的測定法におい
て、担体を用いる方法が広く行われている。ＥＬＩＳＡ
法、ＩＲＭＡ法の如きサンドイッチ型測定法や第二抗体
固相法等の競合型測定法がある。

従来行われているサンドインチ型抗原測定法は、抗体を
不）容化した担体の上に被検液中の抗原をトラップし、
これを当該抗原に対する標識抗体により測定する方法が
ある。

〔発明が解決しようとする課題〕

この様な測定方法は、いずれの場合も測定悪文は担体上
に非特異的に結合された標識成分に由来するバックグラ
ウンドにより規制され、高感度の測定に限界があった。

本発明人の目的は、このような状況下、従前にない高感
度の測定法を提供するこにある。

〔課題を力・Ｙ決するための手段〕

本発明は下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）工程
： 工程（Ａ）二次のｆａｌ又は（ｂｌ工程。

（Ａ）被検液の測定すべき抗原物質と、活性成分とから
ｊｉｌ成される複合体を形成させた後、この複合体を担
体に結合させる工程。

（ｂｌ当該複合体を担体上で形成させる工程。

工程（Ｂ）：複合体が結合した担体を洗浄した後、担体
から、前記複合体を解離させる工程。

工程（Ｃ）：この複合体を他の担体に結合させた後、こ
の担体を洗浄する工程。

工程（Ｄ）；　　（Ｃ）に記載の担体上の複合体を測定
する工程。

を包含することを特徴とする抗原物質の測定法である。

以下本発明について工程順に従い説明する。

工程（Ａ）について 被検液としては、例えば、血？ｉ？、血斉、髄液、唾液
、尿等の体液、緩衝液が挙げられる。測定すべき抗原物
質としては、抗原として抗原部位を有する全ての物質、
実質上、従来の免疫学的測定法で測定し得た全ての物質
が測定可能である。例を挙げれば、γ−グルタミルトラ
ンスペブヂダーゼ（γ−ＣＴＰ）　、アルカリホスファ
ターゼ、糖転位酵素等の酵素類、甲状腺刺激ホルモン（
ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、胎盤性性腺刺激
ホルモン（ｈＣＧ）、インスリン、セクレチン、成長ホ
ルモン（ＧＨ）、等の蛋白性ホルモン類、フィブリン分
解物（ＦＤＰ）　、Ｃ−反応性蛋白（ＣＲＰ）、α、−
酸性グリコプロテイン（α。

−ＡＧＰ）　、α、−アンチトリプシン（α、−ＡＴ）
、α１−プラスミンインヒビタ−（αｚ−Ｐ■）、βオ
ーマイクログロブリン（βｔ−ｙ、）。

免疫グロブリン等の血漿蛋白類、α−フェトプロティン
（ＡＦＰ）、癌胎児性蛋白（ＣＥＡ）、胎児性フェリチ
ン等の癌胎児性蛋白類、リンパ球、ウィルス微生物等の
細胞、細胞表面抗原等、ジゴキシン、チロキシン、トリ
ヨードチロシン、コルチゾール、プロスタグランジン等
のハブテンである。これら抗原は被検液中で、遊離した
状態のみではな（免疫複合体、結合蛋白と結合した状態
でも測定可能である。

活性成分とは、下記１又は、１及び２である。

１、抗体。ここで言う抗体とは測定すべき抗原又は当該
抗原と同じ抗原認識部位を有する物質を公知の方法で免
疫して得られるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗
体のいずれであってもよい。

２、上記抗体と抗原抗体反応を生じさせる成分。

（例えば抗原、抗抗体等） これらの活性成分は通常、工程（Ａ）又は／及び工程（
Ｃ）での複合体と担体との結合に関与する官能基の１種
または２種以上を結合させて用いても良い。

ここで　官能基としては、例えば、ジニトロフェニル基
又はトリニトロフェニル基等のハブテン、ビオチン、−
５−Ｓ−結合を介して結合した測定すべき抗原及び対応
する抗体以外の抗体又は抗原、前記ハブテン又は前記ビ
オチン、等が挙げられる。

官能基は、工程（Ａ）で被検液中の成分で担体との結合
を阻害されず、工程（Ｂ）の洗浄で脱離しにくり、解離
の際には解離を容易にするものが好ましい、工程（Ｃ）
の結合に関与する官能基は、（Ｂ）の解離させる工程で
解離した溶液中から効率良く他の担体に結合しうる官能
基が好ましい。

又、これらの活性成分の少なくとも一つは、工程（Ｄ）
の測定の際に利用される標識を結合させる。

標識としては免疫学的測定において測定に利用されるい
ずれの物質でも良く、酵素、放射性物質、発光物質、蛍
光物質、金属化合物等が挙げられる。

例えば、酵素ではペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ、アルカリホスファターゼ、放射性物質として
はヨウ素、水素、蛍光物質としては、フルオレセインイ
ソチオシアネート、発光物質としては、アクリジウム塩
等が挙げられる。

これらの官能基、標識は、（Ａ）から（Ｄ）の工程に影
響を及ぼさないキャリヤーを介在させて活性成分に結合
させても良い、活性成分が低分子の場合には、特にこの
様な介在が好ましい、キャリヤーとしては、例えば非特
異ウサギＩｇＧ、ウシ血清アルブミン、デキストラン等
が挙げられる。

標識を結合させる方法としては、従来免疫学的測定法に
おいて抗体、抗原に標識を結合するいずれの結合方法で
も良い。

抗原と活性成分から構成される複合体の形成は、被検液
に１１１又は２種以上の活性成分を加えて行われる。２
種以上の活性成分を用い、官能基を結合する活性成分と
１８６を結合する活性成分は別々に用いるのが好ましい
。

複合体の形成は通常の抗原抗体反応に用いられる条件下
に行われる。一般には０〜４５℃、数時間〜数ｌＯ時間
、好ましくは、２０〜３７℃、１〜６時間で形成される
。　このようにして形成された複合体は、担体に結合さ
れる。

担体としては、従来の免疫学的測定法において使用され
ている吻全てを使用しろる０例えば、ポリスチレン、ポ
リアクリル、テフロン、祇、ガラス、アガロース等が挙
げられる。また、その形状はどのようなものであっても
良い。

担体は、工程（Ａ）で形成される複合体を結合するため
、又は、担体上で複合体を形成させるための、反応基を
有する必要がある。

担体に結合する反応基は、複合体中の測定すべき抗原、
活性成分、官能基、４！！識又は、複合体形成により新
たに生じた免疫活性部位に結合するものなら、いずれも
反応基として用いられる。

反応基としては、工程（Ｂ）で複合体を容易に解離し得
る反応基が好ましい。

この様な反応基としては官能基に対応した通常のものが
挙げられるが、例えば、 １）官能基がジニトロフェニル基、トリニトロフェニル
基等のハブテンのときは、これらに対する抗体が挙げら
れる。

２）官能基がビオチジのときは、アビジン又はストレプ
トアビジンが挙げられる。

３）官能基が−５−Ｓ−結合を介した抗原、または抗体
のときは、対応する抗体または抗原が挙げられる。

反応基の担体への結合は、免疫学的測定における担体作
成の公知の方法で行われる。

複合体の担体への結合は、担体を用いる前記免疫学的測
定に通常用いられる条件が採用される。

被検液中に活性成分と、担体を同時に加えて、複合体形
成を担体上で行わせる事は、工程を簡略に出来るので望
ましい。

工程」旦と唱二■工 洗浄は担体を用いる免疫学的測定に通常用いられる条件
が採用される。

複合体の解離は、複合体を分解させずに行う事が好まし
い。複合体と担体との結合が抗原抗体反応による時、該
抗原抗体反応の結合定数を複合体形成の結合定数より小
さくする事により、酸、アルカリ、高濃度無機塩等で複
合体を解離する事が出来る。

複合体を分解させずに担体より解離するより好ましい方
法は、複合体と担体との結合に関与する官能基と同一反
応部位を有する物質を加える事である。

例えば、官能基がジニトロフェニルの時には、ジニトロ
フェニルアミノ酸（例ニジニトロフェニルリジン）、官
能基がビオチンの時はビオチン、−５−Ｓ−を介して結
合した抗原、抗体、ハブテン又はビオチン等の時は−５
−３−を切断する試薬が用いられる。

二■ユ立り唱二公工 担体は工程（Ａ）で挙げたものを用いる。

担体に結合する反応基は、複合体中の測定すべき抗原、
活性成分、官能基、標識又は、複合体形成により新たに
生じた免疫活性部位に結合するものなら、いずれも反応
基として用いられる。

好ましい反応基としては工程（Ａ）で示した反応基の他
、複合体中の測定すべき成分、・活性成分、標識又は、
複合体形成により新たに生じた免疫活性部位に結合する
反応基が挙げられる。

複合体中の測定すべき成分、・活性成分と抗原抗体反応
で結合する反応基は、官能基の導入を１つ省略出来るの
で特に好ましい。

反応基の召沢は、工程（Ａ）で用いる反応基と同一の反
応基を用いた場合は、工程（Ｂ）で解濯した溶液から複
合体を分離する必要があり、この分＃操作を省略するた
めには工程（Ａ）と異なる反応基を用いるのが好ましい
、この場合は（Ｂ）の解離させる工程と（Ｃ）の担体に
結合させる工程を同時に行う事が出来る。

複合体の担体への結合は、工程（Ａ＞と同様、担体を用
いる前記免疫学的測定に通常用いられる条件が採用され
る。

上記のＣＢ）と（Ｃ）の工程に関しては、必要に応じて
繰り返してもよい。

工楳ユ旦し唖二■工 担体上の複合体を測定するには、　　（Ａ）の工程で記
した活性成分に導入した標識を測定する方法が挙げられ
る。

以上説明した様に本発明は、従来の免疫学的測定法で測
定しうる抗原物質を従来より高感度で測定しうる。

抗原測定の実施に際しては以下の様に、目的に応じた複
合体の組み合わせで行うことが可能である。

１、サンドインチ型測定の時には、活性成分として、サ
ンドイッチ可能な２種の動物より得られた抗体を用いる
。一方に官能基を他方に標識を結合させておき複合体を
形成させ、工程（Ａ）で官能基により担体に結合させ、
工程（Ｃ）で官能基を結合した抗体に対する抗抗体を結
合した担体を用いることにより、標識を結合させた抗体
の担体への非特異結合を少なくし、工程（Ｄ）で担体上
の複合体中の標識を測定する。

２゜活性成分として同種の動物より得られた２種の抗体
を用いる場合、一方に２種の官能基を、他方に標識を結
合させておき複合体を形成させ、工程（Ａ）で官能基に
より担体に結合させ、工程（Ｃ）で他方の官能基を結合
し得る担体を用いることにより、標識を結合させた抗体
の担体への非特異結合を少なくし、工程（Ｄ）で担体上
の複合体の標識を測定する。

３、競合型測定の場合は、活性成分として抗原と抗体を
用いる。抗原に標識を結合させておき、抗体に官能基を
結合させ、複合体を形成後、工程（Ａ）で官能基により
担体に結合し、工程（Ｃ）で抗体に対する抗抗体を結合
した担体を用いることにより、標識を結合した抗原の担
体への非特異結合を少なくし、工程（Ｄ）で担体上の複
合体中の標識を測定する。

以下本発明を実施例で説明するが本発明はこれに限られ
るものではない。

〔実施例〕

実施例−１ 叛衡通 ０、ＩＭ　ＮａＣ１、１ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、０．１％ウ
シ血清アルブミン及び０．１％ＮａＮ５を含む０．０１
？Ｉリン酸ナトリウム緩衝液、ｐｈｉ　７．０を調製し
緩衝液Ａとした。

Ｎ狸Ｕ準韮 ｈＴｓｌＩキット″”第一”　（第一ラジオアイソトー
プ、東京）の標準品を用いた。

１　Ｇ、Ｆ（ａｂ’）ｚ＋Ｆａｂ’のテＩｇＧは硫酸ナ
トリウムによる塩叶とｆｌＥＡＥセルローズを用い、Ｆ
（ａｂ’）ｔはＩｇＧのペプシン消化により、Ｆａｂ’
はＦ（ａｂ’）ｔの還元により、それぞれ公知の方法（
石川ら、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ（Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）第４巻、第２０９頁（１９８３
）　）により調製した。

■、　メルカプトサクシニル−モノクローナルマウス（
抗ｈＴＳＨβ−サブユニット）　ＩｇＧ　＋のｔＩｉ製
モノクローナルマウス（抗ｈＴｓＩｌβ−サブユニット
）ＩｇＧ＋、　　（７リンクロフトセントルイＸ、ａ：
Ｘ＋）−州）にＳ−アセデルメルカプトサクシニック・
アンハイドライドを用いる公知の方法〔石川ら、ジャー
ナル・オブ・イムノアッセイ　（前出）〕によりチオー
ル基を導入した。１分子当り導入された、チオール基の
数は１０．５個であった。

２、マレイミド−ジニトロフェニル−Ｌ−リジンの調製 ５．５ｍＭジニトロフェニル−Ｌ−リジン、５ｍｊｌ　
ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ＰＨ
７，０，０、ｈｌと５ｍＭ　Ｎ−サクシニミジル−６−
マレイミドヘキサノエート（前出）を含むＮ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミド０．１０ｍ１とを３０℃、３０分反応
させた。

３、ジニトロフェニル−モノクローナルマウス（抗ｈＴ
ｓＨβ−サブユニット）　ＩｇＧ、の！ｌＩ製メルカプ
トサクシニルーモノクローナルマウス（抗ｈＴｓＨβ−
サブユニット）　Ｉｇｃｌｏ、ｔ■を溶解した５ｍＭ　
ＥＤＴＡを含む０．１ンリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
６，０，４，５ｍｌとマレイミド−ジニトロフェニル−
Ｌ−リジン溶液０．５ｍｌとを３０℃、３０分反応させ
た０反応液をセファデックスＧ−２５カラムによりゲル
ろ過した。カラムサイズは、１．ＯＸ３０ｃｍ＋、溶出
液はＯ，ＬＭリン酸ナトリウム綴Ｉｉ液、ｐｌ＋　７．
０、を用いた。モノクローナルマウス（抗ｈＴｓＩＩβ
−サブユニット）　！ｇに、　１分子当り導入されたジ
ニトロフェニル基の数は７．２個であった。

ジニトロフェニル−ウシ血゛アルブミンの羽情１「ウシ
血清アルブミン（フラクションＶ、アーマ−社、カンカ
キ−、イリノイ州）を用いて上記と同様の方法で調製し
た。

ウシ血清アルブミン１分子当り導入されたジニトロフェ
ニル基の数は７．０個であった。

白−セファローズ４Ｂの８．″ ｈＣＧ　（２，５ａ＋ｇ）、ジニトロフェニル−ウシ血
清アルブミン（’Ｌｏｎｇ）及び非特異マウスＩｇＧ　
（２０■）は、ファルマシアの手引書に従ってＣＮＢｒ
−活性化セファローズ４Ｂ　（Ｉｇ）に不溶化した。

■Ｇのアフィニティー　＋１ ウサギ（抗ｈＣＧ）ＩｇＧ　　（ダコバソツ、グロスト
ラフプ、デンマーク）より調製したウサギ（抗ｈＣＧ）
Ｆ（ａｂ’）ｚ、ウサギ（抗ジニトロフェニルーウジ血
清アルブミン）ＩｇＧ（マイルズ社、エルクルト、イン
デイアナ州）及びウサギ（抗マウスＩｇＧ）　ＩｇＧ（
医学生物学研究所１名古屋）はそれぞれｈｃｃ、ジニト
ロフェニル−ウシ血清アルブミン及び非特異マウスＩｇ
Ｇ不溶化セファローズ４Ｂカラムを用い、ｐｌ＋　２．
５で溶出する公知の方法〔河野ら、ジャーナル・オブ・
バイオケミストリ　（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第１００
巻、第１２４７頁　（１９８６））によりアフィニティ
ー精製した。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測メーβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ活性は、４−メチルウンベリフェリル　β−
Ｄ−ガラクトシドを、Ｈとして、３０℃、１６時間の反
応後公知の方法で蛍光光学的に測定した〔今用ら、アナ
ルス・クリニカル・バイオケミストリー（八ｎｎ、ｃＩ
ｉｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第２１巻、第３１０頁（１９
８４）　）　、蛍光光度は、１０−　”Ｍ４−メチルウ
ンベリフェロンを溶解した０、１Ｍグリシン−Ｎａ０１
１Ｊ脂封液、ｐＨｌＯ，３を標準として測定した。

アフィニティー精製ウサギ抗（ｈＣＧ）　ｔａｂ’　は
、Ｎ。

Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドを架橋剤として公知
の方法で〔石川ら、スカンジナビャン・ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、
）第８巻（補７）第４３頁（１９７Ｂ）　）β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ標識した。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１
分子にＦａｂ’　２．１個が結合した。

Ｆａｂ’−β−Ｄ−ガラクトダーゼ０．８呵を含む緩衝
液Ａ　０．５ｍｌを、非特異マウス血清蛋白−セファロ
ーズ４Ｂのカラムに緩衝液Ａを用いて通した。標識抗体
量は酵素活性より計算した。

７フイニテイー主ｎ製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウ
シ血清アルブミン）　ＴｇＧ溶液（０，１ｇ／ｌ）又は
アフィニティー精製ウサギ（抗マウスＩｇＧ）　ｒｇＧ
溶液（０，１ｇ／ｌ）を用いてポリスチレンボール〔直
径３．２ｗｍ（プレシジョン・プラスティックボール社
、シカゴ）〕表面上に公知の方法で〔石川ら、スカンジ
ナビャン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（前出）〕
物理的吸着により不溶化した。

虹堕９遥定 アフィニティー精製ウサギ抗（ｈＣＧ）　Ｆａｂ″−β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ２００ｆｏ＋を含む緩衝液Ａ０
．０１ｍ１に非特異マウスＩｇＧ　０．１ｍｇを含む緩
衝液Ａ０゜０１ｍ１を加え、２０℃、２時間放置した。

別にジニトロフェニル−モノクローナルマウス（抗ｈＴ
ｓｌＩβ−サブユニット）　ＩｇＧ＋、１５０ｆｍｏｌ
を含む緩衝？＆Ａ０．０２ｍ１に非特異ウサギＦ（ａｂ
’）ｘ　０．１ａ＋ｇを含む緩衝液Ａ０．０２ｍ１を加
え、２０℃、２時間放置した。

その後２つの溶液を混合し、種々の濃度のｈＴｓＨ標準
品を溶解した緩衝液Ａ０．０９ｍ１と共に２０℃にて一
夜反応させた０反応液にアフィニティー精製ウサギ（抗
ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）ＩｇＧ不溶化
ポリスチレンボール２個を加え、２０℃、４時間反応さ
せた。

反応液を除去した後ポリスチレンボールを緩衝液Ａ２＋
１で２回洗浄した。

１ｍＭ　　ジニトロフェニル−し−リジン、非特異ウサ
ギＦ（ａｂ’）ｇ　Ｏ，Ｌｍｇを含む緩衝液Ａ０．１５
ｍ１及びアフィニティー精製ウサギ（抗マウスｆｇＧ）
　ｒｇｃ不溶化ポリスチレンボール２個を加えて２０℃
、４時間反応させた。

アフィニティー精製ウサギ（抗マウスＩｇＧ）　ＩｇＧ
不溶化ポリスチレンボールを上記と同様に洗浄後、ポリ
スチレンボールに結合したβ−〇−ガラクトシダーゼ活
性を３０℃にて１６時間反応後測定した。

結果を後記比較例−１と共に、第１図に示す、すなわち
、第１図は本発明及び従来例の各結果を、ｈＴｓＨ濃度
（ｎＵ／チューブ、横軸）と特異的に結合したβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼに対応する蛍光強度（縦軸）との関係
で示すグラフである。

比較例−１ 緩衝液、ｈＴＳＨ標準品、β−Ｄ−ガラクトシグーゼの
活性測定、アフィニティー精製ウサギ（抗ｈｃＧ）Ｆａ
ｂ’−β−Ｄ−ガラクトシダーゼの調製、モノクローナ
ルマウス（抗ｈＴＳＨβ−サブユニー／　））　ＩｇＧ
。

不溶化ポリスチレンボールの調製は実施例−１に従った
◆ Ｕ跳Ω厘足 モノクローナルマウス抗（ｈＴＳＨβ−サブユニット）
　ＴｇＧ、不溶化ポリスチレンボールを標準ｈＴＳＨ含
む緩衝液Ａ０．１５＋ｎｌと２０℃にて一夜反応させた
。

反応液を除去し、ポリスチレンボールを２ｍｌの緩衝液
Ａで２回洗浄した後、アフィニティー精製ウサギ（抗ｈ
ＣＧ）　Ｆａｂ’　−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ２００
ｆｍｏｌ及び非特異ウサギＦ（ａｂ’）ｇｏ、　１ｍｇ
を含む緩衝液Ａ０．１５ｍ１と２０℃、４時間反応させ
た。

ポリスチレンボールを上記と同時に洗浄後、ポリスチレ
ンボールに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を３
０℃にて１時間反応後測定した。結果を第１図に示す。

実施例−２ 緩ｉＪｉン夜、ＴｇＧ、Ｆ（ａｂ’）ｚ＋Ｆａｂ’の調
製、蛋白−セファローズ４Ｂの鋼製、ＩｇＧのアフィニ
ティー精製、アフィニティーｔｆｔ！　＜抗ジニトロフ
ェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相、ア
フィニティー精製ウサギ（抗マウスＩｇＧ）　ＩｇＧ不
溶化固相の調製は実施例−１の方法に従った。

匝り皿至晶 ｈＧＩＩ　ＲＩＡキット（グイナボット東京）の標準品
を用いた。

実施例−１の方法に従って行った。モノクローナルマウ
ス（抗ｈＧＨ）　ＩｇＧ＋　１分子当り導入されたジニ
トロフェニル基は５．７個であった。

実施例−１の方法に従った。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
１分子に４．１個のＦａｂ’が結合した。

匹り凹屋定 精製ウサギ抗（ｈＧＨ）　Ｆａｂ’−β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ２００ｒｍｏｌを含む緩衝液Ａ０．０ｈａ＋に
非特異マウスＩｇＧ　Ｏ，１ｍｇを含む緩衝液Ａ０．０
１ｍ１を加え、２０℃、２時間放置した。

別にジニトロフェニル−モノクローナルマウス（抗ｈＧ
１１）ＩｇＤ＋１５０ｆｍｏｌを含む緩衝液Ａ０．０２
ｍ１に非特異ウサギＦ（ａｂ’）ｔ　０．１ｍｇを含む
緩衝液Ａ０．０２ｍ１を加え、２０℃、２時間放置した
。

その後２つの溶液を混合し、種々の濃度のｈＧｌ！４１
！！準品を溶解した緩衝液ＡＯ，Ｏｂｌと共に２０℃で
一夜反応させた０反応液にアフィニティー精製ウサギ（
抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）■ｇＧ不溶
化ポリスチレンポール２個を加え、２０℃、４時間反応
させた。

反応液を除去した後、ポリスチレンポールを緩衝液Ａ２
ａｌｌで２回洗浄した。

１＋ｍＭジニトロフェニル−し−リジン、非特異ウサギ
Ｆ（ａｂ’）ｇ　０．１ｍｇを含む緩衝液Ａ０．１５ｎ
＋１及びアフィニティー精製ウサギ（抗マウス［ｇＧ）
ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボール２個を加えて、２０℃
、４時間反応させた。

アフィニティー精製ウサギ（抗マウスＩｇＧ）　ＩｇＧ
不溶化ポリスチレンボールを上述と同様に洗浄し、ポリ
スチレンボールに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活
性を３０℃にて、１６時間反応後、測定した。結果を後
記比較例−２と共に第２図に示す。

すなわち、第２図は本発明及び従来例の各結果を、ｈＧ
Ｈｆｆ、度Ｃ９ｇ／チューブ、横軸）と特異的に結合し
たβ−Ｄ−ガラクトシダーゼに対応する蛍光強度（縦軸
）との関係で示すグラフである。

比較例−２ 緩衝液、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定、モノク
ローナルマウス（抗ｈＧＩｌ）　ｒｇｃ不溶化固相の！
ＩＩ製は実施例−１に従った。

ｈＧＩ＋標準品、精製ウサギ（抗ｈＧＨ）Ｆａｂ’−β
−Ｄ−ガラクトシダーゼの！ｌｌ製は実施例−２の方法
に従った・ 匹り二皿定 標準ｈＧ）Ｉを含む緩衝液Ａ０．１５−１とモノクロー
ナルマウス（抗ｈＧＨ）　ｒｇＧ、不溶化ポリスチレン
ボールを２０℃、−夜反応させた。

反応液を除去した後、ポリスチレンポールを２ｍｌの緩
衝液Ａで２回洗浄し、ウサギ（抗屁ＩＩ）　Ｆａｂ’　
−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ２００ｆｍｏｌと非特異ウ
サギＦ（ａｂ’）ｚ　Ｏ，ＩＢを含む緩衝液Ａ０．１５
ｍ１と２０℃、４時間反応させた。

ポリスチレンポールを上述と同様に洗浄し、ポリスチレ
ンポールに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を３
０℃にて１時間反応後測定した。

結果を第２図に示す。

〔発明の効果５ 以上説明したように本発明方法は抗原を超高感度で測定
できるので、甲状腺疾患、下垂体ｍ能低下症等の各種ホ
ルモン分泌異常や各Ｎ怒染症等の診断に貢献するもので
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明及び従来例のβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ活性を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）工程を包
   含することを特徴とする抗原物質の測定法 工程（Ａ）：次の（ａ）または（ｂ）工程。 （ａ）被検液の測定すべき抗原物質と、活性成分とから
   構成される複合体を形成させた後、この複合体を担体に
   結合させる工程。 （ｂ）当該複合体を担体上で形成させる工程。 工程（Ｂ）：複合体が結合した担体を洗浄した後、担体
   から前記複合体を解離させる工程。 工程（Ｃ）：この複合体を他の担体に結合させた後、こ
   の担体を洗浄する工程。 工程（Ｄ）：（Ｃ）に記載の担体上の複合体を測定する
   工程。