CN113046325A - 一株维生素k3单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株维生素K3单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明维生素K3单克隆抗体杂交瘤细胞株YCH 2G8，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20785。此细胞株分泌的单克隆抗体，对维生素K3具有较好的特异性和检测灵敏度。本发明合成了维生素K3半抗原，制备了维生素K3完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株YCH 2G8。本发明提供的维生素K3单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对维生素K3具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.49ng/mL)，为检测强化食品和饲料中维生素K3含量提供了免疫学方法。

Description

一株维生素K3单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一株维生素K3单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
维生素K3，也称为甲萘醌(2-甲基-1，4-萘醌)，是一种人工合成的脂溶性维生素，主要用作促凝血剂，参与光合作用机制，细胞呼吸，氧化磷酸化和抗癌剂。习惯饮食中维生素K的摄入量较低，以及关键的γ-羧化谷氨酸蛋白的低羧化现象在国际上普遍存在，增加维生素K的摄入对于改善公共健康非常重要。蔬菜和蔬菜菜肴是维生素K摄入来源，利用维生素K对食物进行生物强化是解决食物中维生素K摄入量低的重要潜在补充食品的方法。因此，准确测定强化食品中维生素K3含量对于食品质量控制很有必要。如今，为了促进畜牧业或水产养殖业中的动物生长和疾病预防，许多外来物质不当地或非法地添加到动物饲料中，从而导致动物中的内源性物质缺乏。因此，为了防止动物的维生素K3缺乏，经常不合理地将维生素K3加入到动物食用饲料。但由于其毒性和不当添加容易在动物体内产生副作用，特别是对于新生动物。因此，监测饲料中VK3的含量非常重要。
维生素K3的测定方法包括仪器分析方法，高效液相色谱法(HPLC)，HPLC结合各种检测器，如荧光，紫外，电化学等。尽管这些方法在实际样品的测试中通常是准确的，但它们具有一些缺陷包括耗时，成本高和复杂的提取步骤。此外，还有其他检测技术可以检测维生素K3，如流动注射分析，荧光法，比色法和电化学方法，并且检测限，线性范围，选择性和灵敏度等检测性能都非常出色，短时间不适合用于筛查样品中的大量测试样品，仍需进一步提高用于确定实际样品中维生素K3的检测性能且快速检测样本中的维生素K3。免疫测定方法如酶联免疫吸附测定(ELISA)，具有简单和低成本的优点，使其达到筛选目的成为现实，为维生素K3检测提供了一种新的检测途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种维生素K3单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。
本发明的第一个目的是提供一株维生素K3单克隆抗体杂交瘤细胞株YCH2G8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20785。
本发明的第二个目的是提供一种维生素K3单克隆抗体，由CGMCC No.20785的单克隆细胞株YCH 2G8分泌产生。
本发明的第三个目的是提供维生素K3单克隆抗体的应用，建立维生素K3含量的免疫检测方法。
本发明的一种实施方式中，所述应用是用于强化食品和饲料中维生素K3的检测。所述检测领域为强化食品和饲料。
本发明的第四个目的是提供制备维生素K3完全抗原的方法；具体如下：
维生素K3半抗原的制备方法：将2-甲基-1，4-萘醌，戊二酸，硝酸盐悬浮在乙腈溶液中，加热并搅拌至完全溶解；随后，滴加含过硫酸铵乙腈水溶液，滴加完成后搅拌，将反应混合物冷却至室温，得到棕黄色固体沉淀；乙酸乙酯萃取三次，浓缩合并的有机相，并通过制备柱纯化得到黄色固体2-(3-羧丙基)-3-甲基-1，4-萘醌，即得维生素K3半抗原。
步骤如下：将2-甲基-1，4-萘醌5.8mmol，戊二酸6mmol和硝酸盐6mmol悬浮在体积浓度为30％(v/v)的乙腈溶液中，加热并搅拌至完全溶解；随后，在60min内滴加10mL体积浓度为30％(v/v)含过硫酸铵乙腈水溶液，滴加完成后65℃搅拌5min，将反应混合物冷却至室温，得到棕黄色固体沉淀；乙酸乙酯萃取三次，浓缩合并的有机相，并通过制备柱纯化得到黄色固体2-(3-羧丙基)-3-甲基-1，4-萘醌，即维生素K3半抗原。。
维生素K3完全抗原的制备方法，包括维生素K3免疫原：称取维生素K3半抗原，将其溶解在DMF中，然后加入1-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，将该混合物在室温搅拌6h，得到反应液A；称取KLH，溶解于硼酸盐缓冲液中，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加入到溶液B液中，室温反应，即得偶联物维生素K3-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到维生素K3免疫原维生素K3-KLH。
免疫原的制备方法具体为：称取2.6mg的维生素K3半抗原，将其溶解在800μL DMF中，然后加入5.75mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，3.45mg N-羟基琥珀酰亚胺，该混合物在室温搅拌6h，得到反应液A；称取5mg KLH，溶解于0.1M硼酸盐缓冲液中，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加入到溶液B液中，室温反应8h，即得偶联物维生素K3-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到维生素K3免疫原维生素K3-KLH。
维生素K3完全抗原的制备方法，包括维生素K3包被原：称取维生素K3半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺，用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A2液，室温搅拌反应；称取鸡卵清白蛋白OVA，溶解于硼酸盐缓冲溶液中，得到B2溶液，在室温条件下，逐滴将A2液加入到B2液中，室温反应，即得偶联物维生素K3-OVA混合液，通过透析分离维生素K3包被原和未偶联的小分子半抗原，得到维生素K3包被原维生素K3-OVA。
维生素K3包被原的制备方法具体为：称取1.73mg维生素K3半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐3.83mg，N-羟基琥珀酰亚胺2.30mg，用800μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A2液，室温搅拌反应6h；称取5mg鸡卵清白蛋白OVA，溶解于硼酸盐缓冲溶液中，得到B2溶液，在室温条件下，逐滴将A2液加入到B2液中，室温反应8h，即得偶联物维生素K3-OVA混合液，通过透析分离维生素K3包被原和未偶联的小分子半抗原。
本发明的维生素K3单克隆抗体杂交瘤细胞株YCH 2G8的筛选方法，主要包括以下步骤：
(1)小鼠的免疫：将免疫原维生素K3-KLH与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用维生素K3-KLH完全抗原(不含佐剂)冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测血清效价和抑制；
(2)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG 4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得维生素K3单克隆抗体杂交瘤细胞株；
(3)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
本发明的有益效果：本发明提供的维生素K3单克隆抗体杂交瘤细胞株YCH2G8分泌的单克隆抗体，对维生素K3具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.49ng/mL)，为检测强化食品和饲料中维生素K3含量提供了免疫学方法。本发明提供的维生素K3单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测维生素K3的试剂盒，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株维生素K3单克隆抗体杂交瘤细胞株YCH 2G8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20785。
附图说明
图1YCH 2G8单克隆抗体对维生素K3的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将维生素K3完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对维生素K3有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株YCH 2G8。
实施例1杂交瘤细胞株YCH 2G8的制备
(1)完全抗原的制备：
a、半抗原合成路线如下：
Figure BDA0003007471260000031
维生素K3半抗原的制备：将2-甲基-1，4-萘醌(1.0g,5.8mmol)，戊二酸(0.8g,6mmol)和硝酸盐(1.0g,6mmol)悬浮在体积浓度为30％(v/v)的乙腈溶液中，加热并搅拌至完全溶解；随后，在60min内滴加10mL体积浓度为30％(v/v)含过硫酸铵乙腈水溶液，完成后65℃搅拌5min，将反应混合物冷却至室温，得到棕黄色固体沉淀；乙酸乙酯萃取三次，浓缩合并的有机相，并通过制备柱纯化得到黄色固体2-(3-羧丙基)-3-甲基-1，4-萘醌，即维生素K3半抗原。
b、免疫原维生素K3-KLH的制备：称取2.6mg的维生素K3半抗原将其溶解在800μLDMF中，然后加入5.75mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，3.45mg N-羟基琥珀酰亚胺，将该混合物在室温搅拌6h，得到反应液A；称取5mg KLH，溶解于0.1M硼酸盐缓冲液中，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加入到溶液B液中，室温反应8h，即得偶联物维生素K3-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原维生素K3-KLH。
(2)包被原维生素K3-OVA的制备：
称取1.73mg维生素K3半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐3.83mg，N-羟基琥珀酰亚胺2.30mg，用800μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A2液，室温搅拌反应6h。称取5mg鸡卵清白蛋白OVA(维生素K3半抗原与OVA摩尔比为60:1)，溶解于2mL 0.1M硼酸盐缓冲溶液中，得到B2溶液，在室温条件下，逐滴将A2液加入到B2液中，室温反应8h，即得偶联物维生素K3-OVA混合液，通过透析分离维生素K3-OVA包被原和未偶联的小分子半抗原。包被原用于单抗制备过程中小鼠血清效价和抑制的检测，并不直接用于小鼠，是制备单抗必需的。
(3)动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取三种不同摩尔比的维生素K3-KLH完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血(小鼠断尾采血5μL+995μL抗体稀释液＝抗血清)，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
(4)细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到﹙1～4﹚×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(5)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清、1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用维生素K3为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对维生素K3标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株YCH 2G8。
(6)单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体，置于-20℃保存。
实施例2维生素K3单克隆抗体的IC50的测定
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.0g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
洗涤液(PBST)：1000mL的0.01mol/L pH7.4的PBS溶液中加入0.5mL的Tween–20；PBST：含0.05％Tween–20的PBS；
抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤缓冲液；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。
(1)包被：将维生素K3-OVA包被原用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
(4)加样：将抗血清(小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清)从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体维生素K3的IC50为0.49ng/mL，说明对维生素K3有很好的灵敏度，可用于维生素K3免疫分析检测。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株维生素K3单克隆抗体杂交瘤细胞株YCH 2G8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20785。
2.一种维生素K3单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.20785的杂交瘤细胞株YCH 2G8分泌产生。
3.维生素K3半抗原的制备方法，其特征在于：将2-甲基-1，4-萘醌，戊二酸，硝酸盐悬浮在乙腈溶液中，加热并搅拌至完全溶解；随后，滴加含过硫酸铵乙腈水溶液，滴加完成后搅拌，将反应混合物冷却至室温，得到棕黄色固体沉淀；乙酸乙酯萃取三次，浓缩合并的有机相，并通过制备柱纯化得到黄色固体2-(3-羧丙基)-3-甲基-1，4-萘醌，即维生素K3半抗原。
4.根据权利要求3所述维生素K3半抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：将2-甲基-1，4-萘醌5.8mmol，戊二酸6mmol和硝酸盐6mmol悬浮在体积浓度为30％的乙腈溶液中，加热并搅拌至完全溶解；随后，在60min内滴加10mL含体积浓度为30％过硫酸铵的乙腈水溶液，滴加完成后65℃搅拌5min，将反应混合物冷却至室温，得到棕黄色固体沉淀；乙酸乙酯萃取三次，浓缩合并的有机相，并通过制备柱纯化得到黄色固体2-(3-羧丙基)-3-甲基-1，4-萘醌，即维生素K3半抗原。
5.维生素K3完全抗原的制备方法，其特征在于包括维生素K3免疫原：称取维生素K3半抗原，将其溶解在DMF中，然后加入1-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，将该混合物在室温搅拌6h，得到反应液A；称取KLH，溶解于硼酸盐缓冲液中，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加入到溶液B液中，室温反应，即得偶联物维生素K3-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到维生素K3免疫原维生素K3-KLH。
6.根据权利要求5所述维生素K3完全抗原的制备方法，其特征在于免疫原的制备方法具体为：称取2.6mg的维生素K3半抗原，将其溶解在800μL DMF中，然后加入5.75mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，3.45mg N-羟基琥珀酰亚胺，该混合物在室温搅拌6h，得到反应液A；称取5mgKLH，溶解于0.1M硼酸盐缓冲液中，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加入到溶液B液中，室温反应8h，即得偶联物维生素K3-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到维生素K3免疫原维生素K3-KLH。
7.维生素K3完全抗原的制备方法，其特征在于包括维生素K3包被原：取维生素K3半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A2液，室温搅拌反应；称取鸡卵清白蛋白OVA，溶解于硼酸盐缓冲溶液中，得到B2溶液，在室温条件下，逐滴将A2液加入到B2液中，室温反应，即得偶联物维生素K3-OVA混合液，通过透析分离维生素K3包被原和未偶联的小分子半抗原，得到维生素K3包被原维生素K3-OVA。
8.根据权利要求7所述维生素K3完全抗原的制备方法，其特征在于维生素K3包被原的制备方法具体为：称取1.73mg维生素K3半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐3.83mg，N-羟基琥珀酰亚胺2.30mg，用800μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A2液，室温搅拌反应6h；称取5mg鸡卵清白蛋白OVA，溶解于2mL 0.1M硼酸盐缓冲溶液中，得到B2溶液，在室温条件下，逐滴将A2液加入到B2液中，室温反应8h，即得偶联物维生素K3-OVA混合液，通过透析分离维生素K3-OVA包被原和未偶联的小分子半抗原。
9.权利要求2所述维生素K3单克隆抗体的应用，其特征在于：建立维生素K3含量的免疫检测方法，应用于强化食品和饲料中维生素K3的检测。
10.根据权利要求9所述维生素K3单克隆抗体的应用，其特征在于：所述检测领域为强化食品和饲料。
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