CN108802365A - 一种孕酮酶结合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种孕酮酶结合物的制备方法。该方法采用孕酮衍生物（P‑NHS）直接与酶进行交联结合而成，不需要额外添加活化剂和偶联剂。本发明涉及的孕酮衍生物为N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)和孕酮的化学合成物质，或N‑磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo‑NHS)和孕酮的化学合成物质。该方法操作简单，成本低廉，稳定性好。

Description

一种孕酮酶结合物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种应用于化学发光免疫分析技术中的孕酮酶结合物的制备方法。
背景技术
孕酮（英语：Progesterone；化学式：C21H30O2；分子量：314.46），亦称为黄体酮、孕甾酮、黄体甾酮、黄体激素、助孕激素、助孕素或助孕酮。是一种涉及女性月经周期、妊娠和对人类还又其他动物的胚胎有影响的类固醇，是类固醇生物合成过程中生成的第一个具有生物活性的化合物，它由肾上腺皮质、男性睾丸，女性卵巢和胎盘生成，主要代谢产物为孕二醇-3-葡糖苷酸。孕酮是属于一类称为孕激素（progestogen）的荷尔蒙，也是人类最重要的孕激素。
孕酮是一种女性荷尔蒙，参与人类与其他动物的雌性月经周期，支援怀孕与胚胎形成。未怀孕的女性，其孕酮只在每次月经周期的后半段才由卵巢黄体大量分泌。脑，肝与肾上腺也会分泌。怀孕时(第三个月开始)，胎盘也可大量分泌。
促黄体生成素（LH）作用于黄体调节孕酮的合成和分泌。随着LH在月经周期中期达到高峰，黄体开始发育，孕酮的水平也随之增长。在排卵后的5-8天达到最高水平。如果没有受孕，则在下一次行经前4天左右降低至卵泡期水平。如果怀孕，孕酮水平则随着其主要来源胎盘的发育而持续增长，并贯穿整个妊娠期。
血液循环中的孕酮结合蛋白主要有类固醇结合蛋白、白蛋白、性激素结合蛋白，其中主要与白蛋白和类固醇结合蛋白结合，具有生物活性的游离型孕酮仅占总孕酮的2.5～3%。
临床上检测孕酮主要用于确认排卵、评价黄体功能缺失，检验诱导排卵过程的有效性等。目前认为，结合孕酮的检测是除了子宫内膜活检以外可以正确评价黄体功能的一种方法，甚至可以替代子宫内膜活检。正常妊娠和异位妊娠时孕酮水平都会升高。血清孕酮的测定也可用于替代疗法的疗效监测和妊娠早期自发性流产危险性的评估。
用于体内孕酮测定的主要方法有放射免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、化学发光免疫分析法等。 目前常用的放射免疫分析法（RIA）是用I125标记孕酮半抗原来实现的，其合成工艺复杂，有效期短，对环境有一定污染，影响检测结果的因素较多。近几年来，化学发光免疫分析技术发展迅速，灵敏度、特异性以及自动化程度均达到或超过了RIA水平，特别是标记物的稳定性和不污染环境是RIA法无法比拟的。
目前各大中型医院均进口了全自动化学发光免疫分析系统，但是仪器和试剂价格昂贵，试剂盒中酶标记物合成工艺是国外厂家高度保密的专利技术。
国内厂家酶联免疫吸附分析法（ELISA）试剂盒以及化学发光免疫分析法（CLIA）试剂盒主要采用的孕酮半抗原酶结合物作为标记物，其中孕酮半抗原为孕酮衍生物（P-3-CMO）与牛血清白蛋白（BSA）的结合物（P-3-CMO-BSA）或鸡卵清白蛋白（OVA）的结合物（P-3-CMO-OVA），此种酶结合物生产工艺复杂，成本较高，容易产生空间位阻影响孕酮特异性抗体的结合。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明公开了一种操作简单、成本低廉、稳定性好的孕酮酶结合物，该酶结合物是化学发光免疫分析法检测孕酮试剂盒的关键组分。
本发明涉及的孕酮酶结合物是由孕酮衍生物（P-NHS）与酶发生偶联反应生成，该反应不需要额外添加活化剂和偶联剂。
进一步地，所述孕酮衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和孕酮的化学合成物质，其化学结构式如下：
进一步地，所述孕酮衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和孕酮的化学合成物质,其化学结构式如下：
进一步地，所述孕酮衍生物的合成方法如下：
S1.孕酮琥珀酸酯的制备：取11-a-羟基孕酮加入到二氯甲烷、琥珀酸酐中，加入4-二甲氨基吡啶，在油浴中回流5小时，冷却至室温后，冰浴降温到结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶孕酮琥珀酸酯。
S2.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物的制备：取孕酮琥珀酸酯溶解于柠檬酸溶液（PH4.0）中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，避光条件下2～8℃反应8h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物，即孕酮衍生物。
进一步地，将孕酮衍生物与酶加入到缓冲液中，然后进行避光反应，反应后除去未反应完全的孕酮衍生物，得到孕酮酶结合物。
进一步地，所述酶为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的一种，优选为碱性磷酸酶。
进一步地，所述孕酮衍生物与酶的比例质量比为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
进一步地，所述缓冲液为EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES)缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的任一种，优选的为碳酸盐缓冲液；所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。
进一步地，所述避光反应的温度为4℃～37℃，所述避光反应的时间为0.5～24小时。
进一步地，所述除去未反应的孕酮衍生物的方法有有超滤法、或透析法、或脱盐柱法，除去未反应完全的孕酮衍生物后，加入保护剂，得到孕酮酶结合物，所述保护剂优选为甘油。
本发明的技术效果在于：
（1）碱性磷酸酶标记的孕酮衍生物制备方法采用的是孕酮衍生物（P-NHS）直接偶联进行磷酸酶，相比较其他专利或厂家用的是孕酮-BSA衍生物（P-6-CMO-BSA）或孕酮-OVA衍生物（P-6-CMO-OVA），该方法成本更低，工艺更简单，更可控。孕酮的大分子蛋白衍生物可能存在一定的位阻干扰，影响测试结果的准确性，而本发明涉及的孕酮衍生物（P-NHS）是与孕酮结构类似的小分子物质，有效避免的位阻干扰的问题。
（2）生物素标记抗体的制备方法采用经过活化的生物素直接与抗体进行偶联，无需添加EDC\NHS等偶联剂，工艺更简单，成本更低。
具体实施方式
下面结合实例进一步说明本发明，本发明的优点和特点将被描述的更清楚。但是，应该可以理解，本实例仅仅是本发明的一种范例，并不会对本发明的范围做任何限制。
实施例1
将100ug碱性磷酸酶加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中，加入1ug孕酮衍生物（P-NHS），37℃反应4小时后，用ProteinG亲和柱(GE公司) 纯化酶标抗体，得到孕酮酶结合物。
需要说明的是，所述孕酮衍生物与碱性磷酸酶加入到碳酸钠缓冲液中是不分先后顺序的，也可以先将1ug孕酮衍生物加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中，再加入100ug碱性磷酸酶；或者将1ug孕酮衍生物与100ug碱性磷酸酶同时加入到碳酸钠缓冲液(pH8.0)中。所述孕酮衍生物与酶的比例可以根据情况进行调整，所述孕酮衍生物与酶的比例（质量比）为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
所述碱性磷酸酶也可以用辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的任一种代替，所述碳酸钠缓冲液可以用EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲系统中的任一种代替。
上述所述孕酮衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和孕酮的化学合成物质，其化学结构式如下：
进一步地，所述孕酮衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和孕酮的化学合成物质,其化学结构式如下：
进一步地，所述孕酮衍生物的合成方法如下：
S1.孕酮琥珀酸酯的制备：取11-a-羟基孕酮加入到二氯甲烷、琥珀酸酐中，加入4-二甲氨基吡啶，在油浴中回流5小时，冷却至室温后，冰浴降温到结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶孕酮琥珀酸酯。
S2.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物的制备：取孕酮琥珀酸酯溶解于柠檬酸溶液（PH4.0）中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，避光条件下2～8℃反应8h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物，即孕酮衍生物。
实施例2
将50ug葡萄糖氧化酶加入1mL10mM SSC 缓冲液(pH8.0) 中，加入1ug孕酮衍生物（P-NHS），4℃反应24小时后，用15mL 30KD截留分子量的超滤管(Millipore 公司)，超滤纯化酶结合物，得到孕酮酶结合物。
需要说明的是，所述孕酮衍生物与葡萄糖氧化酶加入到碳酸钠缓冲液中是不分先后顺序的，也可以先将1ug孕酮衍生物加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中，再加入50ug葡萄糖氧化酶；或者将1ug孕酮衍生物与50ug葡萄糖氧化酶同时加入到碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中。所述孕酮衍生物与葡萄糖氧化酶的比例可以根据情况进行调整，所述孕酮衍生物与葡萄糖氧化酶的比例（质量比）为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
所述葡萄糖氧化酶也可以用辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、碱性磷酸酶和苹果酸脱氢酶中的任一种代替，所述碳酸钠缓冲液可以用EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲系统中的任一种代替。
上述所述孕酮衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和孕酮的化学合成物质，其化学结构式如下：
进一步地，所述孕酮衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和孕酮的化学合成物质,其化学结构式如下：
进一步地，所述孕酮衍生物的合成方法如下：
S1.孕酮琥珀酸酯的制备：取11-a-羟基孕酮（采购自Sigma公司）3.5g于200mL二氯甲烷、50mL琥珀酸酐中，加入4-二甲氨基吡啶500mg，在油浴中回流5小时，冷却至室温后，冰浴降温2小时有结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶孕酮琥珀酸酯4.2g。
S2.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物的制备：取3.2g的孕酮琥珀酸酯溶解于50mM 柠檬酸溶液（PH4.0）中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)300mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)100mg，避光条件下2～8℃反应8h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物460mg，即孕酮衍生物。
实施例3
将150ug辣根过氧化物酶加入1mL10mM 醋酸盐缓冲液(pH10.0) 中，加入1ug孕酮衍生物（P-NHS），25℃反应1小时后，用ProteinG亲和柱(GE公司) 纯化酶标抗体，得到孕酮酶结合物。
需要说明的是，所述孕酮衍生物与辣根过氧化物酶加入到碳酸钠缓冲液中是不分先后顺序的，也可以先将1ug孕酮衍生物加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中，再加入150ug辣根过氧化物酶；或者将1ug孕酮衍生物与150ug辣根过氧化物酶同时加入到碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中。所述孕酮衍生物与辣根过氧化物酶的比例可以根据情况进行调整，所述孕酮衍生物与辣根过氧化物酶的比例（质量比）为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
所述辣根过氧化物酶也可以用葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、碱性磷酸酶和苹果酸脱氢酶中的任一种代替，所述碳酸钠缓冲液可以用EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲系统中的任一种代替。
上述所述孕酮衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和孕酮的化学合成物质，或者所述孕酮衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和孕酮的化学合成物质。
所述孕酮衍生物的合成方法如下：S1.孕酮琥珀酸酯的制备：取11-a-羟基孕酮（采购自Sigma公司）3.5g于200mL二氯甲烷、50mL琥珀酸酐中，加入4-二甲氨基吡啶500mg，在油浴中回流5小时，冷却至室温后，冰浴降温2小时有结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶孕酮琥珀酸酯4.2g。
S2.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物的制备：取3.2g的孕酮琥珀酸酯溶解于50mM 柠檬酸溶液（PH4.0）中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)300mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)100mg，避光条件下2～8℃反应8h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物460mg，即孕酮衍生物。
实施例4
将20ug脲酶加入1mL10mM EDTA缓冲液(pH7.0) 中，加入1ug孕酮衍生物（P-NHS），37℃反应4小时后，用15mL 30KD截留分子量的超滤管(Millipore 公司)，超滤纯化酶结合物，得到孕酮酶结合物。
孕酮酶结合物应用实验：将实施例1～4生成的孕酮酶结合物与某进口公司生产的孕酮试剂盒中Rb（孕酮酶结合物）组分分别应用于孕酮化学发光免疫分析试剂盒中进行对比实验，结果如下：
由以上的结果可以看出：本工艺合成的孕酮酶结合物与国外同类型产品应用于化学发光免疫分析试剂盒中，信燥比和稳定性测试结果很接近，达到优良结果，本发明的孕酮酶结合物制备方法具有很好的适用性和先进性。
以上所述实施例仅是本发明的优选实施方式。应当指出，本发明所述的稀释比例是指按质量比稀释的比例，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围，本实施例中未明确的部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种孕酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述孕酮酶结合物是由孕酮衍生物（P-NHS）与酶发生偶联反应生成，该反应不需要额外添加活化剂和偶联剂。
2.根据权利要求1所述的一种孕酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述孕酮衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和孕酮的化学合成物质，其化学结构式如下：
。
3.根据权利要求1所述的一种孕酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述孕酮衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和孕酮的化学合成物质,其化学结构式如下：
。
4.根据权利要求1或2所述的一种孕酮酶结合物的制备方法，其特征在于，所述孕酮衍生物的合成方法如下：
S1.孕酮琥珀酸酯的制备：取11-a-羟基孕酮加入到二氯甲烷、琥珀酸酐中，加入4-二甲氨基吡啶，在油浴中回流5小时，冷却至室温后，冰浴降温到结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶孕酮琥珀酸酯；
S2.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物的制备：取孕酮琥珀酸酯溶解于柠檬酸溶液（PH4.0）中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，避光条件下2～8℃反应8h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与孕酮合成物，即孕酮衍生物。
5.根据权利要求1所述的一种孕酮酶结合物的制备方法，其特征在于：将孕酮衍生物与酶加入到缓冲液中，然后进行避光反应，反应后除去未反应完全的孕酮衍生物，得到孕酮酶结合物。
6.根据权利要求5所述的一种孕酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述酶为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的一种，优选为碱性磷酸酶。
7.根据权利要求5所述的一种孕酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述孕酮衍生物与酶的比例质量比为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
8.根据权利要求5所述的一种孕酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的任一种，优选的为碳酸盐缓冲液；所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。
9.根据权利要求5所述的一种孕酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述避光反应的温度为4℃～37℃，所述避光反应的时间为0.5～24小时。
10.根据权利要求5所述的一种孕酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述除去未反应的孕酮衍生物的方法有有超滤法、或透析法、或脱盐柱法，除去未反应完全的孕酮衍生物后，加入保护剂，得到孕酮酶结合物，所述保护剂优选为甘油。
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杨征宇 等: "11α-羟基孕酮半琥珀酸酯合成方法的改进", 《中国药物化学杂志》 *

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