JP2925601B2 - 新規な抗原測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原の測定法、特に低分子抗原をも高感度に
測定することのできる抗原の測定法に関する。

〔従来技術〕

生体成分、特に人の体液中の抗原物質の測定は、臨床
上大変重要である。抗原物質の測定はホルモンの測定に
よる内分泌検査、癌の診断、薬物の定量等に広く用いら
れている。

従前、前述のごとき抗原物質の微量測定は、RIA、EI
A、FIA等の免疫学的測定によって行われている。

免疫学的測定法は、競合法とサンドイッチ法に大別さ
れる。

免疫学的測定法はYallowらによる競合法によるRIAに
より始められた。競合法は測定すべき抗原により、標識
抗原の抗体に対する結合を阻害することを利用する測定
法である。加える標識抗原と抗体の量を多くすると、少
量の抗原による阻害が検出できない。加える標識抗原と
抗体の量を少なくすると、標識抗原が抗体に結合する割
合が低下するため限界がある。このため、測定限界は一
般に約1fmol（10^-15mol）である。

一方、サンドイッチ法は測定すべき抗原を、抗体を結
合した担体と標識した抗体でサンドイッチ状に結合させ
る測定法である。抗原を結合する担体上の抗体も標識し
た抗体も多量に用いた後、担体を洗浄して過剰の標識抗
体を除去することができるため、測定限界は競合法より
100〜1000倍低濃度であり、amol（10^-18mol）レベル迄
測定が可能である。最近では、TSH、hCG等の蛋白質ホル
モンはELISA、IRMAと呼ばれるサンドイッチ法で測定す
るのが一般的となっている。

しかし、サンドイッチ法で測定することができる抗原
には制約がある。つまり、サンドイッチ法で測定するこ
とができる抗原は、少なくとも同時に２箇所で抗体と結
合できる抗原部位を有する必要があり、低分子の抗原は
サンドイッチ法で測定することができない。

また、理論的にはサンドイッチ法で測定することがで
きる抗原でも、２箇所の抗原部位に対する抗体を得るこ
とが困難な場合や、２箇所の抗原部位に対する抗体を得
ることができても、高力価の抗体は１箇所の抗原部位に
しか得られず、高感度の測定ができない場合がある。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、このような状況下１箇所の抗原部位
に対する抗体のみを用いてサンドイッチ法の特徴を生か
した抗原の高感度の測定法を提供することにある。特
に、従来のサンドイッチ法では測定できないペプチド、
ステロイド、薬物等の低分子抗原でもサンドイッチ法と
同様の高感度で測定できる方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は、抗原に官能基又は標識を結合させて修飾
抗原を得、これを使用することにより、１箇所の抗原部
位に対する抗体のみを用いて、従来のサンドイッチ法と
同様直接的に被検液中の抗原を測定することができ、１
箇所の抗体の抗原部位しか有しない抗原においても、競
合法より高感度で測定が可能であることを見出し本発明
に到った。

本発明は、下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）
工程： 工程（Ａ）：被検液中で測定すべき抗原に、官能基又は
標識を結合させ、修飾抗原を形成させる工程。

工程（Ｂ）：修飾抗原を、抗原に対する抗体を介して担
体に結合させた後、担体と被検液を分離する工程。

工程（Ｃ）：次の（ａ）又は（ｂ）工程。

（ａ）担体から修飾抗原を解離させる工程。

（ｂ）担体から修飾抗原と、抗原に対する抗体から構成
される修飾抗原−抗体複合体を解離させる工程。

工程（Ｄ）：（Ｃ）に記載の修飾抗原又は修飾抗原−抗
体複合体を測定する工程。

を包含することを特徴とする抗原物質の測定法である。

以下、本発明について工程順に従い説明する。

工程（Ａ）について 被検液中で修飾抗原を得る工程である。

被検液としては、例えば、血清、血漿、髄液、唾液、
尿等の体液、測定すべき抗原を含む緩衝液等が挙げられ
る。測定すべき抗原としては、抗原として抗原部位を含
む全ての物質、実質上、従来の免疫学的測定法で測定さ
れうる全ての抗原物質が測定可能である。

例を挙げれば、蛋白性ホルモンに分類される甲状腺刺
激ホルモン（TSH）、胎盤性性腺刺激ホルモン（hCG）、
血漿蛋白に分類されるフィブリン分解物（FDP）、Ｃ−
反応性蛋白（CRP）、癌胎児性蛋白に分類されるα−フ
ェノプロテイン（AFP）、癌胎児性抗原（CEA）、ハプテ
ンに分類されるアンギオテンシンＩ、バソプレッシン、
ソマトスタチン、心房性ナトリウム利尿ホルモン、エン
ドセリン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（LH−RH）、
カシニン等のペプチド、プロゲステロン、テストステロ
ン、コルチゾール等のステロイド、総サイロキシン
（T₄）、トリヨードサイロニン（T₃）、カテコールアミ
ン、ジゴキシン等が挙げられ、分子量2,000以下の低分
子量抗原も測定対象としうる。本発明における望ましい
抗原はハプテンに分類される抗原である。特に望ましい
抗原は分子中にアミノ基を有するペプチドである。

官能基としては、該官能基と特異的に結合する物質が
存在し、被検液中に官能基、該官能基と特異的に結合す
る物質が実質的に存在しない官能基であれば何れでもよ
い。例を挙げればジニトロフェニル基、トリニトロフェ
ニル基、フルオレセイン基等のハプテン、ビオチニル等
である。

標識としては、免疫学的測定において測定に利用され
るいずれの標識でもよく、酵素、放射性物質、発光物
質、螢光物質、金属化合部等が挙げられる。

例えば、酵素としてはペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ等が、放射性
物質としてはヨウ素、水素等が、螢光物質としてはフル
オレセインイソチオシアネート等が、発光物質としては
アクリジニウム塩等が挙げられる。

直接、抗原に接合される標識としては、放射性物質、
発光物質、蛍光物質等が好ましい。

測定すべき抗原に、官能基または標識を結合させて修
飾抗原を形成させる方法としては、通常、抗原の有する
反応基を利用して化学結合を介して官能基または標識を
結合させる方法が例示される。

抗原の有する反応基に関して、例えば一般に蛋白性ホ
ルモンは−NH₂基を有する。また、ハプテンは、蛋白質
に結合して抗体を作成するので、結合のための反応基を
有している。このような反応基が化学結合に供される。
このような基としては−NH₂基、−SH基、−COOH基、−C
HO基等が挙げられる。

このような抗原の反応基を用いて化学結合を介して官
能基又は標識を結合させる場合、抗原の反応基に対する
反応基を有するか、又はかかる反応基を結合させた官能
基又は標識化合物が用いられる。抗原の反応基に対する
反応基とは、抗原の反応基と実質上定量的に反応する反
応基をいう。例えば、抗原が反応基としてNH₂基を有す
る場合はＮ−ヒドロキシサクシンイミド基、酸無水物、
抗原が反応基として−SH基を有する場合はマレイミド
基、ピリジルジスルフィド基等である。

このような官能基を導入するための化合物の例として
は、Ｎ−スルホサクシニミジル−６−（ビオチンアミ
ド）ヘキサノエート、３−（Ｎ−マレイミド−プロピオ
ニル）ビオチン、Ｎ−サクシニミジル−2,4−ジニトロ
フェニル−５−アミノカプロエート、N⁶−ヒオチニル−
Ｌ−リジンヒドラジド、ｐ−ジアゾベンゾイルビオシチ
ン等が挙げられる。

標識を導入するための化合物の例として、Ｎ−サクシ
ニミジル−３−（４−ヒドロキシ−５−〔¹²⁵I〕ヨード
フェニル）プロピオネート、Ｎ−ハイドロキシサクシニ
ミドアクリジニウムエステル、ユーロピウム（Eu³⁺）キ
レート化合物等が挙げられる。

被検液中に加える、官能基又は標識を導入するための
化合物の量は、被検液中には測定すべき抗原以外に、抗
原の反応基と同一の反応基を有する物質（夾雑物）が存
在するので、被検液中の抗原の反応基が効率よく反応し
うるに十分量を添加すればよい。また、当該化合物を必
要以上多量に添加すると、バックグランドが上昇し、測
定感度が低下する。

反応温度は抗原及び被検液中の蛋白の変性が起こらな
い０〜55℃、好ましくは４〜40℃である。反応時間は10
分間〜48時間、好ましくは30分間〜12時間である。

反応終了後、未反応の官能基又は標識を導入するため
の化合物の反応性を消去するため、当該化合物の反応基
と反応する物質を加えるのが好ましい。かかる物質とし
ては、例えば、Ｎ−スルホサクシニミジル−６−（ビオ
チンアミド）ヘキサノエートの場合はグリシン等が、３
−（Ｎ−マレイミド−プロピオニル）ビオチンの場合は
２−メルカプトエタノール等が挙げられる。

工程（Ｂ）について 修飾抗原を、抗原に対する抗体を用いて特異的に担体
に結合させ、ひいては被検液中から修飾抗原を分離する
工程である。

修飾抗原を、抗原に対する抗体を介して担体に結合さ
せるための第一の方法は、抗原に対する抗体を担体に結
合させておき、次に修飾抗原を反応させる方法である。
第二の方法は、修飾抗原と抗原に対する抗体を反応さ
せ、抗体を介して担体に結合させる方法である。

第二の方法においては、抗原に対する抗体に官能基を
結合させておき、修飾抗原と該抗体とを反応させ、修飾
抗原−抗体複合体を形成する。ここで用いる官能基は工
程（Ａ）で用いた官能基と異なったものを選択する。該
官能基と特異的に結合する物質を担体に結合させてお
き、修飾抗原−抗体複合体を反応させる方法である。

官能基と特異的に結合する物質としては、ハプテンに
対してはハプテンに対する特異抗体が、ビオチンに対し
てはアビジン、ストレプトアビジンが例示される。

測定すべき抗原に対する抗体は、公知の方法で得るこ
とができる。即ち、抗原又は抗原の抗原部位を動物に免
疫して、ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体を
得る。抗原又は抗原の抗原部位がハプテンの場合は、蛋
白質と結合させて免疫を行い抗体を得る。

担体としては、免疫学的測定法において使用されうる
ものを使用すればよい。例えば、ポリスチレン、ポリア
クリル、テフロン、紙、ガラス、アガロース等が挙げら
れる。また、その形状には特に制限はない。

担体に、抗原に対する抗体又は官能基と特異的に結合
する物質を結合させる方法としては、サンドイッチ法で
用いられる抗体の担体への結合に用いられている方法が
例示される。

修飾抗原を担体に結合した後、担体と被検液とを分離
する。

分離する方法としては、従来担体を用いた免疫学的測
定法で用いられるいずれの方法でもよい。

工程（Ｂ）から後記の工程（Ｃ）へ移る前に担体を洗
浄するのが好ましい。

洗浄はサンドイッチ法で通常用いられる条件で行えば
よい。

工程（Ｃ）について 本工程は、担体上に抗原に対する抗体を介して結合し
た測定すべき修飾抗原と、非特異的に結合した修飾され
た夾雑物との分離を行う工程である。

担体から修飾抗原を解離させることは、酸、アルカ
リ、高濃度無機塩等で処理することによって行うことが
できる。

一般に、酸で解離する場合はpH5以下、好ましくはpH
0.5〜3.5とすることによって、アルカリで解離する場合
はpH9以上とすることによって、高濃度無機塩で解離す
る場合は2M以上の塩濃度とすることによって行われる。
当該処理は一般に０〜45℃の温度において、10分〜数10
時間処理することによって行われる。

工程（Ｂ）において第二の方法を用いた場合は、抗体
に結合した官能基と同一部位を有する物質を加えること
によって担体から修飾抗原と抗原に対する抗体から構成
される修飾抗原−抗体複合体を解離させることができ
る。

例えば、官能基がジニトロフェニルの時にはジニトロ
フェニルアミノ酸（例：ジニトロフェニルリジン）が、
官能基がビオチニルの時にはビオチンが用いられる。

また、抗体に官能基が−Ｓ−Ｓ−結合を介して結合し
ている場合は、−Ｓ−Ｓ−結合を切断する試薬により修
飾抗原−抗体複合体を解離することができる。

工程（Ｄ）について 本工程は工程（Ｃ）において解離した、修飾抗原又は
修飾抗原と抗原に対する抗体から構成される修飾抗原−
抗体複合体を測定する工程であり、免疫複合体転移法を
含む公知の方法で行い得る。

例を挙げれば、第一の方法としては、解離した修飾抗
原が官能基を結合させた抗原の場合、官能基と特異的に
結合する物質を結合した担体と、標識を結合した抗原に
対する抗体（標識抗体）で修飾抗原をサンドイッチ法で
測定する方法である。

サンドイッチ法による測定は、標識抗体との反応後担
体と反応させる方法、担体と反応後標識抗体と反応させ
る方法、担体と標識抗体とを同時に反応させる方法のい
ずれの方法でもよい。

第二の方法としては、修飾抗原を工程（Ｂ）と同様に
抗原に対する抗体を介して担体に結合させ、修飾抗原の
官能基又は標識に着目して測定する方法である。

官能基に着目して測定する方法としては、官能基と特
異的に結合する物質に標識を結合した標識物と担体との
サンドイッチ法で測定する。標識物の例としては、アビ
ジン又はストレプトアビジンと酵素の結合物等が挙げら
れる。

第一の方法以外の方法においては、官能基を結合した
修飾抗原を官能基と特異的に結合する物質に標識を結合
した標識物と反応させ、標識を結合した修飾抗原に変換
する反応を工程（Ｄ）以前に行うことも可能である。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例をもって説明するが、本発明は
これらに限られるものではない。

実施例１ 緩衝液 0.1M塩化ナトリウムおよび1g/ウシ血清アルブミン
を含む0.01M酸ナトリウム緩衝液、pH7.0を調製し、緩衝
液Ａとした。

ウサギ抗アンギオテンシンＩ抗血清の調製 アンギオテンシンＩ−ウシ血清アルブミン結合体をグ
ルタルアルデヒドを用いる公知の方法により調製した。

アンギオテンシンＩ−ウシ血清アルブミン結合体を、
完全フロインドアジュバンドを用いる公知の方法でウサ
ギに免疫し、ウサギ抗アンギオテンシンＩ抗血清を調製
した。

IgG、Ｆ（ab′）_２、Fab′の調製 IgGは硫酸ナトリウムによる塩析とDEAEセルロースを
用い、Ｆ（ab′）_２はIgGのペプシン消化により、Fab′
はＦ（ab′）_２の還元により、それぞれ公知の方法〔石
川ら、ジャーナル．オブ・イムノアッセイ（J.Immunoas
say）第４巻、第209頁（1983）〕により調製した。

アンギオテンシンＩ−セファローズ4Bの調製 アンギオテンシンＩ（0.5mg）はファルマシアの手引
書に従って活性化CH−セファローズ4B（0.15g）に不溶
化した。

アフィニティ精製ウサギ抗アンギオテンシンIFab′−ペ
ルオキシダーゼの調製 ウサギ抗アンギオテンシンIFab′は、Ｎ−サクシニミ
ジル−６−マレイミドヘキサノエートを架橋剤として公
知の方法で〔橋田ら、ジャーナル・オブ・アプライド・
バイオケミストリー（J.Appl.Biochem.）第６巻、第56
頁（1984）〕ペルオキシダーゼで標識した。

ウサギ抗アンギオテンシンIFab′−ペルオキシダーゼ
はアンギオテンシンＩ−セファローズ4Bカラムを用い、
pH2.5で溶出する公知の方法〔Ｋ−h.Ruanら、クリニカ
ル・キミカ・アクタ（Clin.Chim.Acta.）第147巻、第16
7頁（1985）〕によりアフィニティ精製した。

ビオチニル非特異ウサギIgGの調製 ビオチニル非特異ウサギIgGはマレイミド−非特異ウ
サギIgGとＮ−ビオチニル−２−メルカプトエチルアミ
ンとの公知の反応〔河野ら、ジャーナル・クリニカル・
ラボラトリイー・アナリシス（J.Clin.Lab.Anal.）第２
巻、第19頁（1988）〕で調製した。

蛋白−不溶化固相の調製 ウサギ抗アンギオテンシンIIgG溶液（0.1g/）又は
ビオチニル非特異ウサギIgG溶液（0.1g/）を用いてポ
リスチレンボール〔直径3.2mm（プレシジョン・プラス
チックボール社、シカゴ）〕に公知の方法〔石川ら、ス
カンジナビヤン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Sc
and.J.Immunol.）第８巻（補７）、第43頁（1978）〕で
物理的吸着によりウサギ抗アンギオテンシンＩ又はビオ
チニル非特異ウサギIgG不溶化ポリスチレンボールを調
製した。

ストレプトアビジン溶液（0.1g/）をビオチニル非
特異ウサギIgG不溶化ポリスチレンボールと30℃、４時
間反応させてストレプトアビジン不溶化ポリスチレンボ
ールを調製した。

血漿の調製 健常人より、10.5mgのジソジウム エチレンジアミン
テトラアセテート（EDTA）を含む氷冷された試験管に7m
lの血液を採取し、４℃で遠心分離して血漿を調製し
た。血漿は測定前にアンギオテンシンＩ変換酵素抑制剤
である4mMの８−ハイドロキシキノリンを含む0.16mMリ
ン酸緩衝液、pH4.6の等量と氷冷下20分インキュベート
した後、4mM EDTAを含む0.1M炭酸ナトリウム緩衝液、pH
9.1で12.5倍希釈した。

標準液の調製 アンギオテンシンI0.56mgを蒸留水0.5mlに溶解し、0.
16mMの８−ハイドロキシキノリン、4mM EDTA及び1g/
ウシ血清アルブミンを含む0.1M炭酸ナトリウム緩衝液、
pH8.5、で希釈し、種々の濃度の標準液を調製した。

アンギオテンシンＩの測定 血漿又は標準液50μを88mMスルホサクシニミジル−
６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート〔sulfosuccini
midyl−６−（biotinamido）hexanoate〕を含むジメチ
ルホルムアミド溶液３μと30℃、１時間インキュベー
トした。その後、1Mグリシン−水酸化ナトリウム、pH8.
5、７μと30℃、１時間インキューベートし、1g/ウ
シ血清アルブミン、0.1M塩化ナトリウム、1g/アジ化
ナトリウム及び4mM EDTAを含む10mMリン酸ナトリウム緩
衝液、pH6.0、90μを添加した。

上記の反応液150μとウサギ抗アンギオテンシンＩ
不溶化ポリスチレンボールと20℃、一夜インキュベート
した。インキューベート後、反応液を除去し、0.1M塩化
ナトリウムを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.
0、2mlで２回洗浄を行った後、緩衝液A100μと1M塩酸
20μを加えて30℃、１時間インキュベートした。

ポリスチレンボールを除去し、1Mリン酸ナトリウム緩
衝液、pH7.0、10μ及び0.9M水酸化ナトリウム20μ
で中和した。その後、アフィニティ精製ウサギ抗アンギ
オテンシンIFeb′−ペルオキシダーゼ（500fmol）を含
む緩衝液A20μを加えて20℃、３時間及び４℃、一夜
インキュベートし、さらに２個のストレプトアビジン不
溶化ポリスチレンボールを加えて振盪下20℃、４時間イ
ンキュベートした。

反応液を除去し、前記と同様にポリスチレンボールを
洗浄した。その後、ポリスチレンボールに結合したペル
オキシダーゼ活性を、３−（４−ハイドロキシフェニ
ル）プロピオニックアシッドを基質として、30℃、１時
間の公知の方法で蛍光光学的に測定した〔今川ら、アナ
リティカル・レターズ第16巻（B19）、第1509頁（198
3）〕。蛍光強度は0.05M硫酸に溶解した0.2mg/キニー
ネを標準として測定した。

標準液の測定結果を図１に示した。測定限界は13fg
（10amol）であった。２μの血漿を用いると6.5ng/
まで測定が可能であった。

２種の血漿（アンギオテンシンＩ濃度56と102ng/）
に３種の濃度のアンギオテンシンＩ（65〜6,400）を加
えた血漿を用いて添加回収率を測定した結果、添加回収
率は85〜104％であった。

56〜5,558ng/の13種の濃度で測定内変動係数を測定
した結果、測定内変動係数は1.8〜10％（ｎ＝５）であ
った。

測定限界は従来の競合法より80倍以上の低濃度であ
る。

実施例２ 緩衝液、IgG、Ｆ（ab′）_２、Fab′の調製、カシニン
−セファローズ4Bの調製、アフィニティ精製ウサギ抗カ
シニン Fab′−ペルオキシダーゼの調製、ビオチニル
非特異ウサギIgGの調製、蛋白−不溶化固相の調製は実
施例１と同様の方法で行った。

ウサギ抗カシニン抗血清の調製 カシニン−ウシ血清アルブミン結合体をＳ−アセチル
メルカプト無水コハク酸及びｍ−マレイミドベンゾイル
−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステルを用いる公知の
方法により調製した。

カシニン−ウシ血清アルブミン結合体を、完全ならび
に不完全フロインドアジュバンドを用いる公知の方法で
ウサギに免疫し、ウサギ抗カシニン抗血清を調製した。

血漿の調製 ラットより、10.5mgのジソジウム エチレンジアミン
テトラアセテート（EDTA）を含む氷冷された試験管に7m
lの血液を採取し、４℃で遠心分離して血漿を調製し
た。血漿は、測定前に4mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH7.5で25倍希釈した。

標準液の調製 カシニン1.0mgを蒸留水0.5mlに溶解し、4mM EDTA及び
1g/ウシ血清アルブミンを含む0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液、pH7.5で希釈し、種々の濃度の標準液を調製し
た。

カシニンの測定 血漿又は標準液50μを53mMスルホサクシニミジル−
６−（ビオチンアミド）ヘキサノエイト〔sulfosuccini
midyl−６−（biotinamido）hexanoate）〕を含むジメ
チルホルムアミド溶液３μと30℃、１時間インキュベ
ートした。その後、1Mグリシン−水酸化ナトリウム、pH
8.0、７μと30℃、１時間インキュベートし、1g/ウ
シ血清アルブミン、0.1M塩化ナトリウム、1g/アジ化
ナトリウム及び4mM EDTAを含む10mMリン酸ナトリウム緩
衝液、pH6.0、90μを添加した。

上記の反応液150μとウサギ抗カシニン不溶化ポリ
スチレンボールと20℃、一夜インキュベートした。イン
キュベート後、反応液を除去し、0.1M塩化ナトリウムを
含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0、2mlで２回洗
浄を行った後、緩衝液A100μと1M塩酸20μを加えて
30℃、１時間インキュベートした。

ポリスチレンボールを除去し、1Mリン酸ナトリウム緩
衝液、pH7.0、10μ及び0.9M水酸化ナトリウム20μ
で中和した。その後、アフィニティ精製ウサギ抗カシニ
ンFab′−ペルオキシダーゼ（50fmol）を含む緩衝液A20
μを加えて20℃、３時間及び４℃、一夜インキュベー
トし、さらに２個のストレプトアビジン不溶化ポリスチ
レンボールを加えて振盪下20℃、４時間インキュベート
した。

反応液を除去し、前記と同様ポリスチレンボールを洗
浄した。その後、ポリスチレンボールに結合したペルオ
キシダーゼ活性を、３−（４−ハイドロキシフェニル）
プロピオニックアシッドを基質として、30℃、１時間の
公知の方法で蛍光光学的に測定した。（今川ら、アナリ
ティカル・レターズ〔第16巻（B19）、第1509頁（198
3）〕。蛍光強度は、0.05M硫酸に溶解した0.2mg/キニ
ーネを標準として測定した。

標準液の測定結果を図２に示した。測定限界は130fg
（100amol）であった。２μの血漿を用いると65ng/
まで測定が可能であった。

３種の濃度のカシニン（650〜19,500ng/）を加えた
血漿を用いて添加回収率を測定した結果、添加回収率は
101〜119％であった。840〜26,700ng/の６種の濃度で
測定内変動係数を測定した結果、測定内変動係数は7.9
〜13％（ｎ＝５）であった。

比較例１ 緩衝液 0.15M塩化ナトリウム、0.1％ゼラチン及び0.02％アジ
化ナトリウムを含む0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.0を調製し、緩衝液Ｂとした。

ウサギ抗カシニン抗血清 実施例２と同じ抗血清を用いた。¹²⁵ I−チロシン化カシニンの調製 Ｎ末端チロシン化カシニンをNa¹²⁵I及びクロラミンＴ
を用いる公知の方法により標識し、¹²⁵I−チロシン化カ
シニンを調製した。

¹²⁵I−チロシン化カシニンの比放射能は11μCi/μｇ
であった。

標準液の調製 カシニン0.5mgを0.1Mホウ酸緩衝液、pH8.5、1mlに溶
解し、緩衝液Ｂで希釈し、種々の濃度の標準液を調製し
た。

カシニンのラジオイムノアッセイ 標準液100μを、緩衝液Ｂで1000倍希釈したウサギ
抗カシニン抗血清の溶液200μ、¹²⁵I−チロシン化カ
シニンの緩衝液Ｂ溶液100μ（10,000cpm）、及び緩衝
液B200μと４℃、18時間インキュベートした。

その後、0.25％デキストランＴ−70及び2.5％活性炭
（ノーリットＡ）を含む緩衝液Ｂ懸濁液200μを添加
し、４℃、15分間静置後、４℃、3000rpmで20分間遠心
分離した。上清の放射能をγ−カウンターにて測定し
た。

標準液の測定結果を図３に示した。測定限界は100pg
（75fmol）であった。

本発明による実施例２の測定限界は、従来法である競
合法による比較例１に比べて、750倍低濃度である。

実施例３ 緩衝液 常用緩衝液として、0.1M NaCl、1g/ウシ血清アル
ブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0、
（緩衝液Ａ）および0.1M NaCl、1g/ウシ血清アルブ
ミンおよび1mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH7.0、（緩衝液Ｃ）を用いた。

ウサギ抗アルギニンバソプレッシン抗体の調製 抗アルギニンバソプレッシン抗血清は、アルギニン−
バソプレッシン（ペプチド・インスチチュート,Inc.,大
阪）とウシサイログロブリンの結合体を、２〜３週間隔
で８回皮下投与することにより、雄性ニュージーランド
白ウサギを感作して得た。

アルギニンバソプレッシン（5mg）は、カルボジイミ
ド法〔スコウスキーら，ジャーナル・オブ・ラボラトリ
ー・アンド・クリニカル・メディシン（J.Lab.Clin.Me
d.）,80巻,134〜144頁（1972）〕により、１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
（カルビオケム−ベーリング，ラ・ジョラ，カリフォル
ニア,USA）を用いて、50mgのウシサイログロブリン（シ
グマ・ケミカルCo.,セントルイス，ミズーリ,USA）に結
合させた。結合体は、0.4mg/mlの生理食塩水溶液とし、
等量のフロイント完全アジュバント（マイルス・ラボラ
トリーズ,Inc.,エルクハート、インディアナ）で乳液化
して投与した。結合体の投与量はウサギ１匹当たり0.2m
gとした。最終の感作より13日後、採血し、抗血清を−2
0℃で保存した。

IgG、Ｆ（ab′）_２およびFabは実施例１と同様に調製
し、280nmの吸光度からこれらの量を求めた。

アルギニンバソプレッシン−セファロース4Bの調製 アルギニンバソプレッシン（0.61mg）は、ファルマシ
アの手引書に従い、活性化CH−セファロース4B（0.17
g、ファルマシア・ファイン・ケミカルス AB,ウプサ
ラ，ウテェーデン）に結合させた。

アフィニティー精製ウサギ抗アルギニンバソプレッシン
Fab′−ペルオキシダーゼの調製 抗アルギニンバソプレッシンFab′は、公知の方法
〔橋田ら，ジャーナル・オブ・アプライド・バイオケミ
ストリー（前出）〕により、Ｎ−サクシニミジル−６−
マレイミドヘキサノエート（同仁堂，熊本，日本）を用
いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（グレードI,RZ＝3.
0,ベーリンガー・マンハイムGmbH,マンハイム,FRG）に
結合させた。

ウサギ抗抗バソプレッシンFab′−ペルオキシダーゼ
は、アルギニンバソプレッシン−セファロース4Bカラム
を用い、pH2.5で溶出する公知の方法〔ルーアンら，ク
リニカル・キミカ・アクタ（前出）〕によりアフィニテ
ィー精製した。

蛋白・不溶化固相の調製 実施例１と同様の方法で、ポリスチレンボール（3.2m
m径、イムノ・ケミカル，岡山，日本）を、ウサギ抗ア
ルギニンバソプレッシンIgG（0.1g/）でコートした。
ビオチニル非特異ウサギIgG、ビオチニル非特異ウサギI
gGポリスチレンボールおよびストレプトアビジン不溶化
ポリスチレンボールの調製は実施例１に準じた。これら
の蛋白・不溶化ポリスチレンボールはIg/のNaN₃を含
む緩衝液Ａで40℃で保存した。

尿サンプルと抗アルギニンバソプレッシンの希釈 尿試料は22〜35歳の健常人の朝一番の排泄からサンプ
リングされ、緩衝液Ｃで20倍に希釈された。

アルギニンバソプレッシン（0.61mg）は、0.5mlの0.2
M酢酸に溶かし、緩衝液Ｃで希釈した。

アルギニンバソプレッシンの測定 試料のビオチン化は、２種の異なる方法により行っ
た。

直接ビオチン化−100μの希釈アルギニンバソプ
レッシン溶液または希釈された尿を10μの66mM N−ヒ
ドロキシサクシニミドビオチン（Zymed Lab.,Inc.,サン
フランシスコ，カリフォルニア）／ジメチルスルフォキ
サイド（DMSO）溶液と共に20℃、１時間インキュベート
した。インキュベート後、反応溶液を10μの1Mグリシ
ン−NaOH緩衝液、pH7.0と20℃で30分間インキュベート
し、その後、5g/のNaN₃を含む30μの緩衝液Ｃを加
えた。

間接ビオチン化−100μの希釈アルギニンバソプ
レッシン溶液または希釈された尿を５μの63mM N−サ
クシニミジル−６−マレイミドヘキサノエート（同仁
堂、熊本）／ジメチルホキサイド溶液を共に20℃、１時
間インキュベートした。インキュベート後、反応溶液は
５μの1mM EDTA含有99mM還元型グルタチオン（同仁
堂、熊本）/0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0と20
℃、１時間インキュベートし、次いで、５μの138mM
N−ヒドロキシサクシニミドビオチン/DMSO溶液と共に20
℃、１時間インキュベートした。最後に、５μの2Mグ
リシン−NaOH緩衝液、pH7.0を加え、インキュベーショ
ンは20℃で30分間行った。その後、5g/のNaN₃を含む
緩衝液Ｃを30μ加えた。その概要は、下記の式に示す
通りである。

ビオチン化された被検液（150μ）を２個の抗アル
ギニンバソプレッシンIgG不溶化ポリスチレンボールと
４℃で一夜インキュベートした。その後、ポリスチレン
ボールを2mlの0.1M NaCl含有、10mMリン酸ナトリウム
緩衝液、pH7.0を加え、吸引除去して２回洗浄し、1mM E
DTAを含む緩衝液A100μと1M塩酸20μの混合液と４
℃、１時間インキュベートした。ポリスチレンボール除
去後、残余の液に10μの1Mリン酸ナトリウム緩衝液、
pH7.0と20μの1M NaOHを加えて中和した。中和した
混合液をアフィニティー精製抗アルギニンバソプレッシ
ンFab′−ペルオキシダーゼ結合体（200fmol）および非
特異的ウサギＦ（ab′）_２（0.1mg）を含む緩衝液A20μ
と共に、４℃で一夜インキュベートした。その後、２
個のストレプトアビジン不溶化ポリスチレンボールを加
え、４℃で５時間インキュベートした。反応液除去後、
ポリスチレンボールを上記の様に２回洗浄し、ポリスチ
レンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を実施例１
と同じく、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン
酸を基質に用いて、30℃、60分間測定した。螢光強度は
0.2mg/キニーネ/50mM硫酸溶液を標準とし、励起波長3
20nm、放出波長405nmにて、島津螢光光度計（RF−510、
島津製作所、京都）で測定した。

アルギニンバソプレッシンの検出限界は、アルギニン
バソプレッシン非存在下で非特異的に吸着したペルオキ
シダーゼ活性（バックグラウンド）に対し、有意な（ｔ
−test,p＜0.001,N＝５）活性上昇を生じさせる最小の
アルギニンバソプレッシン量とした。

直接ビオチン化した場合、アルギニンバソプレッシ
ンの検出限界は、54fg（50amol/tube）であった（図
４、白丸）。

間接ビオチン化した場合、アルギニンバソプレッシ
ンの検出限界は、11fg（10amol/tube）であった（第
４、黒丸）。

これは、競合法によるラジオイムノアッセイ〔モート
ンら，ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（J.Endo
crinol.）,65巻,411〜424頁（1975）〕、〔グレンツァ
ーら，アクタ・エンドクリノロジカ（Acta Endocrinolo
gica）,106巻,317〜329頁（1984）〕あるいは競合法に
よるエンザイムイムノアッセイ〔宇野ら，エクスペリメ
ンチア（Experimentia）,38巻,786〜787頁（1982）〕で
報告された検出限界より、23〜400倍低い値である。尿
中のアルギニンバソプレッシンの測定範囲は、５μの
尿試料で２〜2,000ng/であった。

９種の濃度のアルギニンバソプレッシン（6.6〜63.5n
g/）を含む尿サンプル（５μ）に、２種の濃度（20
および80ng/）のアルギニンバソプレッシンを添加し
た時、尿サンプルに添加したアルギニンバソプレッシン
の回収率は86.4±7.6％（平均値±SD,77〜101％:n＝1
8）であった。

6.6〜117.3ng/にわたる14種の濃度で、アルギニン
バソプレッシン添加または非添加尿サンプルの測定精度
を求めた。測定内変動係数は、3.0〜12.6％（ｎ＝５）
であった。

間接ビオチン化した場合、ビオチンがペプチドのエピ
トープ部位に近接して結合する為に生じうる立体阻害が
回避でき、直接法より５倍検出限界が下がった。このこ
とは、アミノ基を持つハプテンも本発明の方法で高感度
に測定しうることを示す。

〔効 果〕

以上説明したように、本発明は１箇所の抗原部位に対
する抗体のみを用いて、サンドイッチ法の特徴を生かし
た抗原の高感度の測定が可能であり、また従来のサンド
イッチ法で測定できなかった低分子抗原においても、サ
ンドイッチ法と同様、従来の競合法より高感度で測定し
うる。

【図面の簡単な説明】

図１、図２及び図４は本発明方法による抗原測定の実施
例の検量線である。 図３は従来法による抗原測定の比較例の検量線である。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）
   工程を包含することを特徴とする抗原物質の測定法。 工程（Ａ）：測定すべき抗原を含む被検液中に、官能基
   又は標識を導入するための化合物を添加し、被検液中で
   該測定すべき抗原に、官能基又は標識を結合させ、修飾
   抗原を形成させる工程。 工程（Ｂ）：修飾抗原を、抗原に対する抗体を介して担
   体に結合させた後、担体と被検液を分離する工程。 工程（Ｃ）：次の（ａ）又は（ｂ）工程。 （ａ）担体から修飾抗原を解離させる工程。 （ｂ）担体から、修飾抗原と抗原に対する抗体から構成
   される修飾抗原−抗体複合体を解離させる工程。 工程（Ｄ）：（Ｃ）に記載の修飾抗原又は修飾抗原−抗
   体複合体を測定する工程。
2. 【請求項２】下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）
   工程を包含することを特徴とする請求項１記載の測定
   法。 工程（Ａ）：測定すべき抗原を含む被検液中に、官能基
   又は標識を導入するための化合物を添加し、被検液中で
   該測定すべき抗原に、官能基又は標識を結合させ、修飾
   抗原を形成させる工程。 工程（Ｂ）：修飾抗原を、抗原に対する抗体であって、
   工程（Ａ）で用いた官能基と異なる官能基が結合した抗
   体と反応させ、修飾抗原−抗体複合体を形成し、該修飾
   抗原−抗体複合体を、工程（Ａ）で用いた官能基と異な
   る官能基と特異的に結合する物質を有する担体と反応さ
   せた後、担体と被検液を分離する工程。 工程（Ｃ）：抗体に結合した官能基と同一部位を有する
   物質を加えることによって、担体から、修飾抗原と抗原
   に対する抗体から構成される修飾抗原−抗体複合体を解
   離させる工程。 工程（Ｄ）：（Ｃ）に記載の修飾抗原−抗体複合体を測
   定する工程。