CN114028557B - 一种水包油型兽用疫苗佐剂、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种水包油型兽用疫苗佐剂、制备方法及其应用，涉及药物制剂领域。该水包油型兽用疫苗佐剂，按照质量份包括以下成分组成：植物精油30‑50份，辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯5‑30份，丙二醇二癸酸酯5‑30份。本发明水包油型兽用疫苗佐剂，稳定、价廉、粘度低，副反应小，高效。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种水包油型兽用疫苗佐剂、制备方法及其应用。
背景技术
佐剂是一种与抗原同时使用，能够增强机体的非特异性免疫能力及抗原免疫原性，而自身不具备抗原特性的物质。兽用疫苗主要使用油佐剂疫苗，油佐剂疫苗是使用矿物油和表面活性剂作为免疫增强剂的疫苗，该类佐剂能使抗原在机体注射部位持续释放，为抗原在淋巴系统中转运提供载体，增加单核细胞的形成和聚集，提高免疫效力。疫苗佐剂可以分为三种剂型：油包水(W/O)型、水包油包水(W/O/W)型及水包油(O/W)型。
国产兽用灭活疫苗长期采用矿物油为主的油包水剂型。在成品疫苗中矿物油含量为50～75％。国产白油纯度较低，现趋向使用进口白油。油包水矿物油剂型存在如下缺陷，成品疫苗粘度大，副反应重；成本偏高，随着石油价格的不断提高，矿物油成本已占成品疫苗的50％以上；大量使用不能代谢的矿物油，对畜产品安全造成不良影响。从国外行业发展态势来看，新剂型研发应用得到普遍重视。采用疫苗新剂型，特别是各种抗原控释系统，不仅可以明显提高疫苗免疫效力，而且更安全，使用更方便。特别是水包油、双相微乳剂型大幅度降低矿物油用量，疫苗粘度小、免疫副反应轻已成为国际高品质疫苗的主流。
随着研究深入，许多安全高效的免疫增强新材料被不断开发用于疫苗佐剂。现在许多水佐剂能明显刺激动物机体细胞免疫应答，又有效激活体液免疫应答。在对食品安全更加注重的今天，水佐剂在兽用疫苗中使用将越来越多。随着生活水平的提高，对食品安全也越来越重视。兽用疫苗正由原来的W/O剂(高毒性)型疫苗向O/W型(低毒性或无毒性)转变。因此，研制稳定、价廉、粘度小，副反应小，高效的O/W型佐剂工艺具有重要的现实意义和市场价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种水包油型兽用疫苗佐剂，该佐剂稳定、价廉、粘度低，副反应小，高效。
本发明的另一目的是提供水包油型兽用疫苗佐剂的制备方法，该方法简单、成本低。
本发明的再一目的是提供水包油型兽用疫苗佐剂的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种水包油型兽用疫苗佐剂，按照质量份包括以下成分组成：
植物精油30-50份，
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯5-30份，
丙二醇二癸酸酯5-30份。
在本发明中，所述植物精油为肉桂精油、大蒜精油或生姜精油。
在本发明中，所述水包油型兽用疫苗佐剂还包括5-10份的维生素E。
在本发明中，所述水包油型兽用疫苗佐剂还包括1-5份的角鲨烯。
本发明还提供含有所述佐剂的疫苗。
在本发明中，所述疫苗是将抗原水溶液和所述佐剂按照质量比为4-6：1混合。
在本发明中，所述抗原水溶液为猪圆环病毒水溶液。
与现有技术比较，本发明有以下有益效果：本发明水包油型兽用疫苗佐剂含有植物精油、表面活性剂(辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、丙二醇二癸酸酯)，只需要通过手摇或轻微的搅拌(比如磁力搅拌或机器搅拌)，就能形成均一体系，制备过程无需精密的仪器，操作方便，制备成本低。本发明水包油型兽用疫苗佐剂与灭活抗原可以制成稳定的O/W型疫苗，粘度小，注射方便又具有良好的免疫原性。本发明水包油型兽用疫苗佐剂中的植物精油和表面活性剂，易被动物吸收，对动物无毒副作用。
具体实施方式
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯，购自广州市天润药业有限公司，Labrasol，CAS No:85536-07-8。
丙二醇二癸酸酯，购自广州市天润药业有限公司,Propylene glycol picaprate,CAS No.：56519-72-3。
肉桂精油，购自厂家泰州淳道香料有限公司，大蒜精油，购自厂家泰州淳道香料有限公司，生姜精油购自购买厂家泰州淳道香料有限公司。
实施例1制备水包油型佐剂
(1)水包油型佐剂1的制备
水包油型佐剂1的配方：
肉桂精油 20g，
维生素E 10g，
角鲨烯 10g,
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 30g，
丙二醇二癸酸酯 30g。
按配方称取各物质，混合，用手摇匀或玻璃棒轻轻搅拌均匀，于115℃高压灭菌20分钟后，即得水包油型佐剂1，室温避光保存。
(2)水包油型佐剂2的制备
水包油型佐剂2的配方：
肉桂精油 40g，
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 30g，
丙二醇二癸酸酯 30g。
按配方称取各物质，混合，用手摇匀或玻璃棒轻轻搅拌均匀，于115℃高压灭菌20分钟后，即得水包油型佐剂2，室温避光保存。
(3)水包油型佐剂3的制备
水包油型佐剂3的配方：
肉桂精油 30g，
维生素E 10g，
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 30g，
丙二醇二癸酸酯 30g。
按配方称取各物质，混合，用手摇匀或玻璃棒轻轻搅拌均匀，于115℃高压灭菌20分钟后，即得水包油型佐剂3，室温避光保存。
(4)水包油型佐剂4的制备
水包油型佐剂4的配方：
肉桂精油 30g，
角鲨烯 10g，
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 30g，
丙二醇二癸酸酯 30g。
按配方称取各物质，混合，用手摇匀或玻璃棒轻轻搅拌均匀，于115℃高压灭菌20分钟后，即得水包油型佐剂4，室温避光保存。
(5)水包油型佐剂5的制备
水包油型佐剂5的配方：
肉桂精油 40g，
吐温-80 30g，
丙二醇二癸酸酯 30g。
按配方称取各物质，混合，用手摇匀或玻璃棒轻轻搅拌，于115℃高压灭菌20分钟后，即得水包油型佐剂5，室温避光保存。
(6)水包油型佐剂6的制备
水包油型佐剂6的配方：
肉桂精油 40g，
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 30g，
司本-80 30g。
按配方称取各物质，混合，用手摇匀或玻璃棒轻轻搅拌，于115℃高压灭菌20分钟后，即得水包油型佐剂6，室温避光保存。
(7)水包油型佐剂MF59的制备
水包油型佐剂MF59的配方：
司本-85 10g，
吐温-80 15g，
角鲨烯 15g，
柠檬酸缓冲液 60g。
按配方称取各物质，在8000rpm/min转速下搅拌10分钟制成乳液，再采用高压均质机乳化后，经0.22um滤器过滤除菌，即得水包油型佐剂6，2～8℃避光保存。在制备过程中发现，若仅在8000rpm/min转速下搅拌10分钟，不采用高压均质机乳化，会分层，不能形成均一体系。
水包油型佐剂1～6制备方法简单，不需特殊仪器，成品为透明液体；佐剂MF59制备需要高速剪切和高压均质机，生产设备要求比较高，大规模制备不方便，成本高，成品为乳白色乳剂。
实施例2猪圆环病毒2型(O/W型)水佐剂疫苗制备
分别采用水包油型佐剂1-4，以灭活的猪圆环病毒2型(PCV2)LG株为抗原，制备猪圆环病毒2型(O/W型)水佐剂灭活疫苗。灭活前，每毫升猪圆环病毒2型(LG株)病毒液中病毒含量为106.50TCID50。
将水包油型佐剂1与灭活的猪圆环病毒2型(LG株)病毒液按质量比为1:5混合，用手摇匀后，即可形成均一的水包油型疫苗，命名为疫苗A。
将水包油型佐剂2与灭活的猪圆环病毒2型(LG株)病毒液按质量比为1:5混合，用手摇匀后，即可形成均一的水包油型疫苗，命名为疫苗B。
将水包油型佐剂3与灭活的猪圆环病毒2型(LG株)病毒液按质量比为1:5混合，用手摇匀后，即可形成均一的水包油型疫苗，命名为疫苗C。
将水包油型佐剂4与灭活的猪圆环病毒2型(LG株)病毒液按质量比为1:5混合，用手摇匀后，即可形成均一的水包油型疫苗，命名为疫苗D。
将水包油型佐剂5与灭活的猪圆环病毒2型(LG株)病毒液按质量比为1:5混合，手摇后，出现分层，无法形成均一疫苗。
将水包油型佐剂6与灭活的猪圆环病毒2型(LG株)病毒液按质量比为1:5混合，手摇后，出现分层，无法形成均一疫苗。
上述疫苗A、疫苗B、疫苗C和疫苗D的物理性状均一致，具体如下：
疫苗A、疫苗B、疫苗C和疫苗D，均呈淡粉色半透明液体。
剂型检验：取1个250mL烧杯，盛放100mL冷水，取清洁吸管，吸取少许疫苗滴于冷水表面，液滴迅速与水混合，判定疫苗A、疫苗B、疫苗C和疫苗D均为水包油剂型。
黏度：按Brookfield粘度计测定产品粘度，疫苗A、疫苗B、疫苗C和疫苗D的粘度在0～30CP以内(25℃)。
粒径：用移液枪精确取乳液10μL于测试杯中，加入290μL PBS充分混匀，确保乳化颗粒良好分散，将测试杯放入马尔文纳米粒度仪中测定，测定温度设定为25℃。疫苗A、疫苗B、疫苗C和疫苗D的平均粒径在200nm左右。
离心稳定性：取乳液10mL加入离心管中，以3000rpm/min离心15min，管底无水相析出。疫苗A、疫苗B、疫苗C和疫苗D均稳定。
37℃稳定性：将疫苗A、疫苗B、疫苗C和疫苗D分别置于37℃培养箱中，每天定时观察，28天不破乳分层；在4℃冰箱中放置24个月稳定。
实施例3猪圆环病毒2型(O/W型)水佐剂疫苗的安全检验
检验实施例2中疫苗A、疫苗B、疫苗C和疫苗D的安全性。
(1)小鼠安全试验
将清洁级小鼠分为5个小组，每组10只。采用疫苗A、B、C、D分别免疫一组小鼠，每只小鼠颈部皮下注射0.5ml对应的疫苗，还有一组小鼠不接种疫苗，作对照组。
分别在接种后1天、3天、5天，每组随机选取3只小鼠进行解剖，观察注射部位吸收情况，结果见表1。通过表1可以看出：接种小鼠注射部位解剖，疫苗A、B、C、D组注射后3天开始均3/3完全吸收。疫苗B接种1天后有1/3完全吸收，3天3/3完全吸收；疫苗C接种1天后有2/3完全吸收，3天3/3完全吸收；疫苗A、D注射后1天开始均3/3完全吸收。疫苗A、B、C、D组注射后均无炎症。
表1灭活疫苗安全检验结果
(2)猪安全试验
将猪圆环2型病毒抗体阴性的14日龄健康仔猪分为5组，每组4头。采用疫苗A、B、C、D分别免疫一组仔猪，每头肌肉注射4头份(4ml)对应的疫苗，还有一组不接种疫苗，作对照组。
接种后观察14天，所有试验猪观察指标包括采食、局部反应、过敏反应和体温等情况，结果见表2。通过表2可以看出：所有试验猪采食、消瘦等均未见异常；仔猪疫苗接种部位未见异常反应，也无过敏反应；接种后检测7天平均体温，温差不超过0.5℃。
表2仔猪超剂量接种疫苗安全性试验结果
实施例2中制备的猪圆环病毒2型(O/W型)水佐剂疫苗分别在小鼠和猪上进行了安全试验，结果均符合兽用疫苗安全性标准，证明水包油型佐剂1-4对小鼠和猪是安全的。
实施例4猪圆环病毒2型(O/W型)水佐剂疫苗的免疫效力试验
1、猪免疫效力试验
将健康21日龄PCV2的ELISA抗体阴性猪20头分为4组，每组5头。其中3组猪均接种实施例2中制备的疫苗A，分别为0.5ml/头免疫剂量组(低剂量组)、1ml/头免疫剂量组(中剂量组)、2ml/头免疫剂量组(高剂量组)；另外一组为对照组，不免疫。免疫后21天采血分离血清，用猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒(购自武汉科前生物股份有限责任公司)检测ELISA抗体值。
猪免疫效力试验结果(表3)：低剂量组采用0.5ml疫苗A免疫仔猪，ELISA抗体检测阳性率达到80％，达到疫苗合格标准；中剂量组和高剂量组免疫后抗体效价更高，抗体阳性率分别为100％和90％。
表3不同剂量猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫猪的ELISA抗体阳性率
| 分组 | 低剂量组(0.5ml/头) | 中剂量组(1ml/头) | 高剂量组(2ml/头) | 空白对照 |
| 阳性率 | 80％ | 100％ | 90％ | 阴性 |
2、小鼠免疫效力比较试验
实验用疫苗：(1)实施例2中制备的疫苗A；(2)实施例2中制备的疫苗B；(3)15A佐剂疫苗：ISA 15A VG佐剂(O/W型，购自SEPPIC公司)与灭活的猪圆环病毒2型(LG株)病毒液按照质量比1：5混合，在500rpm条件下搅拌10分钟乳化，制成的疫苗；灭活前，每毫升猪圆环病毒2型(LG株)病毒液中病毒含量为106.50TCID50。(4)206佐剂疫苗：ISA206 VG佐剂(W/O/W型佐剂，购自SEPPIC公司)与灭活的猪圆环病毒2型(LG株)病毒液按照质量比1：1混合，抗原与佐剂预热至30℃左右，采用300rpm搅拌5分钟乳化，制成的疫苗；灭活前，每毫升猪圆环病毒2型(LG株)病毒液中病毒含量为106.50TCID50。
取20g左右清洁级小鼠分为疫苗A组、疫苗B组、15A佐剂疫苗组、206佐剂疫苗组和空白对照组，每组有5只。疫苗A组、疫苗B组、15A佐剂疫苗组小鼠，分别颈部皮下注射对应的疫苗，接种剂量为0.2ml/只；206佐剂疫苗组小鼠，颈部皮下注射对应的疫苗，接种剂量为0.3ml/只。各组小鼠接种的抗原含量一致。免疫后14天，各组按首免的相同途径和剂量进行第2次免疫。空白对照组不免疫。首免后35天采血，分离血清，用圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒检测血清的抗体效价。
小鼠免疫效力试验结果见表4，首免后35天，小鼠抗体效价从高到低依次为疫苗A组、206佐剂疫苗组、疫苗B疫苗组和15A佐剂疫苗组，表明疫苗B免疫效果优于15A佐剂疫苗；疫苗A免疫效果优于ISA206佐剂和ISA 15A佐剂。
表4各组小鼠首免后35天ELISA抗体效价
| 小鼠编号 | 疫苗A组 | 疫苗B组 | 15A佐剂疫苗组 | 206佐剂疫苗组 | 空白组 |
| 1 | 1:1600 | 1：800 | 1：400 | 1：800 | ≤1：50 |
| 2 | 1:1600 | 1：800 | 1：800 | 1：800 | ≤1：50 |
| 3 | 1:1600 | 1：800 | 1：800 | 1：800 | ≤1：50 |
| 4 | 1:800 | 1：1600 | 1：1600 | 1：1600 | ≤1：50 |
| 5 | 1:1600 | 1：800 | 1：800 | 1：1600 | ≤1：50 |
| 平均值 | 1:1440 | 1：960 | 1：880 | 1：1120 | ≤1：50 |
实施例2制备的疫苗A和B分别在小鼠和猪上进行了效力试验，疫苗B免疫效果优于15A佐剂疫苗；疫苗A甚至优于ISA206佐剂和ISA 15A佐剂。但是疫苗A和B在制备过程中不需要采用乳化装置进行乳化，只需要手摇匀即可形成均一体系，因此显著降低了生产成本。由于ISA206佐剂和ISA 15A佐剂均为矿物油，本发明水包油型佐剂1～4油相为植物来源的精油，因此本发明水包油型佐剂1～4安全性更高。
Claims (4)
1.一种水包油型兽用疫苗佐剂，按照质量份由以下成分组成：
肉桂精油 20份，
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯30份，
丙二醇二癸酸酯30份;
维生素E10份,
角鲨烯10份。
2.含有权利要求1所述佐剂的疫苗。
3.根据权利要求2所述疫苗，其特征在于是将抗原水溶液和所述佐剂按照质量比为4-6：1混合。
4.根据权利要求3所述疫苗，其特征在于所述抗原水溶液为猪圆环病毒水溶液。
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