JPH0466871A

JPH0466871A - 高感度な免疫測定法

Info

Publication number: JPH0466871A
Application number: JP18025490A
Authority: JP
Inventors: Eiji Ishikawa; 石川　栄治; Takeyuki Kono; 河野　武幸
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-07-07
Filing date: 1990-07-07
Publication date: 1992-03-03

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は高感度な免疫測定法に関する。更に詳しくは、
ビオチンとアビジンの結合又はビオチンとストレプトア
ビジンの結合を介して標識をした免疫反応物質を、アビ
ジン又はストレプトアビジンの共存下において用いた、
目的物質の免疫測定法に関する。

〔従来の技術〕

従来、免疫測定法による検体中の目的物質の定量的測定
は、該目的物質と免疫複合体を形成し得る免疫反応物質
に対して直接標識物を結合させ、該標識体と固相に結合
した他の免疫反応物質との間で、サンドインチ状に該目
的物質の免疫複合体を固相上に形成せしめ、次いで、固
相に結合した標識物を測定する免疫測定法が広く行なわ
れている。

例えば、標識物が酵素であり検体中の目的物質が抗体の
場合は、酵素標識抗体と固相に結合した抗原とで目的物
質である抗体とのサンドインチ状免疫複合体を固相上に
形成し、固相に結合した酵素の活性を測定する方法が一
般的に用いられている。また、検体中の目的物質が抗原
の場合は、酵素標識抗体と固相に結合した抗体とで、目
的物質である抗原とのサンドイッチ状免疫複合体を固相
上に形成し、固相に結合した酵素の活性を測定する方法
が一般的に用いられている。

しかし、抗原、抗体等の目的物質の測定における最大の
問題点は、標識体の固相への非特異結合にある。標識体
の固相への非特異結合の原因には、標識体の固相への直
接の非特異結合と検体中の標識体と結合可能な物質の非
特異結合を介しての２種類に大別される。この非特異結
合の影響をできるだけ低減せしめることにより、測定感
度の上昇及び測定値の信頼性を向上する方法が幾つか発
表されている。例えば、酵素標識体の固相への直接の非
特異結合を低減するため、酵素標識体の製造方法が種々
検討されている〔石川ら、「蛋白質・核酸・酵素」別冊
Ｎｏ。３１．３７〜４５（１９Ｂ？）］　。また、検体
中の標識体と結合可能な物質の固相への非特異結合は、
目的物質が抗体の場合、重要な問題であるが、この場合
の非特異結合を低減する方法として、標識抗原と固相に
結合した抗原とで目的物質である抗体とのサンドイッチ
状免疫複合体を固相上に形成し、固相に結合した標識物
を測定する方法が報告されている（遠藤ら、Ｃｌ１ｎ、
Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、　１０３．６フー７７　（１９
８０））。

最近、改良方法として抗原を直接結合した固相の代ワリ
に、ジニトロフェニル基のようなハブテンを結合した抗
原を用いて、目的物質である抗体と標識抗原のサンドイ
ッチ状免疫複合体を形成し、酸サンドイッチ状免疫複合
体を抗ジニトロフェニル基抗体のような抗ハプテン抗体
を結合した固相に結合し、固相に結合した標識物を測定
する方法が報告されている。この方法は、抗原と特異抗
体との反応を溶媒中で行い、形成されたサンドイッチ状
免疫複合体を結合能の高い結合で固相に結合することが
でき、短時間で高感度の抗体測定が可能となった（特開
平１−３１２４６４号）。

更に、標識体の固相への非特異結合を低減させる方法が
本発明者により開発されている。即ち、上述のような固
相上に形成された検体中の目的物質、標識物及び免疫反
応物質からなるサンドイッチ状免疫複合体を固相から溶
出せしめた後、標識物を測定する方法である。例えば、
抗体の測定において、サンドイッチ状免疫複合体を結合
した固相にハブテンを加えることにより、固相よりサン
ドイッチ状免疫複合体を溶出せしめ、溶出液中の酵素活
性を測定することにより、さらに高感度の測定が可能と
なった（特願平１−１７８７３号）。

また、この溶出液を抗抗体の結合した固相に結合させる
ことにより、抗体のクラス別の測定（Ｉｍｍｕｎｅ　Ｃ
ｏｍｐｌｅｘ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｍｅｔｈｏｄ法）も
可能となった（特開平２−２８５５８号）。

このように、標識体を用いる抗原、抗体等の測定は有用
な方法であり、種々の改良方法が提案されている。

例えば、抗体、抗原であるタンパク質やベプタイド等の
酵素標識体の製造方法としては、種々の酵素標識法が開
発されてきた。抗体、抗原の酵素標識法の開発について
は石川ら（蛋白質・核酸・酵素、前出）に記載されいて
る。・つまり、古くは抗体のアミノ基と酵素のアミノ基
を利用したグルタルアルデヒド法が用いられてきた。近
年、新しい二官能性架橋剤が開発され、アミノ基同士で
はなく一方のアミノ基と他方のチオール基を用いること
により、重合体の生成を抑制し、測定感度の向上が達成
されてきている。

しかし、従来の方法を用いての酵素標識体の製造は、い
ずれも生理活性物質である抗原、抗体と酵素を直接結合
させるものであるため、反応が微妙で再現性に問題があ
る、製造に一定以上のサンプル量が必要であり応用でき
る範囲に限界がある、等の問題が指摘されているのが実
情であった。即ち、−船釣に抗体の酵素標識においても
、抗体のクラスにおける違いのみならず抗体側々におい
ても最適条件が異なる。特に、臨床診断上に重要な抗体
に対する抗原は不安定であったり、溶解するため特殊な
条件の検討が必要であったり、一つの抗原中に−ｒアミ
ノ基チオール基が共存する場合には、既存の二官能性架
橋剤では抗原の重合体が生成したりする等の問題がある
。そのため、抗原ごとに標識方法、標識条件の検討をす
る必要があった。また、分子量の大きい抗原と酵素を反
応させるには、両者の濃度を上げる必要があり、また少
しの条件の変化が標識体の性質に影響し、再現性が悪い
ことも指摘されていた。更に、場合によっては、現在の
直接標識技術では標識体が得られない場合がある例えば、ＨＴＬＶ−１、ＨＣＶ、ＨＢｓやＨＩＶのよう
なウィルス抗体に必要な抗原およびアセチルコリンリセ
ブターやＴＳＨ’Ｊセプターのようなりセプター抗体測
定に必要なりセプターは膜タンパクであり、酵素との結
合が可能な濃度に抗原を溶解するには、界面活性剤を多
量に含む条件が必要である。しかし、この条件では多く
の酵素は活性を失うことになる。また、この問題を解決
するため、抗体の認識部分であるエピトープのベプタイ
ドを抗原として用いる方法もあるが、この場合、認識部
分にリジンやシスティンのような酵素標識の間に反応に
関与するアミノ酸を含む場合が多く、従来の直接酵素標
識法を用いることには限界があった。

また、最近、蛍光物質や発光物質を抗原や抗体に直接標
識した標識体も用いられているが、この場合にもリジン
やシスティンを認識部位に含むペブタイドにおいては直
接標識法を用いるには限界があった。

これらのことから、より簡単で応用範囲の広い酵素標識
法の開発が当業界で要請されているが、このような要請
に応えるものとして、ビオチン標識法が開発されている
。

例えば、ビオチン標識抗体及び抗体を結合したた固相を
用いて、検体中の抗原とサンドインチ状複合体を作製し
、次いで、アビジンやストレプトアビジンを結合した酵
素や蛍光物質等を反応させることにより、固相に結合し
た抗原量の測定を行なう方法である（Ｍ、　１Ｑｉｌｋ
ｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、　１７１．１−３２．１９８８）。

〔発明が解決しようとする課題〕

このビオチン標識体を用いた利点、欠点に関しては、Ｍ
、　Ｗｉｃｋｅｒ　ら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ−Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

前出）に記載されている。

この方法の利点は、ビオチンは安定な化合物であり、カ
ルボキシル基を有し、タンパク質やベブタイド等と容易
に反応し、サクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）
基等の官能基の導入が容易であり、この化合物を用いる
ことにより容易にかつ簡単にビオチンをタンパク質やペ
プタイド等に導入することができる点にある。既に様々
な官能基を導入した化合物が市販されている。

一方、ビオチンと結合能を有するアビジンやストレプト
アビジンに標識物を結合したアビジンやストレプトアビ
ジン標識体は、共通試薬であり、既に種々の標識物につ
いてのアビジン等との結合物が市販されており、容易に
合成や入手が可能である。ビオチンとアビジン、ストレ
プトアビジンの結合力は高く、希薄な溶液中でも定量的
に結合することができる。

しかしながら、このビオチン標識体を用いた方法の欠点
は、アビジンやストレプトアビジンを結合した標識物が
、固相に非特異的に結合しやすいため、測定感度が向上
しない点にある。特に検体中に微量にしか存在しない目
的物質について高感度に定量するには、アビジンやスト
レプトアビジン標識体の固相への非特異的結合による影
響を低減させる必要があり、そのような方法の開発が要
請されている。

従って、本発明の目的は、固相への非特異的結合の影響
を防止した高感度な免疫測定法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

かかる実情下、本発明者らは鋭意研究を重ねた。

そしてまず、抗原等の免疫反応物質のビオチン結合体と
アビジン標識体又はストレプトアビジン標識体とを結合
させて、予めビオチン−アビジン又はビオチン−ストレ
プトアビジンシステムを介した標識体を作成し、次に単
離精製した該標識体を用いてサンドイッチ型免疫測定を
、アビジン又はストレプトアビジンの共存下において行
ったところ、固相への非特異的結合が減少し感度が上昇
することを見出し、本発明を完成させた。

即ち、本発明は、一般式（ａ）又は（ｂ）で示されるビオチンとアビジン
の結合またはビオチンとストレプトアビジンの結合を介
した標識体、（ａ）　：　Ｘ−ビオチン−アビジン−標識物（ｂ）　
：　Ｘ−ビオチン−ストレプトアビジン−標識物（式中
、Ｘは抗原、抗体及び抗抗体からなる群から選ばれる免
疫反応物質を表す。）、及び固相化物質を用いて、アビ
ジン又はストレプトアビジンの共存下において検体中の
目的物質を含むサンドイッチ状免疫複合体を固相上に形
成せしめる工程を有することを特徴とする目的物質の免
疫測定法、に関するものである。

本発明における標識体において、Ｘは抗原、抗体及び抗
抗体からなる群から選ばれる免疫反応物質を表し、検体
中の目的物質と免疫複合体を形成し得るものである。従
って、例えば目的物質が抗体の場合、Ｘは抗原又は抗抗
体を、目的物質が抗原の場合、Ｘは抗体を表す。

ここで、抗原とは抗原抗体反応、免疫応答を誘起し得る
物質を言い、タンパク質、多糖、それらの複合体、脂質
との複合体等が挙げられ、またこれらの抗原の抗原決定
基を含むベブタイドをも表すものである。

ここで、抗体とは、抗体の一部である（Ｐａｂ）２やＦ
ａｂ’を含む。

ここで、標識物とは免疫測定法において使用できるもの
であれば特に限定されず、通常、酵素、発光物質、蛍光
物質、金属化合物、放射性物質が挙げられる。例えば、
酵素ではβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ
、アルカリホスファターゼ、発光物質としてはアクリジ
ウム塩、蛍光物質としてはフルオレセインイソチオシア
ネート、金属化合物としてはユーロピウム錯体、放射性
物質としては３Ｈ１＋４（：、　１２５１．　＋３１１
．３２ｐ等が用いられる。

本発明における標識体は、次のようにして容易に製造す
ることができる。即ち、まず抗原、抗体等の免疫反応物
質にビオチンを結合させ、次いで、該ビオチン結合体と
アビジンまたはストレプトアビジン標識体を反応せしめ
、必要に応じてカラム等を用いて精製することにより得
ることができる。

ビオチン結合体の製造は既存の公知技術に従って容易に
行なうことができる（Ｂａｙｅｒ、　Ｂ、＾、他。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６２
．３０８−３１５　（１９７９））。

即ち、ビオチンの誘導体、例えばサクシンイミド誘導体
と抗原等の免疫反応物質を緩衝液中で混合するか、又は
光反応で行なわれる。反応後、必要に応じて未反応のビ
オチン誘導体をカラム等を用いて除去する。

また、抗原等の免疫反応物質とビオチンとの間にスペー
サを入れることが望ましい場合がある。

例えば、抗原にグルタチオン基（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ
ｅ）を導入し、次いでビオチン誘導体を反応せしめるこ
とによって得ることもできる。

免疫反応物質が抗体又は分子量５万以上の抗原の場合、
抗体又は抗原１分子に結合するビオチンは通常１分子か
ら１０分子までであり、好ましくは１分子から４分子が
望ましい。

免疫反応物質が分子量５．０００以上５万未満の抗原又
は抗体の一部の場合、抗体１分子に結合するビオチンは
通常１分子から５分子までであり、好ましくは１分子か
ら２分子が望ましい。

免疫反応物質が分子量５．０００未満の抗原又は抗原の
抗原決定基を含むペプタイドの場合は、抗体１分子に結
合するビオチンは通常１分子から２分子までであり、好
ましくは１分子である。

アビジン又はストレプトアビジン標識体の製造も公知の
技術で容易に行なうことができる（　Ｈａ　ｙｅｒ他、
前出）。例えば、標識物が酵素の場合、β−ガラクトシ
ダーゼのアビジン標識酵素は、アビジンとＮ−サクシニ
ミジル−６−マレイミドへ圭すノエート　（Ｎ−ｓｕｃ
ｃｉｍｉｎｉｄｙｌ−６−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａ
ｎ。

ａｔｅ）を反応せしめることにより、アビジンまたはス
トレプトアビジンにマレイミド基を導入し、次いでβ−
ガラクトシダーゼと反応せしめることによって得ること
ができる。

酵素１分子に結合するアビジン又はストレプトアビジン
は、通常１分子から４分子までであり、好ましくは１分
子から２分子が望ましい。

標識物が発光物質や蛍光物質の場合、発光や蛍光を有す
る物質の反応体、例えばサクシンイミド基を有する反応
体とアビジン又はストレプトアビジンと混合することに
より得ることができる。

アビジン又はストレプトアビジン１分子に結合する発光
物質や蛍光物質の数は１分子から３０分子、通常２分子
から１０分子である。

ビオチン結合体とアビジン又はストレプトアビジン標識
体の反応は、両者の溶液を混合することによって得られ
る。例えば、ｐＨ６〜９の緩衝液中で、通常０〜４０℃
、好ましくは４〜３７℃で、通常１０分〜４８時間、好
ましくは１０分〜８時間反応させる。ビオチン結合体と
アビジン又はストレプトアビジン標識体の混合比率は、
モル比率で、通常０．　１〜１００であり、好ましくは
０゜３〜１０の範囲が望ましい。

免疫反応物質が低分子で容易に生成した標識体と未反応
ビオチン結合体の分離が容易な場合は、ビオチン結合体
を過剰に入れることができる。

免疫反応物質が高分子で容易に生成した標識体と未反応
アビジン又はストレプトアビジン標識体の分離が容易な
場合は、アビジン又はストレプトアビジン標識体を過剰
に入れることができる。

本発明の免疫測定法は、前記のような方法により得られ
た標識体及び固相化物質を用いて、アビジン又はストレ
プトアビジンの共存下において検体中の目的物質を含む
サンドイッチ状免疫複合体を固相に結合した後、標識物
を測定することにより目的物質の量を測定するものであ
る。ここで、固相化物質とは、目的物質を固相に結合さ
せ、サンドイッチ状免疫複合体を固相上に形成せしめる
ことのできる物質をいう。通常目的物質が抗原の場合は
抗体を、目的物質が抗体の場合は、抗原又は抗抗体等を
表すものである。面相化物質は固相上に結合させるか、
結合対の一方を標識して用いられる。

本発明において、アビジン又はストレプトアビジンを共
存させる方法としては、標識体としてビオチンとアビジ
ンの結合を介したものを用いる場合にはアビジンを、ビ
オチンとストレプトアビジンの結合を介したものを用い
る場合にはストレプトアビジンを標識体を加える際に、
通常同時に添加する。添加方法としては、例えばアビジ
ンを含む緩衝液中に固相化物質を溶解し、標識体と検体
中の目的物質を反応させる方法が挙げられる。本発明に
おいて、アビジン又はストレプトアビジンを共存させた
場合、アビジン等が固相に非特異的に結合するため、標
識体の固相への非特異的結合が妨げられるので、高感度
な免疫測定が可能となる。従って、アビジン等の添加量
はこのような標識体の固相への非特異的結合を妨げるに
充分な量であることが必要である。添加量は通常、１回
のアッセイにつき１〜３００μｇであり、好ましくは５
〜５０μｇである。１μｇよりも少ないと、固相への非
特異的結合の減少効果は充分ではなく、逆に３００μｇ
よりも多いと反応液の粘度が上昇し、反応上好ましくな
い。

次に、本発明の免疫測定法について説明する。

この方法には次の２つの方法に分類され４種の態様が例
示される。

第１の方法は、固相上に形成されたサンドイッチ状免疫
複合体中の標識物を測定する方法である。

第２の方法は固相上に形成されたサンドイッチ状免疫複
合体を固相より溶出した後、標識物を測定する方法であ
る。

まず、第１の方法の例である第１の態様は、標識体と固
相に結合した固相化物質とでアビジンまたはストレプト
アビジンの共存下において、測定対象物質である検体中
の目的物質とのサンドイッチ状免疫複合体を固相上に形
成し、固相に結合した標識物を測定する方法である。

測定方法としては、目的物質を含む検体と固相化物質と
を反応せしめ、検体を吸引径固相を洗浄し、次いで、固
相と標識体を反応せしめる。未反応の標識体を吸引し、
固相を洗浄した後、固相に結合した標識物を測定する。

あるいは、標識体、固相化物質、及び目的物質を含む検
体を同時に反応させ、反応液を吸引し、固相を洗浄した
後、固相に結合した標識物を測定する方法でもよい。測
定の条件は既知のサンドイツチ法免疫測定法と同様に行
なうことができる。

この第一の態様における固相化物質の製造は、既知のタ
ンパク質を固相に結合するいずれの方法であってもよい
。

例えば、固相としては、アガロース、ポリスチレン、ポ
リアクリル、テフロン、紙、ガラス等が通常用いられ、
好ましくはポリスチレンがよい。

抗原を固相に結合する方法としては、通常物理的吸着に
より行なうことができる。また、抗原がハプテンのとき
は、抗原を適当なキャリアタンパクと結合して、固相に
結合する。キャリアタンパクとしては、アルブミン、非
特異イムノグロブリン等が挙げられる。また、抗体と結
合した固相の製造方法は、石川らによる方法（Ｓｃａｎ
ｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ。

１、、８．４３　（１９７８））の方法により行なうこ
とができる。

第１の方法の例である第２の態様は、検体中の目的物質
と免疫複合体を形成する固相化物質中の抗原等が第１の
態様では直接固相に結合しているのに対し、第２の態様
では、−組の結合対を有する物質の固定化物質を介して
サンドイッチ状免疫複合体を面相上に形成させる方法で
ある。ここでいう結合対とは、物理的結合によって強固
に選択的に結合できる物質の対をいう。例えば、ハプテ
ンと抗ハブテン抗体が例として挙げられる。本発明の結
合対にはビオチン−アビジン又はストレプトアビジンの
結合対は含まない。また、測定対象である目的物質と標
識体の反応に影響する結合対は用いることができない。

望ましい結合対はジニトロフェニル基と抗ジニトロフェ
ニル基抗体カ例示される。

固相化物質に標識する結合対の一方（例えば、前記の例
ではジニトロフェニル基）は、低分子側が望ましい。即
ち、ハプテンと抗ハプテン抗体の結合対においては、ハ
プテンを抗原等に標識するのが望ましい。

このような望ましい結合対の一方としてジニトロフェニ
ル基が挙げられる。

結合対の一方を結合させた抗原又は抗体の製造法は公知
の方法によって得られる。例えば、橋田他、　Ｊ、　Ａ
ｐｐｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　６．５６　（１９８４
）に記載されたようにＮ−サクシニミジル−６−マレイ
ミドヘキサノエートを架橋剤として用いて容易に得るこ
とができる。

結合対の他方（例えば、前記の例では抗ジニトノフェニ
ル基抗体）は、一方がハプテンの場合抗ハプテン抗体で
ある。このような望ましい結合対の他方として、抗ジニ
トロフェニル基抗体が挙げられる。

結合対の他方が結合した固相の製造方法は既知のタンパ
ク質を固相に結合するいずれの方法であってもよい。

測定方法としては、標識体と結合対の一方で標識した固
相化物質を目的物質を含む検体に加え、反応後、結合対
の他方が結合した固相に反応液を加え反応を行い、その
後、反応液を吸引し、固相を洗浄した後、固相に結合し
た標識物を測定する方法、あるいは標識体、結合対の一
方で標識した固相化物質、及び結合対の他方が結合した
固相を同時に目的物質を含む検体中に加え、反応後、反
応液を吸引し、固相を洗浄した後、面相に結合した標識
物を測定する方法である。後者の方がステップが少なく
、望ましい。

測定の条件は既知のサンドインチ法免疫測定法と同様の
方法で行なうことができる。

本発明においては第１の態様、第２の態様のいずれにお
いても、従来法に比し高感度の結果が得られるが、第２
の態様の方がより感度の高い結果が得られ、望ましい。

第２の方法の例である第３の態様は、第１又は第２の態
様で固相に結合したサンドイッチ状免疫複合体を溶出し
た後、溶出液中の標識物を測定する方法である。

標識体を用い、検体中の目的物質を含むサンドイッチ状
免疫複合体を形成せしめる方法として第１の態様を採っ
た場合には、抗原等を固相に結合する際に、サンドイッ
チ状免疫複合体を解離せずに溶出できる結合を介して結
合しておく必要がある。

望ましい方法は、第２の態様でサンドインチ状免疫複合
体を固相に結合し、洗浄後、結合対の−方またはそれを
含む化合物を加え、固相よりサンドイッチ状免疫複合体
を溶出することができる。

結合対の一方又はそれを含む化合物の具体例として、結
合対の一方で標識した抗原としてジニトロフェニル基標
識抗原を、結合対の他方が結合した固相として抗ジニト
ロフェニル基抗体を結合した面相を用いた時は、ジニト
ロフェノール−リジンが挙げられる。

溶出には、結合対の一方又はそれを含む化合物を０．１
〜１０ｍＭ含むｐＨ６，０〜９．０の緩衝液を加え、通
常０〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃、通常１０分〜
４８時間、好ましくは１〜６時間で行なうのが望ましい
。

第２の方法の例である第４の態様は、第３の態様で溶出
された免疫複合体を、新しい固相に結合する方法である
。新しい固相としては、サンドイッチ状免疫複合体を結
合する能力があり、標識体を結合する能力のない固相を
いう。望まし゛い固相として目的物質が抗体の場合、抗
抗体を結合した固相が挙げられる。特に抗抗体として、
ＩｇＧ。

Ａ、Ｍ等の抗体のクラスを識別できる抗体を選ぶことに
より、検体中の抗体のクラス別の抗体を測定することが
できる。

測定方法としては、第３の態様で結合対の一方又はそれ
を含む化合物と同時に新しい固相を加えると、サンドイ
ッチ状免疫複合体を固相から溶出と同時に新しい固相に
結合させることができ、望ましい方法である。その後、
反応液を吸引し、新しい固相を洗浄した後、新しい固相
に結合した標識物を測定する方法である。

標識物の測定は、通常の免疫測定法における測定と同様
に行われ、公知の方法で行うことができる。

標識体の固相への非特異的吸着の影響を低減するには、
第２の方法が好ましく、特に第４の態様が望ましい。

〔以下余白〕

〔実施例〕以下、実施例、参考例により本発明を更に詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの標準液の調製：アンギオテンシン■をグルタルアルデヒドを用いる公知
の方法で牛血清アルブミンと結合した。

このアンギオテンシン■−牛血清アルブミンを６乃至９
週間の間隔で完全フロインドアジュバントと共にニュー
シーラント　ホワイト　ラビットに免疫し、ウサギ抗ア
ンギオテンシン■抗血清を得た〔田中ら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　Ｂｉｏｐｈｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、１
６０．４０−４５　（１９８９）］。

この抗血清より、硫酸ナトリウムによる塩析とＤＥＡＥ
セルローズを用い、ＩｇＧを精製し、単位体積当りのＩ
ｇＧを測定した。

得られた全ＩｇＧを用いてＰａｂ’−ペルオキシダーゼ
を作成し〔田中ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｓ、
Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎｏ、前出〕、この標識体をアンギオテンシ
ン■−セファローズ４Ｂカラムに吸着させた。カラムに
附加されたペルオキシダーゼ活性のうち、５．１％が吸
着された。抗血清の全ＩｇＧ中の５．１％が抗アンギナ
テンシンＩＩｇＧであった。

この抗アンギナテンシンＩＩｇＧをウサギ血清で希釈し
て、種々の濃度のウサギ抗アンギナテンシン１１ｇＧの
標準液を調製した。

緩衝液：緩衝液Ａ：０．１Ｍ’Ｊン酸ナトリウム緩酸液トリウム
緩衝液調製し緩衝液Ａとした。

緩衝液Ｂ　：　５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，０を調製し緩衝液Ｂとした
。

緩衝液Ｃ：０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１ｇ／βウシ
血清アルブミン（フラクションＶ１アーマー社、カンカ
キ−、イリノイ州）　、１．０ｍＭ塩化マグネシウムお
よび１．０ｇ／β了ジ化ナトリウムを含む１０＋Ｊリン
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７、０を調製し緩衝液Ｃとし
た。

緩衝液Ｄ：１．０ｇ／Ａウシ血清アルブミン、１．０ｍ
Ｍ塩化マグネシウムおよび１、Ｏｇ／　ｌアジ化ナトリ
ラムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７゜
０を調製し緩衝液りとした。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定：β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ活性は、４−メチルウンベリフェリル　β−
Ｄ−ガラクトシドを基質として、３０℃、１５０分間反
応反応分知の方法で蛍光光学的に測定した〔今月ら、Ａ
ｎｎ、　Ｃ１１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

、２１．３１０−３１７（１９８４）　）。蛍光強度は
、１０−”Ｍ　４−メチルウンベリフェロンを溶解した
０、１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐ　Ｈ１０，３を
標準として測定した。

実施例１調製（１）マレイミド−アビジンの調製アビジン（アビジンＤ、ベクターラボラトリーズ社、カ
ルフォルニア）　３ｍｇを溶解した緩衝液ＡＯ，３ｍ１
．に、３．３ｍＭＮ−サクシニミジル−６−マレイミド
ヘキサノエート（同位化学研究所、熊本）のＮ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミド溶液３０μｌを加え３０℃、３０分
間反応した。反応液からセファデックスＧ−２５のカラ
ム（１，ＯＸ　３０ｃｍ　）を用い、緩衝液Ｂを溶出液
として精製した。

アビジンの量は２８０ｎｍの吸光係数を１．４ｇ−’、
　１ｉｔｅｒ、　ｃｍ−’、分子量を６８．０００とし
て計算した。アビジン１分子当たり１．０個のマレイミ
ド基が結合していた。

（２）　　β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−アビジンの調製
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ２．　Ｏｍｇ　（３，７ｎｍ
ｏｌ）を溶解した緩衝液８８０μｍに、マレイミド−ア
ビジン０、５ｍｇ（７，４ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液
Ｂ　０．５４Ｔｄ！を加え４℃、２００時間反応た。反
応液からウルトロゲルＡｃＡ２２のカラム（１，５Ｘ　
４５ｃｍ）を用い、緩衝液Ｃを溶出液として精製した。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１分子当たり１．２個のアビ
ジンが結合していた。

（３）マレイミドーアンギオテンシン■の調製アンギオ
テンシン１　１．５ｍｇ（１，２μｍｏｌ）を溶解した
蒸留水０．１３−と０．１．ＭＩＪン酸ナトナトリウム
緩衝液Ｈ７，５）　１．２ｄを混合し、混合液に５５ｍ
Ｍ　Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエー
トのＮ、　Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液０．１３−を
加え３０℃、３０分間反応した。反応液からセファデッ
クスＧ−１０のカラム（１，ＯＸ　４５）を用い、緩衝
液Ｂを溶出液として精製した。

（４）グルタチオンーアンギオテンシン■の調製マレイ
ミドーアンギオテンシンＩ　　Ｏ，６９ｍｇ（０，４６
μｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ｂ２艷に１．３．１ｍＭグ
ルタチオンを含む緩衝液ＢＯ０２−を加え３０℃、３０
分間反応した。反応後、０．ＩＭＮ−エチルマレイミド
を含む緩衝液８２０μｌを加え、３０℃、３０分間反応
した。

（５）　　ｌ：：−オチニルーグルタチオンーアンギオ
テンシンＩ／７）調製〔４〕のグルタチオンーアンギオテンシンＩ溶液２゜２
ｍｌに、１．０Ｍ水酸化ナトリウム１３０μβを加え、
ｐＨ７，２に調整後、３４ｍＭビオチン−Ｎ−ハイドロ
キシサクシニミドのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液
０．２−を加え、３０℃、３０分間反応した。反応液か
らセファデックスＧ−１０のカラム（１、ＯＸ４５Ｃｍ
）を用い、緩衝液Ａを溶出液として精製した。

（６）　　β−Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジンービオ
チ：−）Ｌ、−クルタチオンーアンギオテンシン■の調
製 β−Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジン０．２２ｍｇ（０
，３６ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ｃ１，５−に、ビオ
チニルーグルタチオンーアンギオテンシン１７３μｇ　
（３，６ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ａ０．３ｍｌを加
え、３０℃、３時間反応した。反応液からウルトロゲル
ＡｃＡ４４のカラム（１，Ｏｘ　４５ｃｍ　）を用い、
緩衝液Ｃを溶出液として精製した。

製ウシ血清アルブミンにＳ−アセチルメルカプトサクシニ
ック・アンハイドライドを用いる公知の方法でチオール
基を導入し、マレイミド基を導入シタジニトロフエニル
−し−リジンと反応した〔河野ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　
Ｌａｂ、　Ａｎａｌ、、　２．２０９−２１４　（１９
８８）　）。

ウシ血清アルブミンの量は２８０ｎｍの吸光係数を０．
６３ｇ　”−’、　ｌｉｔｅｒｌｃｍ−’、分子量を６
６、２００として計算した。ジニトロフェニル基の量は
３６０ｎｍの吸光係数を１７．４００　ｍｏｌ−’、　
ｌｉｔｅｒｌｃｍ−’として計算した。

２８０ｎｍと３６０ｎｍの吸光度測定から、ウシ血清ア
ルブミン１分子当たり５．５個のジニトロフェニル基が
結合していた。

（２）メルカプトアセチル−ジニトロフェニル−ウシ血
清アルブミンの調製ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン３．７　ｍｇを
溶解した緩衝液Ａ　Ｌ　Ｏｍｌ、に、３．３ｍＭＮ−サ
クシニミジル−８−アセチルチオアセテートのＮ、Ｎ−
ジメチルホルムアミド溶液０．１−を加え、３０℃、３
００分間反応た。反応後、ＩＭ）！Ｊスス−酸緩衝液（
ｐ）Ｉ７．０）　５０μｊｉ！、　０．１　Ｍ　ＢＤＴ
Ａ（ｐＨ７，０）　５０μβ及び１Ｍヒドロキシルアミ
ン溶液（ｐＨ７，０）　７５μｌを添加し、３０℃で１
５分間反応した後、反応液からセファデックスＧ−２５
のカラム（１，ＯＸ　３０ｃｍ　）を用い、緩衝液Ｂを
溶出液として精製した。ジニトロフェニル−ウシ血清ア
ルブミン１分子当たり２．３個のチオール基が結合して
いた。

（３）マレイミド−アビジンの調製マレイミド−アビジンは、前項に従って調製した。

（４）　　ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン−ア
ビジンの調製メルカプトアセチル−ジニトロフェニル−ウシ血清アル
ブミン１．Ｏｍｇ　（１５ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液
８０．７−に、マレイミド−アビジン１．０ｍｇ　（１
５ｎｍ。

１）を溶解した緩衝液Ｂ１．１−を加え、４℃、２００
時間反応た。反応液をウルトロゲル＾ｃＡ４４のカラム
（１，５ｘ　ｉｏｏ　ｃｍ）を用い、緩衝液Ａを溶出液
として精製した。

２８Ｏｒ＋＋ｎと３６０　ｎｍの吸光度測定から、ウシ
血清アルブミン１分子当たり１．１個のアビジンが結合
していた。

〔５）ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミンーアビジ
ンービオチニルーグルタチオンーアンギオテンシン■の
調製ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン−アビジン４８
μｇ　（０，３６ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ａ　１．
７　ｍｌに、ビオチニルーグルタチオンーアンギオテン
シンＩ　　７３　μｇ　（３６ｎｍｏ］、）を溶解した
緩衝液Ａ　０．３　ｍｌを加え、３０℃、３時間反応し
た。反応液からウルトロゲルＡｃＡ４４のカラム（１，
ＯＸ　４５ｃｍ　）を用い、緩衝液Ｃを溶出液として精
製した。

調製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　
ＩｇＧをジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン−セフ
ァローズ４Ｂのカラムに吸着後、ｐＨ２゜５で溶出した
。このアフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニル
ーウシ血清了ルブミン）ＩｇＧの０．１ｇ／β溶液を用
いて、３．２ｍｍΦのポリスチレンビーズ表面上に公知
の方法〔石川ら、５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、第８巻（補７）４３頁（１９７８）　］で物理吸着に
より不溶化した。

（４）ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの測定ウサギ
抗アンギナテンシンＩＩｇＧの標準液２０μｌを０．３
３Ｍ　ＮａＣ１及び７７ｍｇ／ｊｌ’アビジンを含む緩
衝ｉＤ　１３０μｌに溶解したジニトロフェニル−ウシ
血清アルブミン−アビジン−ビオチニル−グルタチオン
−ＴンギオテンシンＩ　（１００ｆｍｏｌ）及びβＤ−
ガラクトシダーゼーアビジンービオチニルグルタチオン
ーアンギオテンシンＩ　（１００ｆｍｏｌ）と共に２０
℃にて３時間振盪下保温する。保温後、反応液ヲアフィ
ニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清ア
ルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相（２個）と共に２０℃に
て３時間振盪下保温、その後、４℃にて一晩静置した。

その後、アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニ
ルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相を０．　
Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ２−で２回洗浄後、結
合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。

その結果を第１図に示した。

参考例１ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミンーアビジンービ
オチニルーグルタチオンーアンギオテンシン■、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼーアビジンービオチニルーグルタチ
オンーアンギオテンシン■及びアフィニティー精製ウサ
ギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　Ｉｇ
Ｇ不溶化固相は実施例１の方法で調製した。

ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの測定ウサギ抗アン
ギナテンシンＩＩｇＧの標準液２０μｌを０．３３Ｍ　
ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ１３０μＡに溶解したジニトロ
フェニル−ウシ血清アルブミンーアビジンービオチニル
ーグルタチオンーアンギオテンシンＩ　（１００ｆｍｏ
ｌ）及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジンービオチ
ニルーグルタチオンーアンギオテンシンＩ　（１００ｆ
ｎ＋ｏｌ）と共に２０℃にて３時間振盪下保温する。保
温後、反応液をアフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロ
フェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相（
２個）と共に２０℃にて３時間振盪下保温、その後、４
℃にて一晩静置した。その後、アフィニティー精製ウサ
ギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　Ｉｇ
Ｇ不溶化固相を０、ＩＭＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ２ｍｆ
で２回洗浄後、結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性
を測定した。

その結果を第１図に示した。

実施例２ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミンーアビジンービ
オチニルーグルタチオンーアンギオテンシン■、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼーアビジンービオチニルーグルタチ
オンーアンギオテンシン■及びアフィニティー精製ウサ
ギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　Ｉｇ
Ｇ不溶化固相は実施例１の方法で調製した。

ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの測定ウサギ抗アン
ギナテンシンＩＩｇＧの標準液２０μｌを０．３３Ｍ　
Ｎａ［：］及び７７ｍｇ／ｊ！アビジンを含む緩衝液Ｄ
　１３０μｍに溶解したジニトロフェニル−ウシ血清ア
ルブミンーアビジンービオチニルーグルタチオンーアン
ギオテンシンＩ　（１００ｆｍｏｌ）　及ＵβＤ−ガラ
クトシダーゼーアビジンービオチニルグルタチオンーア
ンギオテンシンＩ　（１００ｆｍｏｌ）と共に２０℃に
て３時間振盪下保温する。保温後、反応液をアフィニテ
ィー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清了ルブ
ミン）　ＩｇＧ不溶化固相（２個）と共に２０℃にて３
時間振盪下保温、さらに４℃にて一晩静置した。その後
、アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウ
シ血清アルブミン）　ｒｇＧ不溶化固相を０．１　Ｍ　
Ｎａ［ｌ’ｌを含む緩衝液Ｄ２ｒｒｔｆ！で２回洗浄し
た。洗浄後、アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフ
ェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相を１
．０　ｍＭジニトロフェニル−Ｌ　−ＩＪリジンびＯＪ
Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ１５０μｌと共に２０℃に
て１時間振盪下保温する。

保温後、アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニ
ルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相を取り去
り、溶液中に含まれるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を
測定した。

その結果を第２図に示した。

参考例２ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン−了ビジンービ
オチニルーグルタチオンーアンギオテンシン■、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼーアビジンビオチニルーグルタチオ
ンーアンギオテンシン■及びアフィニティー精製ウサギ
（抗ジニトロフェニルーウシ血清了ルブミン）　ＩｇＧ
不溶化固相は実施例１の方法で調製した。

ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの測定ウサギ抗アン
ギナテンシンＩＩｇＧの標準液２０μｌを０．３３Ｍ　
ＮａＣ１を含む緩衝液ＤＩ３０μＡに溶解したジニトロ
フェニル−ウシ血清アルブミン−アビジン−ビオチニル
−グルタチオン−了ンギオテンシンＩ　（１００ｆｍｏ
ｌ）及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−アビジン−ビオチ
ニル−グルタチオン−了ンギオテンシンＩ　（１００ｆ
ｍｏｌ）と共に２０℃にて３時間振盪下保温する。保温
後、反応液を了フィニティ精製ウサギ（抗ジニトロフェ
ニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相（２個
）と共に２０℃にて３時間振盪下保温、その後、４℃に
て一晩静置した。その後、アフィニティー精製ウサギ（
抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不
溶化固相を０．　Ｉ　Ｍ　Ｎａ１ｌを含む緩衝液Ｄ２−
で２回洗浄した。洗浄後、Ｔフイニテイー精製ウサギ（
抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不
溶化固相ｔ４．０ｍＭジニトロフェニル−Ｌ−リジン及
び０．３　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ　１５０μβと
共に２０℃にて１時間振盪下保温する。保温後、アフィ
ニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清ア
ルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相を取り去り、溶液中に含
まれるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。

その結果を第２図に示した。

実施例３ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミンーアビジンービ
オチニルーグルタチオンーアンギオテンシン■、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼーアビジンービオチニルーグルタチ
オンーアンギオテンシン■及びアフィニティー精製ウサ
ギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン＞ＩｇＧ
不溶化固相は実施例１の方法で調製した。

（１）アフィニティー精製（抗ウサギＩｇＧ）　ＩｇＧ
不溶化固相の調製（抗ウサギＩｇＧ）　ＩｇＧをウサギＩｇＧ−セファロ
ーズ４Ｂのカラムに吸着後、９Ｈ２，５で溶出した。こ
のアフィニティー精製ウサギ（抗ウサギＩｇＧ）　Ｉｇ
Ｇの０．１ｇ／ｌ溶液を用いて、３．２　ｍｍ中のポリ
スチレンビーズ表面上に公知の方法〔石川ら、５ｃａｎ
ｄ。

Ｊ、Ｉ＋ｎ＋ｙ＋ｕｎｏｌ、、前出］で物理吸着により
不溶化した。

（２）ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの測定ウサギ
抗アンギナテンシンＩＩｇＧの標準液２０μｌを０．３
３　Ｍ　ＮａＣｌ及び７７ｍｇ／ｊ！アビジンを含む緩
衝液Ｄ１３０μβに溶解したジニトロフェニル−ウシ血
清アルブミン−アビジン−ビオチニル−グルタチオン−
了ンギオテンシンＩ　（１００ｆｍｏｌ）及びβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼーアビジンービオチニルーグルタチオ
ンーアンギオテンシンＩ　（１００ｆｍｏｌ）と共に２
０℃にて３時間振盪下保温する。保温後、反応液をアフ
ィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清
了ルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相（２個）と共に２０℃
にて３時間振盪下保温、その後、４℃にて一晩静置した
。その後、アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェ
ニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相を０．
１　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ２ｍｆで２回洗浄した
。洗浄後、アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェ
ニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化面相を１．
０　ｍＭジニトロフェニル−Ｌ　−ＩＪリジンび０．３
　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ１５０μｍとアフィニテ
ィー精製（抗ウサギＩｇＧ）　ＩｇＧ不溶化固相（２個
）と共に２０℃にて１時間振盪下保温する。保温後、ア
フィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血
清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相を取り去り、さらに
２０℃にて２時間振盪下保温した。アフィニティー精製
（抗ウサギＩｇＧ）　ＩｇＧ不溶化固相を０．１　Ｍ　
ＮａＣ１を含む緩衝液０２ｍ１．で２回洗浄後、結合し
たβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。

その結果を第３図に示した。

参考例３ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミンーアビジンービ
オチニルーグルタチオンーアンギオテンシン１１β−Ｄ
−ガラクトシダーゼーアビジンービオチニルーグルタチ
オンーアンギオテンシン■及びアフィニティー精製ウサ
ギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　Ｉｇ
Ｇ不溶化固相は実施例１の方法で調製した。アフィニテ
ィー精製（抗ウサギＩｇＧ）　ＩｇＧ不溶化固相は実施
例３の方法で調製した。

ウサギ抗アンギナテンシンＩ　ＩｇＧの測定ウサギ抗ア
ンギナテンシンＩＩｇＧの標準液２０μ！を０．３３　
Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ１３０μＡに溶解したジニ
トロフェニル−ウシ血清アルブミン−Ｔビジンービオチ
ニルーグルタチオンーアンギオテンシンＩ　（１００ｆ
ｍｏｌ）及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ°−アビジンー
ビオチニルーグルタチオンーアンギオテンシンＩ　（１
００ｆｍｏｌ）と共に２０℃にて３時間振盪下保温する
。保温後、反応液をアフィニティー精製ウサギ（抗ジニ
トロフェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固
相（２個）と共に２０℃にて３時間振盪下保温、その後
、４℃にて一晩静置した。その後、アフィニティー精製
ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン）　
ＩｇＧ　不溶化固相を０．１　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝
液Ｄ２ｍｌで２回洗浄した。洗浄後、アフィニティー精
製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）
　ＩｇＧ　不溶化固相を１．０　ｍＭジニトロフェニル
−し−リジン及び０．３　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ
１５０μｌとアフィニティー精製（抗ウサギＩｇＧ）　
ＩｇＧ不溶化固相（２個）と共に２０℃にて１時間振盪
下保温する。保温後、アフィニティー精製ウサギ（抗ジ
ニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化
固相を取り去り、さらに２０℃にて２時間振盪下保温し
た。

アフィニティー精製（抗ウサギＩｇＧ）　ＩｇＧ不溶化
固相を０．１　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ２ｍｌで２
回洗浄後、結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測
定した。

その結果を第３図に示した。

実施例４アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ
血清アルブミン）ＩｇＧ不溶化固相は実施例１の方法で
調製した。アフィニティー精製（抗ウサギＩｇＧ）　Ｉ
ｇＧ不溶化固相は実施例３の方法で調製した。

（１）ヒオチニルーアンギオテンシン■の調製アンギオ
テンシンＩ　　１．Ｏｍｇ（０，７７μｍｏｌ）を溶解
した蒸留水０．１８ｍ１と緩衝液Ａ１．６ｍ１ｌ！を混
合し、混合液に４４　ｍＭビオチン−Ｎ−ハイドロキシ
サクシニミドのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液０．
１Ｗを加え、３０℃、３０分間反応した。反応液からセ
ファデックスＧ−１０のカラム（１，ＯＸ　４５ｃｍ　
）を用い、緩衝液Ａを溶出液として精製した。

（２）　　β−Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジンービオ
チニルーアンギオテンシン■の調製実施例１で調製したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼアビジン
０．２２ｍｇ　（０，３６ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液
ＣＬ　５　ｍｆにビオチニルーアンギオテンシン■５．
５ｔ−ｔ　ｇ　（３，６ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ａ
０．３−を加え、３０℃、３時間反応した。反応液から
ウルトロゲルＡｃＡ４４のカラム（１，Ｏｘ　４５ｃｍ
　）を用い、緩衝液Ｃを溶出液として精製した。

製実施例１で調製したジニトロフェニル−ウシ血清アルブ
ミン−アビジン４８μｇ　（０，３６ｎｍｏｌ）を溶解
した緩衝液Ａ　１．７　ｍｌ、にビオチニルーアンギオ
テンシ’、／　Ｉ　　５．５μｇ　（３，６ｎｍｏｌ）
を溶解した緩衝液Ａ０゜３−を加え、３０℃、３０分間
反応した。反応液からウルトロゲルへＣへ４４のカラム
（１，ＯＸ　４５ｃｍ　）を用い、緩衝液Ｃを溶出液と
して精製した。

（３）ウサギ抗アンギオテンシンＩＩｇＧの測定ウサギ
抗アンギオテンシンＩＩｇＧの標準液２０μｍを０．３
３　Ｍ　ＮａＣｌ及び７７ｍｇ／ｊ！アビジンを含む緩
衝液Ｄ１３０μ矛に溶解したジニトロフェニル−ウシ血
清アルブミン−アビジン−ビオチニル−了ンギオテンシ
ンＩ　（１００ｆｍｏｌ）及びβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼーアビジンービオチニルーアンギオテンシンＩ　（１
００ｆｍｏｌ）と共に２０℃にて３時間振盪下保温する
。保温後、反応液をアフィニティー精製ウサギ（抗ジニ
トロフェニルーウシ血清アルブミン）ＩｇＧ不溶化固相
（２個）と共に２０℃にて３時間振盪下保温、さらに４
℃にて一晩静置した。その後、アフィニティー精製ウサ
ギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　Ｉｇ
Ｇ不溶化固相を０．ＩＭＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ２ｍｌ
で２回洗浄した。洗浄後、アフィニティー精製ウサギ（
抗ジニトロフェニルウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶
化固相を１．０　ｍＭジニトロフェニル−Ｌ−’Ｊリジ
ンび０．３　Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ１５０μβと
アフィニティー精製（抗ウサギＩｇＧ）　ＩｇＧ不溶化
固相（２個）と共に２０℃にて１時間振盪下保温する。

保温後、アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニ
ルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相を取り去
り、さらに２０℃にて２時間振盪下保温した。アフィニ
ティー精製（抗ウサギＩｇＧ）　ｉｇＧ不溶化固相を０
．１　Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ２ｒｄで２回洗浄後
、結合したβ−Ｄガラクトシダーゼ活性を測定した。

その結果を第４図に示した。

参考例４アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ
血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相は、実施例１の方
法で調製した。アフィニティー精製（抗ウサギＩｇＧ）
　ＩｇＧ不溶化固相は、実施例３の方法で調製した。β
−Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジンービオチニルーアン
ギオテンシン■及びジニトロフェニル−ウシ血清アルブ
ミン−アビジンビオチニル−了ンギオテンシンＩは、実
施例４の方法で調製した。

ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの測定ウサギ抗アン
ギナテンシンＩＩｇＧの標準液２０μｍを０．３３　Ｍ
　ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ１３０μｍに溶解したジニト
ロフェニル−ウシ血清アルブミンーアビジンービオチニ
ルーアンギオテンシンＩ　（１００ｆｍｏ１）及びβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジンビオチニルーアンギオ
テンシンＩ　（１００ｆｍｏｌ）と共に２０℃にて３時
間振盪下保温する。保温後、反応液をアフィニティー精
製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）
　ＩｇＧ不溶化固相（２個）と共に２０℃にて３時間振
盪下保温、さらに４℃にて一晩静置した。その後、アフ
ィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清
アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相を０．　Ｉ　Ｍ　Ｎａ
Ｃ１を含む緩衝液Ｄ２ｍｌで２回洗浄した。洗浄後、ア
フィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血
清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相を１．０　ｍＭジニ
トロフェニル−Ｌ−リジン及び０．３　Ｍ　ＮａＣ１を
含む緩衝液Ｄ１５０μβとアフィニティー精製（抗ウサ
ギ１ｇＧ）　ＩｇＧ不溶化固相（２個）と共に２０℃に
て１時間振盪下保温する。保温後、アフィニティー精製
ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）Ｉ
ｇＧ不溶化固相を取り去り、さらに２０℃にて２時間振
盪下保温した。アフィニティー精製（抗ウサギＩｇＧ）
　ＩｇＧ不溶化固相を０．１　Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝
液Ｄ２蔵で２回洗浄後、結合したβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ活性を測定した。

その結果を第４図に示した。

参考例５（１）　（抗ウサギＩｇＧ）　Ｆ−ｂ’−ペルオキシダ
ーゼの調製（抗ウサギＩｇＧ）　Ｆ　ａｂ’は、Ｎ−サクシニミジ
ル６−マレイミドヘキサノエートを架橋剤として、公知
の方法〔構出ら、Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
、　６．５６６３　（１９８４））でペルオキシダーゼ
標識した。

（１）メルカプトアセチル−ウシ血清アルブミンの調製ウシ血清アルブミン２、Ｏｍｇを溶解した緩衝液ＡＯ，
４ｍ１２に８．８＋ｎＭＮ−サクシニミジルー８−了セ
チルチオアセテートのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶
液４０μ！を加え、３０℃、３００分間反応た。反応後
、反応液を１．０Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐｉ−１７，
０）　４０μβ、０．１　Ｍ　ＥＤＴＡ（Ｊ）８７．０
）　４０μ！及び１．０Ｍヒドロキシルアミン塩酸塩溶
液（ｐＨ７，０）　６０μβと共に３０℃で１５分間反
応した。反応液からセファデックスＧ−２５のカラム（
１，ＯＸ　３０ｃｍ　）を用い、緩衝液Ｂを溶出液とし
て精製した。ウシ血清アルブミン１分子当たり６．０個
のチオール基が結合していた。

（２）アンギオテンシンＩ−ウシ血清アルブミンの調製メルカプトアセチル−ウシ血清アルブミン１．５ｍｇ　
（２３ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ｂ３−に実施例１で
調製したマレイミド−アビジン０，３４■（２３０ｎｍ
ｏｌ）を溶解した緩衝液Ｂ３ｄを加え、３０℃、３００
分間反応た。反応液からウルトロゲルＡｃＡ４４のカラ
ム（１，５Ｘ　４５ｃｍ　）を用い、０４１％ＮａＮ３
を含む０．１Ｍリン酸す）　ｌ）ラム緩衝液（ｐＨ７，
５）を溶出液として精製した。

チオール基の減少から、ウシ血清アルブミン１分子当た
り６．０個のアンギオテンシン■が結合していた。

（３）アンギオテンシン■−ウシ血清アルブミン不溶化
面相の調製アンギオテンシン■＝ウシ血清アルブミンの０゜１ｇ／
β溶液を用いて、３．２　ｍｍ中のポリスチレンビーズ
表面上に公知の方法〔石川ら、３ｃａｎｄ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｌ、前出〕で物理吸着により不溶化した
。

（３）ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの測定ウサギ
抗アンギナテンシンＩＩｇＧの標準液２０μｌを０．３
３　Ｍ　ＮａＣ１及び１．０ｇ／ｉ’ウシ血清７ＪＬ、
ブミンを含む１０ｍＭ　！Ｊン酸ナナトリウム緩衝液１
３０μｌ混合した。混合液をアンギオテンシンＩ−ウシ
血清アルブミン不溶化固相と共に３７℃にて３時間振盪
下保温した。その後、アンギオテンシン■−ウシ血清ア
ルブミン不溶化固相を０．１　Ｍ　ＮａＣ］を含む１０
ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　２　ｍ
ｌで２回洗浄した。洗浄後、アンギオテンシンＩ　−ウ
シ血清アルブミン不溶化固相を０．３　Ｍ　ＮａＣ１及
び１．０ｇ＃！ウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭ　Ｉ
Ｊン酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ７，０）　１５０μβに
溶解した（抗ウサギＩｇＧ）　Ｆ　ａｂ−ペルオキシダ
ーゼ（５０ｎｇ）と共に３７℃にて３時間振盪下保温す
る。保温後、アンギオテンシンＩ−ウシ血清アルブミン
不溶化固相を同様に洗浄し、結合したペルオキシダーゼ
活性を測定した。

ペルオキシダーゼ活性は３−（４−ヒドロキシフェニル
）プロピオン酸を水素供与体として蛍光光学的に測定し
た。蛍光強度は５０ｍＭ硫酸に溶解した１ｍｇ／Ｒキニ
ーネを標準として測定した。

その結果を第５図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１及び参考例１の測定結果を示したもの
である。第２図は実施例２及び参考例２の測定結果を示したもの
である。第３図は実施例３及び参考例３の測定結果を示したもの
である。第４図は実施例４及び参考例４の測定結果を示したもの
である。第５図は参考例５の測定結果を示したものである。これ
らの図において、横軸は測定対象であるウサギ抗アンギ
オテンシンＩＩｇＧの血清中濃度を、縦軸は検出された
標識の量を表す蛍光強度である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一般式（ａ）又は（ｂ）で示されるビオチンとア
ビジンの結合またはビオチンとストレプトアビジンの結
合を介した標識体、（ａ）：Ｘ−ビオチン−アビジン−標識物（ｂ）：Ｘ−ビオチン−ストレプトアビジン−標識物（
式中、Ｘは抗原、抗体及び抗抗体からなる群から選ばれ
る免疫反応物質を表す。）及び固相化物質を用いて、アビジン又はストレプトアビ
ジンの共存下において検体中の目的物質を含むサンドイ
ッチ状免疫複合体を固相上に形成せしめる工程を有する
ことを特徴とする目的物質の免疫測定法。