CN108802370A - 一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法。该方法采用三碘甲状腺原氨酸衍生物（T3‑NHS）直接与酶进行交联结合而成，不需要额外添加活化剂和偶联剂。所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质，或所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N‑磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo‑NHS)和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质。该方法操作简单，成本低廉，稳定性好。

Description

一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种应用于化学发光免疫分析技术中的三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法。
背景技术
3，5，3′三碘甲腺原氨酸（Triiodothyronine，T3）是一种对各种靶器官起作用的重要甲状腺激素，分子量为651，血浆中半衰期为1.5天。大约80%的T3形成于外周组织，由T4在脱碘酶的作用下脱碘转化而来，其余的T3是由于甲状腺球蛋白的水解而被释放进入血液循环。T3的分泌受促甲状腺激素（TSH）和促甲状腺激素释放激素（TRH）的调节，而T3的水平对TSH也存在负反馈调节。
T3是通过与血清中的运载蛋白结合而被转运的，主要有甲状腺素结合球蛋白（TBG），前白蛋白和白蛋白，只有约0.4%的T3是游离的，但游离T3（FT3）才真正具备激素的生物活性。体内TT3的浓度受甲状腺激素结合蛋白的浓度的影响，而FT3不受影响，TT3和FT3保持动态平衡，维持正常的甲状腺功能。
FT3可以通过细胞膜与受体结合发挥生理效应，因此它是甲状腺激素发生生理效应的的真正活性部分，而且体内FT3的浓度不受甲状腺激素结合蛋白的浓度的影响，能较确切地反映甲状腺的功能状态及其他对人体机能的影响。FT3含量对鉴别诊断甲状腺功能是否正常，亢进或低下有重要意义，对甲亢的诊断很敏感，是诊断T3型甲亢的特异性指标。临床上，TSH，FT3和FT4三项联检，常用以确认甲亢或甲低，以及追踪疗效。
TT3对保持正常的甲状腺功能有着重要的作用，它具有比TT4更高的生物活性，所以TT3的定量检测对早期的甲状腺疾病诊断非常有价值。患有甲亢，高TBG血症，甲亢治疗中等病人TT3水平明显增高；相应的甲减，低TT3综合症，低TBG血症等TT3水平偏低。
用于体内游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）和总三碘甲状腺原氨酸（TT3）测定的主要方法有放射免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、化学发光免疫分析法等。 目前常用的放射免疫分析法（RIA）是用I125标记三碘甲状腺原氨酸半抗原来实现的，其合成工艺复杂，有效期短，对环境有一定污染，影响检测结果的因素较多。近几年来，化学发光免疫分析技术发展迅速，灵敏度、特异性以及自动化程度均达到或超过了RIA水平，特别是标记物的稳定性和不污染环境是RIA法无法比拟的。
目前各大中型医院均进口了全自动化学发光免疫分析系统，但是仪器和试剂价格昂贵，试剂盒中酶标记物合成工艺是国外厂家高度保密的专利技术。
国内厂家酶联免疫吸附分析法（ELISA）试剂盒以及化学发光免疫分析法（CLIA）试剂盒主要采用的三碘甲状腺原氨酸半抗原酶结合物作为标记物，其中三碘甲状腺原氨酸半抗原为三碘甲状腺原氨酸衍生物（T3-CMO）与牛血清白蛋白（BSA）的结合物（T3-CMO-BSA）或鸡卵清白蛋白（OVA）的结合物（T3-CMO-OVA），此种酶结合物生产工艺复杂，成本较高，容易产生空间位阻影响三碘甲状腺原氨酸特异性抗体的结合。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明公开了一种操作简单、成本低廉、稳定性好的三碘甲状腺原氨酸酶结合物，该酶结合物是化学发光免疫分析法检测游离三碘甲状腺原氨酸试剂盒和总三碘甲状腺原氨酸试剂盒的关键组分。
本发明涉及的三碘甲状腺原氨酸酶结合物是由三碘甲状腺原氨酸衍生物（T3-NHS）与酶发生偶联反应生成，该反应不需要额外添加活化剂和偶联剂。
本发明涉及的三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质，其化学结构式为：
或者所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质，其化学结构式为：
优选地，所述三碘甲状腺原氨酸衍生物是采用以工艺步骤制备的：
S1. 三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯的制备：取三碘甲状腺原氨酸加入到蒸馏水中，加入硫酸铜，在100℃水浴中回流反应5小时，冷却至室温后，过滤除去固体杂质，然后将滤液冰浴降温到结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯。
S2. N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的制备：取上述三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯溶解于柠檬酸溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，避光条件下2～8℃反应8h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶的三碘甲状腺原氨酸衍生物。
进一步地,将三碘甲状腺原氨酸衍生物与酶按一定的比例加入到缓冲液中，避光反应一段时间，除去未反应完全的三碘甲状腺原氨酸衍生物，即得到三碘甲状腺原氨酸酶结合物。
进一步地，所述的酶为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的任一种，优选为碱性磷酸酶。
进一步地，所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与酶按照质量比为1:4～1:300加入到缓冲液中，优选的三碘甲状腺原氨酸衍生物与酶的质量比为1:50～1:200，最优选的为1:100～1:150。
进一步地，所述缓冲液为EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES)缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的任一种，优选为碳酸盐缓冲液。
进一步地，所述缓冲液的PH值范围为7.5～10.5,优选的为7.8～9.0。
进一步地，所述避光反应的温度为4℃～37℃，所述避光反应的时间为1～24小时。
进一步地，除去未反应的三碘甲状腺原氨酸衍生物的方法为超滤法、透析法、脱盐柱法中的一种，优选为超滤法。
本发明的技术效果在于：
（1）碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸衍生物制备方法采用的是三碘甲状腺原氨酸衍生物（T3-NHS）直接进行偶联磷酸酶，相比较其他专利或厂家用的是三碘甲状腺原氨酸-BSA衍生物（T3-CMO-BSA）或三碘甲状腺原氨酸-OVA衍生物（T3-CMO-OVA），该方法成本更低，工艺更简单，更可控。三碘甲状腺原氨酸的大分子蛋白衍生物可能存在一定的位阻干扰，影响测试结果的准确性，而本发明涉及的三碘甲状腺原氨酸衍生物（T3-NHS）是与三碘甲状腺原氨酸结构类似的小分子物质，有效避免的位阻干扰的问题。
（2）生物素标记抗体的制备方法
采用经过活化的生物素直接与抗体进行偶联，无需添加EDC\NHS等偶联剂，工艺更简单，成本更低。
具体实施方式
下面结合实例进一步说明本发明，本发明的优点和特点将被描述的更清楚。但是，应该可以理解，本实例仅仅是本发明的一种范例，并不会对本发明的范围做任何限制。
实施例1
将100ug碱性磷酸酶加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液(pH8.0)中，加入1ug三碘甲状腺原氨酸衍生物（T3-NHS），进行避光反应，避光反应的温度为37℃，反应4小时后，用ProteinG亲和柱(GE公司) 纯化酶标抗体，得到三碘甲状腺原氨酸酶结合物。
需要说明的是，所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与碱性磷酸酶加入到碳酸钠缓冲液中是不分先后顺序的，也可以先将1ug三碘甲状腺原氨酸衍生物加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中，再加入100ug碱性磷酸酶；或者将1ug三碘甲状腺原氨酸衍生物与100ug碱性磷酸酶同时加入到碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中。所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与碱性磷酸酶的加入比例可以根据情况进行调整，所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与碱性磷酸酶的比例（质量比）为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
所述碱性磷酸酶也可以用辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的任一种代替，所述碳酸钠缓冲液可以用EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲系统中的任一种代替。所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。
所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质，其化学结构式为：
或者所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质，其化学结构式为：
优选地，所述三碘甲状腺原氨酸衍生物是采用以工艺步骤制备的：
S1. 三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯的制备：取三碘甲状腺原氨酸加入到蒸馏水中，加入硫酸铜，在100℃水浴中回流反应5小时，冷却至室温后，过滤除去固体杂质，然后将滤液冰浴降温到结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯。
S2. N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的制备：取上述三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯溶解于柠檬酸溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，避光条件下2～8℃反应8h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶的三碘甲状腺原氨酸衍生物。
实施例2
将50ug葡萄糖-6-磷酸脱氢酶加入1mL10mM 醋酸盐缓冲液中，加入1ug三碘甲状腺原氨酸衍生物（T3-NHS），进行避光反应，避光反应的温度为4℃，反应24小时后，用15mL 30KD截留分子量的超滤管(Millipore 公司)，超滤纯化酶结合物，得到三碘甲状腺原氨酸酶结合物。
需要说明的是，所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶加入到醋酸盐缓冲液中是不分先后顺序的，也可以先将1ug三碘甲状腺原氨酸衍生物加入1mL10mM醋酸盐缓冲液中，再加入50ug葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；或者将1ug三碘甲状腺原氨酸衍生物与50ug葡萄糖-6-磷酸脱氢酶同时加入到醋酸盐缓冲液中。所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与碱性磷酸酶的加入比例可以根据情况进行调整，所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与碱性磷酸酶的比例（质量比）为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶也可以用辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的任一种代替，所述醋酸盐缓冲液可以用EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、碳酸钠缓冲液、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲系统中的任一种代替。所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。
所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质，其化学结构式为：
或者所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质，其化学结构式为：
优选地，所述三碘甲状腺原氨酸衍生物是采用以工艺步骤制备的：
S1. 三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯的制备：取三碘甲状腺原氨酸（采购自Sigma公司）3.5g于200mL蒸馏水中，加入硫酸铜800mg，在100℃水浴中回流反应5小时，冷却至室温后，过滤除去固体杂质，然后将滤液冰浴降温2小时有结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯2.6g。
S2. N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的制备：取1.2g的三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯溶解于50mM 柠檬酸溶液（PH4.0）中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)600mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)200mg，避光条件下2～8℃反应8h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物160mg，即得T3-NHS。
实施例3
将20ugβ-半乳糖苷酶加入1mL10mM 柠檬酸盐缓冲液中，加入1ug三碘甲状腺原氨酸衍生物（T3-NHS），进行避光反应，避光反应的温度为25℃，反应8小时后，用ProteinG亲和柱(GE公司) 纯化酶标抗体，得到三碘甲状腺原氨酸酶结合物。
需要说明的是，所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与β-半乳糖苷酶加入到醋酸盐缓冲液中是不分先后顺序的，也可以先将1ug三碘甲状腺原氨酸衍生物加入1mL10mM 柠檬酸盐缓冲液中，再加入20ugβ-半乳糖苷酶；或者将1ug三碘甲状腺原氨酸衍生物与20ugβ-半乳糖苷酶同时加入到柠檬酸盐缓冲液中。所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与碱性磷酸酶的加入比例可以根据情况进行调整，所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与碱性磷酸酶的比例（质量比）为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
所述β-半乳糖苷酶也可以用辣根过氧化物酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、脲酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的任一种代替，所述柠檬酸盐缓冲液可以用EDTA缓冲液、EGTA 缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲系统、碳酸钠缓冲液、SSC 缓冲系统、SSPE缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的任一种代替。所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。
所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质，或者所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质。
所述三碘甲状腺原氨酸衍生物是采用以工艺步骤制备的：
S1. 三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯的制备：取三碘甲状腺原氨酸加入到蒸馏水中，加入硫酸铜，在100℃水浴中回流反应5小时，冷却至室温后，过滤除去固体杂质，然后将滤液冰浴降温到结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯。
S2. N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的制备：取上述三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯溶解于柠檬酸溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，避光条件下2～8℃反应8h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶的三碘甲状腺原氨酸衍生物。
实施例4
将100ug碱性磷酸酶、1ug三碘甲状腺原氨酸衍生物（T3-NHS）加入到1mL10mM 缓冲液中，进行避光反应，避光反应的温度为4℃～37℃，反应1～24小时后，采用超滤法、或透析法、或脱盐柱法除去未反应完全的雌二醇衍生物，加入保护剂，得到三碘甲状腺原氨酸酶结合物。优选地，所述保护剂优选为甘油。
需要说明的是，所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与碱性磷酸酶的加入比例可以根据情况进行调整，所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与碱性磷酸酶的比例（质量比）为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
所述碱性磷酸酶也可以用辣根过氧化物酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、脲酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的任一种代替，所述缓冲液可以用EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲系统、碳酸钠缓冲液、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的任一种。所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。
所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质，或者所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质。
优选地，所述三碘甲状腺原氨酸衍生物是采用以工艺步骤制备的：
S1. 三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯的制备：取三碘甲状腺原氨酸（采购自Sigma公司）3.5g于200mL蒸馏水中，加入硫酸铜800mg，在100℃水浴中回流反应5小时，冷却至室温后，过滤除去固体杂质，然后将滤液冰浴降温2小时有结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯2.6g。
S2. N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的制备：取1.2g的三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯溶解于50mM 柠檬酸溶液（PH4.0）中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)600mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)200mg，避光条件下2～8℃反应8h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物160mg，即得T3-NHS。
三碘甲状腺原氨酸酶结合物应用实验测试：
将实施例1～4生成的三碘甲状腺原氨酸酶结合物与某进口公司生产的三碘甲状腺原氨酸试剂盒中Rb（三碘甲状腺原氨酸酶结合物）组分分别应用于三碘甲状腺原氨酸化学发光免疫分析试剂盒中进行对比实验，结果如下：
由以上的结果可以看出：本工艺合成的三碘甲状腺原氨酸酶结合物与国外同类型产品应用于化学发光免疫分析试剂盒中，信燥比和稳定性测试结果很接近，达到优良结果，本发明的三碘甲状腺原氨酸酶结合物制备方法具有很好的适用性和先进性。
以上所述实施例仅是本发明的优选实施方式。应当指出，本发明所述的稀释比例是指按质量比稀释的比例，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围，本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：三碘甲状腺原氨酸酶结合物是由三碘甲状腺原氨酸衍生物（T3-NHS）与酶发生偶联反应生成，该反应不需要额外添加活化剂和偶联剂。
2.根据权利要求1所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质，其化学结构式为：
或者所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质，其化学结构式为：
。
3.根据权利要求1或2所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述三碘甲状腺原氨酸衍生物是采用以工艺步骤制备的：
S1. 三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯的制备：取三碘甲状腺原氨酸加入到蒸馏水中，加入硫酸铜，在100℃水浴中回流反应5小时，冷却至室温后，过滤除去固体杂质，然后将滤液冰浴降温到结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯；
S2. N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的制备：取上述三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯溶解于柠檬酸溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，避光条件下2～8℃反应8h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶的三碘甲状腺原氨酸衍生物。
4.根据权利要求1所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：将三碘甲状腺原氨酸衍生物与酶按一定的比例加入到缓冲液中，避光反应一段时间，除去未反应完全的三碘甲状腺原氨酸衍生物，即得到三碘甲状腺原氨酸酶结合物。
5.根据权利要求4所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述的酶为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的任一种，优选为碱性磷酸酶。
6.根据权利要求4所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与酶按照质量比为1:4～1:300加入到缓冲液中，优选的三碘甲状腺原氨酸衍生物与酶的质量比为1:50～1:200，最优选的为1:100～1:150。
7.根据权利要求4所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的任一种，优选为碳酸盐缓冲液。
8.根据权利要求6所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述缓冲液的PH值范围为7.5～10.5,优选的为7.8～9.0。
9.根据权利要求4所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述避光反应的温度为4℃～37℃，所述避光反应的时间为1～24小时。
10.根据权利要求4所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：除去未反应的三碘甲状腺原氨酸衍生物的方法为超滤法、透析法、脱盐柱法中的一种，优选为超滤法。
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