CN114058594B - 一种分泌维生素a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分泌维生素A单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测领域。本发明合成维生素A半抗原，制备维生素A完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，首次免疫(100μg/只)用弗氏完全佐剂，多次加强免疫(50μg/只)用弗氏不完全佐剂，最后一次用维生素A完全抗原(25μg/只，不含佐剂)冲刺免疫。取高效价、低IC50小鼠脾细胞，通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对维生素A具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50为493.68ng/mL)。本发明可用于建立食品中维生素A含量的免疫检测方法，具有实际应用价值。

Description

一种分泌维生素A单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种分泌维生素A单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
维生素A是一组脂溶性类视黄醇的名称，包括视黄醇、视黄醛和视黄酯。维生素A参与免疫功能、视觉、繁殖和细胞通讯。维生素A作为视紫质的重要组成部分对视力至关重要，视紫质是一种在视网膜受体中吸收光的蛋白质，因为它支持结膜和角膜的正常分化和功能。维生素A还支持细胞生长和分化，在心脏、肺、肾脏和其他器官的正常形成和维持中发挥关键作用。人类饮食中有两种形式的维生素A：预制的维生素A(视黄醇及其酯化形式，视黄酯)和维生素A原类胡萝卜素。预制维生素A存在于动物来源的食物中，包括乳制品、鱼和肉(尤其是肝脏)。迄今为止，最重要的维生素原A类胡萝卜素是β-胡萝卜素；其他维生素原A类胡萝卜素是α-胡萝卜素和β-隐黄质。身体将这些植物色素转化为维生素A。维生素原A和预先形成的维生素A都必须在细胞内代谢为视黄醛和视黄酸(维生素A的活性形式)，以支持维生素的重要生物学功能。维生素A的推荐膳食摄入量0-6个月，400μg视黄醇，7-12个月，500μg视黄醇，1-3岁，300μg视黄醇，4-8岁，400μg视黄醇，9-13岁，600μg视黄醇，14-18岁，900μg视黄醇，中老年，900μg视黄醇，孕妇，300μg视黄醇，哺乳期妇女，1300μg视黄醇。维生素A缺乏症在许多发展中国家很常见，通常是因为居民无法从动物性食物来源获得含有预制维生素A的食物，据世界卫生组织统计，全球有1.9亿学龄前儿童和1910万孕妇的血清视黄醇浓度低于0.70微摩尔/升。幼儿和孕妇缺乏维生素A的最常见症状是干眼症和贫血。由于食物提供了一系列对健康有益的营养素和其他成分，因此营养需求应主要通过食物来满足。某些特殊情况下，强化食品和膳食补充剂是有用的。因此，食品中的维生素A的检测至关重要。
维生素A含量分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用(LC-MS)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，因此建立快速简便的维生素A检测方法具有重要意义。
酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为维生素A检测提供了一种检测方法。而建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是其重要前提。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种分泌维生素A单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株分泌的抗体针对维生素A具有较高的检测灵敏度，为维生素A检测提供了一种检测方法。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明的第一个目的是提供一种分泌维生素A单克隆抗体杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称单克隆细胞株LXA，保藏编号为CGMCC No.22331，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的第二个目的是提供一种维生素A单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNo.22331的单克隆细胞株LXA分泌产生。
本发明的第三个目的是提供一种维生素A完全抗原的制备方法，由维甲酸作为半抗原，通过EDC/NHS法偶联载体蛋白，制备所述维生素A完全抗原，所述载体蛋白包括KLH、BSA、OVA其中任意一种。
本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
S1、维甲酸和NHS溶解于DMF中，室温反应；
S2、加入EDC，室温反应，得反应液；
S3、将所述反应液逐滴加入连续搅拌的含有载体蛋白的碳酸盐缓冲溶液中，室温反应；
S4、透析分离，得到维生素A完全抗原。
本发明的一种实施方式中，所述维生素A完全抗原包括维生素A免疫原。
在一种示例中，所述维甲酸与NHS的摩尔比为1∶2～5，所述维甲酸在DMF中的浓度为0.02～0.05mol/L；优选的，所述维甲酸与NHS的摩尔比为1∶3，所述维甲酸在DMF中的浓度为0.04mol/L。
在一种示例中，所述维甲酸与EDC的摩尔比为1∶2～5，优选的，所述维甲酸与EDC的摩尔比为1∶3。
在一种示例中，所述维甲酸与载体蛋白的摩尔比为1∶2～5，优选的，所述维甲酸与载体蛋白的摩尔比为1∶3。
本发明的一种实施方式中，所述维生素A完全抗原包括维生素A包被原。
在一种示例中，所述维甲酸与NHS的摩尔比为2～5∶10，所述维甲酸在DMF中的浓度为0.005～0.01mol/L；优选的，所述维甲酸与NHS的摩尔比为3∶10，所述维甲酸在DMF中的浓度为0.0075mol/L；
在一种示例中，所述维甲酸与EDC的摩尔比为2～5∶10，优选的，所述维甲酸与EDC的摩尔比为3∶10；
在一种示例中，所述维甲酸与载体蛋白的摩尔比为1∶2～5，优选的，所述维甲酸与载体蛋白的摩尔比为1∶3。
本发明的一种实施方式中，所述载体蛋白溶解于0.05M碳酸盐缓冲溶液中，浓度为1～5g/mL；优选的，浓度为2.5g/mL。
本发明的一种实施方式中，所述步骤S1中，反应时间为10～20min；所述步骤S2中，反应时间为20～40min；所述步骤S3中，反应时间为10～15h；
优选的，所述步骤S1中，反应时间为15min；所述步骤S2中，反应时间为30min；所述步骤S3中，反应时间为12h。
本发明的第四个目的是提供一种维生素A完全抗原，根据上述任一所述方法制备得到。
本发明的第五个目的是提供维生素A单克隆抗体的应用。
本发明的一种实施方式中，所述应用是建立维生素A含量的免疫检测方法，用于食品中维生素A的检测。
本发明的一种实施方式中，所述维生素A单克隆抗体用于制备食品安全检测中维生素A残留量的分析检测用的检测主体。
本发明的一种实施方式中，所述检测主体包括试剂、检测板、试剂盒。
本发明的一种实施方式中，制备维生素A完全抗原的方法，以载体蛋白分别选用KLH和OVA为例作为示例，所述维生素A免疫原和维生素A包被原的制备方法基本步骤为：
(1)免疫原维生素A-KLH的制备：选用VA类似物维甲酸作为半抗原，维甲酸含有活性基团羧基，可通过EDC/NHS法制备人工抗原维生素A-KLH。具体步骤如下：称取维甲酸(6.0mg，0.02mmol)和NHS(6.9mg，0.06mmol)溶解于800μL DMF中，室温反应15min后，加入EDC(11.5mg，0.06mmol)，室温反应30min。将反应液逐滴加入到连续搅拌的KLH溶液中(15mgKLH溶解于6mL 0.05M碳酸盐缓冲溶液中)，室温反应12h。最后，反应液用0.01M PBS溶液透析3天，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原维生素A-KLH和包被原维生素A-KLH。将所制备的人工抗原分装并且保存于-20℃冰箱中待用。
(2)包被原维生素A-OVA的制备：称取维甲酸(2.0mg，0.006mmol)和NHS(2.3mg，0.02mmol)溶解于800μL DMF中，室温反应15min后，加入EDC(3.83mg，0.02mmol)，室温反应30min。将反应液逐滴加入到连续搅拌的OVA液中(5mg OVA溶解于2mL 0.05M碳酸盐缓冲溶液中)，室温反应12h。最后，反应液用0.01M PBS溶液透析3天，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原维生素A-OVA和包被原维生素A-OVA。将所制备的包被原分装并且保存于-20℃冰箱中待用。
本发明的分泌维生素A单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，主要包括以下步骤：
(1)小鼠的免疫：将免疫原维生素A-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用维生素A-BSA完全抗原(不含佐剂)冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测血清效价和抑制；
(2)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG 4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得维生素A单克隆抗体杂交瘤细胞株；
(3)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。本发明的有益效果：本发明提供的维生素A单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对维生素A具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为493.68ng/mL)，为检测食品中维生素A含量提供了免疫学方法。本发明提供的维生素A单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测维生素A的试剂盒，具有实际应用价值。
生物材料保藏：一株分泌维生素A单克隆抗体杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称单克隆细胞株LXA，保藏编号为CGMCCNo.22331，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为维生素A单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定的结果图示。
图2为单克隆抗体对维生素A的抑制标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明实施例通过将维生素A完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对维生素A有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例1杂交瘤细胞株的制备
(1)免疫原维生素A-KLH的制备：选用VA类似物维甲酸作为半抗原，维甲酸含有活性基团羧基，可通过EDC/NHS法制备人工抗原维生素A-KLH。具体步骤如下：称取维甲酸(6.0mg，0.02mmol)和NHS(6.9mg，0.06mmol)溶解于800μL DMF中，室温反应15min后，加入EDC(11.5mg，0.06mmol)，室温反应30min。将反应液逐滴加入到连续搅拌的KLH溶液中(15mgKLH溶解于6mL 0.05M碳酸盐缓冲溶液中)，室温反应12h。最后，反应液用0.01M PBS溶液透析3天，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原维生素A-KLH。将所制备的人工抗原分装并且保存于-20℃冰箱中待用。
(2)包被原维生素A-OVA的制备：称取维甲酸(2.0mg，0.006mmol)和NHS(2.3mg，0.02mmol)溶解于800μL DMF中，室温反应15min后，加入EDC(3.83mg，0.02mmol)，室温反应30min。将反应液逐滴加入到连续搅拌的OVA溶液中(5mg OVA溶解于2mL 0.05M碳酸盐缓冲溶液中)，室温反应12h。最后，反应液用0.01M PBS溶液透析3天，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到包被原维生素A-OVA。将所制备的包被原分装并且保存于-20℃冰箱中待用。
(3)动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取三种不同摩尔比的维生素A完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂，即首次免疫(100μg/只)用弗氏完全佐剂与维生素A完全抗原的等体积混合乳化液作为注射剂，数次加强免疫用(50μg/只)弗氏不完全佐剂与维生素A完全抗原的等体积混合乳化液作为注射剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血(小鼠断尾采血5uL+995uL抗体稀释液＝抗血清)，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半(即25μg/只)且不含任何佐剂(即仅含维生素A完全抗原)。
(4)细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(5)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用维生素A为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对维生素A标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株LXA。
(6)单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的维生素A单克隆抗体置于-20℃保存。
使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的维生素A单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG2b型，经小鼠单抗亚型鉴定试剂盒检测得轻链类型为κ型，如图1所示。
实施例2维生素A单克隆抗体的IC50的测定
本发明实施例中所用试剂：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.0g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
洗涤液(PBST)：1000mL的0.01mol/LpH7.4的PBS溶液中加入0.5mL的Tween-20；
PBST：含0.05％Tween-20的PBS；
抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤缓冲液；
TMB显色液：A液：Na2HPO4.12H2O18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1∶5混合即为TMB显色液，现用现混。
维生素A单克隆抗体的IC50的测定方法如下：
(1)包被：将包被原维生素A-OVA用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。
(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min.
(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。
(4)加样：将抗血清(小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清)从1∶1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1∶3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min。
(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min.
(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
采用ic-ELISA检测对维生素A的灵敏度，如图2所示，根据标准方程y＝0.069+1.882/[1+(x/493.68)^1.097](R2＝0.999)，计算出IC50为493.68μg/L。
以上结果说明所制备的维生素A单克隆抗体具有较高的亲和力和灵敏度，可用于维生素A免疫分析检测和亲和柱的制备，即可用于维生素A免疫分析检测。
本发明公开了一种维生素A单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测领域。本发明合成了维生素A半抗原，制备了维生素A完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，首次免疫(100μg/只)用弗氏完全佐剂，多次加强免疫(50μg/只)用弗氏不完全佐剂，最后一次用维生素A完全抗原(25μg/只，不含佐剂)冲刺免疫。取高效价、低IC50小鼠脾细胞，通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对维生素A具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50为493.68ng/mL)。本发明成果可用于建立食品中维生素A含量的免疫检测方法，具有实际应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种分泌维生素A单克隆抗体杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称单克隆细胞株LXA，保藏编号为CGMCC No.22331，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.一种维生素A单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.22331的单克隆细胞株LXA分泌产生。
3.权利要求2所述维生素A单克隆抗体的应用，其特征在于，建立维生素A含量的免疫检测方法，应用于食品中维生素A的检测。
4.根据权利要求3所述维生素A单克隆抗体的应用，其特征在于，所述维生素A单克隆抗体用于制备食品安全检测中维生素A残留量的分析检测用的检测主体。
5.根据权利要求3或4任一所述维生素A单克隆抗体的应用，其特征在于，所述检测主体包括试剂、检测板、试剂盒。
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