JP2968039B2 - 化学発光免疫測定法 - Google Patents
化学発光免疫測定法Info
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- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
- G01N33/552—Glass or silica
Description
本発明は、化学発光免疫測定法に関し、更に詳しくは
体液、特に血清、血漿、尿中の特定成分を高感度で迅速
に定量できる免疫測定法に関するものである。体液中の
特定成分としては、腫瘍マーカー、ホルモン、薬物、抗
体、及び病原体由来抗原成などあらゆる物質が包含され
る。
体液、特に血清、血漿、尿中の特定成分を高感度で迅速
に定量できる免疫測定法に関するものである。体液中の
特定成分としては、腫瘍マーカー、ホルモン、薬物、抗
体、及び病原体由来抗原成などあらゆる物質が包含され
る。
免疫学的測定は、ホモジニアス法とヘテロジニアス法
とに大別される。腫瘍マーカー、ホルモン等の微量成分
を測定するためには、より高感度なヘテロジニアス法が
一般的に採用される。ヘテロジニアス法では、通常抗原
または抗体を予め固相に固定化したておきB/F分離を行
なう必要がある。しかしこの方法では、抗原または抗体
の一方が固相化されているため、液相系の反応よりも反
応速度が遅くなる。この点が反応時間の短縮に大きな障
害となっている。反応時間を短縮し、測定結果を迅速に
出すことは、臨床検査の場において、患者の待ち時間の
短縮、あるいは医師の迅速な診断と治療にとって極めて
重要である。 この点を改善するために、特開昭62−30963号公報に
は、試料をビオチン標識抗体および検出可能となるよう
標識化された抗体と共に液相中で反応させた後、アビジ
ンを不溶化したポリスチレンビーズなどの担体上に、ア
ビジン−ビオチン反応を介して免疫複合体を捕捉し、B/
F分離後、標識を検出する方法が開示されている。しか
し、この方法も、固相として一般的なビーズ、試験管、
マイクロプレート等を用いているため、固相の表面積が
不足し、免疫複合体を固相に捕捉する反応の時間を短縮
することができず、免疫測定の迅速化にとって充分では
なかった。 特開平１−209370号公報には、免疫活性物質とビチオ
ンを結合したレセプター、標識化レセプター（いずれの
レセプターも免疫活性物質と特異的に結合する）及びビ
オチンを結合した固相を共に液相中で恒温保持した後、
アビジンを添加することで免疫活性物質と２種のレセプ
ターから形成された結合体を固相に固定する方法により
免疫反応時間を大幅に短縮し得ることが示されている。
しかし、この方法では複数の前記結合体のビオチンが液
相中でアビジンと結合することにより、前記結合体が固
相に固定できなくなり、検出感度を低下させる問題点が
あった。 また、標識物質としては放射性同位体および酵素が一
般的に使用されるが、取扱いに安全な酵素の方が望まし
い。しかしながら、酵素は比色、蛍光、発光のいずれの
基質を用いても、酵素−基質間の反応にある一定の時間
が必要であり、反応時間の短縮に障害となっていた。こ
の点を改善するのに有効な標識物質としては、酵素によ
る増幅を必要としないアクリジニウムエステル、ルミノ
ール、イソルミノール等の化学発光物質がある。これら
の物質は一般的に知られており、アクリジニウムエステ
ルの使用に関しては、クリニカル・ケミストリー（CLI
N.CHEM.）29/8.1474−1479（1983）：「アクリジニウム
・エスターズ・アズ・ハイ−スペシフィック−アクティ
ビティ・ラベルズ・イン・イムノアッセイ」（Acridini
um Esters as High−Specific−Activity Labels in Im
munoassay）に記載されており、I125と同等あるいはそ
れ以上に高感度であるとされている。しかし、化学発光
物質は疎水性が強く、酵素などに比べると固相表面への
非特異吸着が起こり易い。またアビジンを固相に結合す
る方法によっては固相そのものが発光するという現象が
あり、表面積の大きい固相（アビジンの結合量が多い固
相）を用いる場合、特に大きな障害となる。
とに大別される。腫瘍マーカー、ホルモン等の微量成分
を測定するためには、より高感度なヘテロジニアス法が
一般的に採用される。ヘテロジニアス法では、通常抗原
または抗体を予め固相に固定化したておきB/F分離を行
なう必要がある。しかしこの方法では、抗原または抗体
の一方が固相化されているため、液相系の反応よりも反
応速度が遅くなる。この点が反応時間の短縮に大きな障
害となっている。反応時間を短縮し、測定結果を迅速に
出すことは、臨床検査の場において、患者の待ち時間の
短縮、あるいは医師の迅速な診断と治療にとって極めて
重要である。 この点を改善するために、特開昭62−30963号公報に
は、試料をビオチン標識抗体および検出可能となるよう
標識化された抗体と共に液相中で反応させた後、アビジ
ンを不溶化したポリスチレンビーズなどの担体上に、ア
ビジン−ビオチン反応を介して免疫複合体を捕捉し、B/
F分離後、標識を検出する方法が開示されている。しか
し、この方法も、固相として一般的なビーズ、試験管、
マイクロプレート等を用いているため、固相の表面積が
不足し、免疫複合体を固相に捕捉する反応の時間を短縮
することができず、免疫測定の迅速化にとって充分では
なかった。 特開平１−209370号公報には、免疫活性物質とビチオ
ンを結合したレセプター、標識化レセプター（いずれの
レセプターも免疫活性物質と特異的に結合する）及びビ
オチンを結合した固相を共に液相中で恒温保持した後、
アビジンを添加することで免疫活性物質と２種のレセプ
ターから形成された結合体を固相に固定する方法により
免疫反応時間を大幅に短縮し得ることが示されている。
しかし、この方法では複数の前記結合体のビオチンが液
相中でアビジンと結合することにより、前記結合体が固
相に固定できなくなり、検出感度を低下させる問題点が
あった。 また、標識物質としては放射性同位体および酵素が一
般的に使用されるが、取扱いに安全な酵素の方が望まし
い。しかしながら、酵素は比色、蛍光、発光のいずれの
基質を用いても、酵素−基質間の反応にある一定の時間
が必要であり、反応時間の短縮に障害となっていた。こ
の点を改善するのに有効な標識物質としては、酵素によ
る増幅を必要としないアクリジニウムエステル、ルミノ
ール、イソルミノール等の化学発光物質がある。これら
の物質は一般的に知られており、アクリジニウムエステ
ルの使用に関しては、クリニカル・ケミストリー（CLI
N.CHEM.）29/8.1474−1479（1983）：「アクリジニウム
・エスターズ・アズ・ハイ−スペシフィック−アクティ
ビティ・ラベルズ・イン・イムノアッセイ」（Acridini
um Esters as High−Specific−Activity Labels in Im
munoassay）に記載されており、I125と同等あるいはそ
れ以上に高感度であるとされている。しかし、化学発光
物質は疎水性が強く、酵素などに比べると固相表面への
非特異吸着が起こり易い。またアビジンを固相に結合す
る方法によっては固相そのものが発光するという現象が
あり、表面積の大きい固相（アビジンの結合量が多い固
相）を用いる場合、特に大きな障害となる。
一般に流体試料、たとえば体液中の特定成分を高感度
で迅速に測定するためには、少なくとも２つの問題点を
解決しなければならない。その第１は、迅速な測定に関
するものである。抗原抗体反応は、液相中で行うのが最
も速い。次に、生成した免疫複合体をB/F分離の為に、
固相に捕捉する必要がある。この際、固相として上記従
来技術のようにビーズ、試験管、マイクロプレート等を
用いると、固相表面積が小さく、更に、拡散距離が長く
なる為、反応に長時間を要してしまう。 第２の問題点は、感度に関するものである。測定系を
より高感度にするには、検出の為の標識物質を結合した
抗体または抗原が遊離形のまま固相表面へ非特異的に吸
着するのをできる限り抑える必要がある。しかし、化学
発光物質は先にも述べたように、疎水性が強く、酵素に
比べると非特異的吸着が大きい。またアビジンを固相に
結合する方法によってはB/F分離後、固相に捕捉された
化学発光物質を発光させる際、固相そのものが発光する
という現象がある。これらは、表面積の大きい固相を用
いる場合、特に大きな障害となる。遊離標識抗原または
抗体の非特異的吸着および固相そのものの発光の程度
は、アビジンの固相への結合法によって異なる。一般的
な結合法の多くでは、非特異的吸着が高いか、あるいは
固相そのものが発光する結果になり、目的を達成するこ
とができない。 本発明は、上記２つの問題点を解決できる化学発光免
疫測定法を提供しようとするものである。
で迅速に測定するためには、少なくとも２つの問題点を
解決しなければならない。その第１は、迅速な測定に関
するものである。抗原抗体反応は、液相中で行うのが最
も速い。次に、生成した免疫複合体をB/F分離の為に、
固相に捕捉する必要がある。この際、固相として上記従
来技術のようにビーズ、試験管、マイクロプレート等を
用いると、固相表面積が小さく、更に、拡散距離が長く
なる為、反応に長時間を要してしまう。 第２の問題点は、感度に関するものである。測定系を
より高感度にするには、検出の為の標識物質を結合した
抗体または抗原が遊離形のまま固相表面へ非特異的に吸
着するのをできる限り抑える必要がある。しかし、化学
発光物質は先にも述べたように、疎水性が強く、酵素に
比べると非特異的吸着が大きい。またアビジンを固相に
結合する方法によってはB/F分離後、固相に捕捉された
化学発光物質を発光させる際、固相そのものが発光する
という現象がある。これらは、表面積の大きい固相を用
いる場合、特に大きな障害となる。遊離標識抗原または
抗体の非特異的吸着および固相そのものの発光の程度
は、アビジンの固相への結合法によって異なる。一般的
な結合法の多くでは、非特異的吸着が高いか、あるいは
固相そのものが発光する結果になり、目的を達成するこ
とができない。 本発明は、上記２つの問題点を解決できる化学発光免
疫測定法を提供しようとするものである。
本発明においては、測定の迅速化の為、固相として微
細なガラス繊維の集合体を用いる。これにより、固相表
面積を拡大し、拡散距離を短くし、さらにアビジン−ビ
オチン間の強い反応により、免疫複合体を固相に捕捉す
る。たとえば抗原または抗体をビオチンで標識してお
き、アビジンを固相に結合しておくことにより免疫複合
体を捕捉することによって、液相反応に匹敵する反応速
度を達成することができる。また検出の為の標識物質と
しては酵素による増幅反応を必要とせず、単に発光開始
試薬を添加することにより瞬時に発光反応が起こるアク
リジニウムエステル、ルミノール、イソルミノールなど
の化学発光物質を用い、測定の迅速化を図っている。 なお、本発明においてガラス繊維集合体とは、複数の
ガラス繊維が集まった塊を意味し、その形状は問わな
い。たとえばガラス繊維濾紙のようなシート状のもので
あっても、ガラス繊維を集合した球状のものでもよく、
さらにはガラス繊維を管や容器に詰め込んだものでもよ
い。 更に、本発明では、抗原抗体反応を迅速に行うために
この反応を液相中で行う。即ち、第１の態様では、抗原
を含む流体試料を、試料中の該抗原に対して特異的に反
応する、ビオチンで標識した第１の抗体及び試料中の該
抗原に対して特異的に反応する、化学発光物質で標識し
た第２の抗体と共にインキュベートし、第１の抗体−抗
原−第２の抗体から成る免疫複合体を形成させる。 第２の態様では、抗原を含む流体試料を、試料中の該
抗原に対して特異的に反応する、ビオチンおよび化学発
光物質の一方で標識した抗体及びビオチンおよび化学発
光物質の他方で標識した抗原と共にインキュベートして
競合的に抗原抗体反応を行わせ、試料中抗原体または標
識抗原と標識抗体から成る免疫複合体を形成させる。 第３の態様では、抗体を含む流体試料を、試料中の該
抗体に対して特異的に反応する、ビオチンおよび化学発
光物質の一方で標識した抗原及び該抗体に対して特異的
に反応するビオチンおよび化学発光物質の他方で標識し
た抗体と共にインキュベートし、標識抗原−試料抗体−
標識抗体から成る免疫複合体を形成させる。 第４の態様では、抗体を含む流体試料を、試料中の該
抗体に対して特異的に反応する、ビオチンおよび化学発
光物質の一方で標識した抗原及び該標識抗原と特異的に
反応する、ビオチンおよび化学発光物質の他方で標識し
た抗体と共にインキュベートし、競合的に反応させ、標
識抗原と試料抗体または標識抗体とから成る免疫複合体
を形成させる。 次にB/F分離のために形成された免疫複合体を含む反
応混合物を、アビジンまたはストレプトアビジンを結合
した、表面積が大きくかつ光透過性のあるガラス繊維集
合体に含浸させ、アビジン−ビオチンの強固な結合反応
（結合定数:1015l/mole）を利用し、該免疫複合体を捕
捉する。 洗浄液によりB/F分離を行った後、直ちにガラス繊維
集合体に発光反応開始試薬を適用し、化学発光物質を発
光させて発光量を測定する。 ガラス繊維集合体の中でもガラス繊維濾紙は、微細な
繊維の網目構造の故、表面積が非常に大きく、たとえば
東洋濾紙GA−100では滑面の固相の表面積の約100倍の表
面積を有しており、免疫複合体の固相への拡散距離が短
くなり、反応速度は液相中の反応に匹敵するので好まし
い。またガラス繊維濾紙は光透過性が良く、水分を含ん
だ状態ではほぼ100％の透過率を持ち、発光を効率良く
検出できる。 化学発光物質としては、アクリジニウムエステル、ル
ミノール、イソルミノール等が例示できる。 ところで、アビジンまたはストレプトアビジンをガラ
ス繊維集合体に、一般的に行われているグルタルアルデ
ヒドによって結合した場合、結合部分が発光するあるい
は標識抗体の固相表面への非特異的吸着が増大するとい
う問題が生じる。ガラス繊維集合体という非常に表面積
の大きい固相を用いるため、固相自体の発光や非特異的
吸着の増大が、通常の滑面の固相を用いる場合よりもバ
ックグラウンドに大きく影響する。バックグラウンドが
大きくなると、S/N比は小さくなり、検出感度は低下す
る。 これまで、蛋白質等の固相への結合方法が化学発光法
の観点から検討されたことはなかった。そこで、アビジ
ンまたはストレプトアビジンとガラス繊維集合体との結
合方法を、生化学分野で一般的に行われている蛋白、ペ
プチドの架橋法や酵素の固定化法を参考にし、検討した
ところ、固相自体の発光や非特異的吸着の程度は、結合
方法によって異なることが判明した。その中で固相自体
の発光が小さくかつ非特異的吸着の小さい２つの結合方
法を見い出した。本発明は、この２つの結合方法により
上記第２の問題点である非特異的吸着を解決するもので
ある。 最適な結合方法の一つは、ガラス繊維集合体をアミノ
基を有するシランカップリング剤（例えば、３−アミノ
プロピルトリエトキシシラン）で処理し、導入したアミ
ノ基にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）基を導入
したビオチン（例えば、NHS−ビオチンまたはNHSとビオ
チンの間にスペーサの入ったもの）を反応させ、次いで
導入したビオチンにアビジンまたはストレプトアビジン
を結合させる方法（NHS−ビオチン法という）である。 また、NHS−ビオチン法は、固相自体の発光及び非特
異的吸着を低減させる効果に加え、不溶化アビジンとビ
オチン標識抗体（または抗原）との反応性を著しく向上
させる効果がある。該結合方法によって不溶化したアビ
ジンと一般的な結合方法（たとえば、グルタルアルデヒ
ドを用いる方法）によって不溶化したアビジンのビオチ
ン標識抗体（または抗原）との反応時間を比較すると、
該結合方法の場合、アビジン・ビオチン反応が平衡に達
する時間は、グルタルアルデヒドを用いる方法に比べ、
10分の１以下に短縮される。 この原因として、次の理由が考えられる。一般的な固
相へのアビジンの結合方法は、アビジンのアミノ基を無
作為に用いる為、アビジンのビオチン結合部位が修飾を
受け、アビジンとビオチンとの反応性が低下する。一
方、NHS−ビオチン法では、アビジンが持つ４つのビオ
チン結合部位の内の１つを用いるので、他のビオチン結
合部位は修飾を受けず、アビジンとビオチンとの反応性
は低下しない。従って、NHS−ビオチン法は、本発明の
測定方法の高感度化のみならず、迅速化にも大きく寄与
している。 もう一つの結合方法は、ガラス繊維集合体をアミノ基
を有するシランカップリング剤（例えば、３−アミノプ
ロピルトリエトキシシラン）で処理し、導入したアミノ
基に無水コハク酸を作用させてカルボキシル基を導入す
る。次いで、カルボキシル基にジシクロヘキシルカルボ
ジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドを反応させ、
NHS基を導入する。次に導入したNHS基にアビジンまたは
ストレプトアビジンを結合させる方法（NHSエステル法
という）である。 このいずれかの結合方法によって調整したアビジンま
たはストレプトアビジン結合ガラス繊維集合体を用いる
ことによってバックグラウンドは低下し、検出感度が上
昇する。これによって、迅速かつ高感度な化学発光免疫
測定が可能となる。 この２つの結合方法を含め各種結合法によって調製し
たアビジン結合ガラス繊維濾紙の濾紙自体の発光および
非特異的吸着に関するデータは後記実施例１に示されて
いる。
細なガラス繊維の集合体を用いる。これにより、固相表
面積を拡大し、拡散距離を短くし、さらにアビジン−ビ
オチン間の強い反応により、免疫複合体を固相に捕捉す
る。たとえば抗原または抗体をビオチンで標識してお
き、アビジンを固相に結合しておくことにより免疫複合
体を捕捉することによって、液相反応に匹敵する反応速
度を達成することができる。また検出の為の標識物質と
しては酵素による増幅反応を必要とせず、単に発光開始
試薬を添加することにより瞬時に発光反応が起こるアク
リジニウムエステル、ルミノール、イソルミノールなど
の化学発光物質を用い、測定の迅速化を図っている。 なお、本発明においてガラス繊維集合体とは、複数の
ガラス繊維が集まった塊を意味し、その形状は問わな
い。たとえばガラス繊維濾紙のようなシート状のもので
あっても、ガラス繊維を集合した球状のものでもよく、
さらにはガラス繊維を管や容器に詰め込んだものでもよ
い。 更に、本発明では、抗原抗体反応を迅速に行うために
この反応を液相中で行う。即ち、第１の態様では、抗原
を含む流体試料を、試料中の該抗原に対して特異的に反
応する、ビオチンで標識した第１の抗体及び試料中の該
抗原に対して特異的に反応する、化学発光物質で標識し
た第２の抗体と共にインキュベートし、第１の抗体−抗
原−第２の抗体から成る免疫複合体を形成させる。 第２の態様では、抗原を含む流体試料を、試料中の該
抗原に対して特異的に反応する、ビオチンおよび化学発
光物質の一方で標識した抗体及びビオチンおよび化学発
光物質の他方で標識した抗原と共にインキュベートして
競合的に抗原抗体反応を行わせ、試料中抗原体または標
識抗原と標識抗体から成る免疫複合体を形成させる。 第３の態様では、抗体を含む流体試料を、試料中の該
抗体に対して特異的に反応する、ビオチンおよび化学発
光物質の一方で標識した抗原及び該抗体に対して特異的
に反応するビオチンおよび化学発光物質の他方で標識し
た抗体と共にインキュベートし、標識抗原−試料抗体−
標識抗体から成る免疫複合体を形成させる。 第４の態様では、抗体を含む流体試料を、試料中の該
抗体に対して特異的に反応する、ビオチンおよび化学発
光物質の一方で標識した抗原及び該標識抗原と特異的に
反応する、ビオチンおよび化学発光物質の他方で標識し
た抗体と共にインキュベートし、競合的に反応させ、標
識抗原と試料抗体または標識抗体とから成る免疫複合体
を形成させる。 次にB/F分離のために形成された免疫複合体を含む反
応混合物を、アビジンまたはストレプトアビジンを結合
した、表面積が大きくかつ光透過性のあるガラス繊維集
合体に含浸させ、アビジン−ビオチンの強固な結合反応
（結合定数:1015l/mole）を利用し、該免疫複合体を捕
捉する。 洗浄液によりB/F分離を行った後、直ちにガラス繊維
集合体に発光反応開始試薬を適用し、化学発光物質を発
光させて発光量を測定する。 ガラス繊維集合体の中でもガラス繊維濾紙は、微細な
繊維の網目構造の故、表面積が非常に大きく、たとえば
東洋濾紙GA−100では滑面の固相の表面積の約100倍の表
面積を有しており、免疫複合体の固相への拡散距離が短
くなり、反応速度は液相中の反応に匹敵するので好まし
い。またガラス繊維濾紙は光透過性が良く、水分を含ん
だ状態ではほぼ100％の透過率を持ち、発光を効率良く
検出できる。 化学発光物質としては、アクリジニウムエステル、ル
ミノール、イソルミノール等が例示できる。 ところで、アビジンまたはストレプトアビジンをガラ
ス繊維集合体に、一般的に行われているグルタルアルデ
ヒドによって結合した場合、結合部分が発光するあるい
は標識抗体の固相表面への非特異的吸着が増大するとい
う問題が生じる。ガラス繊維集合体という非常に表面積
の大きい固相を用いるため、固相自体の発光や非特異的
吸着の増大が、通常の滑面の固相を用いる場合よりもバ
ックグラウンドに大きく影響する。バックグラウンドが
大きくなると、S/N比は小さくなり、検出感度は低下す
る。 これまで、蛋白質等の固相への結合方法が化学発光法
の観点から検討されたことはなかった。そこで、アビジ
ンまたはストレプトアビジンとガラス繊維集合体との結
合方法を、生化学分野で一般的に行われている蛋白、ペ
プチドの架橋法や酵素の固定化法を参考にし、検討した
ところ、固相自体の発光や非特異的吸着の程度は、結合
方法によって異なることが判明した。その中で固相自体
の発光が小さくかつ非特異的吸着の小さい２つの結合方
法を見い出した。本発明は、この２つの結合方法により
上記第２の問題点である非特異的吸着を解決するもので
ある。 最適な結合方法の一つは、ガラス繊維集合体をアミノ
基を有するシランカップリング剤（例えば、３−アミノ
プロピルトリエトキシシラン）で処理し、導入したアミ
ノ基にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）基を導入
したビオチン（例えば、NHS−ビオチンまたはNHSとビオ
チンの間にスペーサの入ったもの）を反応させ、次いで
導入したビオチンにアビジンまたはストレプトアビジン
を結合させる方法（NHS−ビオチン法という）である。 また、NHS−ビオチン法は、固相自体の発光及び非特
異的吸着を低減させる効果に加え、不溶化アビジンとビ
オチン標識抗体（または抗原）との反応性を著しく向上
させる効果がある。該結合方法によって不溶化したアビ
ジンと一般的な結合方法（たとえば、グルタルアルデヒ
ドを用いる方法）によって不溶化したアビジンのビオチ
ン標識抗体（または抗原）との反応時間を比較すると、
該結合方法の場合、アビジン・ビオチン反応が平衡に達
する時間は、グルタルアルデヒドを用いる方法に比べ、
10分の１以下に短縮される。 この原因として、次の理由が考えられる。一般的な固
相へのアビジンの結合方法は、アビジンのアミノ基を無
作為に用いる為、アビジンのビオチン結合部位が修飾を
受け、アビジンとビオチンとの反応性が低下する。一
方、NHS−ビオチン法では、アビジンが持つ４つのビオ
チン結合部位の内の１つを用いるので、他のビオチン結
合部位は修飾を受けず、アビジンとビオチンとの反応性
は低下しない。従って、NHS−ビオチン法は、本発明の
測定方法の高感度化のみならず、迅速化にも大きく寄与
している。 もう一つの結合方法は、ガラス繊維集合体をアミノ基
を有するシランカップリング剤（例えば、３−アミノプ
ロピルトリエトキシシラン）で処理し、導入したアミノ
基に無水コハク酸を作用させてカルボキシル基を導入す
る。次いで、カルボキシル基にジシクロヘキシルカルボ
ジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドを反応させ、
NHS基を導入する。次に導入したNHS基にアビジンまたは
ストレプトアビジンを結合させる方法（NHSエステル法
という）である。 このいずれかの結合方法によって調整したアビジンま
たはストレプトアビジン結合ガラス繊維集合体を用いる
ことによってバックグラウンドは低下し、検出感度が上
昇する。これによって、迅速かつ高感度な化学発光免疫
測定が可能となる。 この２つの結合方法を含め各種結合法によって調製し
たアビジン結合ガラス繊維濾紙の濾紙自体の発光および
非特異的吸着に関するデータは後記実施例１に示されて
いる。
以下実施例を示し、本発明の化学発光免疫測定法をよ
り詳細に説明するが、本発明はこれによって限定される
ものではない。 実施例１ 各種結合法によって調製したアビジン結合ガラス繊維濾
紙の発光および非特異的吸着の比較 １）NHS−ビオチン法 ガラス繊維濾紙（東洋濾紙GA−100、直径13mm、厚さ
0.45mm）を３−アミノプロピルトリエトキシシランの２
％アセトン溶液中に、室温で１時間浸漬してガラスと３
−アミノプロピルトリメトキシシランを反応させ、アミ
ノ化ガラス繊維濾紙を得た。アミノ化ガラス繊維濾紙
を、NHS−LC−ビオチン（ピアース（PIERCE）製）0.012
5mg/mlを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（以下、NaPB
という）。（pH8.0）中に、室温で１時間浸漬し、反応
させた。蒸留水で洗浄した後、ビオチンを導入したガラ
ス繊維濾紙をアビジン溶液（アビジン0.1mg/ml、pH7.
0、0.1M、NaPB）に４℃で30分以上浸漬した。この場合
の結合様式を模式的に示せば次の通りである。 また、スクシンイミジル６−（ビオチンザミド）ヘキ
サネートを用いることにより、NHSとビオチンとの間に
スペーサーが挿入された次のような結合様式のものも調
製できる。 ２）NHS−エステル法 NHS−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、0.8M無水コハク酸（飽和四ホウ酸ナト
リウム溶液中）により４℃で５時間処理した。蒸留水で
洗浄した後、カルボキシル基が導入されたガラス繊維濾
紙を0.1Mジシクロヘキシルカルボジイミド及び0.1M Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドのジオキサン溶液中、室温
で２時間処理した。蒸留水で洗浄した後、NHS基を導入
したガラス繊維濾紙をアビジン溶液（0.1mg/ml、pH6.
5、0.1M、NaPB）に４℃で一夜浸漬した。この場合の結
合様式を模式的に示せば次の通りである。 ３）グルタルアルデヒド法（比較） NHS−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、５％グルタルアルデヒド水溶液中に室
温で３時間浸漬した。水で洗浄した後、グルタルアルデ
ヒドにより活性化したガラス繊維濾紙をアビジン溶液
（0.1mg/ml、pH10.0、0.1M、カーボネート緩衝液）中に
４℃で一夜浸漬した。この場合の結合様式を模式的に示
せば次の通りである。 ４）トリレン−2,4−ジイソシアネート（TDIC）法（比
較） NHS−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、２％TDIC（pH9.5、0.1M、ボレート緩
衝液中）溶液中に０℃で30分浸漬した。水で洗浄した
後、TDIC結合ガラス繊維濾紙を0.1mg/mlアビジン溶液
（ボレート緩衝液に溶解）中に４℃で一夜浸漬した。こ
の場合の結合様式を模式的に示せば次の通りである。 ５）塩化シアヌル法（比較） NHS−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、２％塩化シアヌルのベンゼン溶液中に
室温で２時間浸漬した。水で洗浄した後、塩化シアヌル
結合ガラス繊維濾紙を0.1mg/mlアビジン溶液（pH8.0、
0.1M、NaPBに溶解）中に４℃で一夜浸漬した。この場合
の結合様式を模式的に示せば次の通りである。 ６）ジスクシニミジルスベレート（DSS）法（比較） NHS−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、1mM DSSのDMSO中溶液に室温で１時間
浸漬した。水で洗浄した後、DSS結合ガラス繊維濾紙を
0.1mg/mlアビジン溶液（pH7.5、0.1M、NaPBに溶解）中
に４℃で一夜浸漬した。この場合の結合様式を模式的に
示せば次の通りである。 ７）ヘキサメチレンジイソシアネート法（比較） NHS−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、0.5％ヘキサメチレンジイソシアネー
ト溶液（pH9.5、0.1M、ボレート緩衝液に溶解）中に室
温で２時間浸漬した。水で洗浄した後、ヘキサメチレン
ジイソシアネート結合ガラス繊維濾紙を0.1mg/mlアビジ
ン溶液（ボレート緩衝液に溶解）中に４℃で一夜浸漬し
た。この場合の結合様式を模式的に示せば次の通りであ
る。 上記１）〜７）の結合法によって調製したアビジン結
合ガラス繊維濾紙の濾紙自体の発光および非特異吸着率
を測定した。非特異的吸着は次のようにして測定した。
アクリジニウムエステル（４−（２−スクシニミジルオ
キシカルボニルエチル）フェニル−10−メチル−アクリ
ジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネー
ト：同仁化学株式会社製アクリジニウムＩ）により標識
した抗体１μｇを各ガラス繊維濾紙に添加し、10分間反
応させる。0.1％ツイーン（Tween）20を含むリン酸緩衝
化生理食塩水（以下、PBS−Tweenという。）により洗浄
した後、ガラス繊維濾紙上に残っている残存発光量を測
定する。添加した標識抗体全量からの発光量も測定して
おく（＝添加発光量）。非特異吸着率は、（残存発光量
／添加発光量）×100％で表わす。 尚、対照としてアビジンを結合していないガラス繊維
濾紙についても同様に濾紙自体の発光と非特異吸着率を
測定した。また、すべてのガラス繊維濾紙には適当な蛋
白質によりブロッキングを施した。 アクリジニウムＩの発光は、0.3％過酸化水素溶液（1
NNaOH水溶液中）をガラス繊維濾紙に添加することによ
り行った。また、発光量の測定は、ルミフォトメータ−
TD−4000（シグマテクニカ製）を用いて行った。 表１に結果を示す。本発明のアビジン−ガラス繊維濾
紙結合法であるNHS−ビオチン法およびNHSエステル法で
は、対照のアビジン末結合のものと同程度に、濾紙自体
の発光および非特異吸着率は共に低い値であったが、比
較の他の結合方法で明らかに濾紙自体の発光も非特異吸
着率も高い値を示した。 また３）〜７）にすべての結合法において、非特異的
吸着がNHS−ビオチン法やNHSエステル法に比べると相当
大きかった。原因としてはアルキル鎖、ベンゼン環、ト
リアジン環などの疎水性基を多く含んでいることが考え
られる。非特異的吸着は主に疎水性相互作用により起こ
るからである。逆にNH基、CO基などの親水基が少ないと
いうことも非特異的吸着を高める原因になると考えられ
る。 従って、短いアルキル鎖に対してNH基、CO基の割合が
多く、アミド結合を形成するNHS−ビオチン法およびNHS
エステル法では濾紙自体の発光がほとんどなく、非特異
的吸着も極めて低い結合方法を可能にする。 実施例２ NHSエステル法及びグルタルアルデヒド法によって調製
したアビジン結合ガラス繊維濾紙を用いたCEA（カルシ
ノエンブリオニックアンチゲン：癌胎児性抗原）検量線
の作成 １）CEA濃度既知の試料30μ、ビオチニル化抗CEAモノ
クロナール抗体５μｇ（10μ）及びアクリジニウムエ
ステル（アクリジニウムＩ）標識抗CEAモノクロナール
抗体0.1μｇ（10μ）を混合し、室温５分間インキュ
ベートする。 ２）上記反応液50μを、直径13mm、厚さ0.45mmのアビ
ジン結合ガラス繊維濾紙に含浸させ、室温で10分間イン
キュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄し（B/F分離）、これに発光開始試薬として0.3％過酸
化水素溶液（1NNaOH水溶液中）を濾紙に添加することに
よりアクリジニウムＩを発光させ、濾紙上の発光量をル
ミフォトメーターTD−4000により測定する。 以上の測定を２種類アビジン結合ガルス繊維濾紙（NH
Sエステル法及びグルタルアルデヒド法）を用いて行っ
た。 第１図に各々の結合法による検量線を示した。グルタ
ルアルデヒド法では、最小検出感度は20ng/mlであった
が、NHS−エステル法では0.3ng/mlの最小検出感度が得
られている。このように結合法としてNHS−エステル法
を用いることにより高感度化が可能となる。 実施例３ 抗原抗体反応及びアビジン−ビオチン反応のタイムコー
ス 抗原抗体反応のタイムコース： １）所定のAFP（アルファフェトプロテイン）濃度の試
料30μ、ビオチニル化抗AFPモノクロナール抗体５μ
ｇ（10μ）及びアクリジニウムエステル（アクルジニ
ウムＩ）標識抗AFPポリクロナール抗体0.1μｇ（10μ
）を混合し、室温で経時的に反応させる。 ２）上記反応液50μを、直径13mm、厚さ0.45mmのアビ
ジン結合ガラス繊維濾紙（NHSエステル法）に含浸さ
せ、室温10分間インキュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄し（B/F分離）、実施例２と同様にアクリジニウムＩ
を発光させ、濾紙上の発光量を自社製フォトンカウンタ
ーにより測定する。 アビジン−ビオチン反応タイムコース： １）所定のAFP濃度の試料30μ、ビオチン化抗AFPモノ
クロナール抗体５μｇ（10μ）及びアクリジニウムエ
ステル（アクリジニウムＩ）標識抗AFPポリクロナール
抗体0.1μｇ（10μ）を混合し、室温10分間インキュ
ベートする。 ２）上記反応液50μを直径13mmのアビジン結合ガラス
繊維濾紙（NHSエステル法）に含浸させ、室温で経時的
に反応させる。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄し（B/F分離）、上記と同様に発光させ、濾紙上の発
光量を測定する。 第２図および第３図に各反応のタイムコースを示し
た。抗原抗体反応は３分前後で、アビジン−ビオチン反
応は１分前後で平衡に達している。マイクロプレートや
ビーズを用いた通常の固相上での反応では平衡に達する
のに数時間を要するのに比べ、極めて顕著な反応速度の
向上である。 この結果から抗原抗体反応３分、アビジン−ビオチン
反応１分（発光の測定は数秒）という非常に迅速な免疫
測定系が構成できる。 実施例４ AFP検量線 １）AFP濃度既知の試料６μ、PBS（リン酸緩衝化生理
食塩水）24μ、ビオチニル化抗AFPモノクロナール抗
体４μｇ（10μ）及びアクリジニウムエステル（アク
リジニウムＩ）標識抗AFPモノクロナール抗体0.1μｇ
（10μ）を混合し、室温で３分間インキュベートす
る。 ２）上記反応液50μを、直径13mm、厚さ0.45mmのアビ
ジン結合ガラス繊維濾紙（NHS−ビオチン法）に含浸さ
せ、室温１分間インキュベーションする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄（B/F分離）し、実施例２と同様にアクリジニウムＩ
を発光させ、濾紙上の発光量を、自社製フォトンカウン
ターにより測定する。 実施例５ インスリン検量線 １）インスリン濃度既知の試料10μ、PBS20μ、ビ
オチニル化抗インスリンモノクロナール抗体0.1μｇ（1
0μ）、アクリジニウムエステル（アクリジニウム
Ｉ）標識抗インスリンモノクロナール抗体0.05μｇ（10
μ）を混合し、室温で３分間インキュベートする。 ２）上記反応液50μを直径13mmのアビジン結合ガラス
繊維濾紙（NHS−ビオチン法）に含浸させ、室温１分間
インキュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄し（B/F分離）、実施例２と同様に発光させ、濾紙上
の発光量を、自社製フォトンカウンターにより測定す
る。 第４図および第５図にAFP及びインスリンの検量線を
示した。 実施例６ T4検量線 １）T4（サイロキシン）濃度既知の試料５μ、ANS
（８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸）を含むPB
S25μ、ビオチニル化抗T4ポリクロナール抗体0.1μｇ
（10μ）、アクリジニウムエステル（アクリジニウム
Ｉ）標識T410μを混合し、室温で５分間インキュベー
トする。 ２）上記反応液50μを、直径13mm、厚さ0.45mmのアビ
ジン結合ガラス繊維濾紙（NHS−ビオチン法）に含浸さ
せ、室温で１分間インキュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄し（B/F分離）、実施例２と同様に発光させ、濾紙上
の発光量を自社製フォトンカウンターにより測定する。 第６図にT4の検量線を示した。 実施例７ HBS抗体検量線 １）HBS抗体陽性の試料（PBSにより段階希釈したもの）
30μ、ビオチニル化HBS抗原10μ、アクリジニウム
エステル（アクリジニウムＩ）標識抗HBSポリクロナー
ル抗体10μを混合し、室温で５分間インキュベートす
る。 ２）上記反応液50μを、直径13mm、厚さ0.45mmのアビ
ジン結合ガラス繊維濾紙（NHS−ビオチン法）に含浸さ
せ、室温で１分間インキュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄し（B/F分離）、実施例２と同様に発光させ、濾紙上
の発光量を自社製フォトンカウンターにより測定する。 第７図にHBS抗体の検量線を示した。
り詳細に説明するが、本発明はこれによって限定される
ものではない。 実施例１ 各種結合法によって調製したアビジン結合ガラス繊維濾
紙の発光および非特異的吸着の比較 １）NHS−ビオチン法 ガラス繊維濾紙（東洋濾紙GA−100、直径13mm、厚さ
0.45mm）を３−アミノプロピルトリエトキシシランの２
％アセトン溶液中に、室温で１時間浸漬してガラスと３
−アミノプロピルトリメトキシシランを反応させ、アミ
ノ化ガラス繊維濾紙を得た。アミノ化ガラス繊維濾紙
を、NHS−LC−ビオチン（ピアース（PIERCE）製）0.012
5mg/mlを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（以下、NaPB
という）。（pH8.0）中に、室温で１時間浸漬し、反応
させた。蒸留水で洗浄した後、ビオチンを導入したガラ
ス繊維濾紙をアビジン溶液（アビジン0.1mg/ml、pH7.
0、0.1M、NaPB）に４℃で30分以上浸漬した。この場合
の結合様式を模式的に示せば次の通りである。 また、スクシンイミジル６−（ビオチンザミド）ヘキ
サネートを用いることにより、NHSとビオチンとの間に
スペーサーが挿入された次のような結合様式のものも調
製できる。 ２）NHS−エステル法 NHS−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、0.8M無水コハク酸（飽和四ホウ酸ナト
リウム溶液中）により４℃で５時間処理した。蒸留水で
洗浄した後、カルボキシル基が導入されたガラス繊維濾
紙を0.1Mジシクロヘキシルカルボジイミド及び0.1M Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドのジオキサン溶液中、室温
で２時間処理した。蒸留水で洗浄した後、NHS基を導入
したガラス繊維濾紙をアビジン溶液（0.1mg/ml、pH6.
5、0.1M、NaPB）に４℃で一夜浸漬した。この場合の結
合様式を模式的に示せば次の通りである。 ３）グルタルアルデヒド法（比較） NHS−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、５％グルタルアルデヒド水溶液中に室
温で３時間浸漬した。水で洗浄した後、グルタルアルデ
ヒドにより活性化したガラス繊維濾紙をアビジン溶液
（0.1mg/ml、pH10.0、0.1M、カーボネート緩衝液）中に
４℃で一夜浸漬した。この場合の結合様式を模式的に示
せば次の通りである。 ４）トリレン−2,4−ジイソシアネート（TDIC）法（比
較） NHS−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、２％TDIC（pH9.5、0.1M、ボレート緩
衝液中）溶液中に０℃で30分浸漬した。水で洗浄した
後、TDIC結合ガラス繊維濾紙を0.1mg/mlアビジン溶液
（ボレート緩衝液に溶解）中に４℃で一夜浸漬した。こ
の場合の結合様式を模式的に示せば次の通りである。 ５）塩化シアヌル法（比較） NHS−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、２％塩化シアヌルのベンゼン溶液中に
室温で２時間浸漬した。水で洗浄した後、塩化シアヌル
結合ガラス繊維濾紙を0.1mg/mlアビジン溶液（pH8.0、
0.1M、NaPBに溶解）中に４℃で一夜浸漬した。この場合
の結合様式を模式的に示せば次の通りである。 ６）ジスクシニミジルスベレート（DSS）法（比較） NHS−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、1mM DSSのDMSO中溶液に室温で１時間
浸漬した。水で洗浄した後、DSS結合ガラス繊維濾紙を
0.1mg/mlアビジン溶液（pH7.5、0.1M、NaPBに溶解）中
に４℃で一夜浸漬した。この場合の結合様式を模式的に
示せば次の通りである。 ７）ヘキサメチレンジイソシアネート法（比較） NHS−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、0.5％ヘキサメチレンジイソシアネー
ト溶液（pH9.5、0.1M、ボレート緩衝液に溶解）中に室
温で２時間浸漬した。水で洗浄した後、ヘキサメチレン
ジイソシアネート結合ガラス繊維濾紙を0.1mg/mlアビジ
ン溶液（ボレート緩衝液に溶解）中に４℃で一夜浸漬し
た。この場合の結合様式を模式的に示せば次の通りであ
る。 上記１）〜７）の結合法によって調製したアビジン結
合ガラス繊維濾紙の濾紙自体の発光および非特異吸着率
を測定した。非特異的吸着は次のようにして測定した。
アクリジニウムエステル（４−（２−スクシニミジルオ
キシカルボニルエチル）フェニル−10−メチル−アクリ
ジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネー
ト：同仁化学株式会社製アクリジニウムＩ）により標識
した抗体１μｇを各ガラス繊維濾紙に添加し、10分間反
応させる。0.1％ツイーン（Tween）20を含むリン酸緩衝
化生理食塩水（以下、PBS−Tweenという。）により洗浄
した後、ガラス繊維濾紙上に残っている残存発光量を測
定する。添加した標識抗体全量からの発光量も測定して
おく（＝添加発光量）。非特異吸着率は、（残存発光量
／添加発光量）×100％で表わす。 尚、対照としてアビジンを結合していないガラス繊維
濾紙についても同様に濾紙自体の発光と非特異吸着率を
測定した。また、すべてのガラス繊維濾紙には適当な蛋
白質によりブロッキングを施した。 アクリジニウムＩの発光は、0.3％過酸化水素溶液（1
NNaOH水溶液中）をガラス繊維濾紙に添加することによ
り行った。また、発光量の測定は、ルミフォトメータ−
TD−4000（シグマテクニカ製）を用いて行った。 表１に結果を示す。本発明のアビジン−ガラス繊維濾
紙結合法であるNHS−ビオチン法およびNHSエステル法で
は、対照のアビジン末結合のものと同程度に、濾紙自体
の発光および非特異吸着率は共に低い値であったが、比
較の他の結合方法で明らかに濾紙自体の発光も非特異吸
着率も高い値を示した。 また３）〜７）にすべての結合法において、非特異的
吸着がNHS−ビオチン法やNHSエステル法に比べると相当
大きかった。原因としてはアルキル鎖、ベンゼン環、ト
リアジン環などの疎水性基を多く含んでいることが考え
られる。非特異的吸着は主に疎水性相互作用により起こ
るからである。逆にNH基、CO基などの親水基が少ないと
いうことも非特異的吸着を高める原因になると考えられ
る。 従って、短いアルキル鎖に対してNH基、CO基の割合が
多く、アミド結合を形成するNHS−ビオチン法およびNHS
エステル法では濾紙自体の発光がほとんどなく、非特異
的吸着も極めて低い結合方法を可能にする。 実施例２ NHSエステル法及びグルタルアルデヒド法によって調製
したアビジン結合ガラス繊維濾紙を用いたCEA（カルシ
ノエンブリオニックアンチゲン：癌胎児性抗原）検量線
の作成 １）CEA濃度既知の試料30μ、ビオチニル化抗CEAモノ
クロナール抗体５μｇ（10μ）及びアクリジニウムエ
ステル（アクリジニウムＩ）標識抗CEAモノクロナール
抗体0.1μｇ（10μ）を混合し、室温５分間インキュ
ベートする。 ２）上記反応液50μを、直径13mm、厚さ0.45mmのアビ
ジン結合ガラス繊維濾紙に含浸させ、室温で10分間イン
キュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄し（B/F分離）、これに発光開始試薬として0.3％過酸
化水素溶液（1NNaOH水溶液中）を濾紙に添加することに
よりアクリジニウムＩを発光させ、濾紙上の発光量をル
ミフォトメーターTD−4000により測定する。 以上の測定を２種類アビジン結合ガルス繊維濾紙（NH
Sエステル法及びグルタルアルデヒド法）を用いて行っ
た。 第１図に各々の結合法による検量線を示した。グルタ
ルアルデヒド法では、最小検出感度は20ng/mlであった
が、NHS−エステル法では0.3ng/mlの最小検出感度が得
られている。このように結合法としてNHS−エステル法
を用いることにより高感度化が可能となる。 実施例３ 抗原抗体反応及びアビジン−ビオチン反応のタイムコー
ス 抗原抗体反応のタイムコース： １）所定のAFP（アルファフェトプロテイン）濃度の試
料30μ、ビオチニル化抗AFPモノクロナール抗体５μ
ｇ（10μ）及びアクリジニウムエステル（アクルジニ
ウムＩ）標識抗AFPポリクロナール抗体0.1μｇ（10μ
）を混合し、室温で経時的に反応させる。 ２）上記反応液50μを、直径13mm、厚さ0.45mmのアビ
ジン結合ガラス繊維濾紙（NHSエステル法）に含浸さ
せ、室温10分間インキュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄し（B/F分離）、実施例２と同様にアクリジニウムＩ
を発光させ、濾紙上の発光量を自社製フォトンカウンタ
ーにより測定する。 アビジン−ビオチン反応タイムコース： １）所定のAFP濃度の試料30μ、ビオチン化抗AFPモノ
クロナール抗体５μｇ（10μ）及びアクリジニウムエ
ステル（アクリジニウムＩ）標識抗AFPポリクロナール
抗体0.1μｇ（10μ）を混合し、室温10分間インキュ
ベートする。 ２）上記反応液50μを直径13mmのアビジン結合ガラス
繊維濾紙（NHSエステル法）に含浸させ、室温で経時的
に反応させる。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄し（B/F分離）、上記と同様に発光させ、濾紙上の発
光量を測定する。 第２図および第３図に各反応のタイムコースを示し
た。抗原抗体反応は３分前後で、アビジン−ビオチン反
応は１分前後で平衡に達している。マイクロプレートや
ビーズを用いた通常の固相上での反応では平衡に達する
のに数時間を要するのに比べ、極めて顕著な反応速度の
向上である。 この結果から抗原抗体反応３分、アビジン−ビオチン
反応１分（発光の測定は数秒）という非常に迅速な免疫
測定系が構成できる。 実施例４ AFP検量線 １）AFP濃度既知の試料６μ、PBS（リン酸緩衝化生理
食塩水）24μ、ビオチニル化抗AFPモノクロナール抗
体４μｇ（10μ）及びアクリジニウムエステル（アク
リジニウムＩ）標識抗AFPモノクロナール抗体0.1μｇ
（10μ）を混合し、室温で３分間インキュベートす
る。 ２）上記反応液50μを、直径13mm、厚さ0.45mmのアビ
ジン結合ガラス繊維濾紙（NHS−ビオチン法）に含浸さ
せ、室温１分間インキュベーションする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄（B/F分離）し、実施例２と同様にアクリジニウムＩ
を発光させ、濾紙上の発光量を、自社製フォトンカウン
ターにより測定する。 実施例５ インスリン検量線 １）インスリン濃度既知の試料10μ、PBS20μ、ビ
オチニル化抗インスリンモノクロナール抗体0.1μｇ（1
0μ）、アクリジニウムエステル（アクリジニウム
Ｉ）標識抗インスリンモノクロナール抗体0.05μｇ（10
μ）を混合し、室温で３分間インキュベートする。 ２）上記反応液50μを直径13mmのアビジン結合ガラス
繊維濾紙（NHS−ビオチン法）に含浸させ、室温１分間
インキュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄し（B/F分離）、実施例２と同様に発光させ、濾紙上
の発光量を、自社製フォトンカウンターにより測定す
る。 第４図および第５図にAFP及びインスリンの検量線を
示した。 実施例６ T4検量線 １）T4（サイロキシン）濃度既知の試料５μ、ANS
（８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸）を含むPB
S25μ、ビオチニル化抗T4ポリクロナール抗体0.1μｇ
（10μ）、アクリジニウムエステル（アクリジニウム
Ｉ）標識T410μを混合し、室温で５分間インキュベー
トする。 ２）上記反応液50μを、直径13mm、厚さ0.45mmのアビ
ジン結合ガラス繊維濾紙（NHS−ビオチン法）に含浸さ
せ、室温で１分間インキュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄し（B/F分離）、実施例２と同様に発光させ、濾紙上
の発光量を自社製フォトンカウンターにより測定する。 第６図にT4の検量線を示した。 実施例７ HBS抗体検量線 １）HBS抗体陽性の試料（PBSにより段階希釈したもの）
30μ、ビオチニル化HBS抗原10μ、アクリジニウム
エステル（アクリジニウムＩ）標識抗HBSポリクロナー
ル抗体10μを混合し、室温で５分間インキュベートす
る。 ２）上記反応液50μを、直径13mm、厚さ0.45mmのアビ
ジン結合ガラス繊維濾紙（NHS−ビオチン法）に含浸さ
せ、室温で１分間インキュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をPBS−Tweenにより洗
浄し（B/F分離）、実施例２と同様に発光させ、濾紙上
の発光量を自社製フォトンカウンターにより測定する。 第７図にHBS抗体の検量線を示した。
第１図は、実施例２で得たCEA検量線である。 第２図は、実施例３での抗原抗体反応のタイムコースで
ある。 第３図は、実施例３でのアビジン−ビオチン反応のタイ
ムコースである。 第４図は、実施例４で得たAFP検量線である。 第５図は、実施例５で得たインスリン検量線である。 第６図は、実施例６で得たT4検量線である。 第７図は、実施例７で得たHBs抗体検量線である。
ある。 第３図は、実施例３でのアビジン−ビオチン反応のタイ
ムコースである。 第４図は、実施例４で得たAFP検量線である。 第５図は、実施例５で得たインスリン検量線である。 第６図は、実施例６で得たT4検量線である。 第７図は、実施例７で得たHBs抗体検量線である。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−30963（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−317389（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−118659（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−156155（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−66460（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/543 G01N 33/53 G01N 33/552
Claims (5)
- 【請求項１】流体試料中の抗原を測定する方法であっ
て、 （ａ）該流体試料を、流体試料中の該抗原に対して特異
的に反応する、ビオチンで標識した第１の抗体、および
該抗原に対して特異的に反応する、化学発光物質で標識
した第２の抗体と共にインキュベートし、第１の抗体−
抗原−第２の抗体から成る免疫複合体を形成し、 （ｂ）前記（ａ）工程の反応混合物を、アビジンまたは
ストレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体に含浸
させてインキュベートし、該免疫複合体をアビジン・ビ
オチン反応によりガラス繊維集合体上に捕捉し、 （ｃ）形成された不溶化アビジン−免疫複合体を保持し
たガラス繊維集合体を該反応混合物から分離し、 （ｄ）不溶化アビジン−免疫複合体中の化学発光物質を
発光開始試薬により発光させ、ガラス繊維集合体上で発
光量を測定する化学発光免疫測定法において、 （イ）ガラス繊維集合体を、アミノ基を有するシランカ
ップリング剤で処理し、 （ロ）導入したアミノ基にＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド基を導入したビオチンを反応させて、ガラス繊維上に
ビオチンを導入し、 （ハ）導入したビオチンにアビジンまたはストレプトア
ビジンを反応させることにより得た、アビジンまたはス
トレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体、あるい
は （イ′）ガラス繊維集合体を、アミノ基を有するシラン
カップリング剤で処理し、 （ロ′）導入したアミノ基に無水コハク酸を作用させて
カルボキシル基を導入し、 （ハ′）導入したカルボキシル基にジシクロヘキシルカ
ルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン
とを反応させて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を導
入し、 （ニ′）導入したＮ−ヒドロキシスクシンイミド基にア
ビジンまたはストレプトアビジンを反応させることによ
り得た、アビジンまたはストレプトアビジンを結合した
ガラス繊維集合体 を用いることを特徴とする化学発光免疫測定法。 - 【請求項２】流体試料中の抗原を測定する方法であっ
て、 （ａ）該流体試料を、流体試料中の該抗原に対して特異
的に反応する、ビオチンおよび化学発光物質の一方で標
識した抗体、およびビオチンおよび化学発光物質の他方
で標識した抗原と共にインキュベートして、試料中の抗
原と標識抗原を競合的に標識抗体と反応させて、抗体と
試料中の抗原または標識抗原とから成る免疫複合体を形
成し、 （ｂ）前記（ａ）工程の反応混合物を、アビジンまたは
ストレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体に含浸
させてインキュベートし、該免疫複合体をアビジン・ビ
オチン反応によりガラス繊維集合体上に捕捉し、 （ｃ）形成された不溶化アビジン−免疫複合体を保持し
たガラス繊維集合体を該反応混合物から分離し、 （ｄ）不溶化アビジン−免疫複合体中の化学発光物質を
発光開始試薬により発光させ、ガラス繊維集合体上で発
光量を測定する化学発光免疫測定法において、 （イ）ガラス繊維集合体を、アミノ基を有するシランカ
ップリング剤で処理し、 （ロ）導入したアミノ基にＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド基を導入したビオチンを反応させて、ガラス繊維上に
ビオチンを導入し、 （ハ）導入したビオチンにアビジンまたはストレプトア
ビジンを反応させることにより得た、アビジンまたはス
トレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体、あるい
は （イ′）ガラス繊維集合体を、アミノ基を有するシラン
カップリング剤で処理し、 （ロ′）導入したアミノ基に無水コハク酸を作用させて
カルボキシル基を導入し、 （ハ′）導入したカルボキシル基にジシクロヘキシルカ
ルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン
とを反応させて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を導
入し、 （ニ′）導入したＮ−ヒドロキシスクシンイミド基にア
ビジンまたはストレプトアビジンを反応させることによ
り得た、アビジンまたはストレプトアビジンを結合した
ガラス繊維集合体 を用いることを特徴とする化学発光免疫測定法。 - 【請求項３】流体試料中の抗体を測定する方法であっ
て、 （ａ）該流体試料を、流体試料中の該抗体に対して特異
的に反応する、ビオチンおよび化学発光物質の一方で標
識した抗原、および該抗体に対して特異的に反応する、
ビオチンおよび化学発光物質の他方で標識した抗体と共
にインキュベートし、標識抗原−試料抗体−標識抗体か
ら成る免疫複合体を形成し、 （ｂ）前記（ａ）工程の反応混合物を、アビジンまたは
ストレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体に含浸
させてインキュベートし、該免疫複合体をアビジン・ビ
オチン反応によりガラス繊維集合体上に捕捉し、 （ｃ）形成された不溶化アビジン−免疫複合体を保持し
たガラス繊維集合体を該反応混合物から分離し、 （ｄ）不溶化アビジン−免疫複合体中の化学発光物質を
発光開始試薬により発光させ、ガラス繊維集合体上で発
光量を測定する化学発光免疫測定法において、 （イ）ガラス繊維集合体を、アミノ基を有するシランカ
ップリング剤で処理し、 （ロ）導入したアミノ基にＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド基を導入したビオチンを反応させて、ガラス繊維上に
ビオチンを導入し、 （ハ）導入したビオチンにアビジンまたはストレプトア
ビジンを反応させることにより得た、アビジンまたはス
トレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体、あるい
は （イ′）ガラス繊維集合体を、アミノ基を有するシラン
カップリング剤で処理し、 （ロ′）導入したアミノ基に無水コハク酸を作用させて
カルボキシル基を導入し、 （ハ′）導入したカルボキシル基にジシクロヘキシルカ
ルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン
とを反応させて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を導
入し、 （ニ′）導入したＮ−ヒドロキシスクシンイミド基にア
ビジンまたはストレプトアビジンを反応させることによ
り得た、アビジンまたはストレプトアビジンを結合した
ガラス繊維集合体 を用いることを特徴とする化学発光免疫測定法。 - 【請求項４】流体試料中の抗体を測定する方法であっ
て、 （ａ）該流体試料を、流体試料中の該抗体に対して特異
的に反応する、ビオチンおよび化学発光物質の一方で標
識した抗原、および該標識抗原に対して特異的に反応す
る、ビオチンおよび化学発光物質の他方で標識した抗体
と共にインキュベートし、試料抗体と標識抗体を競合的
に標識抗原と反応させて、標識抗原と試料抗原または標
識抗体から成る免疫複合体を形成し、 （ｂ）前記（ａ）工程の反応混合物を、アビジンまたは
ストレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体に含浸
させてインキュベートし、該免疫複合体をアビジン・ビ
チオン反応によりガラス繊維集合体上に捕捉し、 （ｃ）形成された不溶化アビジン−免疫複合体を保持し
たガラス繊維集合体を該反応混合物から分離し、 （ｄ）不溶化アビジン−免疫複合体中の化学発光物質を
発光開始試薬により発光させ、ガラス繊維集合体上で発
光量を測定する化学発光免疫測定法において、 （イ）ガラス繊維集合体を、アミノ基を有するシランカ
ップリング剤で処理し、 （ロ）導入したアミノ基にＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド基を導入したビオチンを反応させて、ガラス繊維上に
ビオチンを導入し、 （ハ）導入したビオチンにアビジンまたはストレプトア
ビジンを反応させることにより得た、アビジンまたはス
トレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体、あるい
は （イ′）ガラス繊維集合体を、アミノ基を有するシラン
カップリング剤で処理し、 （ロ′）導入したアミノ基に無水コハク酸を作用させて
カルボキシル基を導入し、 （ハ′）導入したカルボキシル基にジシクロヘキシルカ
ルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン
とを反応させて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を導
入し、 （ニ′）導入したＮ−ヒドロキシスクシンイミド基にア
ビジンまたはストレプトアビジンを反応させることによ
り得た、アビジンまたはストレプトアビジンを結合した
ガラス繊維集合体 を用いることを特徴とする化学発光免疫測定法。 - 【請求項５】流体試料中の抗体を測定する方法であっ
て、 （ａ）該流体試料を、流体試料中の該抗体に対して特異
的に反応する、ビオチンで標識した抗体、および流体試
料中の抗体に対して特異的に反応する、化学発光物質で
標識した抗原と共にインキュベートし、標識抗体−試料
抗体−標識抗原から成る免疫複合体を形成し、 （ｂ）前記（ａ）工程の反応混合物を、アビジンまたは
ストレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体に含浸
させてインキュベートし、該免疫複合体をアビジン・ビ
オチン反応によりガラス繊維集合体上に捕捉し、 （ｃ）形成された不溶化アビジン−免疫複合体を保持し
たガラス繊維集合体を該反応混合物から分離し、 （ｄ）不溶化アビジン−免疫複合体中の化学発光物質を
発光開始試薬により発光させ、ガラス繊維集合体上で発
光量を測定する化学発光免疫測定法において、 （イ）ガラス繊維集合体を、アミノ基を有するシランカ
ップリング剤で処理し、 （ロ）導入したアミノ基にＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド基を導入したビオチンを反応させて、ガラス繊維上に
ビオチンを導入し、 （ハ）導入したビオチンにアビジンまたはストレプトア
ビジンを反応させることにより得た、アビジンまたはス
トレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体、あるい
は （イ′）ガラス繊維合体を、アミノ基を有するシランカ
ップリング剤で処理し、 （ロ′）導入したアミノ基に無水コハク酸を作用させて
カルボキシル基を導入し、 （ハ′）導入したカルボキシル基にジシクロヘキシルカ
ルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン
とを反応させて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を導
入し、 （ニ′）導入したＮ−ヒドロキシスクシンイミド基にア
ビジンまたはストレプトアビジンを反応させることによ
り得た、アビジンまたはストレプトアビジンを結合した
ガラス繊維集合体 を用いることを特徴とする化学発光免疫測定法。
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1991
- 1991-11-27 EP EP19910120243 patent/EP0488195B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-27 DE DE1991616820 patent/DE69116820T2/de not_active Expired - Fee Related
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