JP3234947B2 - 生物流体中のリガンドの量を測定する方法及びその様な方法を実施する為のキット - Google Patents

生物流体中のリガンドの量を測定する方法及びその様な方法を実施する為のキット

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物流体中の試料中のリガンド（蛋白質と特
異的に結合する物質）の量を測定する方法に関する。こ
の方法では、被測定リガンドを含有している生物流体が
溶解されたリガンド誘導体の存在下で培養される。その
溶解されたリガンド誘導体は、被測定リガンドとリガン
ド誘導体とが標識された特異的バインダーに対し競争し
リガンド誘導体が不溶形に変換されるように、被測定リ
ガンドとリガンド誘導体の両方に結合する標識された特
異的なバインダーの化学量論量未満を有する液相中で不
溶形に変換することが出来る。そして液相に残っている
検定システムの成分から検定システムの不溶成分を分離
した後に、生物流体中の被測定リガンドの量が、リガン
ド誘導体に結合する標識された特異的バインダーの量か
ら計算される。本発明はまたそのような方法を実施する
為のキットにも関する。
本発明は、特に一価のリガンド、即ち一価の抗原又は
ハプテンを表わしているリガンドの遊離割合の測定の為
の述べられた種類の方法に関するものである。その一価
のリガンドとは特異的なバインダーパートナーによって
免疫的に結合されるための結合場所を一つしか有さない
もの、即ち、一部はその生理的結合タンパク質に結合し
た形で、そして一部は非結合、即ち遊離形で生物流体中
に存在している甲状腺ホルモンである。そして本発明の
方法の目的はこの遊離の割合を定量的に測定することで
ある。
本発明に従う方法は、標識された抗体（標識された特
異的バインダー類）が使用され、イミュノメトリックア
ッセイとも呼ばれている免疫検定法の一つである。その
ような方法は競争的方法と呼ばれているタイプに属して
いる。被測定リガンドの全量がサンドイッチ中に結合さ
れている典型的なサンドイッチ方法とは対照的に、標識
された結合パートナーのある割合が被測定リガンドに結
合され、そして別の割合が競争するこのリガンドの誘導
体に結合されている。種々の形式のイミュノメトリック
アッセイについての更に別の記載はEP−Ｂ−89806の紹
介に見出され、ここでは、Ｅ−Ｂ−103605と同じ様に、
リガンドの遊離したものの割合の測定の為のイミュノメ
トリックアッセイのやり方が記載され、この方法はいわ
ゆるアナログトレーサー検定法としてEP−Ｂ−26103に
記載されている。
リガンド、特に例えば甲状腺ホルモンなどの一価のリ
ガンドの遊離形の割合を測定する為の本発明に従う種類
のイミュノメトリック方法においては、被測定リガンド
及び既知の量のリガンド誘導体が、本発明の基づいてい
る上に記載した基本的な方法に従い標識化された抗体の
少量に対し競争させられる。標識された抗体は本質的に
完全に遊離のリガンド及びリガンド誘導体に結合されて
おり、そして二つの結合パートナーにわたる標識された
抗体の分配は試料中のリガンドの測定される濃度を反映
している。リガンドの測定されるべき濃度についての情
報及び被測定リガンドとリガンド誘導体上の標識化抗体
の分布についての情報を得る為に、リガンド誘導体と標
識化された抗体の反応生成物が残りの検定溶液から分離
される為に固定されるのが好ましく、これはEP−Ｐ−10
3605に従うと、標識化抗体と共に培養する前又は後にリ
ガンド誘導体を不溶形に変換することによって実施され
る。実施するのに今日まで一般に採用されている手順
は、最初から固体の基体に結合されて固定されている形
態のリガンド誘導体形を使用することであった。
この種の方法の具体例はEP−Ａ−303284及びEP−Ａ−
324540である。
EP−Ａ−149631に記載されているタイプの方法型で
は、検定方法の慣用の成分のほかにリガンド誘導体に対
する外来のバインダーが使用される。リガンド誘導体に
対するこの外来のバインダーは、リガンド誘導体に対し
特異的な別の抗体であり得る。その機能はリガンド誘導
体に対しある種の緩衝を形成すべきものである。EP−Ａ
−149631に議論された方法に於て、リガンド誘導体は化
学的に修飾されたリガンドであって、パプテン性を有し
ており、従って一価のものであるから、EP−Ａ−149631
に従う方法では、外来のバインダーは固定物とは結合せ
ず、測定中に複合体が形成され、その複合体はリガンド
誘導体と標識化された抗体からなっている。
EP−Ａ−106615に従う遊離の物質の測定の為の別の方
法に於て、被測定リガンドと特異的なバインダーに対す
るある抗体とに同時に結合する特異的なバインダーが使
用され、そしてリガンドの結合とその追加的な抗体の結
合は、これら二つの間に競争が存在するように互に影響
しあうべきである。そして抗体の結合の程度から測定さ
れるべき遊離のリガンドの濃度を導き出すことが可能で
ある。
EP−Ｂ−89806又はEP−Ｂ−103605又はEP−Ａ−30328
4又はEP−Ａ−324540に従う方法において、もし標識化
された抗体に対して、測定されるべき遊離のリガンドと
競争する固定されたリガンド誘導体が使用されるなら
ば、実施に於て問題点（マトリックス効果）がしばしば
生じる。そしてこの問題点は、固定されたリガンド誘導
体と標識化された抗体の間の反応が、拡散工程が重要な
役割を果す、そして固相の或る種のランダムな性質によ
ってかなり決定されてしまう固相の表面に於て起きる反
応であるということの為である。実際に、これらのマト
リックス効果は、固定されたリガンド誘導体を有してい
る固体基体の個々の製造バッチ全てがそれらの性質につ
き注意深く試験されなければならないことを意味し、し
ばしば廃棄物として分けなければならない役に立たない
基体が高いパーセントで出来てしまい、このことは製造
工程のコストをかなり増加させ、従って最終的な検定法
のコストを増加させることを意味している。
EP−Ａ−105 714はさらに、例えばTSHなどの多価のリ
ガンドが二つの異なる抗体との反応によって完全に結合
している典型的なイミュノメトリックサンドイッチ法に
おいては、液相反応として実際のサンドイッチ形成を実
施し、そして次にサンドイッチ抗体の一つに対する結合
パートナーを有している固相を加えることで反応系から
形成サンドイッチを抽出することによって、必要な培養
時間を短くすることが出来ることを開示する。この方法
は特定の結合パートナーに対し少なくとも二つの結合場
所を有しているリガンドの合計濃度の測定にのみ適して
いる。
特許請求の範囲第１項の特徴前の部分に従って、生物
流体の試料中の遊離リガンドの量を測定する為の迅速か
つ信頼性の有る方法を提供することが本発明の目的であ
る。その方法は迅速に、信頼性を持って、そして高い精
度で実施できる、そして上記の対応する慣用方法のコス
トあたりの効率に悪影響を与えているマトリックス問題
が回避される方法である。
この目的は本発明の特許請求の範囲の特徴的な部分に
述べられた構成の採用によって、特許請求の範囲の特徴
前の部分に従う方法で達成される。
この種の方法の有利でかつ好ましい具体例、及びその
方法を実現するのに役立てられるキットが従属請求項に
記載されている。
本発明に従う方法で採用される手順では、測定される
べき遊離のリガンドの及びリガンド誘導体の標識化抗体
との競争反応が、タンパク質物質の存在下で液相で実施
される。そのタンパク質は固相に結合されており、実際
の免疫反応よりも遅く非共有タンパク結合をもたらす反
応中でコンジュゲートとして使用されるリガンド誘導体
の基体タンパク質部分と特異的に結合する。このように
してリガンド誘導体と標識化抗体からなる免疫複合体を
液体反応混合物から抽出する。
本発明に従う方法では、反応の最後には、リガンド誘
導体に結合する標識化抗体は、リガンド誘導体、その基
体タンパク質部分、及び固定化タンパク質材料を通じ
て、サンドイッチ構造の一部として固体基体に結合され
る。従って慣用のサンドイッチ法と対照的に、結合して
いるものは予定量で使用されるリガンド誘導体であり、
被測定リガンドではない。例えば甲状腺ホルモンのよう
な一価の抗体又はハプテン等の様な、一価のリガンドの
場合には、サンドイッチ構造を造ることは通常可能では
ない。しかし、サンドイッチ構造を造ることは、リガン
ドと基体タンパク質のコンジュゲートの形態の、可溶リ
ガンド誘導体を使用することによって、EP−Ａ−161107
の方法では許される。遊離リガンドにより結合されてい
る標識された抗体部分は固相には固定されず溶液中に残
り、従って被測定リガンドの量についての情報を提供す
るという点から、測定されるべき遊離リガンドの存在
は、述べられたサンドイッチ構造の合成の攪乱として明
らかである。
本出願に於ては、そして例えばEP−Ａ−303284に於て
は、リガンド又はその化学的に修飾された形態が、タン
パク質基体分子に共有結合されている、リガンド誘導体
とは、リガンドのコンジュゲートとして定義される。
立体的にかさばる基体タンパク質とリガンドのコンジ
ュゲートであるリガンド誘導体を使用することによっ
て、リガンド誘導体は、同時に、最初に記載した先行技
術の意味に於て「差別的に結合するリガンド誘導体」で
ある。この誘導体は生理的結合タンパク質と比較して、
結合能力をかなり減少しており、従って被測定リガンド
の遊離割合のトラブルのない測定を可能としている。
本発明に従う方法に使用される標識化された抗体は、
被測定遊離リガンドとリガンド遊離体に関して、被測定
遊離リガンドの量を反映する程度にその抗体が両方に結
合し、そして異なる親和性は二つの結合パートナーの比
較的大きな濃度差の影響を補償することが出来るもので
あり得るような親和性を有するモノクローナル抗体であ
るのが好ましい。遊離のチロキシン（FT4）の測定の場
合には例えば1010リットル／モルのオーダーの会合定数
を有しているモノクローナル抗体が適している。
規則としてリガンド誘導体は正常な患者からの試料で
期待される測定リガンドの量に基づいて0.5〜20倍のモ
ル量のオーダーで使用される。標識化抗体は、試料中で
期待される被測定リガンドの量とリガンド誘導体のわか
っている添加量との合計に対する化学量論量未満で使用
される。
本発明に従う方法は以下に詳細に記載されるが、血清
中の遊離チロキシン（FT4）の測定の為の被覆試験管試
験法の形の好ましい具体例を実施例として用いる。この
方法に於て、決められた一定の量のT4−IgGコンジュゲ
ート（Ｌ−IgG）と試料からの遊離のT4（Ｌ）とが、溶
液中で一定量の標識化抗−T4抗体（トレーサーAk＊）に
対して競争する。試験管壁上に抗IgG抗体（抗−IgG）が
固定されており、これはT4−IgGコンジュゲートと結合
し、従って、リガンド誘導体とトレーサーからなる免疫
複合体の一部としての、試料中に存在する遊離のT4のフ
ラクションによって結合されないトレーサー部分とも結
合していることになり、そのトレーサー部分はT4−IgG
コンジュゲートに結合する為にもはや利用できない。従
って測定はサンドイッチ形成によってT4誘導体の一定量
のイミュノメトリック測定がFT4濃度に依存して、攪乱
することに基づいている。
標識化抗体は、例えば最初に議論した先行技術の刊行
物中で詳細にリストされている、既知のラベル又はラベ
ル系の任意のもので標識出来る。特に、知られている放
射性同位元素で、特に、ヨウ素同位元素で標識すること
が出来、検定法はそのときは放射性免疫検定法である。
しかし標識化成分は別の知られている標識であることも
でき、例えば酵素又は螢光性の又は好ましくは化学発光
性の標識であることも出来る。
以下に詳細に図面を参照しながら好ましい具体例につ
いて本発明に従う方法を説明する。
図１は、試験の原理の図解を示し 図２は、本発明に従う方法の好ましい具体例中のリガ
ンド誘導体として使用されるT4−IgGコンジュゲートの
製造の為の反応混合物のHPLCゲルクロマトグラフィの溶
出プロフィールを示すものであり、以下に記載された実
施例中で使用される天然のT4−IgGコンジュゲートは11
分で溶出されている。
図３は、FT4の測定の為の本発明に従う方法の典型的
な標準曲線を示し、そして 図４は、本発明に従う方法の結果とFT4に対する市販
の検定法の結果との比較を示す（ヘニング ベルリンか
らのDYNO試験FT4）。
図１に示された一般に有効な計画に従って好ましい具
体例として記載された方法に於て、測定されるリガン
ド、T4ウサギIgGコンジュゲート溶液、及び標識化抗T4
抗体を含有している溶液を含有している血清試料が、連
続してすばやくヤギの抗ウサギ抗体で被覆した試験管中
にピペットで入れられた。標識化抗T4抗体は好ましくは
モノクローナル抗体であり、T4−IgGコンジュゲートの
基体タンパク質部分とも試験管の被膜とも交差反応はし
ない。この様にして試料からのFT4は均質な液相反応中
で、標識化抗−T4抗体の形態の標識化特異的バインダー
に対して、リガンド誘導体としてのT4ウサギIgGコンジ
ュゲートと競争する。よりゆっくりではあるが同時にT4
ウサギIgGコンジュゲートは固定されたヤギ抗ウサギ抗
体に結合し、そして血清試料のFT4含量に反比例して、
コンジュゲートに結合した標識化抗T4抗体と結合する。
２時間培養後、試験管を洗浄し試験管に残っている標識
化抗体をその標識に基づいて測定する。
液相中の決定的な競争反応は液−固相反応よりも実質
的により迅速に行われるので、本発明に従うこの方法は
最初に固定されたT4コンジュゲートが用いられる対応す
る方法の基本的な反応速度論的な問題を有さない。
リガンド誘導体として使用されるT4ウサギIgGコンジ
ュゲートの製造に於て、本発明に従う方法の記載された
タイプのものについては、標識化抗体によるT4部分に関
して、そしてサンドイッチの形成による固定の為のIgG
部分に関しての両方について上記コンジュゲートの免疫
学的な認識を確実にすることが必要である。
この要求は、例えば以下の実施例におけるように、も
し基体タンパク質が有意義に変性されない穏やかな方法
によって又は天然の非変性タンパク質部分を有するコン
ジュゲートの単離が可能な方法によってリガンド誘導体
として使用されるT4ウサギIgGコンジュゲートが得られ
るならばこの要求は満たされる。
実施例 （ａ）T4ウサギIgGコンジュゲートの調製 50μｌのアセトニトリル中の34μｇのT4−NHS活性エ
ステル（ヘニングベルリン製）を0.5mlのリン酸緩衝液p
H8.0中の1mgのウサギIgG（シグマ製）と共に室温で90分
間培養する。T4−NHS活性エステルと反応した天然のウ
サギIgGはHPLCゲルクロマトグラフィによって単離さ
れ、従ってT4−IgG集合体、未反応T4−NHS活性エステ
ル、及び他の反応生成物から分離される。溶出プロフィ
ールの例を図２に示す。T4−IgG負荷量はクロマトグラ
フィの間325及び280nmにおける吸収の測定を通じて、カ
ラムの流れを連続的に測定しているマルチチャンネルUV
吸収検出機によって決定される。
測定に於て測定当たりのT4ウサギIgGコンジュゲート
の量は、正常な患者中の試料中のFT4のモル量（20pmol/
）の最大で20倍である。
（ｂ）標識化抗T4抗体の調製 標識化特異的バインダーとしてそれ自体は知られた方
法で得られるモノクローナル抗体T4抗体が化学発光標識
としてアクリジニウムエステルと既知の反応によって標
識化される。試験方法に於てT4ウサギIgGコンジュゲー
トに対して及びFT4に対して化学量論的な量以下で標識
化抗体は使用される。抗体の発光標識化は以下の様にし
て実施される。
10μｌのアセトニトリル中の10μｌのアクリジニウム
エステル（ヘキストレーニング社製）を90μｌの燐酸緩
衝液pH8.0中で20分間100μｇのモノクローナル抗T4抗体
（ヘニングベルリン社製）と共に培養する。標識化抗体
を次にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィによって
生成する。約110,000RLU（ベルソルド社からのオートク
リニルマットで測定）の標識化抗体を測定当たり使用す
る。
（ｃ）タンパク材料で被覆されている試験管の調製 適当なポリスチレン試験管を室温で24時間2.5μｇの
ヤギT4ウサギIgG（SCANTIBODIES製）/0.5mlの0.1M NaHC
O3,pH8.0で被覆することにより試験で使用される試験管
を調製した。これに続いて傾斜、水での洗浄、及びその
後の結晶化が抑制されているソルビトールシロップ３％
溶液（Karison）、0.5％BSA、及び0.005％NaN3での２時
間被覆を行う。傾斜を再度実施し、試験管をその後の使
用の為の貯蔵用に凍結乾燥する。
（ｄ）検定手順 試験は（ａ）〜（ｃ）で製造した成分を用いて以下の
様に実施する。
試験管当たり次のものを連続して迅速にピペットでと
る。50μｌの血清試料又は標準、T4−IgGコンジュゲー
ト溶液、標識化抗体を含有している200μｌの溶液。最
後の２つの溶液は50mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、0.1
％ゼラチン及び0.05％NaN3を含有している。試験管を17
0rpmで振盪しながら２時間培養する。最後に試験管をそ
れぞれ４×1mlの洗浄溶液で洗浄し、そして発光計中で
測定する。図３及び４に説明される次の結果が得られ
る。
図３は記載された方法の平均標準曲線であり、この曲
線は試験の検定間の変化を測定することから生じるもの
である。
図４は本発明に従う試験と既知の市販試験（ヘニング
ベルリン社からのDYNO試験FT4）の間の189人の患者の血
清で得られた相関を示している。コンピュータープログ
ラムを用いた評価は0.96の係数を与えた。最適適合のラ
インは以下の様に計算された（本発明に従うFT4試験 p
mol/）＝0.8×（DYNO試験FT4 pmol/）＋1.1pmol/ （ｅ）検定法についてのある種の検定パラメーターの影
響についての更に別の試験 （e1）種々のT4−IgG負荷水準において使用されるT4ウ
サギIgGコンジュゲートの量の変化の影響 ４つの異なるT4−IgGコンジュゲートを合成し、精製
し、そしてT4負荷量を325nm及び280nmの吸収を測定する
ことによって決定した。下の表１は本発明に従うFT4試
験中で、トレーサーの結合を達成する為に非常に少量の
コンジュゲートしか要求されないことを示している。
e2）本発明に従うFT4試験中で使用され抗ウサギIgGが被
覆されている試験管の安定性についての試験 貯蔵による試験管の品質の変化を125I標識化ウサギIg
G及び同量の非標識ウサギIgGの過剰量で希釈されている
125I標識化ウサギIgGとの培養によって試験した。下の
表２は未希釈125I標識化ウサギIgGの結合に基づいた非
標識ウサギIgGの存在下で見出される結合、及びこの結
合の50の測定の分散係数を示している。
この結果は高温の貯蔵温度ですら試験管が非常に高い
安定性を有することを示している。これらの安定性は、
T4−IgGコンジュゲートの形態の固定されたT4誘導体が
壁上に存在する慣用の試験管のものよりもかなり良好で
ある。新たに製造された試験管のデータと比較して、こ
れらの公知の試験管中では37℃で１週間だけの貯蔵後も
かなりの変化が起きる。これと対照的に本発明に従う方
法で使用された試験管は37℃で数週間安定である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−172551（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−500632（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/543 511

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生物流体試料中の、一部は遊離形でまた一
    部は生理的結合蛋白質に結合した形で存在する甲状腺ホ
    ルモンリガンド（Ｌ）の遊離形の割合を定量的に測定す
    る方法において、 被測定遊離リガンド（Ｌ）及びリガンド誘導体（Ｌ−Ig
    G）が標識化された特異的バインダー（Ak＊）について
    競争しそしてリガンド誘導体（Ｌ−IgG）が不溶形に変
    換されるように、液相に於て、生理的結合蛋白質に関し
    てかなり減少した結合能力を有しており不溶形に変換出
    来るリガンド誘導体（Ｌ−IgG）の存在下で、被測定遊
    離リガンド（Ｌ）を含有している該生物流体を、免疫結
    合反応で被測定遊離リガンド（Ｌ）及びリガンド誘導体
    （Ｌ−IgG）の両方に特異的に結合する標識化された特
    異的バインダー（Ak＊）の化学量論量未満とともに培養
    し、 そして、液相中に残っている検定系の成分から検定系不
    溶成分を分離した後に、該生物流体中の被測定遊離リガ
    ンド（Ｌ）の量が、不溶化されたリガンド誘導体に対し
    結合されている標識化された特異的バインダー（Ak＊）
    の量から計算される方法であって、 リガンド誘導体（Ｌ−IgG）として甲状腺ホルモンリガ
    ンドとイミュノグロブリンとの可溶性のコンジュゲート
    が使用され、 該反応が、該コンジュゲートのリガンド部分と特異的バ
    インダー（Ak＊）との間の結合に影響を与えることなし
    に、リガンド誘導体（Ｌ−IgG）のイミュノグロブリン
    部分に特異的に結合するタンパク質物質（抗IgG）で壁
    が被覆されている試験管内で実施され、 リガンド誘導体（Ｌ−IgG）のイミュノグロブリン部分
    とタンパク質材料（抗IgG）との間で結合することが、
    遊離のリガンド（Ｌ）又はリガンド誘導体（Ｌ−IgG）
    のリガンド部分と標識化特異的バインダー（Ak＊）との
    間で免疫結合反応することによりもゆっくりと行われる
    ように、該タンパク質材料（抗IgG）が、リガンド誘導
    体（Ｌ−IgG）のイミュノグロブリン部分に対する、抗
    イディオタイプイミュノグロブリン及び抗イディオタイ
    プポリ又はモノクローナル抗体から選択されることを特
    徴とする方法。
  2. 【請求項２】この方法がチロキシン（FT4）の遊離割合
    を測定する方法であって、リガンド誘導体（Ｌ−IgG）
    がチロキシン−IgGコンジュゲートであり、試験管壁に
    結合したタンパク質材料（抗IgG）がリガンド誘導体
    （Ｌ−IgG）のIgG部分に対する抗イディオタイプ（anti
    −idiotypical）IgGであることを特徴とする請求項１に
    記載の方法。
  3. 【請求項３】リガンド誘導体（Ｌ−IgG）がチロキシン
    −ウサギIgGコンジュゲートであり抗インディオタイプI
    gG（抗IgG）がヤギ抗ウサギIgG又はヤギ抗ウサギ抗体で
    ある請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】使用されるリガンド誘導体（Ｌ−IgG）の
    合計量を完全に結合するのに少なくとも十分なタンパク
    質材料（抗IgG）の量で試験管壁が被覆されており、使
    用されるリガンド誘導体（Ｌ−IgG）の量が普通の患者
    で期待される被測定リガンド（Ｌ）の量に基づくモル量
    の0.5〜20倍のオーダーの量であり、試料中に存在する
    該バインダーの量と特定の親和性を表わしており被測定
    リガンド（Ｌ）及びリガンド誘導体（Ｌ−IgG）の合計
    量の特定のフラクションのみが標識化された特異的バイ
    ンダー（Ak＊）と反応するような、化学量論量以下の量
    で標識化された特異的バインダー（Ak＊）が使用される
    ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】該特異的バインダー（Ak＊）が、該リガン
    ド誘導体（Ｌ−IgG）のイミュノグロブリン部分とも該
    蛋白質材料とも反応しないT4に対する標識化モノクロー
    ナル抗体である請求項２〜４のいずれか一に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】該リガンド誘導体（Ｌ−IgG）のイミュノ
    グロブリン部分が天然のイミュノグロブリンである請求
    項１〜５のいずれか一に記載の方法。
  7. 【請求項７】次の培養段階 （ａ）リガンド誘導体（Ｌ−IgG）の免疫グロブリン部
    分と特異的に結合するタンパク質材料（抗IgG）の過剰
    量で試験管壁が被覆されている試験管を準備し、 （ｂ）被測定遊離甲状腺ホルモンリガンド（Ｌ）の未知
    の量を含有している生物流体又はリガンド（Ｌ）の標準
    溶液を添加し、 （ｃ）リガンド誘導体（Ｌ−IgG）の既知の量を含有し
    ている溶液又は分散液を添加し、そして （ｄ）既知の量の標識化された特異的バインダー（A
    k＊）を含有している溶液又は分散液を添加することを
    特徴とし、 そして適当な培養期間の後、液相を試験管から除去し、
    試験管を洗浄し、そして次に試料中の遊離甲状腺ホルモ
    ンリガンド（Ｌ）の量の割合を、標準試料の結果を参照
    して、試験管壁に結合された標識された特異的バインダ
    ー（Ak＊）の割合から決定する、 順序で実施されることを特徴としている請求項１〜６の
    いずれか一に記載の方法。
  8. 【請求項８】別の試薬として、ｉ）甲状腺ホルモン・イ
    ミュノグロブリンコンジュゲートの形のリガンド誘導体
    の既知の量、ii）標識された抗リガンド抗体の既知の
    量、必要ならばiii）リガンド標準試料として甲状腺ホ
    ルモンの標準溶液、及びiv）適当な緩衝液と希釈溶液、
    並びにｖ）リガンド誘導体のイミュノグロブリン部分に
    対する抗イディオタイプイミュノグロブリンの過剰量で
    壁が被覆された試験管、を含んでいる、請求項１〜７の
    いずれか一に記載の方法を実施するキット。
  9. 【請求項９】リガンド誘導体、標識化抗体、もし要求さ
    れるならばリガンド標準試料、及び被覆されたすべて凍
    結乾燥形の試験管を含有することを特徴とする請求項８
    に記載のキット。
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