CN114177284A - 一种兽用疫苗的自乳化型佐剂、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种兽用疫苗的自乳化型佐剂、制备方法及应用，兽用疫苗佐剂领域。该兽用疫苗的自乳化型佐剂，按照质量份由下列物质组成:矿物油5‑25份，角鲨烯3‑10份，中链甘油三酸酯2‑10份，卵磷脂10‑25份，Tween802‑20份，聚乙二醇单油酸酯10‑30份，聚氧乙烯吡咯烷酮5‑15份，二甘醇单乙醚15‑35份。本发明的兽用疫苗的自乳化型佐剂，与水相抗原混合时，采用玻璃棒轻轻搅拌或者用手摇匀，就可自发形成O/W型纳米乳液，且疫苗黏度低，稳定性好，易于注射，副反应小，免疫效果好。

Description

一种兽用疫苗的自乳化型佐剂、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及兽用疫苗佐剂领域，具体涉及一种兽用疫苗的自乳化型佐剂、制备方法及应用。
背景技术
疫苗佐剂能非特异性地提高疫苗抗原的免疫应答类型或免疫反应强度，延长免疫保护期，提高疫苗对异源毒株的交叉保护能力。含油类佐剂在国内外动物疫苗产品中最为常用。其中，水包油(O/W)型疫苗中油和表面活性剂的用量较少，粘度极低，易于注射。但是，现有技术中，O/W型疫苗的制备需要能提供高剪切力或高机械能的乳化设备，存在较高的技术壁垒，操作复杂，耗时长，成本较高。例如，诺华、葛兰素史克等公司开发的O/W型乳剂MF59、AS03等，将角鲨烯、吐温80、司盘85、维生素E等以适当比例配制，通过高压微射流方法进行均质，形成均一的乳液。发明专利201310021011.3提供了一种通过胶体磨挤出、微射流法或高压均质法制备的即用型水包油乳剂，能显著提高疫苗的安全性、稳定性和有效性。但上述制备水包油乳剂的过程仍然需要高价值设备的投入，制备过程中仍然需要提供较高的机械动力，对于动物疫苗来讲，生产成本仍较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种兽用疫苗的自乳化型佐剂，与水相抗原混合时，采用玻璃棒轻轻搅拌或者用手摇匀，就可自发形成O/W型纳米乳液，且疫苗黏度低，稳定性好，易于注射，副反应小，免疫效果好。
本发明的另一目的是提供一种兽用疫苗的自乳化型佐剂的制备方法，采用玻璃棒轻轻搅拌或者用手摇匀，就可自发形成O/W型纳米乳液，不需要乳化设备，操作简单，耗时短，成本较低。
本发明的再一目的是提供所述自乳化型佐剂在制备兽用疫苗中的应用，该疫苗黏度低，稳定性好，易于注射，副反应小，免疫效果好。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种兽用疫苗的自乳化型佐剂，按照质量份由下列物质组成:
Figure BDA0003414499250000011
Figure BDA0003414499250000021
本发明还提供所述兽用疫苗的自乳化型佐剂的制备方法，包括如下步骤：将各组分混匀，得所述兽用疫苗的自乳化型佐剂。
本发明还提供含有所述自乳化型佐剂的水包油型疫苗。
在本发明中，所述水包油型疫苗包括自乳化型佐剂和灭活抗原水溶液。
在本发明中，所述自乳化型佐剂和灭活抗原水溶液的体积比为10～25:75～90。
在本发明中，所述灭活抗原水溶液为猪口蹄疫灭活病毒液。
有益效果：本发明自乳化型佐剂，与水相抗原混合时，采用玻璃棒轻轻搅拌或者用手摇匀，就可自发形成O/W型纳米乳液，且疫苗黏度低，稳定性好，易于注射，副反应小，免疫效果好。本发明自乳化型佐剂的制备方法，简单，采用玻璃棒轻轻搅拌或者用手摇匀，就可自发形成O/W型纳米乳液，不需要高价值的乳化设备，操作简单，耗时短，生产成本低。本发明自乳化型佐剂，与水相抗原混合时，抗原与佐剂的体积比为10～25:75～90，提升了抗原在疫苗中的比例(75％以上)，为多价多联疫苗的制备提供了更大的抗原空间，可以通过降低抗原的浓缩倍数实现生产成本的下降。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
中链甘油三酸酯(medium chain triglycerides，MCT)，产品编号S25953，购自上海源叶生物科技有限公司。
卵磷脂(注射用)，购自南京威尔药业集团股份有限公司。
聚乙二醇单油酸酯，CAS号9004-96-0，购自南京威尔药业集团股份有限公司。
聚氧乙烯吡咯烷酮，是Polyvinylpyrrolidone K-30，CAS号9003-39-8，购自Sigma-Aldrich，货号81420。
二甘醇单乙醚，产品编号D806762，购自上海麦克林生化科技有限公司。
实施例1
(1)自乳化型佐剂1
自乳化型佐剂1，按照质量份由如下组份组成：
Figure BDA0003414499250000031
(2)自乳化型佐剂2
自乳化型佐剂2，按照质量份由如下组份组成：
Figure BDA0003414499250000032
(3)自乳化型佐剂3
自乳化型佐剂3，按照质量份由如下组份组成：
Figure BDA0003414499250000033
Figure BDA0003414499250000041
各自乳化型佐剂的配制方法如下：按配方量分别称取上述各成分，用玻璃棒轻轻搅拌或者用手摇匀，进行高压灭菌处理，常温保存备用。
实施例2自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗的制备、性质评价及其应用
(1)猪口蹄疫灭活病毒液
猪口蹄疫灭活病毒液(含有灭活的口蹄疫O型O/MYA98/BY/2010株和A型Re-A/WH/09株病毒)由内蒙古金宇保灵生物药品有限公司提供，灭活前每0.2毫升病毒液中病毒含量O型、A型均不低于107.5TCID50。该灭活病毒液符合《兽用生物制品质量标准汇编》(2018)的相关要求。
(2)自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗的制备
在无菌条件下，将25mL实施例1制备的自乳化型佐剂1与50mL猪口蹄疫灭活病毒液、25mL PBS缓冲液(浓度为0.01M，pH 7.2)混合，用手摇匀，即可得到均一的体系，命名为自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗1。
在无菌条件下，将20mL实施例1制备的自乳化型佐剂2与50mL猪口蹄疫灭活病毒液、30mLPBS缓冲液(浓度为0.01M，pH 7.2)混合，用手摇匀，即可得到均一的体系，命名为自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗2。
在无菌条件下，将10mL实施例1制备的自乳化型佐剂3与50mL猪口蹄疫灭活病毒液、40mL PBS缓冲液(浓度为0.01M，pH 7.2)混合，用手摇匀，即可得到均一的体系，命名为自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗3。
对照疫苗A的制备：在无菌条件下，先将50mL猪口蹄疫灭活病毒液与25mL PBS缓冲液(浓度为0.01M，pH 7.2)混合均匀(抗原相)，在搅拌状态下向25mLISA25佐剂中加入上述混合均匀的抗原相，用磁力搅拌器以2500rpm的搅拌速度连续搅拌10min，得到对照疫苗A。
对照疫苗B的制备：按专利号为201310021011.3、名称为一种兽用疫苗的即用型佐剂、制备及其应用的发明专利中配方4：角鲨烷15g，白油15g，普鲁尼克121 0.2g，吐温808.8g，司本80 0.2g，司本85 8.8g，羟甲基纤维素2.0g，卡波姆971P 3.0g，水47.0g。按配方量分别称取各组分，冰水浴过夜后混合均匀，用胶体磨挤压法乳化，0.22μm滤膜过滤除菌后，得到即用型水包油佐剂，记作佐剂EAO。用佐剂EAO替代本发明自乳化型佐剂制备对照疫苗B，其中EAO佐剂与猪口蹄疫灭活病毒液的质量比为1:1。
(3)疫苗的物理性状检测
检测自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗1-3、对照疫苗A和对照疫苗B的物理性状，具体方法为：吸取1mL疫苗，让其逐滴滴落到盛在烧杯中的清洁冷水表面，观察其是否能迅速分散于水中。
将自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗1-3、对照疫苗A和对照疫苗B分别置于4℃和37℃保存，观察其外观变化，比较各疫苗的稳定性。
按现行《中华人民共和国兽药典》附录3102中旋转式粘度计测定法进行黏度测定。
具体结果见表1。
表1自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗1-3、对照疫苗A、对照疫苗B的物理性状比较
Figure BDA0003414499250000051
通过表1可以看出，采用本发明自乳化型佐剂制备的疫苗，4℃稳定性大于19个月，比对照疫苗A和对照疫苗B稳定。
根据《中国兽药典》要求，所有注射用疫苗的黏度应不超过200cP。采用本发明自乳化型佐剂制备的疫苗均满足要求，且通过表1可以看出，采用本发明自乳化型佐剂制备的疫苗，黏度显著低于对照疫苗A和对照疫苗B，便于临床注射使用。
使用Malvern Zetasizer Nano ZS粒径分析仪检测上述各灭活疫苗的粒径分布，结果如表2所示。采用本发明自乳化型佐剂1-3制备的疫苗，粒径分布均匀，且粒径显著低于对照疫苗A和对照疫苗B，有利于降低疫苗的黏度，提高稳定性，便于临床注射使用。
表2各疫苗的粒径、Zeta电位及分散系数比较
疫苗 粒径(nm) Zeta电位(mV) 分散系数
自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗1 45.27 -18.72 0.23
自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗2 39.05 -16.33 0.11
自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗3 46.32 -25.10 0.19
对照疫苗A 218.46 -8.76 0.46
对照疫苗B 104.83 -38.88 0.14
实施例2自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗的仔猪免疫效力评价及安全性评价
选取猪口蹄疫病毒抗原和抗体均为阴性的15-20kg仔猪60头，随机分为6组，每组10头。将各自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗、对照疫苗A、对照疫苗B分别免疫一组仔猪，免疫剂量为2.0ml/头，同时设置空白对照组不免疫。于免疫后4周采血，分离血清，采用口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒、口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒(中国农业科学院兰州兽医研究所提供)分别检测猪口蹄疫O型、A型抗体效价，统计免疫后4周不同稀释度抗体的阳性率。结果见表3、表4。
表3各疫苗的免疫效力比较(口蹄疫O型抗体)
Figure BDA0003414499250000061
表4各疫苗的免疫效力比较(口蹄疫A型抗体)
Figure BDA0003414499250000071
按照《兽用生物制品质量标准汇编(2010)》的要求，抗体阳性率≥80％为合格。抗体效价≥1:64，可对猪体提供99％以上的免疫保护。通过表3、表4可以看出，采用自乳化型佐剂1-3制备的疫苗免疫仔猪后四周，抗体效价≥1:64的比例均在80％以上，显著优于ISA25佐剂和EAO佐剂配制的疫苗。采用自乳化型佐剂1-3制备的疫苗均能显著提高口蹄疫O型和A型抗体滴度，从而为动物提供有效的免疫保护。
(5)自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗的仔猪安全性评价
上述免疫后的仔猪，逐日观察其生长状况、精神状态、注射位点的外观变化及异常行为等，除对照疫苗A免疫组2只猪注射部位有肿块，1-2天后消失外，其余各免疫组未见任何副反应。对本实施例中免疫后的仔猪，进行连续7天的体温检测，具体结果见表4。从表5可以看出，各自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗免疫后猪只体温均在39.0-40.0℃的正常范围之内，无发热症状，而对照疫苗A在免疫后第2-3天，猪只体温大于40.0度，随后恢复正常。同时，对猪只进行注射部位的肉眼观察，注射各自乳化型猪口蹄疫灭活疫苗的猪只未发现注射部位损伤、溃疡等异常现象；而免疫对照疫苗A的猪只，有2只在注射部位出现肿块，1-2天左右消失。上述结果说明，采用自乳化型佐剂1-3制备的疫苗，免疫仔猪后副反应很小，对仔猪安全。
表5每组仔猪免疫后7天的平均体温变化(℃)
Figure BDA0003414499250000072
Figure BDA0003414499250000081

Claims (6)

1.一种兽用疫苗的自乳化型佐剂，按照质量份由下列物质组成:
Figure FDA0003414499240000011
2.权利要求1所述兽用疫苗的自乳化型佐剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将各组分混匀，得所述兽用疫苗的自乳化型佐剂。
3.含有权利要求1所述自乳化型佐剂的水包油型疫苗。
4.根据权利要求3所述水包油型疫苗，其特征在于：所述水包油型疫苗包括自乳化型佐剂和灭活抗原水溶液。
5.根据权利要求4所述水包油型疫苗，其特征在于：所述自乳化型佐剂和灭活抗原水溶液的体积比为10～25:75～90。
6.根据权利要求5所述水包油型疫苗,其特征在于所述灭活抗原水溶液为猪口蹄疫灭活病毒液。
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