CN114774368B - 一株分泌抗丙炔氟草胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株分泌抗丙炔氟草胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明分泌抗丙炔氟草胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.22334。本发明获得的抗丙炔氟草胺单克隆抗体细胞株可用于食品安全检测中丙炔氟草胺残留分析检测，其对丙炔氟草胺有较好的检测灵敏度和特异性(IC₅₀值为0.59ng/mL)。本发明成果可用制备丙炔氟草胺的免疫检测试剂盒，为谷物、油料、蔬菜、水果、调味料以及生乳中丙炔氟草胺残留量的检测提供有力的检测方法与手段。

Description

一株分泌抗丙炔氟草胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明属于食品中农药残留的快速检测技术领域，尤其是涉及一株分泌抗丙炔氟草胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

丙炔氟草胺(flumioxazin，简称FLU)，商品名Sumisoya、速收，是日本住友化学工业株式会社开发的环酰亚胺类除草剂。丙炔氟草胺为原卟啉原氧化酶抑制剂，是触杀型选择性除草剂，使用后会在土壤表面形成处理层，杂草幼苗接触后会引起植物体内的原卟啉积累，使细胞膜脂质过氧化作用增强，从而导致敏感杂草的细胞膜结构与细胞功能产生不可逆损害，在24～48h内敏感杂草幼苗就会由凋萎、白化到坏死及枯死。其目前已在多个国家上市，主要用来防除大豆、棉花、葡萄和其他许多作物田中的阔叶杂草。

测定丙炔氟草胺含量的分析方法目前研究较少，主要有气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)和高效液相色谱法(HPLC-UV)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，因此建立快速简便的丙炔氟草胺检测方法具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为丙炔氟草胺检测提供了一种新的检测途径。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一株分泌抗丙炔氟草胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

本发明的第一个目的在于提供一株分泌抗丙炔氟草胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.22334，所述杂交瘤细胞株分类命名为单克隆细胞株。

本发明的第二个目的在于提供一种分泌抗丙炔氟草胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：

S1：取杂环酮、硫羧酸溶于有机溶剂中，并加入碳酸钾，加热回流反应，待反应结束后将反应液分离纯化得到丙炔氟草胺半抗原FLU-COOH；

S2：利用S1中所述丙炔氟草胺半抗原制备丙炔氟草胺完全抗原，将丙炔氟草胺完全抗原与完全弗氏佐剂制备得到免疫原1，所得丙炔氟草胺完全抗原和不完全弗氏佐剂乳化得到免疫原2；

S3：将S2中所得免疫原1对小鼠进行皮下免疫；

S4：将S3中免疫后的小鼠使用S2中免疫原2再进行加强免疫，并使用丙炔氟草胺完全抗原进行冲刺免疫；

S5：取S4中冲刺免疫后的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞，进行细胞融合，得到所述杂交瘤细胞株。

在本发明的一个实施例中，S1中所述杂环酮的结构式为：

其中

在本发明的一个实施例中，S1中所述硫羧酸如式(1)-式(2)所示：

其中n＝1-6。

在本发明的一个实施例中，S1中所述丙炔氟草胺与硫羧酸的质量之比为1:0.8-3。

在本发明的一个实施例中，S1中所述有机溶剂为DMSO、乙二醇和DMF中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，S1中所述丙炔氟草胺半抗原结构式：

n＝1-6。

本发明的第三个目的在于提供所述杂交瘤细胞株在制备抗丙炔氟草胺单克隆抗体中的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种抗丙炔氟草胺单克隆抗体，所述抗丙炔氟草胺单克隆抗体是由所述的杂交瘤细胞株分泌所得。

本发明的第五个目的在于提供所述的抗丙炔氟草胺单克隆抗体在检测丙炔氟草胺中的应用。

本发明的第六个目的在于提供一种组合物，所述组合物包括所述的抗丙炔氟草胺单克隆抗体。

所述的组合物在检测丙炔氟草胺中的应用。

本发明的第七个目的在于提供一种试剂盒，包括所述的抗丙炔氟草胺单克隆抗体。

所述的试剂盒在检测丙炔氟草胺中的应用。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明提供的杂交瘤细胞株SALL分泌的单克隆抗体，对丙炔氟草胺具有较好的特异性和检测灵敏度(IC₅₀值为0.59ng/mL)，可实现对谷物、油料、蔬菜、水果、调味料以及生乳中丙炔氟草胺残留量的检测，为食品中丙炔氟草胺残留的免疫学检测提供了原料，具有实际应用价值。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1-图3是本发明实施例1中丙炔氟草胺羧酸衍生物FLU-COOH的质谱图。

图4是本发明实施例1中所得偶联物丙炔氟草胺-BSA

图5是本发明SALL单克隆抗体对丙炔氟草胺的抑制标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明通过将丙炔氟草胺完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过icELISA筛选细胞上清，最终得到了对丙炔氟草胺有较高灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株SALL。

实施例1

1.完全抗原的制备

(1)半抗原的合成，反应方程式如下图所示：

衍生步骤简述如下：

丙炔氟草胺半抗原的制备：取0.5g丙炔氟草胺，适量的巯基丙酸与碳酸钾，按1:1:3的比例溶入10mLDMF中，高温加热回流12h，反应结束后加入100mL去离子水，滴加1M HCl溶液调至酸性，乙酸乙酯萃取，合并三次萃取的有机相，60℃旋转蒸馏干燥，得到丙炔氟草胺羧酸衍生物FLU-COOH；将所得FLU-COOH进行表征，具体见图1-图3。(通式中n＝1)。

(2)称取3.4mg已制备的FLU-COOH，溶于200μLDMF中，搅拌下依次加入4.6mgN-羟基琥珀酰亚胺和7.7mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应4h，得到的混合物称为A液；然后称取10mg牛血清蛋白BSA溶于2mL碳酸盐缓冲液中，称为B液；将A液缓慢滴入B液中，搅拌下室温反应12h，用0.01mol/L磷酸缓冲液PBS透析3d，即得偶联物丙炔氟草胺-BSA，-20℃冻存备用。

2.包被原的制备：

称取1.7mg FLU-COOH，溶于200μLDMF中，搅拌下依次加入2.3mgN-羟基琥珀酰亚胺和3.4mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应4h，得到的混合物称为A液；然后称取10mg鸡卵清蛋白OVA溶于2mL碳酸盐缓冲液中，称为B液；将A液缓慢滴入B液中，搅拌下室温反应12h，用0.01mol/L磷酸缓冲液PBS透析3d，即得偶联物丙炔氟草胺-OVA，-20℃冻存备用。

3.小鼠的免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取丙炔氟草胺完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血(小鼠断尾采血5μL+995μL抗体稀释液＝抗血清)，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。

4.细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

(1)摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

(2)收集鼠源骨髓瘤SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO₂培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

(3)融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

5.细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用丙炔氟草胺为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对丙炔氟草胺标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株SALL。

6.单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

7.抗体应用：将杂交瘤细胞株SALL通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于丙炔氟草胺的添加回收试验，具体步骤如下：

(1)包被：将包被原丙炔氟草胺-OVA用0.05MpH 9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。

(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min.

(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。

(4)加样：将抗血清(小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清)从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min。

(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min.

(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。

用ic-ELISA测定单克隆抗体对丙炔氟草胺的IC₅₀为0.59ng/mL，说明对丙炔氟草胺有很好的灵敏度，可用于丙炔氟草胺免疫分析检测。

SALL单克隆抗体对丙炔氟草胺的抑制标准曲线如图1所示。

溶液配制：

碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na₂CO₃1.59 g，NaHCO₃2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.0g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

洗涤液(PBST)：1000mL的0.01mol/LpH7.4的PBS溶液中加入0.5mL的Tween-20；

PBST：含0.05％Tween-20的PBS；

抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤缓冲液；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄.12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB。显色液，现用现混。

8，特异性实验-交叉反应：

使用间接竞争ELISA法，测定单克隆抗体对丙炔氟草胺的IC₅₀为0.59ng/mL，并验证其对丙炔氟草胺等的IC₅₀及交叉反应率，交叉反应值计算如下：

(丙炔氟草胺的IC₅₀/化合物的IC₅₀)×100，具体如表1所示，

交叉物：Flumiclorac-pentyl(氟胺草酯)、Fluthiacet-methyl(氟噻甲草酯)、Cafenstrole(唑草胺)、Carfentrazone(三唑酮草酯)、Pyraflufen-ethyl(吡草醚)、Sulfentrazone(磺酰唑草酮)。

表1单克隆抗体与FLU及类似物的交叉反应性

由表1实验结果可知，本发明所得单克隆抗体只对丙炔氟草胺有抑制，IC₅₀值为0.59ng/mL，对类似物的交叉都小于3％，说明该单克隆抗体具有很高的灵敏度和特异性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一株分泌抗丙炔氟草胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.22334。

2.一种分泌抗丙炔氟草胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：取丙炔氟草胺和巯基丙酸溶于有机溶剂中，并加入碳酸钾，加热回流反应，待反应结束后将反应液分离纯化得到丙炔氟草胺半抗原；

S2：利用S1中所述丙炔氟草胺半抗原制备丙炔氟草胺完全抗原，将丙炔氟草胺完全抗原与完全弗氏佐剂制备得到免疫原1，所得丙炔氟草胺完全抗原和不完全弗氏佐剂乳化得到免疫原2；所述丙炔氟草胺半抗原的结构式：

，n=1；

S3：将S2中所得免疫原1对小鼠进行皮下免疫；

S4：将S3中免疫后的小鼠使用S2中免疫原2再进行加强免疫，并使用丙炔氟草胺完全抗原进行冲刺免疫；

S5：取S4中冲刺免疫后的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞，进行细胞融合，得到所述杂交瘤细胞株；

制备丙炔氟草胺完全抗原的步骤：所得丙炔氟草胺半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基碳二亚胺盐酸盐混合溶解于有机溶剂中，反应得到混合物，并将丙炔氟草胺半抗原加入牛血清白蛋白BSA溶液中进行反应，得到偶联物丙炔氟草胺-BSA，即所述丙炔氟草胺完全抗原。

3.权利要求1中所述杂交瘤细胞株在制备抗丙炔氟草胺单克隆抗体中的应用。

4.一种抗丙炔氟草胺单克隆抗体，其特征在于，所述抗丙炔氟草胺单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌所得。

5.如权利要求4所述的抗丙炔氟草胺单克隆抗体在检测丙炔氟草胺中的应用。

6.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求4中所述的抗丙炔氟草胺单克隆抗体。

7.如权利要求6所述的组合物在检测丙炔氟草胺中的应用。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4中所述的抗丙炔氟草胺单克隆抗体。

9.如权利要求8所述的试剂盒在检测丙炔氟草胺中的应用。

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