CN111909903B - 一株齐帕特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株齐帕特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。齐帕特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株SMB1C2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19170。将齐帕特罗的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，最终得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对齐帕特罗具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.5ng/mL），可实现对牛奶、肌肉组织和尿液中齐帕特罗残留量的检测，为食品中齐帕特罗残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株齐帕特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一株齐帕特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。
背景技术
齐帕特罗（Zilpaterol hydrochloride，ZIL）是一种兴奋剂类药物，β—肾上腺素受体激动剂。该类药物是指一类能使支气管平滑肌β肾上腺素受体激动的药物。β—肾上腺素受体激动剂类药物能使支气管平滑肌松弛、支气管扩张。可用来治疗支气管哮喘、慢性喘息型支气管炎。常用的有沙丁胺醇、特布他林等。包括非选择性的β肾上腺素受体激动剂如肾上腺素、麻黄碱和异丙管上腺素以及选择性β2肾上腺素受体激动剂如沙丁胺醇、叔丁喘宁等。它们主要通过激动呼吸道的β2受体，激活腺苷酸环化酶，使细胞内的环磷腺昔（cAMP）含量增加，游离Ca2+减少，从而松弛支气管平滑肌，抑制过敏反应介质释放，增强纤毛运动，降低血管通透性，而发挥平喘作用。
“瘦肉精”主要是肾上腺素，β-激动剂，β-兴奋剂等，齐帕特罗为其中之一，其大剂量用在饲料中可以减少牲畜脂肪含量，提高瘦肉率，屠宰后的“瘦肉精肉”色泽鲜红诱人，使肉品可以提早上市，降低成本。而这些“瘦肉精”一旦进入人体，一方面它能促进体内脂肪分解，使大量游离脂肪酸进入血液，使血管壁弹性变弱，血压升高，血管发生膨胀，压迫周围的神经末梢；另一方面它能降低Mg2+浓度，导致肌肉过度兴奋，发生震颤，同时还会改变K+,Ca2 +,Na+的浓度，对人体的危害极大。因此，建立快速有效的检测齐帕特罗含量的方法具有重要意义及市场价值。采用高效液相色谱方法检测，检测方法较为繁琐、复杂，检测限过高，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对ZIL的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法（ELISA）前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对齐帕特罗的高特异性单克隆单体。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株齐帕特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对齐帕特罗具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立齐帕特罗的免疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株齐帕特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株SMB1C2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19170。
齐帕特罗单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No. 19170的杂交瘤细胞株SMB1C2分泌产生。
本发明提供的齐帕特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株SMB1C2的制备基本步骤为：
（1）半抗原的衍生：将4,5,6,7-四氢-6-羟亚胺基-咪唑并[4,5,1-jk]-[1]苯并氮杂卓-2,7-(1H,6H)-二酮制备得到盐酸齐帕特罗，再与溴丁酸乙酯反应即得到齐帕特罗半抗原；
齐帕特罗半抗原的合成路线如下：
Figure 894818DEST_PATH_IMAGE001
a、将100g的4,5,6,7-四氢-6-羟亚胺基-咪唑并[4,5,1-jk]-[1]苯并氮杂卓-2,7-(1H,6H)-二酮溶于到甲醇和DMF(N,N-Dimethylformamide,N,N-二甲基甲酰胺)的混合溶剂中，搅拌均匀后和40g第一催化剂一起加入到反应器中，依次用氮气、氢气置换反应器中的空气后，向反应器中充入氢气，搅拌升温至30-50℃，氢气压力为1-10MPa，反应时间为4-24h，反应结束后，过滤回收催化剂。
b、将步骤a所得滤液加酸调节pH为6.5-8.0后加入丙酮，将混合物和15g第二催化剂一起加到反应器中，依次用氮气、氢气置换反应器中的空气后，向反应器中充入氢气，搅拌升温至55-90℃，氢气压力为1-10MPa，反应时间为1-48h，反应结束后，过滤回收催化剂。
c、将步骤b所得滤液加酸调节pH为4.0-8.0，浓缩去除溶剂，然后加入乙醇/水溶液，用碱调节pH为9.0-10.5，搅拌结晶即得齐帕特罗。
d、将步骤c所得齐帕特罗溶于甲醇中，再进一步与溴丁酸乙酯反应即得到齐帕特罗半抗原re-ZIL。
所述第一催化剂为氢化还原反应的催化剂，具体为负载量为5%的Pd/C、负载量为10%的Pd/C及负载量为1% - 5%的Pt/C中的一种或几种；
所述第二催化剂为氢化还原反应的催化剂；具体为负载量为5%的Pd/C、负载量为10%的Pd/C及负载量为1% - 5%的Pt/C和兰尼镍中的一种或几种。
（2）完全抗原re-ZIL-EDC-BSA的制备：称取2.65mg 齐帕特罗衍生物(re-ZIL与牛血清白蛋白(BSA)摩尔比为100：1)，溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌反应10min,充分溶解后，先后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)2.3mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)3.5mg，室温活化反应4-6小时，作为A液。取6mg BSA，用2mL 0.01M碳酸盐缓冲溶液(CBS, pH=9.0)溶解（称为B液），再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温偶联反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原re-ZIL-EDC-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；
（3）小鼠的免疫：将re-ZIL-EDC-BSA完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG 4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（HAT培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得ZIL的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株SMB1C2；
（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
re-ZIL-EDC-BSA完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫（100μg/只）用完全弗氏佐剂，多次加强免疫（50μg/只）用不完全弗氏佐剂，最后一次冲刺免疫用re-ZIL-EDC-BSA完全抗原（25μg/只，不含佐剂）进行小鼠腹腔注射。取特异性高，IC50低的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过ic-ELISA法筛选细胞和三次亚克隆，得到一株高分泌特异抗体的杂交瘤细胞株。
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株SMB1C2分泌的单克隆抗体，对ZIL具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.5ng/mL），可实现对牛奶、肌肉组织和尿液中齐帕特罗残留量的检测，为食品中ZIL残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
附图说明
图1 SMB1C2单克隆抗体的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将齐帕特罗完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了针对齐帕特罗具有高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株SMB1C2。
实施例1 杂交瘤细胞株SMB1C2的制备
（1）完全抗原re-ZIL-EDC-BSA的制备：称取2.65mg 齐帕特罗衍生物（re-ZIL与牛血清白蛋白（BSA）摩尔比为100：1），溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌反应10min,充分溶解后，先后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)2.3mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)3.5mg，室温活化反应4-6小时，作为A液。取6mg BSA，用2mL 0.01M碳酸盐缓冲溶液（CB, pH=9.0）溶解（称为B液），再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温偶联反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原re-ZIL-EDC-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；
（2）动物免疫：将re-ZIL-EDC-BSA完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞： 融合前 7-10 天，将 SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。 融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到（1-4）*107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min： 第1min，将1mL的PEG 4000 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5min。 离心（800 rpm，10 min），弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20%胎牛血清，2% 50×HAT的RPMI-1640选择性培养基（HAT培养基），按照200μL/ 孔加到 96 孔细胞板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。
（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20% 胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液（HT培养基）进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用齐帕特罗为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对齐帕特罗标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得齐帕特罗单克隆抗体细胞株SMB1C2。
（5）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106 齐帕特罗杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
5.1包被：将包被原re-ZIL-DCC-OVA 用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1µg/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
5.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
5.3封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
5.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
5.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37 ℃避光反应15min；
5.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体齐帕特罗的IC50为：0.5 ng/mL，说明对齐帕特罗有很好的灵敏度，可用于齐帕特罗免疫分析检测。
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05 % 吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4 .12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。

Claims (3)

1.一株齐帕特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株SMB1C2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19170。
2.齐帕特罗单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.19170的杂交瘤细胞株SMB1C2分泌产生。
3.权利要求2所述齐帕特罗单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全检测中齐帕特罗残留的分析检测。
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