CN114836387B - 一株11-α羟孕酮单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一株11-α羟孕酮单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株11‑α羟孕酮单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，涉及免疫检测技术领域。本发明所述的杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.45112，本发明所得的杂交瘤细胞株属于单克隆细胞株。本发明所述的11‑α羟孕酮单克隆抗体，对11‑α羟孕酮具有较好的特异性(对孕酮、17‑α羟孕酮、甲羟孕酮和雌二醇等性激素的交叉率小于0.02％)和检测灵敏度(IC50值为0.311ng/mL)。为检测临床上血样中11‑α羟孕酮含量提供了免疫学方法。

Description

一株11-α羟孕酮单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一株11-α羟孕酮单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
孕激素是由卵巢黄体分泌的一种类固醇激素，又称孕酮，作为血压调节器和抗雄激素非常重要。其中，孕酮衍生物11-α-和11-β-羟孕酮在体外是11-β-羟类固醇脱氢酶亚型2的有效抑制剂。为了评估11-α-和11-β-羟孕酮是否具有血压调节作用，有研究发现将其连续14天注入完整的和肾上腺切除的Sprague-Dawley大鼠体内，11-α-和11-β-羟孕酮均在3天内导致大鼠血压显著升高，并且这种效应持续14天。这些结果表明，11-α-和11-β-羟孕酮在大鼠体内均具有潜在的致高血压作用。此外，还有报道显示，11-α-羟孕酮在前列腺癌组织中高水平存在。不过只有全面分析C11α-羟基代谢物水平，才能全面评估11-α-羟孕酮及其代谢物对人类病理生理学的潜在影响。虽然11-α-羟孕酮在生理和病理生理状态下均可被检测到，但是11-α-羟孕酮的生物合成和代谢至今仍不清楚，11α-羟化酶(一种被认为与11-α-羟孕酮生物合成有关的酶)也尚未在人体组织中被发现。因此，建立一种快速、高效的11-α羟孕酮的监测方法对于研究11-α-羟孕酮的生物合成和代谢是十分必要的。
目前11-α羟孕酮含量分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用(LC-MS)等仪器方法。然而，这些检测方法具有耗时长、步骤繁琐、成本高等缺点。因此建立快速简便的11-α羟孕酮检测方法具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为11-α羟孕酮检测提供了一种新的检测途径。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中11-α羟孕酮含量分析方法耗时长、步骤繁琐、成本高等。
为解决上述技术问题，本发明提供了一株11-α羟孕酮单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。通过将11-α羟孕酮完全抗原免疫动物，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，并通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对11-α羟孕酮有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
本发明的第一个目的是提供一株11-α羟孕酮单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45112，本发明所得的杂交瘤细胞株属于单克隆细胞株。
本发明的第二个目的是提供一株11-α羟孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤，
S1、将11-α羟孕酮溶于溶液中，加入羧甲基羟胺半盐酸盐，60-70℃搅拌1-3h，静置8-14h，得到11-α羟孕酮半抗原；
S2、使用S1中所述11-α羟孕酮半抗原制备11-α羟孕酮完全抗原，将所得的11-α羟孕酮完全抗原制备成含抗原弗氏完全佐剂与含抗原弗氏不完全佐剂；
S3、对免疫动物进行首次免疫、加强免疫和冲刺免疫，首次免疫采用S2中所述含抗原弗氏完全佐剂，加强免疫采用S2中所述含抗原弗氏不完全佐剂，冲刺免疫采用S2中所述11-α羟孕酮完全抗原；
S4、取S3中冲刺免疫后的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到所述抗11-α羟孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
在本发明的一个实施例中，在S1中，还包括通过氮气吹干，重悬于1mL三氯甲烷中，并用超纯水萃取三次。收集有机相，再次氮气吹干，终产物溶于中1mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。
在本发明的一个实施例中，在S1中，所述溶液的溶剂为甲醇和/或吡啶。
在本发明的一个实施例中，在S1中，所述溶液为甲醇、水和吡啶的混合溶液；所述甲醇：水：吡啶的体积比为4：1：1。
在本发明的一个实施例中，在S1中，所述11-α羟孕酮、羧甲基羟胺半盐酸盐的摩尔比为1：1-2。
在本发明的一个实施例中，在S1中，所述11-α羟孕酮半抗原选自以下结构：
在本发明的一个实施例中，在S1中，称取10mg 11-α羟孕酮，溶解于0.6mL甲醇：水：吡啶(4：1：1)溶液中，加入4mg羧甲基羟胺半盐酸盐(Carboxymethoxylaminehemihydrochloride，CMO)，65℃水浴搅拌2h，室温避光静置过夜。随后，溶液通过氮气氮吹干，重悬于1mL三氯甲烷中，并用超纯水取三次。收集有机相，再次氮吹吹干，终产物溶于中1mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，即11-α羟孕酮半抗原。
在本发明的一个实施例中，在S2中，所述11-α羟孕酮完全抗原由所述11-α羟孕酮半抗原活化后与载体蛋白偶联得到。
在本发明的一个实施例中，在S2中，所述11-α羟孕酮完全抗原的制备方法包括如下步骤，将所述11-α羟孕酮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于溶剂中，反应得到混合液，后将混合液加入到载体蛋白溶液中进行反应，得到所述11-α羟孕酮完全抗原。
在本发明的一个实施例中，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白(KLH)和/或牛血清蛋白(BSA)。
在本发明的一个实施例中，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
在本发明的一个实施例中，在S2中，所述11-α羟孕酮完全抗原的制备方法具体包括如下步骤，11-α羟孕酮半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入1-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌反应5-7h，称为A液；称取载体蛋白，加入缓冲溶液，称为B液；搅拌下，缓慢将A液逐滴加至B液中，室温反应6-10h，得到混合液；通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到11-α羟孕酮完全抗原。
在本发明的一个实施例中，在S2中，所述含抗原弗氏完全佐剂是弗氏完全佐剂与11-α羟孕酮完全抗原的等体积混合的乳化液。
在本发明的一个实施例中，在S2中，所述含抗原弗氏不完全佐剂是弗氏不完全佐剂与11-α羟孕酮完全抗原的等体积混合的乳化液。
在本发明的一个实施例中，在S3中，整个免疫过程包括1次首次免疫、多次加强免疫和1次冲刺免疫。
在本发明的一个实施例中，在S3中，整个免疫过程中首次免疫与加强免疫之间间隔28-31天，加强免疫之间间隔20-22天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18-21天。
在本发明的一个实施例中，在S3中，整个免疫过程中首次免疫的剂量为95-105μg/只，加强免疫的剂量为45-55μg/只，冲刺免疫的剂量为20-30μg/只。
在本发明的一个实施例中，在S3中，所述首次免疫和加强免疫是通过背部皮下注射入免疫动物体内；所述冲刺免疫是通过腹腔注射入免疫动物体内。
在本发明的一个实施例中，在S3中，所述加强免疫过程中对免疫动物进行采血，通过间接竞争酶联免疫法(icELISA)检测血清效价和抑制率，筛选出血清中11-α羟孕酮抗体含量高的免疫动物。
在本发明的一个实施例中，在S4中，细胞融合是将融合的细胞通过选择性培养基(HAT培养基)培养，利用间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法选择效价高、抑制效果最好的阳性细胞进行亚克隆，得到杂交瘤细胞株。
在本发明的一个实施例中，所述亚克隆的次数为3-5次。
在本发明的一个实施例中，在S4中，所述细胞融合是通过聚乙二醇(PEG4000)法进行的。
在本发明的一个实施例中，在S4中，所述细胞融合是在冲刺免疫结束2-4天后进行。
本发明的第三个目的是提供一种所述杂交瘤细胞株在制备11-α羟孕酮单克隆抗体中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种11-α羟孕酮单克隆抗体，所述11-α羟孕酮单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.45112的杂交瘤细胞株分泌得到。
在本发明的一个实施例中，向免疫动物腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.45112的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，获得所述11-α羟孕酮单克隆抗体-20℃保存。
在本发明的一个实施例中，取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106保藏编号为CGMCC No.45112的杂交瘤细胞株，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH＝7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
本发明的第五个目的是提供一种组合物，所述组合物中含有所述的杂交瘤细胞株和/或所述的11-α羟孕酮单克隆抗体。
本发明的第六个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的杂交瘤细胞株、所述的11-α羟孕酮单克隆抗体和所述的组合物中的一种或多种。
本发明的第七个目的是提供一种试纸条，所述试纸条含有所述的杂交瘤细胞株、所述的11-α羟孕酮单克隆抗体、所述的组合物和所述的试剂盒中的一种或多种。
本发明的第八个目的是提供一种所述的杂交瘤细胞株、所述的11-α羟孕酮克隆抗体、所述的组合物、所述的试剂盒或所述的试纸条在检测11-α羟孕酮中的应用，尤其是临床血样中11-α羟孕酮含量的免疫检测。
本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明所述的11-α羟孕酮单克隆抗体，对11-α羟孕酮具有较好的特异性(对孕酮、17-α羟孕酮、甲羟孕酮和雌二醇等性激素的交叉率小于0.02％)和检测灵敏度(IC50值为0.311ng/mL)。为检测临床上血样中11-α羟孕酮含量提供了免疫学方法。本发明提供的11-α羟孕酮单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测11-α羟孕酮的试剂盒，具有实际应用价值。
生物材料保藏
分泌11-α羟孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株属于单克隆细胞株，所述杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45112，分类命名为单克隆细胞株。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1为本发明11-α羟孕酮单克隆抗体对11-α羟孕酮的抑制标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
(1)下述实施例中涉及的试剂如下：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO31.59 g，NaHCO32.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2-7.4，用超纯水定容至1000mL；
洗涤液(PBST)：0.01mol/LpH＝7.4的PBS溶液中加入0.5mL的Tween-20；
PBST：含0.05％Tween-20的PBS；
抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤液；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
(2)下述实施例中涉及的检测方法如下：
11-α羟孕酮抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至1，0.3，0.1和0.03μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至1，0.3，0.1和0.03μg/mL。选择最佳工作点后，将11-α羟孕酮标准品稀释189，63，21，7，2.3，0.76，0.25和0ng/mL等浓度，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图，获得11-α羟孕酮标准抑制曲线，计算IC50。
实施例
一株分泌11-α羟孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法，具体包括以下步骤：
(1)11-α羟孕酮完全抗原的制备：
a、11-α羟孕酮半抗原的衍生路线如下：
称取10mg 11-α羟孕酮，溶解于0.6mL甲醇：水：吡啶(4：1：1)溶液中，加入4mg羧甲基羟胺半盐酸盐(Carboxymethoxylamine hemihydrochloride，CMO)，65℃水浴搅拌2h，室温避光静置过夜。随后，溶液通过氮气吹干，重悬于1mL三氯甲烷中，并用超纯水萃取三次。收集有机相，再次氮气吹干，终产物溶于中1mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，即11-α羟孕酮半抗原。
b、称取7.5mg的半抗原将其溶解在500μL DMF中，然后加入12.5mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，8mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，该混合物在室温搅拌6h；称取15mg钥孔血蓝蛋白KLH，溶解于0.1M碳酸盐缓冲液(CBS，pH＝9.4)中；随后，逐滴将含半抗原溶液加入到KLH溶液中，室温反应8h，即得偶联物11-α羟孕酮-KLH，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原11-α羟孕酮-KLH。
(2)包被原11-α羟孕酮-BSA的制备：
称取7.5mg的半抗原将其溶解在500μL DMF中，然后加入12.5mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，8mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，该混合物在室温搅拌6h；称取15mg牛血清白蛋白BSA，溶解于0.1M碳酸盐缓冲液(CBS，pH＝9.4)中；随后，逐滴将含半抗原溶液加入到BSA溶液中，室温反应8h，即得偶联物11-α羟孕酮-BSA，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到包被原11-α羟孕酮-BSA。包被原用于单抗制备过程中小鼠血清效价和抑制的检测。
(3)动物免疫：选择健康的6-8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。11-α羟孕酮完全抗原(免疫原)与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠。首次免疫用弗氏完全佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用弗氏不完全佐剂，剂量为50μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔1个月，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用生理盐水稀释免疫原后腹腔注射(不含佐剂)进行冲刺免疫，剂量为25μg/只；冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠。
(4)细胞融合：在冲刺免疫3天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到(1-4)×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，细胞轻轻敲散，重悬于含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640培养基中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(5)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用11-α羟孕酮为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对11-α羟孕酮标准品均有较好抑制以及对其类似交叉反应率低的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测，重复三次，获得细胞株。
测试例
(1)11-α羟孕酮单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH＝7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
用ic-ELISA测定单克隆抗体11-α羟孕酮的IC50为0.311ng/mL，说明对11-α羟孕酮有很好的灵敏度，可用于11-α羟孕酮免疫分析检测。分别测定11-α羟孕酮单克隆抗体对11-α羟孕酮、孕酮、17-α羟孕酮、甲羟孕酮和雌二醇的交叉反应，结果如表1所示。该单克隆抗体对11-α羟孕酮的交叉为100％，其中对孕酮、17-α羟孕酮、甲羟孕酮和雌二醇的交叉均小于0.02％。说明本发明所得单克隆抗体具有高灵敏度和特异性。
表1单克隆抗体的特异性
注：交叉反应率(Cross-reactivity，CR)＝11-α羟孕酮的IC50/结构类似物的IC50*100％。
结果表明，11-α羟孕酮单克隆抗体对孕酮、17-α羟孕酮、甲羟孕酮和雌二醇的交叉反应率极低，因此，本发明制备的抗体对11-α羟孕酮具有较好的特异性。
(2)抗体应用
将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于11-α羟孕酮的添加回收试验，具体步骤如下：
(1)包被：将包被原11-α羟孕酮-BSA用0.05M pH＝9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。
(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min.
(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。
(4)加样：将抗血清(小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清)从1：1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1：3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min。
(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。
(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
11-α羟孕酮单克隆抗体对11-α羟孕酮的抑制标准曲线如图1所示，可见用ic-ELISA测定11-α羟孕酮单克隆抗体的IC50值为0.311ng/mL，说明该抗体对11-α羟孕酮有很好的灵敏度，可用于11-α羟孕酮的免疫分析检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一株11-α羟孕酮单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45112。
2.权利要求1中所述杂交瘤细胞株在制备11-α羟孕酮单克隆抗体中的应用。
3.一种11-α羟孕酮单克隆抗体，其特征在于，所述11-α羟孕酮单克隆抗体由权利要求1中所述杂交瘤细胞株分泌得到。
4.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求3所述的11-α羟孕酮单克隆抗体。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求3所述的11-α羟孕酮单克隆抗体和权利要求4所述的组合物中的一种或多种。
6.一种试纸条，其特征在于，所述试纸条含有权利要求3所述的11-α羟孕酮单克隆抗体、权利要求4所述的组合物和权利要求5所述的试剂盒中的一种或多种。
7.权利要求3所述的11-α羟孕酮克隆抗体、权利要求4所述的组合物、权利要求5所述的试剂盒或权利要求6所述的试纸条在制备检测11-α羟孕酮的制剂中的应用。
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