JP2776982B2

JP2776982B2 - パスツレラ・ヘモリティカ・タイプａ−１・バクテリン−トキソイドワクチン

Info

Publication number: JP2776982B2
Application number: JP5517608A
Authority: JP
Inventors: ブラウン，アルバート・エル; ダヤル，クリシュナスウォーミー・イエンガー; カウフマン，トーマス・ジェームズ; ニューシャム，レックス・スティーブン
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1992-03-30
Filing date: 1993-03-30
Publication date: 1998-07-16
Anticipated expiration: 2013-07-16
Also published as: WO1993019779A1; BR9306187A; EP0636030A1; MX9301736A; JPH07505629A; ES2211866T3; CA2133108C; EP0636030B1; CA2133108A1; AU707841B2; EP0636030A4; DK0636030T3; DE69333402T2; DE69333402D1; AU6435596A; ATE258445T1; AU3970093A; PT636030E

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella
haemolytica）のワクチンの分野に関する。より詳細に
は、本発明は、パスツレラ・ヘモリティカ由来のロイコ
トキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原および不活性化細胞
からなり、パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１感
染に対して１回の接種でウシの免疫性を誘導することの
できるバクテリン−トキソイドワクチン、該ワクチンの
製造方法およびウシ科動物に対する接種方法に関する。

関連出願に対する相互参照本願は、1992年３月30日出願の米国特許出願第07/86
0,377号の一部継続出願である1992年４月16日出願の米
国特許出願第07/869,934号の一部継続出願である1992年
５月４日出願の米国特許出願第07/878,146号の一部継続
出願である。

発明の背景ウシの病気全体の約40ないし80％が呼吸器系のもので
ある（リリー，エル・イー（Lillie LE）：「ザ・ボバ
イン・レスピラトリー・ディジーズ・コンプレックス
（The bovine respiratory disease complex）」，カナ
ディアン・ベタ・ジャーナル（Can.Vet.J.）第15巻:233
〜242頁,1974年）。ウシの呼吸器疾患症候群（BRDC）は
米国の蓄牛産業における大きな問題である。BRDCはいく
つかの臨床的症候群からなり、その最もありふれた２つ
の症候群は、フィードロットのウシの輸送熱および乳牛
に通常見られる家畜地方病性ウシ・肺炎である。多くの
ウイルス、ストレスの多い経営の実情、および環境因子
が輸送熱の発生において重要であることが現在認識され
ている。ピー・ヘモリティカの生物型Ａ、血清型１（タ
イプＡ−１）は、急性の繊維素性肺葉ウシ肺炎を起こ
し、ついで、死に至らしめる臨床的疾患および病理学的
要因の原因となる主要な細菌性病因である（イェイツ，
ダブリューディージー（Yates WDG）：「ア・レビュー
・オブ・インフェクシャス・ボバイン・リノトラケイテ
ィス，シッピング・フィーバー・ニューモニア・アンド
・ウイラルーバクテリアル・シエルジスム・イン・レス
ピラトリー・ディジーズ・オブ・キャトル（A review o
f infectious bovine rhinotracheitis,shipping fever
pneumonia and viral−bacterial synergism in respi
ratory disease of cattle）カナディアン・ジャーナル
・オブ・コンパラティブ・メディシン（Can.J.Comp.Me
d）第46巻:225〜263頁,1982年）。

カナダのサスカチェワン（Saskatchwan）での２年間
の研究において、ピー・ヘモリティカ・タイプＡ−１
が、輸送熱で死んだウシの74％から単離された（シーフ
ァー，ビー（Schiefer B）、ワード，ジーイー（Ward G
E）、モファット，アールイー（Moffat RE）：「コレレ
ーション・オブ・マイクロバイオロジカル・アンド・ヒ
ストロジカル・ファインディングス・イン・ボバイン・
フィブリナス・ニューモニア（Correlation of microbi
ological and histological findings in bovine fibri
nous pneumonia）」ベタナリー・パソロジー（Vet.Path
ol.）第15巻:313〜321頁,1978年）、サウス・ダコタ（S
outh Dakota）州立大学の獣医科学科の年報（サウス・
ダコタ・ステイト・ユニバーシティー，デパートメント
・オブ・ベタナリー・サイエンス，アニマル・ディジー
ズ・リサーチ・アンド・ダイアグノスティック・ラボラ
トリー：マニュアル・プログレス・リポーツ1987〜1991
（South Dakota State University,Departoment of Vet
erinary Science,Animal Disease Research and Diagno
stic Laboratory:Annual Progiress Reports1987〜199
1）,NC107テクニカル・コミッティー・オン・ボバイン
・レスピラトリー・ディジーズ（NC107 Technical Comm
ittee on Bovine Respiratory Disease）に提出され
た）によれば、肺炎にかかったウシの肺の48.7％からピ
ー・ヘモリティカ・タイプＡ−１が単離されたことが明
らかである。よって、該菌が、ウシの肺炎の原因となる
主要な細菌であろう。

ピー・ヘモリティカ血清型Ａ−１は、輸送熱に見られ
る繊維素懐死肺葉ウシ肺炎および家畜地方病性ウシ肺炎
に関連した化膿性気管支肺炎の病因である。興味深いこ
とに、他のピー・ヘモリティカ血清型（しばしばST2お
よびST4、そしてときどきST7およびST11）は、臨床的に
正常なフィードロットのウシの鼻腔または上部気道（UR
T）の多くの部分に存在する無害の菌である（フラン
ク，ジーエイチ（Frank GH）：「ホェン・パスツレラ・
ヘモリティカ・コロナイジズ・ザ・ネイサル・パッセー
ジズ・オブ・キャトル」（When Pasteurella haemolyti
ca colonizes the nasal passages of cattle），ベタ
・メディ（Vet.Med.）第83巻:1060〜1064頁,1988年およ
びウィルキー，ビーエヌ（Wilkie BN），シェウェン，
ピーイー（Shewen PE）：「ディファイニング・ザ・ロ
ール・ザット・パスツレラ・ヘモリティカ・プレイズ・
イン・シッピング・フィーバー（Definig the role tha
t Pasteurella haemolytica plays in shipping feve
r）」ベタ・メディ，第83巻:1053〜1058頁,1988年）。
臨床的に正常な乳牛においては、ピー・ムルトシダ（P.
multocida）がURTフローラにおいて優勢であるかもしれ
ない。URTフローラ中に種々の血清型のピー・ヘモリテ
ィカも見ることができる。対照的に、ピー・ヘモリティ
カ・タイプＡ−１は、フィードロットの牛および乳牛の
URTにおいてわずかに見いだされる（フランク，ジーエ
イチ：上記（1988年）およびウィルキー，ビーエヌ、シ
ェウェン，ピーイー：上記（1988年））。

ウイルス感染、販売、輸送、フィードロットでの管
理、および気候の急激な変化のごときストレス因子にウ
シをさらすことにより、URTのすべての部分においてピ
ー・ヘモリティカ・タイプＡ−１の爆発的な増殖とコロ
ニー形成が起こる（フランク，ジーエイチ：上記（1988
年）およびウィルキー，ビーエヌ、シェウェン，ピーイ
ー：上記（1988年））。他の血清型のピー・ヘモリティ
カにはこのタイプの増殖を示すものはない。輸送熱肺炎
においては、ピー・ヘモリティカ・タイプＡ−１による
URTでのコロニー形成は、臨床的疾患そして同様に続い
て起こる繊維素懐死肺葉ウシ肺炎の進行にとり不可欠で
ある。

肺炎の病因において潜在的に重要であるにもかかわら
ず、URTにおいてピー・ヘモリティカ・タイプＡ−１の
爆発的な増殖を容易ならしめるコロニーの形成の機構は
ほとんど理解されていない、それにもかかわらず、これ
らの生物が、液滴核、コロニー形成した剥離性上皮細胞
あるいは咽頭分泌物の吸引により肺に侵入することが明
らかである。ミネソタ（Minnesota）大学において（ホ
ワイトリー，エルオー（Whiteley LO）ら：「パスツレ
ラ・ヘモリティカ・アンド・ボバイン・レスピラトリー
・ディジーズ：カレント・ソーツ・オン・イッツ・パソ
ジェネシス（Pasteurella haemolytica and bovine res
piratory disease:Current thougts on its pathogenes
is）」，ベタ．インター・メディ（Vet.Int.Med.）第６
巻:1〜12頁,1992年）、肺胞空間へ侵入する急速に増殖
する細菌の大多数が肺胞マクロファージと相互作用する
のが見いだされた。該細菌から放出されるエンドトキシ
ンは肺胞壁を越えて肺血管内マクロファージ、内皮、好
中球、血小板、補体およびハーゲマン（Hageman）因子
を活性化し、細胞と炎症媒体との複雑な相互作用を誘導
する。好中球の流入によるこの炎症応答の進行は、当該
疾患に関連した急激な肺の損傷の原因である。ピー・ヘ
モリティカに対する主要な激毒性因子であるロイコトキ
シンは、食細胞を破壊し、肺のクリアランス機構にも同
様に損傷を与えることにより核細菌が生き延びるのを可
能にするかもしれない。

過去において、ピー・ヘモリティカ・死バクテリンを
用いることにより肺のパスツレラ症の予防が試みられて
きた。しかしながら、バクテリンの接種により、菌の攻
撃にさらされた後の繊維素性肺炎の進行が促進されうる
ことが示された（スタンフォード，エス・イー（Stanfo
rd S.E.），「サム・レスピラトリー・アンド・エンテ
リック・ディジージズ・オブ・キャトル；アン・アップ
デイト（Some Respiratory and Enteric Diseases of C
attle,An Update），モダン・ベタリナリー・プラステ
ィス（Mod.Vet.Prac.t）第65巻（４）:265〜268頁（198
4年））。生ワクチンでの免疫比は、一般的にうまく行
かない。なぜらならば、ピー・ヘモリティカの低抗原性
および健康な動物による急速な不活性化のためである
（ヘンリー，シー・ダブリュー（Henry,C.W.）「シッピ
ング・フィーバー・ニューモニア：ア・ニュー・ルック
・アット・アン・オールド・エミナー（Shipping fever
pneumonia:a new look at an old enemy）」ベタリナ
リー・メディシン（Veterinary Medicine）,1200〜1206
頁,1984年秋）。

より最近になって、パスツレラ・ヘモリティカのワク
チンを開発する試みが、ピー・ヘモリティカのロイコト
キシンに焦点を当てるようになった。ピー・ヘモリティ
カとウシ・好中球との相互作用を調べるための研究にお
いて、標準的な組織培養の培地で増殖したピー・ヘモリ
ティカの対数増殖期の間に最適な細胞毒の産生がなされ
るとことが、その結果により示された（バルユト・シー
・エス（Baluyut,CS.）から「インターラクション・オ
ブ・パスツレラ・ヘモリティカ・ウィズ・ボバイン・ニ
ュトロフェルズ・アイデンティフィケイション・アンド
・パーシャル・キャラクタリゼイション・オブ・ア・サ
イトトキシン（Interaction of Pasteurella haemolyti
ca with Bovine Neutrophils:Identification and Part
ial Charactrization of a Cytotoxin）」アメリカン・
ジャーナル・オブ・ベタリナリー・リサーチ（Am.J.Ve
t.Res.）第42巻第11号,1920〜1926頁（1082年）。その
著者らは、「……なぜならこの毒素が食細胞に影響する
からであり、それは劇毒素因子と考えられる。」と結論
した（1925頁）。

米国特許第4,957,739号には、ロイコトキシン成分の
ごとき精製ピー・ヘモリティカ抗原を含有するワクチン
が挟持されている。該特許において、抗原は、無細胞上
清から精製されるかまたは組換えDNAにより得られる。W
O91/15237にはピー・ヘモリティカの繊毛蛋白、ポラス
ミン受容体蛋白、50K外蛋白およびロイコトキサンから
なる群かや選択され少なくとも１種のポリペプチドを含
有するワクチンが組成物が開示されている。米国特許5,
055,400号には、ワクチン製造に使用される組換え蛋白
の製造に用いるピン−ヘモリティカＡ−１のロイコトキ
シンをコードしているDMAが開示されている。米国特許
第5,055,400号はピー・ヘモリティカ由来の細胞毒上清
の防御能力に言及し、1986年１月27日出願の米国特許出
願第821,197号（現在米国特許第5,165,924号）をかかる
ワクチンの例として引用している。

細菌を含まないピー・ヘモリティカ・タイプＡ−１由
来の細胞毒性培養上清をウシに接種することにより、実
験的な菌の攻撃に対する抵抗性が誘導された（「プロシ
ーディングス・オブ・ザ・ノース・アメリカン・シンポ
ジウム・オン・ボバイン・レスピラトリー・ディジーズ
（Proceedings of the North American Symposium on B
ovine Resperatory Disease）」（アール・ダブリュー
・ローン（R.W.Loan）編）テキサス・エイ・アンド・エ
ム・ユニバーシティー・プレス，カレッジ・ステイショ
ン（Texas A＆M University Press,College Station）,
Tex.pp.480〜481（1984年）中、シェウェン，ピー・イ
ー（Shewen,P.E.）ら，「イミュニティー・トゥ・パス
ツレラ・ヘモリティカ・セロタイプ１（Immunity to Pa
steurella haemolytica Serotype 1）」）。ロイコトキ
サンおよび血清型特異的表面抗原を含有する無細胞ワク
チン（プレポンス（Preponse）^Ｒ・パスツレラ・ヘモリ
ティカ・トキソイド：ニュージャージー州ウェイン（Wa
yne）のアメリカン・シアナミド・カンパニー（America
n Cyanamid Co.）社製）は、生ピー・ヘモリティカを２
回接種され、ついで、気管内に対し該菌の攻撃を受けた
ウシの肺炎の予防に効果的であったことが示された（ベ
クトル，ディー・ティー（Bechtol,D.T.）ら，「フィー
ルド・トライアル・オブ・ア・パスツレラ・ヘモリティ
カ・トキソイド・アドミニスタード・アット・スプリン
グ・ブランディング・アンド・イン・ザ・フィードロッ
ト（Field Trial of a Pasteurella haemolytica Toxoi
d Administered at Spring Branding and in the Feedl
ot」，アグリープラクティス（Agri−Practice），第12
巻第２号,6〜14頁（1991年３月/4月））。

当該技術分野においては、例えば、１回の接種で活性
のある免疫性を付与し、それにより費用のかかる繰り返
し接種の必要性を減じ、かつ皮下注射または筋肉内注射
により投与されるという便利さを持つ改良されたパスツ
レラ・ヘモリティカのワクチンが必要とされている。

発明の概要本発明により、治療上有効量のパスツレラ・ヘモリテ
ィカ・タイプＡ−１・ロイコトキソイド、莢膜抗原、可
溶性抗原および不活性化細胞からなり、１回の接種でウ
シ種におけるパスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１
に対する免疫性を誘導することのできる新規バクテリン
−トキソイドワクチンが提供される。

さらに本発明により、治療上有効量のパスツレラ・ヘ
モリティカ・タイプＡ−１・ロイコトキソイド、莢膜抗
原、可溶性抗原および不活性化細胞からなり、１回の接
種でウシ種におけるパスツレラ・ヘモリティカ・タイプ
Ａ−１に対する免疫性を誘導することのできるバクテリ
ン−トキソイドワクチンの新規製造方法であって、パス
ツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１を後期対数増殖期
に至るに十分な時間培養し；ピー・ヘモリティカ培養物
を不活性化し；ロイコトキソイド、莢膜抗原、可溶性抗
原および不活性化ピー・ヘモリティカ細胞からなる培養
液を得ることからなる製造方法が提供される。本発明に
より、該方法により製造されたワクチンも提供される。

さらに本発明により、ウシ科動物に本発明バクテリン
−トキソイドワクチンを投与することからなる、ウシ科
動物の新規予防接種法が提供される。

さらに、本発明により、ATCC55318株すべての性質を
有するパスツレラ・ヘモリティカの新規生物学的純粋培
養が提供される。

発明の詳細な説明本明細書で用いる「ロイコトキシン」なる語は、文献
の教示のごとく、活発に増殖しているパスツレラ・ヘモ
リティカにより産生される可溶性毒素をいう。例えば、
米国特許第5,055,400号、カナダ特許出願第91000097号
およびジェントリー（Gentry）ら，「ニュートラライジ
ング・モノクローナル・アンタイボディーズ・トゥ・ピ
ー・ヘモリティカ・ロイコトキシン・アフィニティー−
ピューリファイ・トキシン・フロム・クルード・カルチ
ャー・スーパーネイタンツ（Neutralizing monoclonal
antibodies to P.haemolytica leucotoxin affinity−p
urify the toxin from crude culture supernatant
s）」マイクロバイアル・パソジェネシス（Microbial P
athogenesis）第10巻:411〜417頁（1991年）参照。これ
らの開示を出典明示により本明細書に一体化させる。
「ロイコトキサイド」は、不活性化ロイコトキシンをい
う。他の文献においては、ロイコトキシンをエキソトキ
シンまたは細胞毒ともいう。

「莢膜抗原」は、本明細書においては、文献記載のご
とく、ピー・ヘモリティカ由来の可溶性莢膜多糖を意味
する。例えば、インザナ，ティー・ジェー（Inzana,T.J
t.）「カブセルズ・アンド・ビルレンス・イン・ザ・エ
イチエイピー・グループ・オブ・バクテリア（Capsules
and Virulence in the HAP Group of Bacteria）」，
カナディアン・ジャーナル・オブ・ベタ・リサーチ（Ca
n.J.of Vet.Research）第54巻:S22〜S27（1990年）；お
よびアドラム（Adlam）ら，「ピューリフィケーショ
ン，キャラクタライゼーション・アンド・イミュノロジ
カル・プロパティーズ・オブ・ザ・セロタイプ−スペシ
フィック・カプスラー・ポリサッカライド・オブ・パス
ツレラ・ヘモリティカ（セロタイプA1）・オーガニスム
ス（Purufucation,characterization and immunologica
l properties of the serotype−specific capsular po
lysaccharide of Pasteurella haemolytica（serotypeA
l）organisms）」ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイ
クロバイオロジー（J.Gen.Microbiol.）第130巻:2415〜
2426頁（1984年）参照。これらの開示を出典明示により
本明細書に一体化させる。

本明細書における「可溶性抗原」なる語は、ロイコト
キシンおよび莢膜抗原以外のピー・ヘモリティカの増殖
中に分泌されるグリコプロテアーゼおよびノイラミニダ
ーゼのごとき可溶性抗原を意味する。例えば、レジー
（Regie）ら，「モレキュラー・スタディーズ・オブ・S
sa1,ア・セロタイプ−スペシフィック・アンティジェン
・オブ・パレツレラ・ヘモリティカA1（Molecular Stud
ies of Ssa1,a Serotype−Specific Antigen of Pasteu
rella haemolytica A1）」インフェクション・アンド・
イミュニティー（Infection and Immunity）第59巻第10
号:3398〜3406頁（1991年）参照。

本発明は、１の態様において、治療上有効量のパスツ
レラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１・ロイコトキソイ
ド、莢膜抗原、可溶性抗原および不活性化細胞からな
り、１回の接種でウシ種におけるパスツレラ・ヘモリテ
ィカ・タイプＡ−１に対する免疫性を誘導することので
きるパスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１・バクテ
リン−トキソイドワクチンを提供する。本発明における
使用に適するパスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１
は、弱毒化しないすべてのタイプＡ−１であると考えら
れる。現在のところ、好ましい株はATCC55318である。

一般的には、本発明ワクチンを、パスツレラ・ヘモリ
ティカ・タイプＡ−１が最適にロイコトキシン産生する
ように増殖させることにより製造することができる。好
ましくは、蛋白を増強した細胞培養培地で培養し、対数
増殖期の間に培養液を得る。

本発明ワクチンを製造するための好ましい方法の１つ
は、治療上有効量のパスツレラ・ヘモリティカ・タイプ
Ａ−１・ロイコトキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原およ
び不活性化細胞からなり、１回の接種でウシ種における
パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１に対する免疫
性を誘導することのできるバクテリン−トキソイドワク
チンの新規製造方法である。該方法は、パスツレラ・ヘ
モリティカ・タイプＡ−１を後期対数増殖期に至るに十
分な時間培養することを特徴とする。

本発明に用いるのに適した標準的な培地は、蛋白を増
強した細胞培養用培地であり、当業者によって選択され
る。一般的には、３％熱不活性化子ウシ・血清、１％ト
リプトースおよび0.1％ツイン（Tween）80（ミズーリ州
セントルイスのシグマ（Sigma）社のポリソルベート）
または同等物を補足したRPMI−1640が一例として挙げら
れる。グルコースのごとき炭水化物を培地に添加するこ
とにより増殖を促進することができる。

細菌を、種菌接種から後期対数期に至るまで増殖させ
る。最適なロイコトキシン生産には、後期対数期が好ま
しい、一般的には、培地に種菌接種後2.5ないし６時間
かかり、当該分野で知られているように、時間に対する
吸光度の関係により正確に調べることができる。

増殖が後期対数期にある間に、不活性化剤を培養液に
添加する。好ましくは、不活性化剤はホルマリン（米国
薬局方ホルムアルデヒド溶液）のごとき固定作用のある
ものであり、通常は、約0.1ないし約0.5％（v/v）とい
った相対的に低い濃度で使用する。

ついで、ロイコトキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原お
よび不活性化パスツレラ・ヘモリティカ細胞からなる培
養液を、遠心分離のごとき当該分野で知られた標準的な
方法により得る、上清が無細胞でないことが重要であ
り、よって、すべての細胞を除去する濾過のごとき集菌
方法は本発明の範囲内ではない。細胞を遠心分離して濃
密な水性懸濁液にすることにより、細胞の大部分は除去
される。好ましくは、遠心分離を約10,000xgで行う。培
養物から細胞の大部分を除去するための方法および条件
は当業者に知られている。

本発明方法における不活性化と集菌の順序は厳密では
ないと考えられる。現在のところ、集菌の前に不活性化
を行うのが好ましい。

上清を集め、不活性化の前に測定した上清mlあたり10
³ないし10⁸個の細胞が含まれている、細胞数を測定する
のは困難で、実質的にバッチごとに細胞数は変化する。
本発明ワクチンにより付与される免疫性を提供するのを
助ける細胞がワクチン中に存在することの必要性によ
り、細胞数の下限が決定される。上限は、接種した動物
に起こり得る過剰反応を回避するように決定される。不
活性化前の上清中、10⁶までのレベルが示された。

本発明方法により得られ、本発明ワクチンに使用され
る上清は、ロイコトキソイドに富む標品であり、莢膜抗
原、可溶性抗原および不活性化パスツレラ・ヘモリティ
カ・タイプＡ−１細胞ならびに細胞残渣からもなる。

記載した本発明ワクチンは、希釈あるいは濃縮されて
もよい培養上清である。

さらに他の好ましい本発明ワクチン組成物は、本発明
ワクチンと他のワクチン剤（特にBRDCの原因となる抗
原）とを混合することにより得られる。その例として
は、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella mulltocid
e）、ヘモフィルス・ソムヌス（Haemophilus somnu
s）、クロストリジアル・スピーシズ（Clostrideal spe
cies）、ミコプラズマ・スピーシズ（Mycoplame specie
s）、ウシ・呼吸器合胞体ウイルス、ウシ・ウイルス性
下痢ウイルス、ウシ・パラインフルエンザ３型ウイルス
が挙げられる。

無毒化かつ滅菌された医薬上許容される担体中の活性
成分として治療上有効量の核上清を含有する医薬組成物
として本発明ワクチンを製造してもよい。本発明ワクチ
ンの好ましい具体例は、その中でワクチンが凍結乾燥さ
れた形態であり、使用直前に少なくとも１種のアジュバ
ントとともに復元されるものである。かかるワクチン
は、安定性が高く、遊離エンドキシンが減じられている
ために好ましい。そのことは、ワクチン接種後の全身的
反応を減少させる。かかるアジュバントとしては、特
に、米国特許第5,084,269号に教示されているように鉱
油およびレシチンエマルジョン［ヒドロニクス・インク
（Hydronics Inc.）のアムフィジェン（Amphige
n）^Ｒ］、あるいは他の分散油、水酸化アルミニウム、
ムラミルジペプチド、ならびにキルＡ（Quil A）のごと
きサポニンが挙げられる。米国特許第5,084,269号の開
示を、出典明示により本明細書に一体化させる。

本発明によれば、好ましくは、医薬調製物により、0.
5ないし3mlの間、より好ましくは約2mlの免疫原量の活
性成分および担体からなる単位用量が提供される。

本発明の目的のためには、治療上有効量ワクチンの
は、１回の接種でピー・ヘモリティカに対するウシ種の
免疫性を誘導する量である。より詳細には、この量は、
本発明により製造された種々のワクチン標品をウシで試
験し、ピー・ヘモリティカの攻撃を受けた場合、１回の
接種で満足すべき有意な数のウシの免疫性を誘導するワ
クチン標品を選択することにより容易に決定される。ワ
クチンにより誘導された免疫性を、実験的な殺菌の攻撃
に対する抵抗性により測定することができる。それは、
死亡率の減少または消失、臨床的兆候の消失または最小
限の臨床的兆候の出現、当業者に知られた特徴的な肺の
障害の減少または完全な消失により反映される。

望ましい投与規則は、本発明の好ましいワクチン組成
物が活性のある免疫性を付与する１回分の用量とする、
追加免疫は、引き続き細菌への暴露またはストレスの可
能性のある場合にはいつでも望ましいの考えられる。本
発明ワクチンの投与方式は、宿主にワクチンを送達する
いかなる好適な経路であってもよい。現在のところ、好
ましくは、ワクチンを皮下注射または筋肉注射により投
与する。

好ましい凍結乾燥ワクチンは、滅菌希釈剤を含んだア
ジュバントとともに無菌的に再水和されるものである、
離乳、輸送、あるいはストレスまたは感染しやすい条件
に置く前に健康なウシに投与する。

実施例により、以下に本発明ワクチンの好ましい製造
方法および種々のワクチンの製造方法ならびに試験方法
を説明する。これらの実施例は、単に説明的なものであ
って、本発明の範囲を限定するものではない。

本発明により具体化されるワクチンは、1992年５月18
日から米国において市販されており、ワン−ショット
（One−Shot）（ペンシルバニア州イクストン（Exton）
のスミスクライン・ビーチャム・アニマル・ヘルス（Sm
ithKline Beecham Animal Health）の登録商標）として
知られている。

本発明の実施に有用な菌株の寄託以下の菌株の生物学的に純粋な培養の寄託を、メリー
ランド州ロックビル（Rockville）のパークローン・ド
ライブ（Parklawn Drive）12301のアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（American Type Culture
Collection）に対して行った。示された受託番号は、生
育試験および必要な料金の支払い後に付与された。出願
の係属中は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションの長官により37CFR1.14および35USC122の下、資
格ありと決定された者については上記培養の利用が可能
であろう。出願に対し特許付与された場合にはすぐに上
記培養の公の利用に対するすべての制限が解除されるで
あろう（解除の取り消しはされない）。そのうえ、命名
された寄託菌株は、寄託日より30年間、または最後の寄
託要請後５年間、あるいは米国特許の存続期間のいずれ
か長い期間維持されるであろう。培養が死滅または不注
意にも破壊、あるいはプラスミド保持菌がそのプラスミ
ドを失った場合には、同一の分類上の種類のものと置き
換えるであろう。

実施例１ワクチン製剤ピー・ヘモリティカ（P.haemolytica）タイプＡ−１
（1992年４月９日寄託、ATCC受入れ番号55318）を、37
℃、ブレーンハートインフュージョン（BHI）寒天上で
一夜増殖させた。その後の継代を一組のエルレンマイヤ
ーフラスコ、９および19リッターのガラス瓶または種子
醗酵槽中のBHIブロスにて行った、その最終生成培地
は、３％熱不活化子ウシ血清、１％トリプトースおよび
0.1％ツイン80で強化した、炭酸水素ナトリウム（0.2％
w/v）含有のRPMI1640組織培地からなる。アンチフォー
ムを0.0.06％最終濃度にて加えた。その最終醗酵槽を５
％接種原で接種した、培養体を37℃で4.5時間増殖さ
せ、その培養体の溶解酸素含量をモニター観察し、エア
レーションにより40％のレベルに調整した。培養体を連
続的に撹拌し、pH7.4に維持した。接種の2.5、3.25およ
び4.0時間後に滅菌50％グルコースを添加することで増
殖を刺激した。種菌接種の4.5時間後（後期対数増殖
期）で、該培養体を10℃に冷却し、ホルマリンを0.1％
（v/v）の最終濃度まで加えて不活化した。培養流体を
醗酵槽中で１時間撹拌し、ついで完全に不活化するまで
一定速度で撹拌しながら５日間４℃で貯蔵した。不活化
流体を遠心分離に対し、上清を確保した。保存剤とし
て、滅菌10％メルチオレート（Merthiolate）および10
％エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を、各々、最終濃度
0.01％および0.07％まで加えた。ワクチンの組立てに解
凍するまで、該上清を−50℃で貯蔵した。

該上清を解凍し、定量検定の結果に基づき、滅菌リン
酸緩衝食塩水を添加して組み立てた。該組立て生成物を
ボトル中にアリコートし、凍結乾燥し、４℃で貯蔵し
た。

二相アジュバント系は、商品名：アンフィゲン（Amph
igen）で市販されている５％v/v鉱油／レシチンエマ
ルジョンアジュバントと、12％v/v水酸化アルミニウム
ゲルと、食塩水（以下、「アジュバント希釈体」とい
う）とからなる。そのアジュバント希釈体を瓶詰めし、
凍結乾燥ワクチンを再水和するのに用いた。

該ワクチンを、ワクチン接種−攻撃実験により保護能
についてウシにて試験した。

1496の相対細胞（RU）／用量のロイコキソイドおよび
2580の莢膜抗原を凍結乾燥した多量の上清に付与し、ワ
クチンを調製するのに用い、本明細書にて教示されてい
るように、ウシ科におけるピー・ヘモリティカタイプＡ
−１感染による感染症に対して一回の投与にて免疫性を
誘発することが判明した。

実施例２パスツレラ・ヘモリティカ・バクテリン−トキソイド −単ワクチン接種− 用量力価測定実験動物： 400〜550lbs.,肉ウシ攻撃：チェリーのリン酸緩衝食塩水（CPBS）500ml
中、ピー・ヘモリティカＡ−１、異種菌株（heterologo
us strain）、2.2×10⁹cfu. 気管内投与．ワクチン:1.アジュバント希釈体で800RUロイコトキソイ
ドおよび1380RU莢膜抗原／用量に希釈.2ml用量−筋肉内
投与． 2.アジュバント希釈体で400RUロイコトキソイドおよび6
90RU莢膜抗原／用量に希釈.2ml用量−筋肉内投与． 3.アジュバント希釈体で200RUロイコトキソイドおよび3
45RU莢膜抗原／用量に希釈.2ml用量−筋肉内投与． 4.プラセボ（対照）．アジュバント希釈体でワクチン番
号３のように希釈.2ml用量−筋肉内投与．実施例３パスツレラ・ヘモリティカ・バクテリン−トキソイド免疫原性実験動物： 400〜550lbs.,肉ウシ攻撃： CPBS500ml中、ピー・ヘモリティカＡ−１、
異種菌株、1.6×10⁹cfu. 気管内投与．ワクチン:1.アジュバント希釈体で200RUロイコトキソイ
ドおよび345RU莢膜抗原／用量に希釈.2ml用量−筋肉内
（IM）または皮下（SC）投与． 2.プラセボ（対照）．アジュバント希釈体でワクチン番
号１のように希釈.2ml用量−筋肉内投与．実施例４パスツレラ・ヘモリティカ・バクテリン−トキソイド動物： 400〜550lbs.,肉ウシ攻撃：ピー・ヘモリティカＡ−１、2.5×10⁹cfu/ml
を5ml. 経胸腔的肺内投与．ワクチン:1.アジュバント希釈体で再水和.2ml用量−筋
肉内（IM）または皮下（SC）投与． 2.プラセボ（対照）．アジュバント希釈体で再水和.2ml
用量−皮下投与．実施例５パスツレラ・ヘモリティカ・トキソイド４カ月間の免疫性実験この実施例では、体重約450lbs.（204.5kg）の肉ウシ
を20頭選択した。10頭の肉ウシ（群１）を、以下に示す
ように、１回2ml用量のパスツレラ・ヘモリティカ・バ
クテリン−トキソイドで皮下的に接種した。別の10頭の
ウシ（群２）を、ピー・ヘモリティカ抗原を除くパスツ
レラ・ヘモリティカ・バクテリン−トキソイドの全成分
を含有し、対照として供する１回2ml用量のプラセボで
皮下的にワクチン接種した。ウシを、ワクチン接種の４
カ月７日後で、ピー・ヘモリティカの異種菌株で気管内
攻撃した（表VII）。攻撃接種原は、チェリー・リン酸
緩衝食塩水（CPBS）1.2×10⁷個のコロニー形成幹細胞
（cfu）を含有するピー・ヘモリティカのブロス培養体
からなる。いずれの動物も攻撃に屈しなかった。攻撃の
６日後、動物を剖検した。

対照動物は攻撃後の２日間、攻撃のため体温の著しい
上昇（統計的に有意）を示したが、ワクチン接種した動
物は、ワクチン接種後に１日、体温の上昇を示した。統
計分析によれば、ワクチン接種体と対照の間で、攻撃の
２日後で、平均体温において有意な差異があることがわ
かった。

静脈穿刺により各動物から採血した血液試料の血清
を、凝集反応測定法によりピー・ヘモリティカ全細胞に
対する、ロイコトキシン中和測定法によりロイコトキシ
ンに対する、および固相酵素免疫測定法（ELISA）によ
り莢膜抗原に対する抗体価について試験した。試料を、
ワクチン接種前に、ワクチン接種の４カ月後（攻撃前）
および攻撃の６日後（培検の時に）採血した。幾何平均
（GM）抗体価を各試験について計算し、ワクチン接種前
の抗体価と比較して、莢膜抗原に対する抗体価だけが、
ワクチン接種の４カ月後および攻撃の６日後で、ワクチ
ン接種の動物（群１）にて有意に高いという結果が得ら
れた。

培検では、肺を摘出し、肺炎性パスツレラ症に特徴的
な病変について評価した（VIII）。影響を受けた部分を
秤量し、関連する肺の割合を肺全重量のパーセントとし
て表すことによって肺を評点した。加えて、影響のある
部分の描写を包含する視覚検査により評点した。肺全体
の重量との関連で影響のある肺組織の真の重量に基づい
て測定した場合、対照動物は19.35％の平均肺硬化を有
したが、ワクチン接種した動物の平均肺硬化は2.65％で
あった。影響のある肺組織の視覚的評価は、ワクチン接
種した動物で1.68％、対照動物で13.35％の平均肺硬化
を与えた。これらの結果は、重量を基礎とした場合、群
２と比較して群１の肺病変が86.3％減少したことを示
し、視覚検査を用いた場合、87.42％の減少を示した。
統計的分析は、ワクチン接種体と対照の間の肺硬化の差
異が有意であることを示した（ｐ＜0.05）。

培検で皮下注射部位を注意して調べ、いずれの群の動
物も肉眼で識別できる組織反応がなかった。肺組織の病
変関連領域から細菌の単離を試みた。10頭のうち４頭の
ワクチン接種体および10頭のうち８頭の対照の肺病変か
ら、ピー・ヘモリティカが単離された。

これらの結果は、この生成物が、一回用量のワクチン
の投与後、４カ月まで安全かつ効果的であることを示
す。この生成物を用いるウシのワクチン接種は攻撃に対
するその耐性を亢進させた。

動物：肉ウシ、＞600lbs. 攻撃： CPBS500ml中、ピー・ヘモリティカＡ−１、
異種菌株、1.2×10⁷cfu/ml. 気管内投与．ワクチン:1.付随のアジュバント希釈体で再水和した認
可前の一連番号１（一連番号24275010、約305RUロイコ
トキソイドおよび約529RU莢膜抗原）.2ml用量−皮下投
与． 2.付随のアジュバント希釈体で再水和したプラセボ（対
照）． 2ml用量−皮下投与．実施例６パスツレラ・ヘモリティカ・バクテリン−トキソイド免疫性実験の開始実施例１の記載に従ってワクチンを製造した。［ロイ
コトキソイド効能＝254相対細胞／用量（15カ月の自然
エイジング）、莢膜抗原効能＝758相対細胞／用量］平均体重553lbs.（251kg）の30頭の肉ウシをこの実施
例のために選択した。10頭のウシ（群Ａ）を、攻撃の７
日前、１回2ml用量のパスツレラ・ヘモリティカ・バク
テリン−トキソイドで皮下投与によりワクチンを接種し
た。別の10頭のウシ（群Ｂ）を同一方法で１回2ml用量
のワクチンを用いて攻撃の３日前にワクチン接種した。
さらに別の10頭ウシ（群Ｃ）を攻撃の７日前に１回2ml
用量プラセボ（パスツレラ・ヘモリティカ抗原を除く、
パスツレラ・ヘモリティカ・バクテリン−トキソイドの
全成分を含有し、対照として供する）で皮下注射した。
ワクチン接種の７日後（群ＡおよびＣ）またはワクチン
接種の３日後（群Ｂ）、ピー・ヘモリティカの異種菌株
でウシを気管内投与により攻撃した。攻撃接種体は、チ
ェリーのリン酸緩衝食塩水（CPBS）500ml中、3.0×10⁸
コロニー形成細胞（cfu）含有のピー・ヘモリティカの
ブロス培養基からなった。群Ｂ中の１頭の動物および群
Ｃ中の１頭の動物が攻撃に屈し、できる限り早く培検に
付した。他のすべての動物は攻撃の６日後に培検した。

動物の３分の２の攻撃前の体温は40℃であり、それで
攻撃後のいずれの時期においても、いずれの群において
も、攻撃による体温の著しい上昇は見られなかった。

静脈穿刺により各動物から採血した血液試料の血清
を、凝集反応測定法によりピー・ヘモリティカ全細胞に
対する、ロイコトキシン中和測定法によりロイコトキン
に対する、および固相酵素免疫測定法（ELISA）により
莢膜抗原に対する抗体価について試験した。ワクチン接
種前、攻撃の直前である、ワクチン接種の７日後（群Ａ
およびＣ）およびワクチン接種の３日後（群Ｂ）に、な
らびに攻撃の６日後、（培検の時点で）に試料を採血し
た。幾何平均（GM）抗体価を各試験について計算し、３
種すべての抗体に対する有意な応答が、ワクチン接種の
７日後の群Ａの動物において見られ、ワクチン接種の３
日後の群Ｂの動物にて、またはプラセボ投与の７日後の
群Ｃの動物にてそのような応答が観察せらないという結
果が得られた。

培検では、肺を摘出し、肺炎性パスツレラ症に特徴的
な病変について評価した。影響を受けた部分を秤量し、
関連する肺の割合を肺全重量のパーセントとして表すこ
とによって肺を評点した。加えて、影響のある部分の描
写を包含する視覚検査により評点した。肺全体の重量と
の関連で影響のある肺組織の真の重量に基づいて測定し
た場合、対照動物は26.6％の平均肺硬化を有したのに対
して、攻撃の７日前にワクチン接種した動物は12.7％の
平均肺硬化を示し、攻撃の３日前にワクチン接種した動
物は36.1％の平均肺硬化を有した。影響ある肺組織の視
覚評価は、平均肺硬化が７日のワクチン接種を受けた場
合で8.6％、３日のワクチン接種を受けた場合で28.7
％、そしてプラセボ対照の場合で17.8％であった。これ
らの結果は、重量を基礎とした場合、群Ｃと比較して群
Ａの肺病変が52.3％減少したことを示し、視覚検査を用
いた場合、51.7％の減少を示した。統計的分析より、群
Ａと群Ｂの間の肺硬化の差異が有意であり（ｐ＜0.0
5）、群ＡとＣの間ではそうでもないことがわかった。
３日をワクチン接種を受けたものとプラセボ対照を比較
した場合、肺病変の減少は何ら観察されなかった。

培検で皮下注射部位を注意して調べた。３つのすべて
の群のうち、約50％の動物が注射部位で組織反応の形跡
を有した。肺組織の病変関連領域から細菌の単離を試み
た。10頭の７日ワクチン接種体うち５頭の、10頭の３日
ワクチン接種のうち８頭の、および10頭のプラセボ対照
のうち７頭の肺病変から、ピー・ヘモリティカが単離さ
れた。

これらの結果は、この生成物を一回用量にて投与する
と、動物をワクチン接種の７日後に攻撃した場合、肺損
傷を減少させることができるが、ワクチン接種の３日後
では減少させることができないことを示す。攻撃の７日
前にウシをこの生成物でワクチン接種すると、攻撃に対
する耐性が強化された。

結論すべての実験で該ワクチンの安全性は確認された。都
合の悪い反応は何ら観察されなかった。さらに、３種の
異なる一連のワクチンを3,000頭以上の動物に投与して
安全性が得られた。試験にてワクチン接種したもののう
ち3.5％にて局所反応が得られ、その多くは一時的であ
った。他の反応はほとんど観察されなかった。

抗原吸光実験を行い、ワクチンの非保護投与量レベル
を測定した、該実験はワクチンにおける保護と抗原量の
明確な関係を示した。

該実験において示される結果は、このワクチンが効能
を有し、安全であることを示した。この生成物を用いら
ウシのワクチン接種（筋肉内または皮下経路のいずれに
おいても）は、抗原に対する耐性を亢進した。このこと
は、対照動物と比較してワクチン接種体で観察される肺
病変度の有意な減少に反映される。このワクチンを開発
および試験するこれらの研究にて用いた実験用攻撃モデ
ルは、自然の条件下、そのようなレベルの攻撃に暴露さ
れる動物はありそうもないほどに十分に激しいものであ
った。したがって、通常の条件下では、このワクチン
は、より良好に作用すると結論するのが無難である。さ
らには、ウシの呼吸器疾患症候群用のワクチンのよう
な、ウイルスおよび細菌成分を配合した一種またはそれ
以上の多価ワクチンの成分としてこのワクチンを用いて
もよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (31)優先権主張番号８７８，１４６ (32)優先日 1992年５月４日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ）微生物の受託番号ＡＴＣＣ５５３１８ (72)発明者カウフマン，トーマス・ジェームズアメリカ合衆国ネブラスカ州68522、リンカーン、ダブリュ・ジーン・サークル 1500番 (72)発明者ニューシャム，レックス・スティーブンアメリカ合衆国ネブラスカ州68516、リンカーン、エス・フォーティサード・ストリート6800番 (56)参考文献特開昭49−6118（ＪＰ，Ａ) 国際公開91／15237（ＷＯ，Ａ１) 国際公開80／412（ＷＯ，Ａ１) ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＢｏｖｉｎｅＲｅｓｐｅｒａｔｏｒｙ，（1984）Ｐ．480−481 Ｃａｎ．Ｊ．ＶｅｔＲｅｓ．，Ｖｏｌ．52，Ｎｏ．１，（1988）Ｐ．30− 36 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 39/102 A61K 39/39 C12N 1/21 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】治療上有効量のパスツレラ・ヘモリティカ
・タイプＡ−１（Pasteurella haemolytica Type A−
１）・ロイコトキソイド、パスツレラ・ヘモリティカ莢
膜抗原、パスツレラ・ヘモリティカ可溶性抗原および約
10³〜約10⁸細胞/mlの密度のパスツレラ・ヘモリティカ
不活性化細胞からなり、１回の接種でウシ種における免
疫性を誘導することのできるパスツレラ・ヘモリティカ
・タイプＡ−１感染症に対するバクテリン−トキソイド
ワクチン。
【請求項２】ロイコトキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原
および不活性化細胞が、パスツレラ・ヘモリティカ・タ
イプＡ−1 ATCC55318株由来である請求項１記載のワク
チン。
【請求項３】さらに、治療上有効量の１種またはそれ以
上のウシの呼吸器疾患の病因となる付加的な抗原を含む
請求項１記載のワクチン。
【請求項４】さらに、少なくとも１種のアジュバントを
含む請求項１記載のワクチン。
【請求項５】水酸化アルミニウムゲルおよび鉱油／レシ
チンエマルジョンの２種のアジュバントを含有する請求
項４記載のワクチン。
【請求項６】パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１
株を後期対数増殖期に至るに十分な時間培養し；細胞培
養物を不活性化し；それからロイコトキソイド、莢膜抗
原、可溶性抗原および約10³〜約10⁸細胞/mlの密度の不
活性化パスツレラ・ヘモリティカ細胞からなる培養上澄
液を得ることからなる、１回の接種でウシ種におけるパ
スツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１感染症に対する
免疫性を誘導することのできるバクテリン−トキソイド
ワクチンの製造方法。
【請求項７】パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１
株がATCC55318株である請求項６記載の方法。
【請求項８】パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１
細胞培養が後期対数増殖期に至るまでの該十分な時間
が、約2.5〜６時間である請求項６記載の方法。
【請求項９】パスツレラ・ヘモリティカ培養をホルマリ
ンで不活性化する請求項６記載の方法。
【請求項１０】蛋白を増強した細胞培養培地でパスツレ
ラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１株を培養する請求項６
記載の方法。
【請求項１１】細胞培養培地がRPM−1640および約３％
の子ウシ・血清、約１％のトリプトースおよび0.1％の
ツイン（Tween）80からなる請求項13記載の方法。
【請求項１２】パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−
１株を後期対数増殖期に至るに十分な時間培養し；細胞
培養物を不活性化し；それからロイコトキソイド、莢膜
抗原、可溶性抗原および約10³〜約10⁸細胞/mlの密度の
不活性化パスツレラ・ヘモリティカ細胞からなる培養上
澄液を得ることにより製造される、パスツレラ・ヘモリ
ティカ・タイプＡ−１感染症に対するバクテリン−トキ
ソイドワクチン。
【請求項１３】さらに、少なくとも１種のアジュバント
を含む請求項12記載のワクチン。
【請求項１４】水酸化アルミニウムゲルおよび鉱油／レ
シチンエマルジョンの２種のアジュバントを含有する請
求項13記載のワクチン。
【請求項１５】ウシ種動物に、治療上有効量のパスツレ
ラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１・ロイコトキソイド、
パスツレラ・ヘモリティカ莢膜抗原、パスツレラ・ヘモ
リティカ可溶性抗原およびパスツレラ・ヘモリティカ不
活性化細胞からなるバクテリン−トキソイドワクチンの
１回投与することからなるウシ種動物のパスツレラ・ヘ
モリティカに対する予防接種法。
【請求項１６】投与が筋肉内または皮下注射である請求
項15記載の方法。
【請求項１７】ワクチンが、さらに、少なくとも１種の
アジュバントを含む請求項15記載の方法。
【請求項１８】ワクチンが水酸化アルミニウムおよび鉱
油／レシチンエマルジョンの２種のアジュバントを含む
請求項17記載の方法。
【請求項１９】バクテリン−トキソイドワクチンが、後
期対数増殖期のパスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−
１の培養物をホルマリンで不活性化して製造される請求
項15記載の方法。
【請求項２０】治療上有効量のパスツレラ・ヘモリティ
カ・タイプＡ−１・ロイコトキソイド、パスツレラ・ヘ
モリティカ莢膜抗原、パスツレラ・ヘモリティカ可溶性
抗原、約10³〜約10⁸細胞/mlの密度のパスツレラ・ヘモ
リティカ不活性化細胞、水酸化アルミニウムおよび鉱油
／レシチンエマルジョンからなり、１回の接種でウシ種
における免疫性を誘導することのできるパスツレラ・ヘ
モリティカ・タイプＡ−１感染症に対するバクテリン−
トキソイドワクチン組成物。
【請求項２１】パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−
１株を後期対数増殖期に至るに十分な時間培養し；それ
からロイコトキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原および約
10³〜約10⁸細胞/mlの密度のパスツレラ・ヘモリティカ
細胞からなる培養上澄液を得；ついで不活性化剤を添加
することからなる、１回の接種でウシ種におけるパスツ
レラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１感染症に対する免疫
性を誘導することのできるバクテリン−トキソイドワク
チンの製造方法。
【請求項２２】不活性化剤がホルマリンである請求項21
記載の方法。
【請求項２３】パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−
１株を後期対数増殖期に至るに十分な時間培養し；それ
からロイコトキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原および約
10³〜約10⁸細胞/mlの密度のパスツレラ・ヘモリティカ
細胞からなる培養上澄液を得；ついで不活性化剤を添加
して製造される、１回の接種でウシ種におけるパスツレ
ラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１感染症に対する免疫性
を誘導することのできるバクテリン−トキソイドワクチ
ン。
【請求項２４】不活性化剤がホルマリンである請求項23
記載のバクテリン−トキソイドワクチン。