JP3812814B2 - 動物用多価オイルアジュバントワクチン - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、家畜、家禽または愛玩動物に好適に用いることのできる動物用多価ワクチンおよび動物を免疫する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動物用ワクチンには、大きく分けて、弱毒化した生ウイルスまたは生菌を用いた生ワクチンと、それらをホルマリン、紫外線あるいはその他の方法で不活化した不活化ワクチンがあり、それらは互いに個別に使用される場合が多く、両者を混合して同時に注射することは、いくつかの例外を除いてあまり行われていない。その大きな理由は、不活化ワクチンに含まれるホルマリン、石炭酸、水銀製剤などの不活化剤や保存剤または界面活性剤などが、生ウイルスや生菌などの活性に悪影響を及ぼすことが危惧されるためであり、特に親水性界面活性剤はウイルスや菌の生物活性に対し重大な悪影響を及ぼすとともに、ワクチンを注射される生体にとっても、親水性界面活性剤の可溶化作用によりワクチンの注射局所の細胞を壊死させ、接種反応を強めることが危惧される。
【０００３】
特に、コロナウイルス、アルテリウイルス、ヘルペスウイルスなどに代表される、いわゆるエンベロープウイルスにとって、これまでのＯ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントに含まれるポリオキシエチレン系やポリグリセリン系などの親水性界面活性剤は可溶化力が強く、ウイルスエンベロープを破壊することによりウイルスに致死的影響を及ぼすことが知られている。また、豚丹毒菌などの弱毒生ワクチン株の場合にも、乳剤中に親水性界面活性剤が高濃度に存在することにより菌体が溶解され、致死的影響を受ける。
【０００４】
従って、従来においては、このようなエンベロープウイルスや生菌を、親水性界面活性剤の配合が不可欠なＯ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型アジュバント製剤に配合することは不可能であった。例えば、特開昭５９−６２３４０にはポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを、また特開２００１−１３１０８７および特開平１１−２６９０９３には、非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルなどの可溶化力の強い親水性の低分子非イオン性界面活性剤をＷ／Ｏ／Ｗ型ワクチン製剤の外水相中に使用して剤型を整えることが記載されているが、このような処方ではＯ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型製剤中に上記した生ウイルスや生菌を配合することは到底不可能である。
【０００５】
ヒト用ワクチンとは異なり、畜産分野のワクチンにおいては、オイルアジュバントワクチンの占める比率は年毎に増える傾向にあり、従来多用されていた流動パラフィンと親油性乳化剤を用いたＷ／Ｏ型ワクチンアジュバントに代えて、最近では代謝性の高い各種の動植物性オイルを用いたＯ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型アジュバントが使用されるようになってきており、このような乳剤を調製するためには、これまではポリオキシエチレン系などの界面活性作用が強く比較的低分子の界面活性剤を使用するのが常であった。しかし、このような界面活性剤を含むＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤と上記の生ウイルスや生菌などの活性抗原を混合して使用することは、これらの活性抗原の生物活性に重大な影響を及ぼすため不可能であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、Ｏ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型の不活化ワクチンを調製する際に、ポリオキシエチレン系などの親水性界面活性剤、例えばポリソルベート８０などを使用せずに、物理的に安定なＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンを調製することで、不活化抗原および活性抗原を同一製剤中に含有する動物用多価オイルアジュバントワクチンを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記のような従来のワクチンの欠点を除き、活性抗原である生ウイルス、生菌の凍結乾燥品を溶解しても、これら生ウイルスや生菌の活性に影響を及ぼさず、不活化抗原および活性抗原を同一製剤中に含有するＯ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型のオイルアジュバントワクチンを完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、生物学的に不活性な抗原と生物学的に活性な抗原とを含有し、親水性界面活性剤を含まず高分子乳化剤を用いて調製されてなるＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型の動物用多価オイルアジュバントワクチンである。なお、ここでいう「親水性界面活性剤」とは、特に規定されるものではないが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Tween系）やポリオキシエチレンヒマシ油などのポリオキシエチレン系界面活性剤、モノラウリン酸ヘキサグリセリルやモノオレイン酸デカグリセリルなどのポリグリセリン系、ソルビタン脂肪酸エステルやショ糖脂肪酸エステルなどの単糖・オリゴ糖エステル系などの界面活性剤のうちＨＬＢ値（Hydrophil Lypophil Balance）8.0以上の親水性界面活性剤をいう。
【０００９】
前記Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンは、不活性な抗原が高分子乳化剤を用いて乳化して調製されたＯ／Ｗ型乳剤の水相中に含有され、このＯ／Ｗ型乳剤を溶解溶液として、別に凍結乾燥された生ウイルスまたは生菌を溶解することにより得られ、さらには、高分子乳化剤を用いて乳化して調製されたＯ／Ｗ型乳剤の水相中に不活性な抗原を含有させたＯ／Ｗ型不活化ワクチンに、生ウイルスまたは生菌を凍結乾燥した生ワクチンを添加して溶解することにより得られる。
【００１０】
また、前記Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの場合は、生物学的に不活性な抗原を流動パラフィン等の油相中に親油性界面活性剤を用いて分散乳化（一次乳化）して調製されたＷ／Ｏ乳剤を、生物学的に不活性な抗原を含む、あるいは含まない水相中に高分子乳化剤を用いて再度分散乳化（２次乳化）することによりＷ／Ｏ／Ｗ型ワクチンが調製される。次に、このＷ／Ｏ／Ｗ型ワクチンを溶解溶液として、別に凍結乾燥された生ウイルスまたは生菌を溶解することによって不活化・生混合多価オイルアジュバントワクチンが得られる。
【００１１】
なお、本発明で、多価とは同一製剤中に複数種の抗原が含有されていることを示し、２価とは２種類の抗原が、３価は３種類の抗原が含有されていることを意味する。また、乳化剤の分子量とは重量平均分子量を意味する。
【００１２】
前記Ｏ／Ｗ型乳剤の調製過程またはＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤の２次乳化過程で使用される高分子乳化剤としては、多糖のエステルまたはアミドを使用することができ、例えばセルロース脂肪酸エステル、マンナンコレステロールエステル、プルランコレステロールエステルなどの多糖エステルが挙げられる。また、前記高分子乳化剤として、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体なども好適に使用できる。
【００１３】
前記生物学的に活性なウイルス抗原としては、エンベロープを有するウイルスが挙げられる。前記エンベロープを有する代表的なウイルスとしては、コロナウイルス科に属するウイルス、アルテリウイルス科に属するウイルス、ヘルペスウイルス科に属するウイルス、ブニヤウイルス科に属するウイルスなどが挙げられ、コロナウイルス科に属するウイルスとしては、豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、アルテリウイルス科に属するウイルスとしては、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）が挙げられる。また、生物学的に活性な細菌抗原としては、弱毒豚丹毒菌やサルモネラ菌あるいはマイコプラズマの生菌などを用いることができる。
【００１４】
また、生物学的に不活性な細菌抗原としては、特に限定されるものではないが、毒素原性大腸菌、ボルデッテラ・ブロンキセプチカ、パスツレラ・マルトシダ、サルモネラ属菌、マイコプラズマ属、レプトスピラ属、アクチノバチルス属、ヘモフィルス属、マンハイミア属の細菌、あるいはこれらの細菌に由来する抗原およびこれらの遺伝子情報に基づいて作出された抗原及びペプチド合成などの手法によって作出された抗原などが挙げられる。
【００１５】
本発明による動物を免疫する方法は、高分子乳化剤を用いて乳化して調製されたＯ／Ｗ型乳剤の水相中に不活性な抗原が含有されたＯ／Ｗ型不活化ワクチンを、生ウイルスまたは生菌を凍結乾燥した生ワクチンのバイアル中に添加して溶解し、これを動物に接種することにより動物を免疫する方法、または、高分子乳化剤を用いて２次乳化して調製されたＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤の内水相中および／または外水相中に不活性な抗原が含有されたＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンを、生ウイルスまたは生菌を凍結乾燥した生ワクチンのバイアル中に添加して溶解し、これを動物に接種することにより動物を免疫する方法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の詳細を説明する。
本発明における生物学的に活性な抗原とは、弱毒化した生ウイルスまたは生菌のこと（以下、活性抗原という。）であり、また生物学的に不活性な抗原とは、それらを紫外線またはその他の方法で不活化したもの（以下、不活化抗原という。）である。
【００１７】
本発明は、例えば、活性抗原である生ウイルスまたは生菌をバイアル瓶に分注して凍結乾燥した生ワクチンと、Ｏ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型の乳化型を有する不活化ワクチンを組み合わせることにより、対象動物に数種の抗原を一度に接種することができる多価オイルアジュバントワクチンを提供するものであり、従来のＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型ワクチンの欠点である活性抗原（活性微生物）に対する致死的影響を除くため、Ｏ／Ｗ型乳剤の調製過程で使用される親水性乳化剤や、Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳剤の調製過程において１次乳化物であるＷ／Ｏ型乳剤を、再度水相に分散乳化してＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤とする２次乳化で使用される乳化剤として、ポリオキシエチレン系界面活性剤など、可溶化作用のある親水性界面活性剤を一切含まないことを特徴とする。これにより、生、不活化の両ワクチンを混合した際に微生物の活性低下が全く生じない。
【００１８】
すなわち、従来の生ワクチンは、通常、凍結真空乾燥された弱毒生ウイルスや生菌を、これに添付された溶解溶液で溶解して速やかに投与する方法が多用されており、オイルアジュバントワクチンとの混合注射は、生ウイルスや生菌などの活性抗原に対して毒性を示す親水性界面活性剤をほとんど含まないＷ／Ｏ型オイルアジュバントワクチンとの組み合わせに限られ、Ｏ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型のワクチンは、このような親水性界面活性剤を乳化剤として多量に含むため、界面活性剤に感受性の高いコロナウイルスやヘルペスイウルスなど、エンベロープウイルスとの混合注射はできなかった。そこで、本発明では、Ｏ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型のオイルアジュバントワクチンを乳化する際に、生ウイルスや生菌などの活性抗原に影響を及ぼす親水性界面活性剤を全く使用せずに良好な乳化状態のＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型不活化オイルアジュバントワクチンを調製し、このようにして調製されたＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンを、凍結乾燥生ワクチンに加えて溶解させることにより、不活化・生混合のＯ／Ｗ型およびＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの処方を確立するに至ったものである。
【００１９】
従って、本発明における活性抗原としては、特に限定されるものではないが、親水性界面活性剤により致死的影響を受けるエンベロープを有するウイルスや生菌が好適に使用される。前記エンベロープを有するウイルスとしては、例えば、豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、牛コロナウイルス、猫伝染性腹膜炎ウイルス、鶏伝染性気管支炎ウイルスなどのコロナウイルス科に属するウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、馬動脈炎ウイルスなどのアルテリウイルス科に属するウイルス、日本脳炎ウイルス、豚コレラウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルスなどのフラビウイルス科に属するウイルス、オーエスキー病ウイルス、牛ヘルペスウイルス、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス、マレック病ウイルスなどのヘルペスウイルス科に属するウイルス、牛白血病ウイルス、猫白血病ウイルス、猫免疫不全ウイルス、馬伝染性貧血ウイルスなどのレトロウイルス科に属するウイルス、アカバネウイルス、アイノウイルスなどのブニヤウイルス科に属するウイルス、狂犬病ウイルス、牛流行熱ウイルス、水泡性口炎ウイルスなどのラブドウイルス科に属するウイルス、ゲタウイルスなどのトガウイルス科に属するウイルス、インフルエンザなどのオルソミクソウイルス科に属するウイルス、牛ＲＳウイルス、牛パラインフルエンザウイルス３、ニューカッスル病ウイルス、犬ジステンパーウイルスなどのパラミクソウイルス科に属するウイルスなどが挙げられる。また、生菌としては、豚丹毒菌、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、アクチノバチルス・プルロニューモニエ、連鎖球菌、リステリア・モノサイトゲネスなどが挙げられる。これらのウイルスおよび菌は、いずれも大学や国公立の研究機関等から容易に入手することができ、また野外感染性からも容易に分離することが可能で、これを弱毒化またはそのまま活性抗原として使用する。
【００２０】
また、本発明に使用される不活化抗原としては特に限定されるものではなく、ウイルス抗原としては、例えば、上記した活性抗原として使用される各種ウイルスおよびそれらの遺伝子配列に基づく組換え抗原などが挙げられる。また細菌抗原としては毒素原性大腸菌や、豚萎縮性鼻炎の原因菌であるボルデッテラ・プロンキセプチカ、パスツレラ・マルトシダ、さらには上記した活性抗原として使用される細菌菌体、毒素または菌体より分離した菌体成分およびそれらの遺伝子配列に基づく組換え抗原などが挙げられる。これらのウイルスおよび菌は、いずれも大学や国公立の研究機関等から容易に入手することができ、また野外感染性からも容易に分離することが可能で、ウイルス、菌体、毒素は紫外線またはその他の公知の方法で不活化して使用する。また菌体成分はそのままあるいはホルマリン等で固定処理して使用する。
【００２１】
また、本発明では、Ｏ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンを調製するために、Ｏ／Ｗ型乳剤の調製過程で使用される親水性乳化剤や、Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳剤の調製過程において１次乳化物であるＷ／Ｏ型乳剤をＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤とする２次乳化で使用される親水性乳化剤として、親水性界面活性剤を含まず、高分子乳化剤を用いる。本発明で使用する高分子乳化剤としては、多糖のエステルまたはアミドが挙げられ、例えば、多糖類の脂肪酸エステルまたはアミドが挙げられる。多糖類のエステルまたはアミドにおける親水性基である多糖部分としては、セルロースが好ましいが、マンナン、グルカン、キトサン、プルランなども使用できる。なおここでいう多糖とは、構成単糖数が好ましくは50以上、より好ましくは100以上さらに好ましくは200以上である。また、疎水性基としては、オレイン酸などの脂肪酸が好ましいが、コレステロールを疎水基とするものを使用することもできる。従って、本発明で使用する高分子乳化剤としては、セルロース脂肪酸エステル、マンナンコレステロールエステル、プルランコレステロールエステルや、Ｎ−オレイルキトサンやＮ−ステアリルキトサンなどのＮ−アシルキトサンなどが挙げられる。前記セルロース脂肪酸エステルの具体例としては、疎水化ヒドロキシプロピルメチルセロース、例えば、「サンジェロース９０Ｌ」（平均分子量約650,000、構成単糖数約3,600；三協化学製または大同化成工業製）が挙げられる。また、マンナンコレステロールエステルとしては、「コール−ＡＥＣＭ−マンナン（[N-[2-(Cholesterylcarboxyamino)ethyl]carbamoylmethyl]mannan）」（平均分子量約200,000、構成単糖数約1,000；同仁化学製）、プルランコレステロールエステルとしては、「コール−ＡＥＣＭ−プルラン（[N-[2-(Cholesterylcarboxyamino)ethyl]carbamoylmethyl]pullulan）」（平均分子量約50,000、構成単糖数約270；同仁化学製）などが挙げられる。またＮ−アシルキトサンは、希酸で限定加水分解したキトサンをジメチルホルムアミド中でオレイルクロライドやステアリルクロライドなどのアシルクロライドと反応させることにより容易に作出することができる。さらに、本発明の高分子乳化剤としては、カルボキシビニルポリマーやアクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体なども好適に使用することができる。
【００２２】
本発明のＯ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの具体的製造方法およびこれを用いて動物を免疫する方法は、例えば以下のとおりである。
▲１▼ Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンの調製；
高分子乳化剤として多糖脂肪酸エステル、例えば疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば「サンジェロース９０Ｌ」；三協化学製）を好ましくは0.05〜0.5w/v％、より好ましくは0.1〜0.3w/v％、さらに好ましくは0.15〜0.25w/v％と不活化抗原を混合した水相に油性成分（例えば、流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、合成アルカン系オイル、植物油など）を滴下しながら、高速ホモジナイザーで乳化することにより、不活化抗原を水相中に含み、油相成分を1〜75v/v％含むＯ／Ｗ型不活化ワクチンを調製してバイアル瓶に分注する。
▲２▼ 生ワクチンの調製；
弱毒ウイルスまたは弱毒生菌を別のバイアル瓶に分注し、凍結乾燥して生ワクチンを調製する。
▲３▼ 最終ワクチンの調製および動物への接種；
上記▲１▼で調製したＯ／Ｗ型不活化ワクチンを上記▲２▼で調製した生ワクチンに全量加えて溶解し、動物に接種する。
なお、上記▲１▼のＯ／Ｗ型不活化ワクチンの調製において、高分子乳化剤としてマンナンコレステロールエステルやプルランコレステロールエステルを用いる場合の使用濃度は好ましくは0.05〜0.5w/v％、より好ましくは0.1〜0.3w/v％、より好ましくは0.15〜0.25w/v％である。またカルボキシビニルポリマーやアクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体を用いる場合の使用濃度は好ましくは0.002〜0.07w/v％、より好ましくは0.005〜0.04w/v％、さらに好ましくは0.01〜0.025w/v％である。
【００２３】
また、本発明のＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの具体的製造方法およびこれを用いて動物を免疫する方法は、例えば以下のとおりである。
▲１▼ Ｗ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンの調製；
▲１▼-1 １次乳化；
親油性乳化剤として、例えば無水マンニトールオレイン酸エステルを3〜5w/v％含有する油相成分（例えば流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、合成アルカン系オイル、植物油など）７容に不活化抗原を含む水相３容を滴下しながら高速ホモジナイザーで乳化することにより、不活化抗原を水相中に含むＷ／Ｏ型乳剤を調製する。
▲１▼-2 ２次乳化；
高分子乳化剤として多糖脂肪酸エステル、例えば疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば「サンジェロース９０Ｌ」；三協化学製）を0.1〜0.3w/v％含有する水相に、上記▲１▼-1で調製したＷ／Ｏ型乳剤を滴下しながら高速ホモジナイザーで乳化することにより、不活化抗原を内部の水相中に含有するＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンを調製し、バイアル瓶に分注して密栓する。
なお、不活化抗原を外水相中に含有するＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンの場合は、２次乳化の際に外水相中に高分子乳化剤と抗原を同時に添加してＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンを調製し、バイアル瓶に分注して密栓する。
▲２▼ 生ワクチンの調製；
弱毒生ウイルスまたは弱毒生菌を別のバイアル瓶に分注して凍結乾燥して生ワクチンを調製する。
▲３▼ 最終ワクチンの調製および動物への接種；
上記▲１▼で調製したＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンを上記▲２▼で調製した生ワクチンに全量加えて溶解し、動物に接種する。
なお、上記▲１▼のＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンの調製において、高分子乳化剤としてマンナンコレステロールエステルやプルランコレステロールエステルを用いる場合の使用濃度は好ましくは0.05〜0.5w/v％、より好ましくは0.1〜0.3w/v％、より好ましくは0.15〜0.25w/v％である。またカルボキシビニルポリマーやアクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体を用いる場合の使用濃度は好ましくは0.002〜0.07w/v％、より好ましくは0.005〜0.04w/v％、さらに好ましくは0.01〜0.025w/v％である。
【００２４】
【実施例】
［実験］各種界面活性剤の生ウイルス、生菌に対する影響
Ｗ／Ｏ／Ｗ乳剤の２次乳化に使用する界面活性剤が、生ウイルス、生菌にどのように影響するかを調べる目的で、下記ウイルスおよび菌を各種の界面活性剤で処理し、処理後のウイルス価および生菌数を調べた。
【００２５】
（１）供試ウイルス、細菌
▲１▼弱毒豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）Ｋ９６２株；野外の感染豚から分離した強毒株をミドリ猿腎由来Ｖｅｒｏ細胞で低温順化した弱毒株（株式会社微生物化学研究所）。
▲２▼弱毒豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）ＴＯ−Ｋ株；野外の感染豚から分離した強毒株をハムスター由来ＨＡＬ細胞で低温継代順化した弱毒株（株式会社微生物化学研究所）。
▲３▼豚繁殖・呼吸器障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）；野外の感染豚から分離して低温継代した弱毒株（株式会社微生物化学研究所）
▲４▼弱毒豚丹毒菌小金井株；独立行政法人農業技術研究機構動物衛生研究所より分与されたもの。
▲５▼マイコプラズマ・ハイオニューモニエＹＢ−Ｏ１株；野外の感染豚より分離した強毒株（株式会社微生物化学研究所）。
【００２６】
（２）供試親水性界面活性剤
▲１▼Ｗ／Ｏ乳化剤（１次乳化剤）
・無水マンニトールオレイン酸エステル（HLB2.4、分子量428）
▲２▼親水性界面活性剤（２次乳化剤）
・モノラウリン酸ヘキサグリセリル（HLB14.5、分子量約752）
・モノラウリン酸デカグリセリル（HLB15.5、分子量約1,120）
・モノステアリン酸デカグリセリル（HLB12.0、分子量約1,200）
・モノパルミチン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン（HLB15.6、分子量約1,250）
・トリステアリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン（HLB10.5、分子量約1,092）
・ポリオキシエチレン(100)硬化ひまし油（HLB16.5、分子量約5,000〜5,500）
▲３▼高分子乳化剤（２次乳化剤）
・疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（三協化学製「サンジェロース９０Ｌ」；平均分子量約650,000）
・コール−ＡＥＣＭ−マンナン（同仁化学製；[N-[2-(Cholesterylcarboxyamino)ethyl]carbamoylmethyl]mannan;平均分子量約200,000）
・コール−ＡＥＣＭ−プルラン（同仁化学製；[N-[2-(Cholesterylcarboxyamino)ethyl]carbamoylmethyl]pullulan;平均分子量約50,000）
・カルボキシビニルポリマー（BF Goodrich製；平均分子量約600,000）
・アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体（BF Goodrich製;平均分子量約600,000）
【００２７】
（３）試験方法
各種界面活性剤を1w/v％、0.5w/v％、0.2w/v％、0.1w/v％、0.05w/v％、0.025w/v％または0.01w/v％の濃度になるようにＰＥＤＶ、ＴＧＥＶおよびＰＲＲＳＶのウイルス液に添加し、４℃30分間静置した後に猫腎由来fcwf細胞の単層培養を用いてウイルス価を測定した。豚丹毒菌およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエについては、各種界面活性剤を5w/v％、0.5w/v％、0.2w/v％、0.1w/v％、0.05w/v％、0.025w/v％または0.01w/v％の濃度になるように添加し、同様に処理し、馬肉ブイヨン寒天培地で混釈培養して生じたコロニー株を計測した。結果を表１〜５に示す。
【００２８】
なお、表中、ＭＬＨはモノラウリン酸ヘキサグリセリル、ＭＬＤはモノラウリン酸デカグリセリル、ＭＳＤはモノステアリン酸デカグリセリル、ＭＰＰＯＥはモノパルミチン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン、ＴＳＰＯＥはトリステアリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン、ＰＯＥＣＯはポリオキシエチレン(100)硬化ヒマシ油、ＨＰ−ＨＰＭＣは疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ＣＡＥＣＭ−Ｍはコール−ＡＥＣＭ−マンナン、ＣＡＥＣＭ−Ｐはコール−ＡＥＣＭ−プルラン、ＣＶＰはカルボキシビニルポリマー、またＡＭＣＯＰはアクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体をそれぞれ表す。また、ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶおよびＰＲＲＳＶはウイルス価（log10TCID50／ml）で、豚丹毒菌およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエは寒天混釈培養で生じたコロニー数で表示した。さらに、表中の「判定不能」は、界面活性剤の細胞毒性により単層細胞が脱落したことによりウイルス価の測定ができなかったことを示す。また、「ＮＤ」は、この濃度においては極めて粘度が高くなるために取扱いができず、測定を実施しなかったことを示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【表２】
【００３１】
【表３】
【００３２】
【表４】
【００３３】
【表５】
【００３４】
表１〜５に示した結果から明らかなように、ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶおよびＰＲＲＳＶは、共に親水性界面活性剤のいかなる濃度においてもウイルス活性が失われたが、疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コール−ＡＥＣＭ−マンナン、コール−ＡＥＣＭ−プルランにおいては各濃度で全くウイルス価の低下は認められなかった。また、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体においても実用至適濃度（0.01〜0.1w/v％）内におけるウイルス価の低下は認められなかった。一方、豚丹毒菌においては、ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ、ＰＲＲＳＶでみられたような強い影響は認められず、0.1w/v％程度の低濃度ではむしろやや発育が促進されるが、界面活性剤を用いて乳剤を調製する際に通常使用する数w/v％の濃度では生菌数が低下する傾向がみられた。またマイコプラズマでは0.2w/v％以上の濃度では発育抑制が認められた。
従って、これらの界面活性剤が高濃度においては豚丹毒菌などの細菌に対しても発育抑制を示すことが確認された。これらのことから、低分子非イオン性乳化剤は、ウイルスや菌などの微生物の生物活性に対して重大な影響を及ぼすのに対して、疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コール−ＡＥＣＭ−マンナン、コール−ＡＥＣＭ−プルラン、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体などの高分子乳化剤は、ウイルスや菌の生物活性に殆ど影響を与えないことが確認された。
【００３５】
［実施例１］母子免疫用、豚伝染性胃腸炎、豚流行性下痢、豚大腸菌下痢症、豚萎縮性鼻炎混合多価ワクチンの調製と効力検定
（１）豚伝染性胃腸炎、豚大腸菌下痢症２種混合生ワクチンの調製
▲１▼上記実験で用いたものと同じ弱毒豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）をハムスター肺由来ＨＡＬ細胞で培養してウイルス液を得た。
▲２▼上記実験で用いたものと同じ弱毒豚流行性下痢症ウイルス（ＰＥＤＶ）をミドリザル腎由来Ｖｅｒｏ細胞で培養して得られたウイルス液を限外ろ過で約10倍に濃縮したウイルス液を得た。
上記▲１▼、▲２▼のウイルス液を最終ワクチン中でＴＧＥＶ、ＰＥＤＶがそれぞれ約6.0log10TCID50／doseとなるように濃度調製して混合し混合し、凍結乾燥保護剤を加え、20mlバイアル瓶に20ml宛分注して凍結乾燥した。
【００３６】
（２）豚大腸菌下痢症、豚萎縮性鼻炎混合不活化Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイルワクチンの調製
１）毒素原性大腸菌（Ｋ８８及びＫ９９）のホルマリン不活化菌体の調製
Ｋ８８及びＫ９９保有毒素原性大腸菌（いずれも野外の感染豚より分離された株、株式会社微生物化学研究所）をそれぞれ37℃、７時間攪拌タンク培養後、培養液に最終濃度0.2v/v％になるようにホルマリンを加え、37℃で48時間処理して両株の不活化菌液を得た。
２）ボルデッテラ・ブロンキセプチカ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原の調製
ボルデッテラ・ブロンキセプチカＩ相菌（野外の感染豚より分離された株、株式会社微生物化学研究所）を37℃48時間通気攪拌タンク培養し、培養上清からソーナル遠心、ゲルろ過でＨＡ抗原を得た。
３）パスツレラ・マルトシダ壊死毒（ＰＭＴ）抗原の調製
パスツレラ・マルトシダ強毒菌（野外の感染豚より分離された株、株式会社微生物化学研究所）を37℃、48時間攪拌培養し、培養上清から限外ろ過でＰＭＴを採取し、ホルマリン0.3v/v％を加えて不活化毒素を調製した。
【００３７】
各抗原を遠心洗浄または限外ろ過で透析して余剰ホルマリンを除去し、最終ワクチン中において、大腸菌Ｋ８８およびＫ９９がそれぞれ5×107CFU/dose、ボルデッテラ・ブロンキセプチカが1000HA unit/dose、パスツレラ・マルトシダが1000DNT unit/doseになるように原液の各抗原量を調整し、この３容を、マンニトールオレイン酸エステル（親油性乳化剤）5w/v％、スクワラン20v/v％を添加した流動パラフィン７容と混合乳化して、Ｗ／Ｏ型の１次乳剤を調製した。次に、前記Ｗ／Ｏ型乳剤を高分子乳化剤である疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（三協化学製「サンジェロース９０Ｌ」；平均分子量約650,000）、コール−ＡＥＣＭ−マンナン（同仁化学製；平均分子量約200,000）の各0.2w/v％水溶液または0.02w/v％アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体（BF Goodrich社製；平均分子量約600,000）水溶液に滴下しながら高速ホモジナイザーで乳化し、さらに高圧ホモジナイザーで均質に乳化して３種類の安定なＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンを調製し20mlバイアル瓶に各々20ml宛分注した。
【００３８】
（３）最終ワクチンの調製と豚への接種
上記（１）記載の凍結乾燥生ウイルスワクチンに上記（２）記載の３種のオイルアジュバントワクチンをそれぞれ全量加えて溶解し、１検体宛３頭の妊娠豚に交配後１ヶ月および分娩予定日の１ヶ月前の２回、頸部筋肉内に２ml宛注射した。
【００３９】
（４）ワクチン接種豚の抗体測定
１）ワクチン接種豚のＴＧＥＶ、ＰＥＤＶに対する中和抗体価の測定。
社団法人動物用生物学的製剤協会（平成７年１０月発行）、動物用生物学的製剤基準および追加基準を準用し、上記ワクチン接種妊娠豚の分娩時の血清、初乳乳清、産子の生後７日後の血清をサンプルとして96穴のプラスチックプレートを用いて測定した。
２）ワクチン接種豚のＫ８８、Ｋ９９に対する抗体測定（ＥＬＩＳＡ抗体価の測定）
社団法人動物用生物学的製剤協会（平成７年１０月発行）、動物用生物学的製剤基準に記載の豚大腸菌性下痢症（Ｋ８８保有全菌体・Ｋ９９保有全菌体）不活化ワクチンの力価試験法を準用し、上記ワクチン接種妊娠豚の分娩時の血清、産子の生後７日目の血清を検体としてＥＬＩＳＡ抗体価を測定した。
３）ワクチン接種豚のボルデッテラ・ブロンキセプチカに対する抗体測定（ＨＩ抗体価の測定）
社団法人動物用生物学的製剤協会（平成７年１０月発行）、動物用生物学的製剤基準に記載のボルデッテラ感染症精製不活化ワクチンの力価試験法を準用し、上記ワクチン接種妊娠豚の分娩時の血清と初乳乳清、産子の生後７日目の血清を検体として抗体価を測定した。
４）ワクチン接種豚のパスツレラ・マルトシダトキソイドに対する抗体測定（ＰＭＴ中和抗体価の測定）
上記ワクチン妊娠豚の分娩時の血清と初乳乳清、産子の生後７日目の血清をそれぞれ２倍段階希釈し、これにＰＭＴ（パスツレラ・マルトシダトキシン）（5MLD/0.1ml）を等量混合し、３７℃で１時間感作した。次に、この混合物０．１ｍｌを５週齢のBALB/cマウスの脚部筋肉内に注射して７日間観察した。マウスが毒素に耐過生存した血清の希釈倍率をＰＭＴ中和抗体価とした。
【００４０】
高分子乳化剤として0.2％疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用したＷ／Ｏ／Ｗ型多価オイルアジュバントワクチン接種豚の血清・初乳および７日齢産子の血清抗体価を表６〜１１に、高分子乳化剤として0.2％コール−ＡＥＣＭ−マンナンを使用したＷ／Ｏ／Ｗ型多価オイルアジュバントワクチン接種豚の血清・初乳および７日齢産子の血清抗体価を表１２〜１７に、高分子乳化剤として0.02％アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体を使用したＷ／Ｏ／Ｗ型多価オイルアジュバントワクチン接種豚の血清・初乳および７日齢産子の血清抗体価を表１８〜２３に示す。
【００４１】
【表６】
【００４２】
【表７】
【００４３】
【表８】
【００４４】
【表９】
【００４５】
【表１０】
【００４６】
【表１１】
【００４７】
【表１２】
【００４８】
【表１３】
【００４９】
【表１４】
【００５０】
【表１５】
【００５１】
【表１６】
【００５２】
【表１７】
【００５３】
【表１８】
【００５４】
【表１９】
【００５５】
【表２０】
【００５６】
【表２１】
【００５７】
【表２２】
【００５８】
【表２３】
【００５９】
表６〜２３に示したように、高分子乳化剤を用いて調製したＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンを接種された母豚は、豚伝染性胃腸炎、豚流行性下痢、豚大腸菌下痢症、豚萎縮性鼻炎から産子を防御するに十分な抗体を産生することが確認された。また、社団法人動物用生物学的製剤協会（平成７年１０月発行）、動物用生物学的製剤基準に記載の各種ワクチンの力価検定法を準用した試験を実施したところ、全ての項目において合格することが確認され、有効性が確認された。
【００６０】
（５）安全性に関する試験結果
本ワクチン接種後、30分、６時間、12時間、24時間、48時間、72時間の母豚の体温測定を実施するとともに、最終注射後２ヶ月で解剖し、ワクチン接種部位の局所反応について観察した。その結果、全ての高分子乳化剤を用いて２次乳化したワクチンを注射した豚では注射当日には一過性の軽い発熱をみたが、翌日には回復した。
注射局所の剖検では疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いた豚のNo.926、929、932は接種反応を認めなかったが、No.928においては、注射局所に２〜４ｍｍ程度の肉芽腫性反応を数個認めた。コール−ＡＥＣＭ−マンナンを用いた豚で、No.911と912で直径２mm前後のオイルグラニュローマが確認されたが、他の豚では接種反応は認められなかった。アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体はNo.916、918で３×４mmのオイルグラニュローマがそれぞれ２箇所確認されたが他の豚では反応を認めなかった。これらの所見は、通常のＷ／０型ワクチンが注射部位周辺に直径数センチに渡る広範囲にオイルグラニュローマを形成する強い炎症反応を示すのと比較して、本発明の高分子乳化剤を用いたＷ／Ｏ／Ｗワクチンでは注射局所に限局してオイルグラニュローマが形成される反応が認められたのみで、本Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの安全性が確認された。
【００６１】
以上の結果から、高分子乳化剤によって乳剤を形成して生と不活化の抗原を同一製剤中に含む本発明のＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの有効性が確認された。
【００６２】
［実施例２］肥育豚用豚アクチノバチルス１、２、５型、豚丹毒、豚繁殖・呼吸障害症候群混合多価ワクチンの調製と検定
（１）豚丹毒、豚繁殖・呼吸障害症候群混合生ワクチンの調製
▲１▼弱毒豚丹毒菌小金井株（独立行政法人農業技術研究機構動物衛生研究所より分与されたもの）を37℃で24時間培養した菌液を採取した。
▲２▼弱毒豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳＶ）ウイルス（野外の感染豚より分離して低温継代で弱毒化した株；株式会社微生物化学研究所）をＭＡＲＣ細胞で増殖させ、限外ろ過で10倍に濃縮したウイルス液を調製した。
上記▲１▼および▲２▼の菌液およびウイルス液に凍結乾燥保護剤を加えて、豚丹毒、豚繁殖・呼吸障害症候群混合生ワクチンを調製した。
（２）豚アクチノバチルス３価Ｏ／Ｗ型オイルワクチンの調製
１）豚アクチノバチルス１、２、５型菌培養上清由来抗原の調製
アクチノバチルス１型Ｙ−１株菌、２型Ｇ−５株菌および５型Ｅ−３株菌（いずれも、野外の感染豚より分離した強毒株；株式会社微生物化学研究所）を37℃、12時間攪拌タンク培養した菌液より遠心分離で培養上清を採取し、限外ろ過で抗原を濃縮して上記１、２、５型のワクチン抗原を得た。各抗原画分に最終濃度0.3v/v％になるようにホルマリンを加え37℃で２日間処理して蛋白を固定化して３種の抗原を調製した。
２）Ｏ／Ｗ型不活化オイルワクチンの調製
各抗原中の余剰ホルマリンを限外ろ過で除去し、適当な抗原濃度に調整したのち疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（三協化学製「サンジェロース９０Ｌ」；平均分子量約650,000）を終濃度0.2w/v％になるように加え、その７．５容にマンニトールオレイン酸エステル（親油性乳化剤）２w/v％添加スクワラン2.5容を滴下しながら高速ホモジナイザーで混合乳化し、さらに高圧ホモジナイザーにかけて均質化して豚アクチノバチルス３価Ｏ／Ｗ型オイルワクチンを調整し、20mlバイアル瓶に各々20ml宛分注した。
（３）ワクチン接種
上記（１）記載の生ワクチンに上記（２）記載のＯ／Ｗ型不活化ワクチンを全量加えて溶解し、その２mlを１ヶ月齢肥育豚の耳根部筋肉内に注射し、さらに１ヶ月後に同じく２mlを注射して免疫し、２回目注射の３週間後に採血して血清抗体価を測定した。
【００６３】
（４）抗体価の測定方法
１）豚アクチノバチルス１、２、５型に対するＥＬＩＳＡ抗体価の測定
1. 各血清型ＥＬＩＳＡ抗原を炭酸緩衝液で所定の倍率に希釈し、ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに100μｌずつ分注する。
2. ４℃、一晩感作させる。
3. プレートをTween20加PBS（T-PBS）で洗浄する（３回）。
4. 0.5％牛血清アルブミン溶液を各ウェルに200μｌずつ分注する。
5. 37℃、１時間感作させる。
6. プレートをT-PBSで洗浄する（３回）。
7. T-PBSで100倍より２倍段階希釈した血清を各ウェルに100μｌずつ分注する。
8. 37℃、１時間感作させる。
9. プレートをT-PBSで洗浄する（３回）。
10. T-PBSで所定の倍率に希釈したPOD標識抗豚IgGを各ウェルに100μｌずつ分注する。
11. 37℃、１時間感作させる。
12. プレートをT-PBSで洗浄する（５回）。
13. 過酸化水素加0.04％オルトフェニレンジアミン溶液を各ウェルに100μｌずつ分注する。
14. 遮光して30℃、30分間反応させる。
15. １Ｍ硫酸溶液を各ウェルに50μｌずつ分注する。
16. 波長490nmと630nmの二波長で吸光度を測定し、その差をＥＬＩＳＡ価とする。
17. ＥＬＩＳＡ価が0.5を示す最高希釈倍率を抗体価とする。
【００６４】
２）豚丹毒菌に対する生菌発育凝集抗体価の測定
図１〜２に示す方法により生菌発育凝集抗体価を測定した。
判定は、管底に膜状の沈降物を生じるものを生菌凝集反応「＋」、管底中央に円形の菌塊のみを生ずるものを生菌凝集反応「−」とした。「＋」以上の生菌凝集反応を生ずる被検血清の最高希釈倍率の逆数を丹毒生菌凝集抗体価とした。
【００６５】
３）ＰＲＲＳウイルスに対する間接蛍光抗体（ＩＦＡ）価の測定
４穴チャンバースライドにミドリ猿由来ＭＡＲＣ細胞を単層培養し、ＰＲＲＳウイルスｃｈｉｂａ−９２株（独立行政法人農業技術研究機構動物衛生研究所より分与されたもの）を感染させた後、２日目にウイルス感染細胞をアセトン固定し、２倍段階希釈した被検血清を37℃１時間感作し、リン酸緩衝整理食塩水（PBS）で３回洗浄後、染色力価４単位に調整したＦＩＴＣ標識抗豚ＩｇＣウサギ血清を37℃１時間感作し、同様に洗浄後、無蛍光グリセリンＰＢＳを用いてカバーグラスで封入し、ＮＩＫＯＮ落射型蛍光顕微鏡（日本光学製）でＰＲＲＳウイルスに対する蛍光を観察した。一次血清の最高希釈倍数の逆数をＩＦＡ価とした。
【００６６】
以上の疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて調製した肥育豚用豚アクチノバチルス１、２、５型、豚丹毒、豚繁殖・呼吸障害症候群混合多価Ｏ／Ｗ型オイルアジュバンントワクチンの血清抗体化の測定結果を表２４〜２８に示す。なお、表中、Ａｐｐ−１は豚アクチノバチスル１型、Ａｐｐ−２は豚アクチノバチスル２型、Ａｐｐ−５は豚アクチノバチスル５型、ＰＲＲＳＶは豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスを表す。
【００６７】
【表２４】
【００６８】
【表２５】
【００６９】
【表２６】
【００７０】
【表２７】
【００７１】
【表２８】
【００７２】
表２４〜２８に示すように、本発明のＯ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの各抗原に対する抗体価は、これら感染症から肥育豚を十分防御するに足る抗体価を示し、その有効性が確認された。また本発明のＯ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンを接種された供試豚は発熱も一過性で、剖検に於いても接種部位に全く変化は認められなかった。
【００７３】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、可溶化作用のある親水性界面活性剤を含まず、高分子乳化剤を用いることで、不活化および生の多種の抗原を同一製剤中に含有させることができ、省力的かつ安全なＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型の動物用多価オイルアジュバントワクチンを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 豚丹毒菌に対する生菌凝集抗体価の測定方法。
【図２】 豚丹毒菌に対する生菌凝集抗体価の測定方法。
【発明の属する技術分野】
本発明は、家畜、家禽または愛玩動物に好適に用いることのできる動物用多価ワクチンおよび動物を免疫する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動物用ワクチンには、大きく分けて、弱毒化した生ウイルスまたは生菌を用いた生ワクチンと、それらをホルマリン、紫外線あるいはその他の方法で不活化した不活化ワクチンがあり、それらは互いに個別に使用される場合が多く、両者を混合して同時に注射することは、いくつかの例外を除いてあまり行われていない。その大きな理由は、不活化ワクチンに含まれるホルマリン、石炭酸、水銀製剤などの不活化剤や保存剤または界面活性剤などが、生ウイルスや生菌などの活性に悪影響を及ぼすことが危惧されるためであり、特に親水性界面活性剤はウイルスや菌の生物活性に対し重大な悪影響を及ぼすとともに、ワクチンを注射される生体にとっても、親水性界面活性剤の可溶化作用によりワクチンの注射局所の細胞を壊死させ、接種反応を強めることが危惧される。
【０００３】
特に、コロナウイルス、アルテリウイルス、ヘルペスウイルスなどに代表される、いわゆるエンベロープウイルスにとって、これまでのＯ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントに含まれるポリオキシエチレン系やポリグリセリン系などの親水性界面活性剤は可溶化力が強く、ウイルスエンベロープを破壊することによりウイルスに致死的影響を及ぼすことが知られている。また、豚丹毒菌などの弱毒生ワクチン株の場合にも、乳剤中に親水性界面活性剤が高濃度に存在することにより菌体が溶解され、致死的影響を受ける。
【０００４】
従って、従来においては、このようなエンベロープウイルスや生菌を、親水性界面活性剤の配合が不可欠なＯ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型アジュバント製剤に配合することは不可能であった。例えば、特開昭５９−６２３４０にはポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを、また特開２００１−１３１０８７および特開平１１−２６９０９３には、非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルなどの可溶化力の強い親水性の低分子非イオン性界面活性剤をＷ／Ｏ／Ｗ型ワクチン製剤の外水相中に使用して剤型を整えることが記載されているが、このような処方ではＯ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型製剤中に上記した生ウイルスや生菌を配合することは到底不可能である。
【０００５】
ヒト用ワクチンとは異なり、畜産分野のワクチンにおいては、オイルアジュバントワクチンの占める比率は年毎に増える傾向にあり、従来多用されていた流動パラフィンと親油性乳化剤を用いたＷ／Ｏ型ワクチンアジュバントに代えて、最近では代謝性の高い各種の動植物性オイルを用いたＯ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型アジュバントが使用されるようになってきており、このような乳剤を調製するためには、これまではポリオキシエチレン系などの界面活性作用が強く比較的低分子の界面活性剤を使用するのが常であった。しかし、このような界面活性剤を含むＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤と上記の生ウイルスや生菌などの活性抗原を混合して使用することは、これらの活性抗原の生物活性に重大な影響を及ぼすため不可能であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、Ｏ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型の不活化ワクチンを調製する際に、ポリオキシエチレン系などの親水性界面活性剤、例えばポリソルベート８０などを使用せずに、物理的に安定なＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンを調製することで、不活化抗原および活性抗原を同一製剤中に含有する動物用多価オイルアジュバントワクチンを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記のような従来のワクチンの欠点を除き、活性抗原である生ウイルス、生菌の凍結乾燥品を溶解しても、これら生ウイルスや生菌の活性に影響を及ぼさず、不活化抗原および活性抗原を同一製剤中に含有するＯ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型のオイルアジュバントワクチンを完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、生物学的に不活性な抗原と生物学的に活性な抗原とを含有し、親水性界面活性剤を含まず高分子乳化剤を用いて調製されてなるＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型の動物用多価オイルアジュバントワクチンである。なお、ここでいう「親水性界面活性剤」とは、特に規定されるものではないが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Tween系）やポリオキシエチレンヒマシ油などのポリオキシエチレン系界面活性剤、モノラウリン酸ヘキサグリセリルやモノオレイン酸デカグリセリルなどのポリグリセリン系、ソルビタン脂肪酸エステルやショ糖脂肪酸エステルなどの単糖・オリゴ糖エステル系などの界面活性剤のうちＨＬＢ値（Hydrophil Lypophil Balance）8.0以上の親水性界面活性剤をいう。
【０００９】
前記Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンは、不活性な抗原が高分子乳化剤を用いて乳化して調製されたＯ／Ｗ型乳剤の水相中に含有され、このＯ／Ｗ型乳剤を溶解溶液として、別に凍結乾燥された生ウイルスまたは生菌を溶解することにより得られ、さらには、高分子乳化剤を用いて乳化して調製されたＯ／Ｗ型乳剤の水相中に不活性な抗原を含有させたＯ／Ｗ型不活化ワクチンに、生ウイルスまたは生菌を凍結乾燥した生ワクチンを添加して溶解することにより得られる。
【００１０】
また、前記Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの場合は、生物学的に不活性な抗原を流動パラフィン等の油相中に親油性界面活性剤を用いて分散乳化（一次乳化）して調製されたＷ／Ｏ乳剤を、生物学的に不活性な抗原を含む、あるいは含まない水相中に高分子乳化剤を用いて再度分散乳化（２次乳化）することによりＷ／Ｏ／Ｗ型ワクチンが調製される。次に、このＷ／Ｏ／Ｗ型ワクチンを溶解溶液として、別に凍結乾燥された生ウイルスまたは生菌を溶解することによって不活化・生混合多価オイルアジュバントワクチンが得られる。
【００１１】
なお、本発明で、多価とは同一製剤中に複数種の抗原が含有されていることを示し、２価とは２種類の抗原が、３価は３種類の抗原が含有されていることを意味する。また、乳化剤の分子量とは重量平均分子量を意味する。
【００１２】
前記Ｏ／Ｗ型乳剤の調製過程またはＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤の２次乳化過程で使用される高分子乳化剤としては、多糖のエステルまたはアミドを使用することができ、例えばセルロース脂肪酸エステル、マンナンコレステロールエステル、プルランコレステロールエステルなどの多糖エステルが挙げられる。また、前記高分子乳化剤として、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体なども好適に使用できる。
【００１３】
前記生物学的に活性なウイルス抗原としては、エンベロープを有するウイルスが挙げられる。前記エンベロープを有する代表的なウイルスとしては、コロナウイルス科に属するウイルス、アルテリウイルス科に属するウイルス、ヘルペスウイルス科に属するウイルス、ブニヤウイルス科に属するウイルスなどが挙げられ、コロナウイルス科に属するウイルスとしては、豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、アルテリウイルス科に属するウイルスとしては、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）が挙げられる。また、生物学的に活性な細菌抗原としては、弱毒豚丹毒菌やサルモネラ菌あるいはマイコプラズマの生菌などを用いることができる。
【００１４】
また、生物学的に不活性な細菌抗原としては、特に限定されるものではないが、毒素原性大腸菌、ボルデッテラ・ブロンキセプチカ、パスツレラ・マルトシダ、サルモネラ属菌、マイコプラズマ属、レプトスピラ属、アクチノバチルス属、ヘモフィルス属、マンハイミア属の細菌、あるいはこれらの細菌に由来する抗原およびこれらの遺伝子情報に基づいて作出された抗原及びペプチド合成などの手法によって作出された抗原などが挙げられる。
【００１５】
本発明による動物を免疫する方法は、高分子乳化剤を用いて乳化して調製されたＯ／Ｗ型乳剤の水相中に不活性な抗原が含有されたＯ／Ｗ型不活化ワクチンを、生ウイルスまたは生菌を凍結乾燥した生ワクチンのバイアル中に添加して溶解し、これを動物に接種することにより動物を免疫する方法、または、高分子乳化剤を用いて２次乳化して調製されたＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤の内水相中および／または外水相中に不活性な抗原が含有されたＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンを、生ウイルスまたは生菌を凍結乾燥した生ワクチンのバイアル中に添加して溶解し、これを動物に接種することにより動物を免疫する方法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の詳細を説明する。
本発明における生物学的に活性な抗原とは、弱毒化した生ウイルスまたは生菌のこと（以下、活性抗原という。）であり、また生物学的に不活性な抗原とは、それらを紫外線またはその他の方法で不活化したもの（以下、不活化抗原という。）である。
【００１７】
本発明は、例えば、活性抗原である生ウイルスまたは生菌をバイアル瓶に分注して凍結乾燥した生ワクチンと、Ｏ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型の乳化型を有する不活化ワクチンを組み合わせることにより、対象動物に数種の抗原を一度に接種することができる多価オイルアジュバントワクチンを提供するものであり、従来のＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型ワクチンの欠点である活性抗原（活性微生物）に対する致死的影響を除くため、Ｏ／Ｗ型乳剤の調製過程で使用される親水性乳化剤や、Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳剤の調製過程において１次乳化物であるＷ／Ｏ型乳剤を、再度水相に分散乳化してＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤とする２次乳化で使用される乳化剤として、ポリオキシエチレン系界面活性剤など、可溶化作用のある親水性界面活性剤を一切含まないことを特徴とする。これにより、生、不活化の両ワクチンを混合した際に微生物の活性低下が全く生じない。
【００１８】
すなわち、従来の生ワクチンは、通常、凍結真空乾燥された弱毒生ウイルスや生菌を、これに添付された溶解溶液で溶解して速やかに投与する方法が多用されており、オイルアジュバントワクチンとの混合注射は、生ウイルスや生菌などの活性抗原に対して毒性を示す親水性界面活性剤をほとんど含まないＷ／Ｏ型オイルアジュバントワクチンとの組み合わせに限られ、Ｏ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型のワクチンは、このような親水性界面活性剤を乳化剤として多量に含むため、界面活性剤に感受性の高いコロナウイルスやヘルペスイウルスなど、エンベロープウイルスとの混合注射はできなかった。そこで、本発明では、Ｏ／Ｗ型やＷ／Ｏ／Ｗ型のオイルアジュバントワクチンを乳化する際に、生ウイルスや生菌などの活性抗原に影響を及ぼす親水性界面活性剤を全く使用せずに良好な乳化状態のＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型不活化オイルアジュバントワクチンを調製し、このようにして調製されたＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンを、凍結乾燥生ワクチンに加えて溶解させることにより、不活化・生混合のＯ／Ｗ型およびＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの処方を確立するに至ったものである。
【００１９】
従って、本発明における活性抗原としては、特に限定されるものではないが、親水性界面活性剤により致死的影響を受けるエンベロープを有するウイルスや生菌が好適に使用される。前記エンベロープを有するウイルスとしては、例えば、豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、牛コロナウイルス、猫伝染性腹膜炎ウイルス、鶏伝染性気管支炎ウイルスなどのコロナウイルス科に属するウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、馬動脈炎ウイルスなどのアルテリウイルス科に属するウイルス、日本脳炎ウイルス、豚コレラウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルスなどのフラビウイルス科に属するウイルス、オーエスキー病ウイルス、牛ヘルペスウイルス、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス、マレック病ウイルスなどのヘルペスウイルス科に属するウイルス、牛白血病ウイルス、猫白血病ウイルス、猫免疫不全ウイルス、馬伝染性貧血ウイルスなどのレトロウイルス科に属するウイルス、アカバネウイルス、アイノウイルスなどのブニヤウイルス科に属するウイルス、狂犬病ウイルス、牛流行熱ウイルス、水泡性口炎ウイルスなどのラブドウイルス科に属するウイルス、ゲタウイルスなどのトガウイルス科に属するウイルス、インフルエンザなどのオルソミクソウイルス科に属するウイルス、牛ＲＳウイルス、牛パラインフルエンザウイルス３、ニューカッスル病ウイルス、犬ジステンパーウイルスなどのパラミクソウイルス科に属するウイルスなどが挙げられる。また、生菌としては、豚丹毒菌、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、アクチノバチルス・プルロニューモニエ、連鎖球菌、リステリア・モノサイトゲネスなどが挙げられる。これらのウイルスおよび菌は、いずれも大学や国公立の研究機関等から容易に入手することができ、また野外感染性からも容易に分離することが可能で、これを弱毒化またはそのまま活性抗原として使用する。
【００２０】
また、本発明に使用される不活化抗原としては特に限定されるものではなく、ウイルス抗原としては、例えば、上記した活性抗原として使用される各種ウイルスおよびそれらの遺伝子配列に基づく組換え抗原などが挙げられる。また細菌抗原としては毒素原性大腸菌や、豚萎縮性鼻炎の原因菌であるボルデッテラ・プロンキセプチカ、パスツレラ・マルトシダ、さらには上記した活性抗原として使用される細菌菌体、毒素または菌体より分離した菌体成分およびそれらの遺伝子配列に基づく組換え抗原などが挙げられる。これらのウイルスおよび菌は、いずれも大学や国公立の研究機関等から容易に入手することができ、また野外感染性からも容易に分離することが可能で、ウイルス、菌体、毒素は紫外線またはその他の公知の方法で不活化して使用する。また菌体成分はそのままあるいはホルマリン等で固定処理して使用する。
【００２１】
また、本発明では、Ｏ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンを調製するために、Ｏ／Ｗ型乳剤の調製過程で使用される親水性乳化剤や、Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳剤の調製過程において１次乳化物であるＷ／Ｏ型乳剤をＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤とする２次乳化で使用される親水性乳化剤として、親水性界面活性剤を含まず、高分子乳化剤を用いる。本発明で使用する高分子乳化剤としては、多糖のエステルまたはアミドが挙げられ、例えば、多糖類の脂肪酸エステルまたはアミドが挙げられる。多糖類のエステルまたはアミドにおける親水性基である多糖部分としては、セルロースが好ましいが、マンナン、グルカン、キトサン、プルランなども使用できる。なおここでいう多糖とは、構成単糖数が好ましくは50以上、より好ましくは100以上さらに好ましくは200以上である。また、疎水性基としては、オレイン酸などの脂肪酸が好ましいが、コレステロールを疎水基とするものを使用することもできる。従って、本発明で使用する高分子乳化剤としては、セルロース脂肪酸エステル、マンナンコレステロールエステル、プルランコレステロールエステルや、Ｎ−オレイルキトサンやＮ−ステアリルキトサンなどのＮ−アシルキトサンなどが挙げられる。前記セルロース脂肪酸エステルの具体例としては、疎水化ヒドロキシプロピルメチルセロース、例えば、「サンジェロース９０Ｌ」（平均分子量約650,000、構成単糖数約3,600；三協化学製または大同化成工業製）が挙げられる。また、マンナンコレステロールエステルとしては、「コール−ＡＥＣＭ−マンナン（[N-[2-(Cholesterylcarboxyamino)ethyl]carbamoylmethyl]mannan）」（平均分子量約200,000、構成単糖数約1,000；同仁化学製）、プルランコレステロールエステルとしては、「コール−ＡＥＣＭ−プルラン（[N-[2-(Cholesterylcarboxyamino)ethyl]carbamoylmethyl]pullulan）」（平均分子量約50,000、構成単糖数約270；同仁化学製）などが挙げられる。またＮ−アシルキトサンは、希酸で限定加水分解したキトサンをジメチルホルムアミド中でオレイルクロライドやステアリルクロライドなどのアシルクロライドと反応させることにより容易に作出することができる。さらに、本発明の高分子乳化剤としては、カルボキシビニルポリマーやアクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体なども好適に使用することができる。
【００２２】
本発明のＯ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの具体的製造方法およびこれを用いて動物を免疫する方法は、例えば以下のとおりである。
▲１▼ Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンの調製；
高分子乳化剤として多糖脂肪酸エステル、例えば疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば「サンジェロース９０Ｌ」；三協化学製）を好ましくは0.05〜0.5w/v％、より好ましくは0.1〜0.3w/v％、さらに好ましくは0.15〜0.25w/v％と不活化抗原を混合した水相に油性成分（例えば、流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、合成アルカン系オイル、植物油など）を滴下しながら、高速ホモジナイザーで乳化することにより、不活化抗原を水相中に含み、油相成分を1〜75v/v％含むＯ／Ｗ型不活化ワクチンを調製してバイアル瓶に分注する。
▲２▼ 生ワクチンの調製；
弱毒ウイルスまたは弱毒生菌を別のバイアル瓶に分注し、凍結乾燥して生ワクチンを調製する。
▲３▼ 最終ワクチンの調製および動物への接種；
上記▲１▼で調製したＯ／Ｗ型不活化ワクチンを上記▲２▼で調製した生ワクチンに全量加えて溶解し、動物に接種する。
なお、上記▲１▼のＯ／Ｗ型不活化ワクチンの調製において、高分子乳化剤としてマンナンコレステロールエステルやプルランコレステロールエステルを用いる場合の使用濃度は好ましくは0.05〜0.5w/v％、より好ましくは0.1〜0.3w/v％、より好ましくは0.15〜0.25w/v％である。またカルボキシビニルポリマーやアクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体を用いる場合の使用濃度は好ましくは0.002〜0.07w/v％、より好ましくは0.005〜0.04w/v％、さらに好ましくは0.01〜0.025w/v％である。
【００２３】
また、本発明のＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの具体的製造方法およびこれを用いて動物を免疫する方法は、例えば以下のとおりである。
▲１▼ Ｗ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンの調製；
▲１▼-1 １次乳化；
親油性乳化剤として、例えば無水マンニトールオレイン酸エステルを3〜5w/v％含有する油相成分（例えば流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、合成アルカン系オイル、植物油など）７容に不活化抗原を含む水相３容を滴下しながら高速ホモジナイザーで乳化することにより、不活化抗原を水相中に含むＷ／Ｏ型乳剤を調製する。
▲１▼-2 ２次乳化；
高分子乳化剤として多糖脂肪酸エステル、例えば疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば「サンジェロース９０Ｌ」；三協化学製）を0.1〜0.3w/v％含有する水相に、上記▲１▼-1で調製したＷ／Ｏ型乳剤を滴下しながら高速ホモジナイザーで乳化することにより、不活化抗原を内部の水相中に含有するＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンを調製し、バイアル瓶に分注して密栓する。
なお、不活化抗原を外水相中に含有するＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンの場合は、２次乳化の際に外水相中に高分子乳化剤と抗原を同時に添加してＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンを調製し、バイアル瓶に分注して密栓する。
▲２▼ 生ワクチンの調製；
弱毒生ウイルスまたは弱毒生菌を別のバイアル瓶に分注して凍結乾燥して生ワクチンを調製する。
▲３▼ 最終ワクチンの調製および動物への接種；
上記▲１▼で調製したＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンを上記▲２▼で調製した生ワクチンに全量加えて溶解し、動物に接種する。
なお、上記▲１▼のＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンの調製において、高分子乳化剤としてマンナンコレステロールエステルやプルランコレステロールエステルを用いる場合の使用濃度は好ましくは0.05〜0.5w/v％、より好ましくは0.1〜0.3w/v％、より好ましくは0.15〜0.25w/v％である。またカルボキシビニルポリマーやアクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体を用いる場合の使用濃度は好ましくは0.002〜0.07w/v％、より好ましくは0.005〜0.04w/v％、さらに好ましくは0.01〜0.025w/v％である。
【００２４】
【実施例】
［実験］各種界面活性剤の生ウイルス、生菌に対する影響
Ｗ／Ｏ／Ｗ乳剤の２次乳化に使用する界面活性剤が、生ウイルス、生菌にどのように影響するかを調べる目的で、下記ウイルスおよび菌を各種の界面活性剤で処理し、処理後のウイルス価および生菌数を調べた。
【００２５】
（１）供試ウイルス、細菌
▲１▼弱毒豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）Ｋ９６２株；野外の感染豚から分離した強毒株をミドリ猿腎由来Ｖｅｒｏ細胞で低温順化した弱毒株（株式会社微生物化学研究所）。
▲２▼弱毒豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）ＴＯ−Ｋ株；野外の感染豚から分離した強毒株をハムスター由来ＨＡＬ細胞で低温継代順化した弱毒株（株式会社微生物化学研究所）。
▲３▼豚繁殖・呼吸器障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）；野外の感染豚から分離して低温継代した弱毒株（株式会社微生物化学研究所）
▲４▼弱毒豚丹毒菌小金井株；独立行政法人農業技術研究機構動物衛生研究所より分与されたもの。
▲５▼マイコプラズマ・ハイオニューモニエＹＢ−Ｏ１株；野外の感染豚より分離した強毒株（株式会社微生物化学研究所）。
【００２６】
（２）供試親水性界面活性剤
▲１▼Ｗ／Ｏ乳化剤（１次乳化剤）
・無水マンニトールオレイン酸エステル（HLB2.4、分子量428）
▲２▼親水性界面活性剤（２次乳化剤）
・モノラウリン酸ヘキサグリセリル（HLB14.5、分子量約752）
・モノラウリン酸デカグリセリル（HLB15.5、分子量約1,120）
・モノステアリン酸デカグリセリル（HLB12.0、分子量約1,200）
・モノパルミチン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン（HLB15.6、分子量約1,250）
・トリステアリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン（HLB10.5、分子量約1,092）
・ポリオキシエチレン(100)硬化ひまし油（HLB16.5、分子量約5,000〜5,500）
▲３▼高分子乳化剤（２次乳化剤）
・疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（三協化学製「サンジェロース９０Ｌ」；平均分子量約650,000）
・コール−ＡＥＣＭ−マンナン（同仁化学製；[N-[2-(Cholesterylcarboxyamino)ethyl]carbamoylmethyl]mannan;平均分子量約200,000）
・コール−ＡＥＣＭ−プルラン（同仁化学製；[N-[2-(Cholesterylcarboxyamino)ethyl]carbamoylmethyl]pullulan;平均分子量約50,000）
・カルボキシビニルポリマー（BF Goodrich製；平均分子量約600,000）
・アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体（BF Goodrich製;平均分子量約600,000）
【００２７】
（３）試験方法
各種界面活性剤を1w/v％、0.5w/v％、0.2w/v％、0.1w/v％、0.05w/v％、0.025w/v％または0.01w/v％の濃度になるようにＰＥＤＶ、ＴＧＥＶおよびＰＲＲＳＶのウイルス液に添加し、４℃30分間静置した後に猫腎由来fcwf細胞の単層培養を用いてウイルス価を測定した。豚丹毒菌およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエについては、各種界面活性剤を5w/v％、0.5w/v％、0.2w/v％、0.1w/v％、0.05w/v％、0.025w/v％または0.01w/v％の濃度になるように添加し、同様に処理し、馬肉ブイヨン寒天培地で混釈培養して生じたコロニー株を計測した。結果を表１〜５に示す。
【００２８】
なお、表中、ＭＬＨはモノラウリン酸ヘキサグリセリル、ＭＬＤはモノラウリン酸デカグリセリル、ＭＳＤはモノステアリン酸デカグリセリル、ＭＰＰＯＥはモノパルミチン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン、ＴＳＰＯＥはトリステアリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン、ＰＯＥＣＯはポリオキシエチレン(100)硬化ヒマシ油、ＨＰ−ＨＰＭＣは疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ＣＡＥＣＭ−Ｍはコール−ＡＥＣＭ−マンナン、ＣＡＥＣＭ−Ｐはコール−ＡＥＣＭ−プルラン、ＣＶＰはカルボキシビニルポリマー、またＡＭＣＯＰはアクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体をそれぞれ表す。また、ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶおよびＰＲＲＳＶはウイルス価（log10TCID50／ml）で、豚丹毒菌およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエは寒天混釈培養で生じたコロニー数で表示した。さらに、表中の「判定不能」は、界面活性剤の細胞毒性により単層細胞が脱落したことによりウイルス価の測定ができなかったことを示す。また、「ＮＤ」は、この濃度においては極めて粘度が高くなるために取扱いができず、測定を実施しなかったことを示す。
【００２９】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
表１〜５に示した結果から明らかなように、ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶおよびＰＲＲＳＶは、共に親水性界面活性剤のいかなる濃度においてもウイルス活性が失われたが、疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コール−ＡＥＣＭ−マンナン、コール−ＡＥＣＭ−プルランにおいては各濃度で全くウイルス価の低下は認められなかった。また、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体においても実用至適濃度（0.01〜0.1w/v％）内におけるウイルス価の低下は認められなかった。一方、豚丹毒菌においては、ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ、ＰＲＲＳＶでみられたような強い影響は認められず、0.1w/v％程度の低濃度ではむしろやや発育が促進されるが、界面活性剤を用いて乳剤を調製する際に通常使用する数w/v％の濃度では生菌数が低下する傾向がみられた。またマイコプラズマでは0.2w/v％以上の濃度では発育抑制が認められた。
従って、これらの界面活性剤が高濃度においては豚丹毒菌などの細菌に対しても発育抑制を示すことが確認された。これらのことから、低分子非イオン性乳化剤は、ウイルスや菌などの微生物の生物活性に対して重大な影響を及ぼすのに対して、疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コール−ＡＥＣＭ−マンナン、コール−ＡＥＣＭ−プルラン、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体などの高分子乳化剤は、ウイルスや菌の生物活性に殆ど影響を与えないことが確認された。
【００３５】
［実施例１］母子免疫用、豚伝染性胃腸炎、豚流行性下痢、豚大腸菌下痢症、豚萎縮性鼻炎混合多価ワクチンの調製と効力検定
（１）豚伝染性胃腸炎、豚大腸菌下痢症２種混合生ワクチンの調製
▲１▼上記実験で用いたものと同じ弱毒豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）をハムスター肺由来ＨＡＬ細胞で培養してウイルス液を得た。
▲２▼上記実験で用いたものと同じ弱毒豚流行性下痢症ウイルス（ＰＥＤＶ）をミドリザル腎由来Ｖｅｒｏ細胞で培養して得られたウイルス液を限外ろ過で約10倍に濃縮したウイルス液を得た。
上記▲１▼、▲２▼のウイルス液を最終ワクチン中でＴＧＥＶ、ＰＥＤＶがそれぞれ約6.0log10TCID50／doseとなるように濃度調製して混合し混合し、凍結乾燥保護剤を加え、20mlバイアル瓶に20ml宛分注して凍結乾燥した。
【００３６】
（２）豚大腸菌下痢症、豚萎縮性鼻炎混合不活化Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイルワクチンの調製
１）毒素原性大腸菌（Ｋ８８及びＫ９９）のホルマリン不活化菌体の調製
Ｋ８８及びＫ９９保有毒素原性大腸菌（いずれも野外の感染豚より分離された株、株式会社微生物化学研究所）をそれぞれ37℃、７時間攪拌タンク培養後、培養液に最終濃度0.2v/v％になるようにホルマリンを加え、37℃で48時間処理して両株の不活化菌液を得た。
２）ボルデッテラ・ブロンキセプチカ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原の調製
ボルデッテラ・ブロンキセプチカＩ相菌（野外の感染豚より分離された株、株式会社微生物化学研究所）を37℃48時間通気攪拌タンク培養し、培養上清からソーナル遠心、ゲルろ過でＨＡ抗原を得た。
３）パスツレラ・マルトシダ壊死毒（ＰＭＴ）抗原の調製
パスツレラ・マルトシダ強毒菌（野外の感染豚より分離された株、株式会社微生物化学研究所）を37℃、48時間攪拌培養し、培養上清から限外ろ過でＰＭＴを採取し、ホルマリン0.3v/v％を加えて不活化毒素を調製した。
【００３７】
各抗原を遠心洗浄または限外ろ過で透析して余剰ホルマリンを除去し、最終ワクチン中において、大腸菌Ｋ８８およびＫ９９がそれぞれ5×107CFU/dose、ボルデッテラ・ブロンキセプチカが1000HA unit/dose、パスツレラ・マルトシダが1000DNT unit/doseになるように原液の各抗原量を調整し、この３容を、マンニトールオレイン酸エステル（親油性乳化剤）5w/v％、スクワラン20v/v％を添加した流動パラフィン７容と混合乳化して、Ｗ／Ｏ型の１次乳剤を調製した。次に、前記Ｗ／Ｏ型乳剤を高分子乳化剤である疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（三協化学製「サンジェロース９０Ｌ」；平均分子量約650,000）、コール−ＡＥＣＭ−マンナン（同仁化学製；平均分子量約200,000）の各0.2w/v％水溶液または0.02w/v％アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体（BF Goodrich社製；平均分子量約600,000）水溶液に滴下しながら高速ホモジナイザーで乳化し、さらに高圧ホモジナイザーで均質に乳化して３種類の安定なＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンを調製し20mlバイアル瓶に各々20ml宛分注した。
【００３８】
（３）最終ワクチンの調製と豚への接種
上記（１）記載の凍結乾燥生ウイルスワクチンに上記（２）記載の３種のオイルアジュバントワクチンをそれぞれ全量加えて溶解し、１検体宛３頭の妊娠豚に交配後１ヶ月および分娩予定日の１ヶ月前の２回、頸部筋肉内に２ml宛注射した。
【００３９】
（４）ワクチン接種豚の抗体測定
１）ワクチン接種豚のＴＧＥＶ、ＰＥＤＶに対する中和抗体価の測定。
社団法人動物用生物学的製剤協会（平成７年１０月発行）、動物用生物学的製剤基準および追加基準を準用し、上記ワクチン接種妊娠豚の分娩時の血清、初乳乳清、産子の生後７日後の血清をサンプルとして96穴のプラスチックプレートを用いて測定した。
２）ワクチン接種豚のＫ８８、Ｋ９９に対する抗体測定（ＥＬＩＳＡ抗体価の測定）
社団法人動物用生物学的製剤協会（平成７年１０月発行）、動物用生物学的製剤基準に記載の豚大腸菌性下痢症（Ｋ８８保有全菌体・Ｋ９９保有全菌体）不活化ワクチンの力価試験法を準用し、上記ワクチン接種妊娠豚の分娩時の血清、産子の生後７日目の血清を検体としてＥＬＩＳＡ抗体価を測定した。
３）ワクチン接種豚のボルデッテラ・ブロンキセプチカに対する抗体測定（ＨＩ抗体価の測定）
社団法人動物用生物学的製剤協会（平成７年１０月発行）、動物用生物学的製剤基準に記載のボルデッテラ感染症精製不活化ワクチンの力価試験法を準用し、上記ワクチン接種妊娠豚の分娩時の血清と初乳乳清、産子の生後７日目の血清を検体として抗体価を測定した。
４）ワクチン接種豚のパスツレラ・マルトシダトキソイドに対する抗体測定（ＰＭＴ中和抗体価の測定）
上記ワクチン妊娠豚の分娩時の血清と初乳乳清、産子の生後７日目の血清をそれぞれ２倍段階希釈し、これにＰＭＴ（パスツレラ・マルトシダトキシン）（5MLD/0.1ml）を等量混合し、３７℃で１時間感作した。次に、この混合物０．１ｍｌを５週齢のBALB/cマウスの脚部筋肉内に注射して７日間観察した。マウスが毒素に耐過生存した血清の希釈倍率をＰＭＴ中和抗体価とした。
【００４０】
高分子乳化剤として0.2％疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用したＷ／Ｏ／Ｗ型多価オイルアジュバントワクチン接種豚の血清・初乳および７日齢産子の血清抗体価を表６〜１１に、高分子乳化剤として0.2％コール−ＡＥＣＭ−マンナンを使用したＷ／Ｏ／Ｗ型多価オイルアジュバントワクチン接種豚の血清・初乳および７日齢産子の血清抗体価を表１２〜１７に、高分子乳化剤として0.02％アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体を使用したＷ／Ｏ／Ｗ型多価オイルアジュバントワクチン接種豚の血清・初乳および７日齢産子の血清抗体価を表１８〜２３に示す。
【００４１】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
表６〜２３に示したように、高分子乳化剤を用いて調製したＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンを接種された母豚は、豚伝染性胃腸炎、豚流行性下痢、豚大腸菌下痢症、豚萎縮性鼻炎から産子を防御するに十分な抗体を産生することが確認された。また、社団法人動物用生物学的製剤協会（平成７年１０月発行）、動物用生物学的製剤基準に記載の各種ワクチンの力価検定法を準用した試験を実施したところ、全ての項目において合格することが確認され、有効性が確認された。
【００６０】
（５）安全性に関する試験結果
本ワクチン接種後、30分、６時間、12時間、24時間、48時間、72時間の母豚の体温測定を実施するとともに、最終注射後２ヶ月で解剖し、ワクチン接種部位の局所反応について観察した。その結果、全ての高分子乳化剤を用いて２次乳化したワクチンを注射した豚では注射当日には一過性の軽い発熱をみたが、翌日には回復した。
注射局所の剖検では疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いた豚のNo.926、929、932は接種反応を認めなかったが、No.928においては、注射局所に２〜４ｍｍ程度の肉芽腫性反応を数個認めた。コール−ＡＥＣＭ−マンナンを用いた豚で、No.911と912で直径２mm前後のオイルグラニュローマが確認されたが、他の豚では接種反応は認められなかった。アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体はNo.916、918で３×４mmのオイルグラニュローマがそれぞれ２箇所確認されたが他の豚では反応を認めなかった。これらの所見は、通常のＷ／０型ワクチンが注射部位周辺に直径数センチに渡る広範囲にオイルグラニュローマを形成する強い炎症反応を示すのと比較して、本発明の高分子乳化剤を用いたＷ／Ｏ／Ｗワクチンでは注射局所に限局してオイルグラニュローマが形成される反応が認められたのみで、本Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの安全性が確認された。
【００６１】
以上の結果から、高分子乳化剤によって乳剤を形成して生と不活化の抗原を同一製剤中に含む本発明のＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの有効性が確認された。
【００６２】
［実施例２］肥育豚用豚アクチノバチルス１、２、５型、豚丹毒、豚繁殖・呼吸障害症候群混合多価ワクチンの調製と検定
（１）豚丹毒、豚繁殖・呼吸障害症候群混合生ワクチンの調製
▲１▼弱毒豚丹毒菌小金井株（独立行政法人農業技術研究機構動物衛生研究所より分与されたもの）を37℃で24時間培養した菌液を採取した。
▲２▼弱毒豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳＶ）ウイルス（野外の感染豚より分離して低温継代で弱毒化した株；株式会社微生物化学研究所）をＭＡＲＣ細胞で増殖させ、限外ろ過で10倍に濃縮したウイルス液を調製した。
上記▲１▼および▲２▼の菌液およびウイルス液に凍結乾燥保護剤を加えて、豚丹毒、豚繁殖・呼吸障害症候群混合生ワクチンを調製した。
（２）豚アクチノバチルス３価Ｏ／Ｗ型オイルワクチンの調製
１）豚アクチノバチルス１、２、５型菌培養上清由来抗原の調製
アクチノバチルス１型Ｙ−１株菌、２型Ｇ−５株菌および５型Ｅ−３株菌（いずれも、野外の感染豚より分離した強毒株；株式会社微生物化学研究所）を37℃、12時間攪拌タンク培養した菌液より遠心分離で培養上清を採取し、限外ろ過で抗原を濃縮して上記１、２、５型のワクチン抗原を得た。各抗原画分に最終濃度0.3v/v％になるようにホルマリンを加え37℃で２日間処理して蛋白を固定化して３種の抗原を調製した。
２）Ｏ／Ｗ型不活化オイルワクチンの調製
各抗原中の余剰ホルマリンを限外ろ過で除去し、適当な抗原濃度に調整したのち疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（三協化学製「サンジェロース９０Ｌ」；平均分子量約650,000）を終濃度0.2w/v％になるように加え、その７．５容にマンニトールオレイン酸エステル（親油性乳化剤）２w/v％添加スクワラン2.5容を滴下しながら高速ホモジナイザーで混合乳化し、さらに高圧ホモジナイザーにかけて均質化して豚アクチノバチルス３価Ｏ／Ｗ型オイルワクチンを調整し、20mlバイアル瓶に各々20ml宛分注した。
（３）ワクチン接種
上記（１）記載の生ワクチンに上記（２）記載のＯ／Ｗ型不活化ワクチンを全量加えて溶解し、その２mlを１ヶ月齢肥育豚の耳根部筋肉内に注射し、さらに１ヶ月後に同じく２mlを注射して免疫し、２回目注射の３週間後に採血して血清抗体価を測定した。
【００６３】
（４）抗体価の測定方法
１）豚アクチノバチルス１、２、５型に対するＥＬＩＳＡ抗体価の測定
1. 各血清型ＥＬＩＳＡ抗原を炭酸緩衝液で所定の倍率に希釈し、ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに100μｌずつ分注する。
2. ４℃、一晩感作させる。
3. プレートをTween20加PBS（T-PBS）で洗浄する（３回）。
4. 0.5％牛血清アルブミン溶液を各ウェルに200μｌずつ分注する。
5. 37℃、１時間感作させる。
6. プレートをT-PBSで洗浄する（３回）。
7. T-PBSで100倍より２倍段階希釈した血清を各ウェルに100μｌずつ分注する。
8. 37℃、１時間感作させる。
9. プレートをT-PBSで洗浄する（３回）。
10. T-PBSで所定の倍率に希釈したPOD標識抗豚IgGを各ウェルに100μｌずつ分注する。
11. 37℃、１時間感作させる。
12. プレートをT-PBSで洗浄する（５回）。
13. 過酸化水素加0.04％オルトフェニレンジアミン溶液を各ウェルに100μｌずつ分注する。
14. 遮光して30℃、30分間反応させる。
15. １Ｍ硫酸溶液を各ウェルに50μｌずつ分注する。
16. 波長490nmと630nmの二波長で吸光度を測定し、その差をＥＬＩＳＡ価とする。
17. ＥＬＩＳＡ価が0.5を示す最高希釈倍率を抗体価とする。
【００６４】
２）豚丹毒菌に対する生菌発育凝集抗体価の測定
図１〜２に示す方法により生菌発育凝集抗体価を測定した。
判定は、管底に膜状の沈降物を生じるものを生菌凝集反応「＋」、管底中央に円形の菌塊のみを生ずるものを生菌凝集反応「−」とした。「＋」以上の生菌凝集反応を生ずる被検血清の最高希釈倍率の逆数を丹毒生菌凝集抗体価とした。
【００６５】
３）ＰＲＲＳウイルスに対する間接蛍光抗体（ＩＦＡ）価の測定
４穴チャンバースライドにミドリ猿由来ＭＡＲＣ細胞を単層培養し、ＰＲＲＳウイルスｃｈｉｂａ−９２株（独立行政法人農業技術研究機構動物衛生研究所より分与されたもの）を感染させた後、２日目にウイルス感染細胞をアセトン固定し、２倍段階希釈した被検血清を37℃１時間感作し、リン酸緩衝整理食塩水（PBS）で３回洗浄後、染色力価４単位に調整したＦＩＴＣ標識抗豚ＩｇＣウサギ血清を37℃１時間感作し、同様に洗浄後、無蛍光グリセリンＰＢＳを用いてカバーグラスで封入し、ＮＩＫＯＮ落射型蛍光顕微鏡（日本光学製）でＰＲＲＳウイルスに対する蛍光を観察した。一次血清の最高希釈倍数の逆数をＩＦＡ価とした。
【００６６】
以上の疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて調製した肥育豚用豚アクチノバチルス１、２、５型、豚丹毒、豚繁殖・呼吸障害症候群混合多価Ｏ／Ｗ型オイルアジュバンントワクチンの血清抗体化の測定結果を表２４〜２８に示す。なお、表中、Ａｐｐ−１は豚アクチノバチスル１型、Ａｐｐ−２は豚アクチノバチスル２型、Ａｐｐ−５は豚アクチノバチスル５型、ＰＲＲＳＶは豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスを表す。
【００６７】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
表２４〜２８に示すように、本発明のＯ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの各抗原に対する抗体価は、これら感染症から肥育豚を十分防御するに足る抗体価を示し、その有効性が確認された。また本発明のＯ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンを接種された供試豚は発熱も一過性で、剖検に於いても接種部位に全く変化は認められなかった。
【００７３】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、可溶化作用のある親水性界面活性剤を含まず、高分子乳化剤を用いることで、不活化および生の多種の抗原を同一製剤中に含有させることができ、省力的かつ安全なＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型の動物用多価オイルアジュバントワクチンを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 豚丹毒菌に対する生菌凝集抗体価の測定方法。
【図２】 豚丹毒菌に対する生菌凝集抗体価の測定方法。
Claims (12)
- 不活化抗原と弱毒化した生ウイルスまたは生菌とを含有し、多糖エステルまたはアミド、カルボキシビニルポリマーおよびアクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体からなる群から選択される少なくとも１種の高分子乳化剤を用いて乳化して調製されてなるＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型の動物用多価オイルアジュバントワクチンであって、
前記高分子乳化剤を用いて乳化して調製されたＯ／Ｗ型乳剤の水相中に不活化抗原が含有されたＯ／Ｗ型不活化ワクチンまたは前記高分子乳化剤を用いて２次乳化して調製されたＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤の内水相中および／または外水相中に不活化抗原が含有されたＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンと、別に凍結乾燥された生ウイルスもしくは生菌または前記生ウイルスもしくは生菌を凍結乾燥した生ワクチンとを混合してなることを特徴とするＯ／Ｗ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型の動物用多価オイルアジュバントワクチン。 - 多糖エステルまたはアミドが、セルロース脂肪酸エステルである請求項１に記載の動物用多価オイルアジュバントワクチン。
- 多糖エステルまたはアミドが、マンナンコレステロールエステルまたはプルランコレステロールエステルである請求項１に記載の動物用多価オイルアジュバントワクチン。
- 生ウイルスが、エンベロープを有するウイルスである請求項１〜３のいずれかに記載の動物用多価オイルアジュバントワクチン。
- エンベロープを有するウイルスが、コロナウイルス科に属するウイルスである請求項４に記載の動物用多価オイルアジュバントワクチン。
- コロナウイルス科に属するウイルスが、豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）および／または豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である請求項５に記載の動物用多価オイルアジュバントワクチン。
- エンベロープを有するウイルスがアルテリウイルス科に属するウイルスである請求項４に記載の動物用多価オイルアジュバントワクチン。
- アルテリウイルス科に属するウイルスが、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）である請求項７に記載の動物用多価オイルアジュバントワクチン。
- 生菌が、豚丹毒菌である請求項１〜３のいずれかに記載の動物用多価オイルアジュバントワクチン。
- 不活化抗原が、毒素原性大腸菌、ボルデッテラ・ブロンキセプチカ、パスツレラ・マルトシダからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１〜３のいずれかに記載の動物用多価オイルアジュバントワクチン。
- 多糖エステルまたはアミド、カルボキシビニルポリマーおよびアクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体からなる群から選択される少なくとも１種の高分子乳化剤を用いて乳化して調製されたＯ／Ｗ型乳剤の水相中に不活化抗原が含有されたＯ／Ｗ型不活化ワクチンに、生ウイルスまたは生菌を凍結乾燥した生ワクチンを添加して溶解し、これを動物（ただし、ヒトを除く）に接種することにより動物を免疫する方法。
- 多糖エステルまたはアミド、カルボキシビニルポリマーおよびアクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体からなる群から選択される少なくとも１種の高分子乳化剤を用いて２次乳化して調製されたＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤の内水相中および／または外水相中に不活化抗原が含有されたＷ／Ｏ／Ｗ型不活化ワクチンに、生ウイルスまたは生菌を凍結乾燥した生ワクチンを添加して溶解し、これを動物（ただし、ヒトを除く）に接種することにより動物を免疫する方法。
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