CN114317449B - 麦角乙二胺抗原、麦角乙二胺单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了麦角乙二胺抗原、麦角乙二胺单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用，属于免疫检测技术领域。杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.45012。本发明先合成麦角乙二胺半抗原，再合成完全抗原，使用弗氏佐剂混合乳化，注射免疫BALB/c小鼠。筛选出高效价，低IC₅₀的小鼠脾细胞，通过PEG法与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择性培养基，筛选出两种细胞融合后的杂交瘤细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并多次亚克隆，得到单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对麦角乙二胺、麦角酸和麦角新碱具有较好的检测灵敏度，可用于免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，检测食品中麦角乙二胺、麦角酸和麦角新碱的含量。

Description

麦角乙二胺抗原、麦角乙二胺单克隆抗体、杂交瘤细胞株及 应用

技术领域

本发明属于食品安全免疫检测领域，具体涉及麦角乙二胺抗原、麦角乙二胺单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。

背景技术

麦角生物碱(ergot alkaloids，EA)，简称麦角碱，是由麦角菌属(claviceps)侵染黑麦、大麦、小麦、裸麦、燕麦以及多种禾本科植物而产生的生物碱毒素。麦角生物碱的毒性效应主要是外周围和中枢神经效应。麦角碱的活性成分主要是以麦角酸为基本结构的一系列生物碱衍生物。麦角乙二胺(LSD)是一种强烈的半人工致幻剂，从麦角真菌中提出的麦角酸与其它物质合成而得，是已知药力最强的致幻剂，极易为人体吸收。服用后除了能造成严重的精神混乱外，还能给肉体带来痛苦，例如在神经系统的症状是：运动失调，步履蹒跚，抽搐，用量过大还会导致全身瘫痪，严重时会导致死亡。

目前麦角乙二胺和其他麦角生物碱的检测方法主要分为仪器分析方法，包括毛细管电泳法(CE)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)等。其中LC-MS/MS能实现毒素的高通量精确分析而成为目前最主要的方法。已有的方法具有检测限低，可比性和重复性好等优点，但存在检测通量低、假阳性、灵敏度低和基质效应严重等问题，严重限制了其在实验室以外作业中的应用。

因此制备麦角乙二胺抗体，建立免疫分析检测方法快速而有效地检测食品中的麦角乙二胺及小麦等谷物制品中麦角酸等残留量的检测，对于食物中毒的毒源鉴定、致幻剂毒品的预防具有实际应用价值。

发明内容

为解决相关技术中存在的问题，一方面，本发明提供一株分泌麦角乙二胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株PN2H3，保藏编号CGMCC No.45012，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

另一方面，提供一种麦角乙二胺单克隆抗体，是由所述保藏编号为CGMCCNo.45012的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌产生。

另一方面，提供一种麦角乙二胺单克隆抗体的制备方法，包括：取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.45012的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的麦角乙二胺单克隆抗体低温保存。

又一方面，提供一种麦角乙二胺半抗原，其结构如式(1)所示：

另一方面，提供一种所述麦角乙二胺半抗原的制备方法，包括：

将麦角酸LCA溶于N，N-二甲基甲酰胺DMF中，得到麦角酸溶液；

将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC溶解在水中，得到EDC水溶液；

再将所述EDC水溶液和氨基己酸ACA加入到所述麦角酸溶液中；室温下黑暗中搅拌，即得到麦角乙二胺半抗原LCA-ACA。

进一步地，所述麦角酸、所述EDC和所述氨基己酸的投料质量比为1∶1.2-2.4∶0.8-1.8。

又一方面，提供一种麦角乙二胺完全抗原，用所述如式(1)所示的半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物，即为所述麦角乙二胺完全抗原；其中，所述载体蛋白选自但不限于牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA、钥孔血蓝蛋白KLH、甲状腺蛋白Tg或人血清白蛋白HSA；优选钥孔血蓝蛋白KLH或牛血清白蛋白BSA。

又一方面，提供一种麦角乙二胺半抗原或麦角乙二胺完全抗原的应用，用于制备所述的分泌麦角乙二胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

再一方面，提供一种麦角乙二胺半抗原或麦角乙二胺完全抗原的应用，用于制备所述麦角乙二胺单克隆抗体。

又一方面，提供一种分泌麦角乙二胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的应用，应用于检测麦角乙二胺、麦角酸或麦角新碱。

又一方面，提供一种麦角乙二胺单克隆抗体的应用，应用于检测麦角乙二胺、麦角酸或麦角新碱。

另一方面，提供一种试剂盒，含有所述的麦角乙二胺单克隆抗体。

又一方面，提供一种试剂盒的应用，用于检测麦角乙二胺、麦角酸或麦角新碱。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)本发明成功合成了麦角乙二胺的人工抗原，包含半抗原、完全抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径；

(2)本发明提供的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对麦角乙二胺、麦角酸和麦角新碱具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.8ng/mL、0.5ng/mL和1ng/mL)，可实现对小麦等食品中麦角乙二胺和其他麦角生物碱残留量的检测，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的麦角乙二胺和其他麦角生物碱检测方法提供了新手段。

(3)本发明提供的麦角乙二胺人工抗原可将麦角生物碱的共同核心的化学结构麦角酸暴露出来作为抗原决定簇，可同时识别麦角乙二胺和其他麦角生物碱，为高灵敏度抗麦角乙二胺抗体的制备奠定基础，实用价值高，在公共卫生安全检测中具有良好的应用前景，例如食品安全检测，人体血液、尿液样本检测等。

生物材料保藏

一株麦角乙二胺单克隆抗体杂交瘤细胞株，分类命名为：单克隆细胞株PN2H3，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.45012，保藏日期为：2021年12月16日。

附图说明

图1单克隆抗体6C6对麦角乙二胺、麦角酸和麦角新碱的标准抑制曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中涉及的培养基如下：

RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B12 0.005、碳酸氢钠2000。

下述实施例中涉及的试剂如下：

碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05％吐温20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按5∶1混合即为TMB显色液，现用现混。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

麦角乙二胺抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.01，0.03，0.1和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将麦角乙二胺和其他麦角生物碱标准品稀释为7个浓度(0.125，0.25，0.5，1，2.5，5，10ng/mL)，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图(结果如图4所示)，获得麦角乙二胺和其他麦角生物碱标准抑制曲线，计算IC₅₀。

实施例1麦角乙二胺人工抗原的制备：

本实施例所述免疫原与包被原的制备方法中，其区别在于载体蛋白的使用类型，所述免疫原载体蛋白主要采用KLH，所述包被原载体蛋白主要采用BSA，所用偶联方法为混合酸酐法。

1.1麦角乙二胺半抗原(LCA-ACA)的制备

将5mg麦角酸(LCA)溶于500μl N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到麦角酸溶液；

将8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)溶解在50μL水中，得到EDC水溶液；

再将EDC水溶液和6mg氨基己酸(ACA)加入到麦角酸溶液中；室温下在黑暗中搅拌4h，即得到麦角乙二胺半抗原(LCA-ACA)。其中，麦角酸、EDC和氨基己酸的投料质量可以按比例：1∶1.2-2.4∶0.8-1.8任意调配。

1.2麦角乙二胺包被原的制备：

向200uL麦角乙二胺半抗原(LCA-ACA)中先加入1.5μL三正丁胺，于4℃温度下反应5min后，加入0.8μL氯甲酸异丁酯，于4℃温度下继续反应50min，得到A液；

取8mg BSA，用2mL 0.01M碳酸盐缓冲溶液(CB，pH＝9.0)溶解得到B液，再将A液逐滴缓慢加入到B液中，偶联8h；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到麦角乙二胺包被原LCA-ACA-BSA，-20℃保存。

1.3麦角乙二胺免疫原的制备：

用KLH代替BSA，其它步骤与1.2相同，得到麦角乙二胺免疫原LCA-ACA-KLH，-20℃保存。

实施例2：分泌麦角乙二胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备

2.1动物免疫的获得

选择健康的6～8周龄的Balb/C小鼠进行免疫。将麦角乙二胺免疫原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为80ug/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为40ug/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为20ug/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。

2.2细胞融合与筛选

在冲击免疫3天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO₂培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

2.3细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液(HT培养基)进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用麦角乙二胺和其他麦角生物碱为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对麦角乙二胺和其他麦角生物碱标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得麦角乙二胺单克隆抗体细胞株PN2H3。实施例3：麦角乙二胺单克隆抗体的制备

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射3.7×10⁶麦角乙二胺杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。

在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01MPBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

实施例4：麦角乙二胺单克隆抗体的应用

(1)包被：将包被原LCA-ACA-BSA用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液(CBS)从1μg/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。

(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min.

(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。

(4)加样：将抗血清从1∶2000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1∶3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min。

(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。

(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。

实施例5灵敏度及特异性

小麦样品前处理：提取粉碎样品后，称取5g于50mL离心管中，加入15mL乙腈-碳酸铵混合溶液(85/15，v/v)，振荡提取30min，在4℃，10000r/min，离心10min，上清液过滤，取5mL在氮气中吹干，复溶于1mL甲醇中为后续实验使用。

使用间接竞争ELISA法，测定单克隆抗体对麦角乙二胺、麦角酸和麦角新碱的IC50值分别为0.8ng/mL、0.5ng/mL和1ng/mL，并验证其对其他麦角生物碱的IC50及交叉反应率，交叉反应率计算如下：

交叉反应率(％)＝(麦角乙二胺的IC50/化合物的IC50)×100

具体如表1所示，

化合物：麦角乙二胺、麦角酸、麦角新碱、麦角碱、麦角胺、麦角生碱。

表1单克隆抗体与麦角乙二胺及类似物的交叉反应性

由表1实验结果可知，本发明所得单克隆抗体对麦角乙二胺、麦角酸、麦角新碱有较好抑制，IC50值分别为0.8ng/mL、0.5ng/mL和1ng/mL，对其他麦角生物碱类似物的交叉率都小于5％，说明该单克隆抗体具有很高的灵敏度和特异性。

通过以上实施例可以看出，本发明关于麦角乙二胺的人工半抗原、完全抗原的合成步骤简洁，有效，可有效用于免疫分析中，为后续的的研究分析提供了方便的途径，提供的细胞株PN2H3分泌的单克隆抗体，对麦角乙二胺、麦角酸和麦角新碱具有较好的特异性和检测灵敏度(IC₅₀分别为0.8ng/mL、0.5ng/mL和1ng/mL)，可实现对小麦等食品中麦角乙二胺和其他麦角生物碱残留量的检测，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的麦角乙二胺和其他麦角生物碱检测方法提供了新手段。

以上仅以较佳实施例对本发明的技术方案进行介绍，但是对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，应能在具体实施方式上及应用范围上进行改变，故而，综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。

Claims (6)

1.一株分泌麦角乙二胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株PN2H3，保藏编号为CGMCC No.45012，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.一种麦角乙二胺单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.45012的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌产生。

3.如权利要求1所述的分泌麦角乙二胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的应用，其特征在于，应用于检测麦角乙二胺、麦角酸或麦角新碱。

4.如权利要求2所述麦角乙二胺单克隆抗体的应用，其特征在于，应用于检测麦角乙二胺、麦角酸或麦角新碱。

5.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的麦角乙二胺单克隆抗体。

6.权利要求5所述的试剂盒应用于检测麦角乙二胺、麦角酸或麦角新碱。