CN115445462B - 一种新冠病毒s蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫调节剂技术领域，具体涉及一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，新冠病毒S蛋白抗原稀释后加入维生素A、维生素C，再混合弗氏佐剂，并以具有冷冻搅拌头的电动搅拌器搅拌乳化得到，避免了混匀过程高速旋转产热使新冠病毒S蛋白抗原失活，延长了新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物在免疫体体内的存留时间，得到了较高产量的高效价羊抗新冠病毒S蛋白抗体，且通过本发明方法制备的新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化完全，3000rcf/min离心25min，未见油水分层现象，具有优异的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于免疫调节剂技术领域，具体涉及一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法。
背景技术
新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的主要编码S蛋白是新型冠状病毒疫苗的主要靶蛋白，针对新冠病毒S蛋白的特异性抗体可以应用到目前各种新冠病毒检测卡及新冠病毒检测试剂盒中，实现快速、有效、准确地对新冠病毒进行检测。
在新冠病毒S蛋白的人工免疫诱导实验中，最常用的佐剂是弗氏佐剂，免疫注射抗原制备时，常将佐剂与抗原溶液按比例混合进行乳化，以增强抗原诱导机体发生的免疫反应，获得高效价抗体。因此，抗原溶剂、乳化程度的可控性、乳化器材质、环境温度等因素对抗原乳化效果有重大影响。
目前已有报道，去离子水和PBS缓冲液都可以作为抗原乳化的溶剂，且在乳化过程中不改变抗原的结构和免疫原性，以去离子水为溶剂抗原乳化，便于人工控制，但乳化时间相对较长，冰浴条件下的乳化操作较繁琐；以PBS缓冲液为溶剂进行乳化，乳化时间短（2~5min），但容易乳化过度，难以人工控制。
此外，除了抗原溶剂，对佐剂与抗原乳化的方法也有大量的研究报道；例如，传统乳化法主要有：①研磨法：先将佐剂放入玻璃研钵，滴入抗原溶液，边滴边研磨，使之成为油包水乳剂，该法适于制备大量的佐剂抗原，缺点抗原损失大，对微量或昂贵的新冠病毒S蛋白抗原不宜采用。②注射器混合法：将弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，交替推动针管，形成粘稠乳剂，该法容易做到无菌操作，抗原损失少，适用于制备少量的抗原乳剂。但耗时长，难以乳化完全，对于粘稠度大的新冠病毒S蛋白抗原，用塑料注射器推动困难，而用玻璃注射器又有渗漏，易发生胶管脱落或者劳累和烦躁发生崩漏事故，前功尽弃。③超声混合法：将抗原和佐剂于超声波粉碎器上，超声乳化3~4次即可完全乳化，该法的优点是简单、快速、节省材料，但是超声容易激发一些自由基，对抗原有未知损害。所以现行的乳化绝大多数使用电动高频的乳化器或大型乳化仪，但针对高分子量的蛋白类抗原，尤其是新冠病毒S蛋白，也不可避免的存在乳化过度的情况。
因此，对于如何从根本上解决乳化问题，寻求一种各方面优异的乳化方法来制备抗原佐剂乳化物，提高获得的抗体效价是本领域亟待解决的重点问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，新冠病毒S蛋白抗原稀释后加入维生素A、维生素C，再混合弗氏佐剂，并以具有冷冻搅拌头的电动搅拌器搅拌乳化得到新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物，避免混匀过程高速旋转产热使新冠病毒S蛋白抗原失活，延长了新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物在免疫体体内的存留时间，得到了较高产量的高效价羊抗新冠病毒S蛋白抗体。
具体的，本发明的技术方案如下：
一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，包括如下步骤：
（1）新冠病毒S蛋白抗原用PBS缓冲液稀释，按3~5mg/mL加入维生素C，按2~5mg/mL加入维生素A，冰浴，超声溶解，得到抗原稀释液；
（2）抗原稀释液混合等体积的弗氏佐剂，冰浴；
（3）使用电动搅拌器搅拌乳化1~10min，完成乳化，得到白色乳液。
所述电动搅拌器包括搅拌头，搅拌乳化时，将所述搅拌头-20~-10℃下冷冻10~20min后使用。
进一步的，（1）中，所述超声溶解的超声频率为25KHz，超声时间为10s。
进一步的，使用电动搅拌器搅拌乳化的搅拌速度为80~120r/min。
进一步的，（3）中，所述电动搅拌器包括搅拌头，所述搅拌头为中空管，一端可拆卸连接电动搅拌器的输出端，另一端为圆环状或L状，圆环状或L状显著扩大搅拌头的乳化面积，适用于不同的容器，圆环状搅拌头更适用于离心管，避免触碰管壁，L状搅拌头更适合于敞口较大的容器进行乳化。
进一步的，（3）中，搅拌乳化时，将所述搅拌头灭菌处理，-20~-10℃下冷冻10~15min后使用。
本发明所述的电动搅拌器为本领域任选的具有可满足本发明转速要求的输出电机的搅拌器。
本发明的有益效果在于：
1.本发明提供的乳化方法，先稀释新冠病毒S蛋白抗原后添加维生素A及维生素C，再混合弗氏佐剂，配合具有冷冻搅拌头的电动搅拌器，上述步骤实现了抗原佐剂乳化物的快速完全乳化，防止了过度乳化现象的发生；
2.维生素A及维生素C添加顺序的优势在于：先将维生素A混合于抗原稀释液中，超声溶解，维生素A在溶液中形成球形微粒，便于同弗氏佐剂乳化，维生素C先分散于稀释液有助于清除可能由于超声产生的超负氧离子（O2-）、羟自由基(OH-)、有机自由基（R-）和有机过氧基（ROO-）等自由基，避免了抗原的损失；
3.本发明的方法将乳液的稳定性提高到了新的水平，配合具有冷冻搅拌头的电动搅拌器，避免混匀过程高速旋转产热使新冠病毒S蛋白抗原失活。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
以下所述抗原稀释液即新冠病毒S蛋白抗原稀释液。
在本发明的一些实施例中，一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，步骤如下：
（1）新冠病毒S蛋白抗原用PBS缓冲液稀释，按3~5mg/mL加入维生素C、按2~5mg/mL加入维生素A，冰浴，25KHz超声10s溶解，得到抗原稀释液；
（2）抗原稀释液混合等体积的弗氏佐剂，冰浴；
（3）电动搅拌器的搅拌头高压蒸汽灭菌，-20~-10℃下冷冻10~20min后，80~120r/min搅拌乳化1~10min，完成乳化，得到白色乳液。
优选的，电动搅拌器的搅拌头为中空管，末端为圆环状或L状，中空结构保证了搅拌头维持低温，圆环状或L状显著扩大搅拌头的乳化面积，适用于不同的容器，圆环状搅拌头更适用于离心管，避免触碰管壁，L状搅拌头更适合于敞口较大的容器进行乳化。
对实施例制备得到的新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物进行乳化时间对比实验、稳定性实验，对抗原佐剂乳化物免疫得到的血清抗体进行效价实验；上述实验表明，本发明的乳化方法制备得到的新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物，具有乳化时间短、保存稳定、免疫产生的血清抗体效价高的技术效果。
实施例1
一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，步骤如下：
（1）将新冠病毒S蛋白抗原用PBS缓冲液稀释至25mg/mL，按3mg/mL加入维生素A，按2mg/mL加入维生素C，置于冰水冰浴，25KHz超声10s溶解，得到抗原稀释液；
（2）按体积比1:1将6mL抗原稀释液混合6mL弗氏完全佐剂于20mL规格的塑料离心管，冰水冰浴；
（3）将电动搅拌器的圆环状中空搅拌头高压蒸汽灭菌，圆环状搅拌头-10℃下冷冻10min，安装在搅拌器上，置圆环状中空搅拌头于混合物液面以下，打开开关，100r/min开始乳化，乳化过程中，稍微上下移动搅拌头位置，避免圆环状中空搅拌头接触容器内壁，搅拌至6min25s后，混合物变成白色泡沫状，完成乳化，得到新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物。
上述乳化步骤重复3个批次，未出现过度乳化现象，Elisa法检测后，抗原损失≤3%；
实施例2
本对比例与实施例1的不同在于，所使用的维生素A、维生素C浓度不同。
一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂的乳化方法，步骤如下：
（1）将新冠病毒S蛋白抗原用PBS缓冲液稀释至10mg/mL，按5mg/mL加入维生素A，按5mg/mL加入维生素A，置于冰水冰浴，25KHz超声10s溶解，得到抗原稀释液；
（2）按体积比1:1将5mL抗原稀释液混合5mL弗氏完全佐剂于20mL规格的塑料离心管，冰水冰浴；
（3）将电动搅拌器的圆环状中空搅拌头高压蒸汽灭菌，-20℃冷冻15min后，安装在搅拌器上，置圆环状中空搅拌头于混合物液面以下，打开开关，100r/min开始乳化，乳化过程中，稍微上下移动搅拌头位置，避免圆环状中空搅拌头接触容器内壁，搅拌至5min，混合物变成白色泡沫状，完成乳化，得到新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物。
上述乳化步骤重复3个批次，未出现过度乳化现象，Elisa法检测后，抗原损失≤3%；
对比例1
本对比例的新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物乳化方法及组分使用浓度同实施例1，区别在于，本对比例为实心搅拌头且使用前未冷冻。
乳化后，ELISA法检测，新冠病毒S蛋白抗原的损失率≥20%，这表明中空搅拌头预冷使用可以避免混匀过程高速旋转产热对蛋白质等物质的抗原性产生的不良影响。
对比例2
本对比例的新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物组分使用浓度同实施例1，区别在于乳化方法中，改变了维生素A和维生素C的加入顺序，具体如下：
（1）将新冠病毒S蛋白抗原用PBS缓冲液稀释至25mg/mL，置于冰水冰浴，25KHz超声10s溶解，得到抗原稀释液；
（2）按体积比1:1将6mL抗原稀释液混合6mL弗氏完全佐剂于20mL规格的塑料离心管，按6mg/mL加入维生素A，按4mg/mL加入维生素C，冰水冰浴；
（3）同实施例1相同，乳化时间为8min55s。
重复3个批次的乳化，结果表明，将维生素A及维生素C是在弗氏佐剂同抗原稀释液混合后加入，66.6%的新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物抗原损失≥15%，33.3%出现了过度乳化现象，这是由于PBS缓冲液中的磷酸根基团之间的静电斥力作用，增强了乳化液的稳定性，从而加速了完全乳化的过程。如果继续乳化（时间较短），PBS缓冲液中Na+、K+离子与磷酸根基团充分接触，压缩双电层，使其厚度变薄，乳状液的稳定遭到破坏，小液滴聚集，乳剂粘度增加，导致乳化过度。
乳化后，ELISA法检测，新冠病毒S蛋白抗原的损失率≥20%，这表明超声对抗原产生了影响，相比实施例1，证明了维生素C先分散于稀释液有助于清除可能由于超声产生的超负氧离子（O2-）、羟自由基(OH-)、有机自由基（R-）和有机过氧基（ROO-）等自由基，避免了抗原的损失。
对比例3
为了表明本发明使用的组分同本发明的乳化方法的协同作用，本对比例使用注射器双推法乳化，其他使用组分同实施例1，（研磨法、超声法乳化具有显而易见的缺陷，因此本发明不再一一实验）。
具体的，乳化方法如下：
采用注射器乳化，用两个10ml注射器，一个吸入新冠病毒S蛋白抗原稀释液，一个吸弗氏佐剂佐剂，两注射器头以胶管连接，来回推注多次，乳化时间约持续60min，推成“油包水”状，达到乳化标准要求，得到新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物，重复12个批次。
结果表明，制备周期长，且制备期间注射管崩漏2次。这说明以去离子水为溶剂进行新冠病毒S蛋白抗原和弗氏佐剂注射器双推法乳化，是一个缓慢而温和的过程，乳化时间相对较长，便于人工控制，但乳化操作较繁琐，制备的新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物各批次效果不稳定（见稳定性实验）。
以下进行实验表征，为方便对比，各实施例和对比例区别特征如下：
表1 各实施例和对比例区别特征
乳化时间对比实验
将实施例1、2和对比例2的4个重复批次的乳化时间进行对比，结果如下：
表2实施例1和对比例3乳化时间对比
| 1批次 | 2批次 | 3批次 | 4批次 | |
| 实施例1乳化时间 | 6min25s | 6min15s | 6min24s | 6min |
| 实施例2乳化时间 | 5min40s | 5min17s | 5min24s | 5min53s |
| 对比例2乳化时间 | 8min55s | 9min25s | 9min35s | 10min5s |
结果表明，添加维生素A及维生素C的顺序对乳化的效果的影响较大，抗原稀释液先混合弗氏完全佐剂再加入维生素A及维生素C的对比例2乳化时间明显较长，实施例1在稀释抗原加入维生素A及维生素C的乳化时间明显较短，这是由于脂溶性的维生素A在抗原稀释液中优先形成了亲油相的薄膜或分散液滴，加快了同弗氏佐剂的乳化，维生素C的多羟基结构螯合PBS缓冲液中的金属离子以防止其对乳液结构造成破坏。
上述实验进一步证明了本发明的乳化方法中各组分的加入顺序对乳化时间有关键性影响。
稳定性实验
以滴水实验、离心实验检测本发明实施例1、2和对比例1~3乳化方法制备的新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化效果。
1.滴水实验
准备500mL烧杯冰水混合物，取液器吸取1mL新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物，滴3滴于冰水表面，静置5min、10min后，观察有无扩散现象。
2.离心实验
将新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物以3000rcf/min的转速于冷冻离心机中离心10min或25min，离心结束后取出观察新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物有无油水分层现象。
评价标准：
滴水实验，用取液器吸取乳剂时，在枪头的外侧粘附着一层白色粘稠物。将新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物滴于冰水上5~10min内完全保持完整不分散，呈球形滴状浮于水面，则说明乳化完全，为合格的油包水乳剂；
离心实验，将新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物置于离心机中以3000rcf/min离心10min，未见油水分层现象，则说明乳化完全。
实验结果如下：
表3各实施例及对比例的滴水实验及离心实验结果
实验证明，对比例3使用注射器双推法乳化的乳化物在3000rcf/min离心25min出现分层现象，这表明其稳定性较差，对比例2在改变组分的加入顺序后，其乳液的稳定性严重下降，对比例1未冷冻搅拌头并不影响乳化效果。
实施例1、实施例2在3000rcf/min离心25min下，未出现分层现象，滴水实验10min内不分散，稳定性优于各实施例。
血清效价实验
对各实施例和对比例进行血清效价评价实验，步骤如下：
实验方法：山羊体内免疫注射各实施例和对比例的乳化物，最后针次免疫注射后，7天后颈动脉采血，离心取上清，得到羊抗新冠病毒S蛋白多抗血清，以酶联免疫吸附测定法血清效价测定。
实验结果如下：
表4实施例1在不同血清效价水平下羊的数量占比及蛋白浓度比较
| 血清效价 | 羊数量（只） | 羊占比（%） | 羊抗新冠病毒S蛋白多抗血清平均量（mL/只） | 羊抗新冠病毒S蛋白IgG平均蛋白浓度（mg/mL） |
| 1:16 | 0 | 0% | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
| 1:32 | 0 | 0% | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
| 1:64 | 2 | 20% | 103.65±3.05 | 22.34±1.66 |
| 1:128 | 3 | 30% | 96.33±2.65 | 25.14±1.23 |
| 1:512 | 5 | 50% | 80.46±2.18 | 23.78±1.46 |
| 1:1024 | 0 | 0% | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
表5实施例2在不同血清效价水平下羊的数量占比及蛋白浓度比较
| 血清效价 | 羊数量（只） | 羊占比（%） | 羊抗新冠病毒S蛋白多抗血清平均量（mL/只） | 羊抗新冠病毒S蛋白IgG平均蛋白浓度（mg/mL） |
| 1:16 | 0 | 0% | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
| 1:32 | 1 | 10% | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
| 1:64 | 2 | 20% | 89.63±3.69 | 20.16±1.36 |
| 1:128 | 4 | 40% | 98.15±2.98 | 21.36±2.03 |
| 1:512 | 3 | 30% | 86.34±3.38 | 17.69±1.48 |
| 1:1024 | 0 | 0% | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
表6对比例1在不同血清效价水平下羊的数量占比及蛋白浓度比较
| 血清效价 | 羊数量（只） | 羊占比（%） | 羊抗新冠病毒S蛋白多抗血清平均量（mL/只） | 羊抗新冠病毒S蛋白IgG平均蛋白浓度（mg/mL） |
| 1:16 | 2 | 20% | 95.20±1.63 | 92.24±1.57 |
| 1:32 | 3 | 30% | 87.52±2.14 | 85.51±2.04 |
| 1:64 | 2 | 20% | 85.83±2.77 | 22.21±1.32 |
| 1:128 | 3 | 30% | 88.15±2.86 | 27.36±2.11 |
| 1:512 | 0 | 0% | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
| 1:1024 | 0 | 0% | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
表7对比例2在不同血清效价水平下羊的数量占比及蛋白浓度比较
| 血清效价 | 羊数量（只） | 羊占比（%） | 羊抗新冠病毒S蛋白多抗血清平均量（mL/只） | 羊抗新冠病毒S蛋白IgG平均蛋白浓度（mg/mL） |
| 1:16 | 8 | 80% | 85.73±4.13 | 7.31±1.22 |
| 1:32 | 2 | 20% | 90.36±3.95 | 7.65±1.11 |
| 1:64 | 0 | 0% | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
| 1:128 | 0 | 0% | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
| 1:512 | 0 | 0% | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
| 1:1024 | 0 | 0% | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
血清效价评定结果：
实施例1及实施例2结果显示羊抗新冠病毒S蛋白多抗血清效价范围为：1:64~1:512（表4、表5），相比对比例1和2，在免疫相同次数的条件下，实施例1及实施例2获得的抗体效价更高。
对比例1结果显示羊抗新冠病毒S蛋白多抗血清效价范围为1:16~1:128（表3），这是由于搅拌头未冷冻导致的抗原损失，使新冠病毒S蛋白佐剂乳化物的免疫刺激性降低，进一步证明了本发明配合冷冻搅拌头具有优异效果。
对比例2（血清效价1:16~1:32）结果表明维生素A和C的加入顺序不仅影响乳化物的稳定性，也使得免疫产生的血清抗体效价较低，进一步说明了乳化物的稳定性是血清抗体效价高低的关键因素，本发明的乳化方法各步骤相互协同。
Claims (5)
1.一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）新冠病毒S蛋白抗原用PBS缓冲液稀释，按3~5mg/mL加入维生素C，按2~5mg/mL加入维生素A，冰浴，超声溶解，得到抗原稀释液；
（2）抗原稀释液混合等体积的弗氏佐剂，冰浴；
（3）使用电动搅拌器搅拌乳化1~10min，完成乳化，得到白色乳液；
所述电动搅拌器包括搅拌头，搅拌乳化时，将所述搅拌头-20~-10℃下冷冻10~20min后使用。
2.如权利要求1所述的一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，其特征在于，（1）中，所述超声溶解的超声频率为25KHz，超声时间为10s。
3.如权利要求1所述的一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，其特征在于，（3）中，使用电动搅拌器搅拌乳化的搅拌速度为80~120r/min。
4.如权利要求1所述的一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，其特征在于，（3）中，所述电动搅拌器包括搅拌头，所述搅拌头为中空管。
5.如权利要求1所述的一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，其特征在于，搅拌乳化时，将所述搅拌头灭菌处理，-20~-10℃下冷冻10~15min后使用。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6213A (ja) * | 1985-03-09 | 1987-01-06 | Mihama Hisaharu | 血栓症予防及び治療用組成物 |
| FR2778858A1 (fr) * | 1998-05-20 | 1999-11-26 | Oreal | Emulsion e/h/e stable et son utilisation comme composition cosmetique et/ou dermatologique |
| RU2214278C1 (ru) * | 2002-05-27 | 2003-10-20 | Закрытое Акционерное Общество "Нита-Фарм" | Адьювант для биопрепаратов |
| JP2004236589A (ja) * | 2003-02-06 | 2004-08-26 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | ペプチドミルク |
| CN104849460A (zh) * | 2015-05-29 | 2015-08-19 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定的丙型肝炎病毒核心抗原酶结合物稀释液 |
| CN110665379A (zh) * | 2019-10-08 | 2020-01-10 | 浙江农林大学 | 一种针对疫苗抗原的油包水型乳化方法 |
| CN112300275A (zh) * | 2020-02-19 | 2021-02-02 | 南京蛋球球生物医学技术合伙企业(有限合伙) | 用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体及其制备方法与应用 |
| CN112625124A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-04-09 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒蛋白的快速免疫方法及其应用 |
| CN114058594A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-02-18 | 江南大学 | 一种分泌维生素a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
2022
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Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6213A (ja) * | 1985-03-09 | 1987-01-06 | Mihama Hisaharu | 血栓症予防及び治療用組成物 |
| FR2778858A1 (fr) * | 1998-05-20 | 1999-11-26 | Oreal | Emulsion e/h/e stable et son utilisation comme composition cosmetique et/ou dermatologique |
| RU2214278C1 (ru) * | 2002-05-27 | 2003-10-20 | Закрытое Акционерное Общество "Нита-Фарм" | Адьювант для биопрепаратов |
| JP2004236589A (ja) * | 2003-02-06 | 2004-08-26 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | ペプチドミルク |
| CN104849460A (zh) * | 2015-05-29 | 2015-08-19 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定的丙型肝炎病毒核心抗原酶结合物稀释液 |
| CN110665379A (zh) * | 2019-10-08 | 2020-01-10 | 浙江农林大学 | 一种针对疫苗抗原的油包水型乳化方法 |
| CN112300275A (zh) * | 2020-02-19 | 2021-02-02 | 南京蛋球球生物医学技术合伙企业(有限合伙) | 用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体及其制备方法与应用 |
| CN112625124A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-04-09 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒蛋白的快速免疫方法及其应用 |
| CN114058594A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-02-18 | 江南大学 | 一种分泌维生素a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 家禽免疫技术;陈燕君;曹伟胜;何叶峰;;养禽与禽病防治(11);第27-32页 * |
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