KR19990022534A - 소 및 양을 면역화시키기 위한 액티노미세스 피오게네스 및 액티노미세스 피오게네스/푸조박테리움 네크로포룸 백신 - Google Patents

소 및 양을 면역화시키기 위한 액티노미세스 피오게네스 및 액티노미세스 피오게네스/푸조박테리움 네크로포룸 백신 Download PDF

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티. 지. 나가라이아
엠. 엠. 첸가파
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트레윈. 알. 더블유.
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Abstract

소나 양과 같은 반추동물에 투여하기 위한 본 발명의 신규한 접종물은 간 농양 및/또는 족부패증의 발생율을 감소시키고 동물을 면역화 시키기 위한 것이다. 본 발명의 한 특징에 따르면 A. 피오게네스 세포 배양물의 불활성 세포배양산물(예를 들면 세포로부터 만들어지는 상층액)과 적합한 캐리어를 함유하는 A.피오게네스-유도백신을 제공한다. 본 발명의 다른 특징에 따르면 적어도 제1 및 제2박테리아 성분과 캐리어를 함유하는 다가백신으로서 제1성분은 A.피오게네스의 불활성 세포배양산물로 구성되고 제2성분은 F.네크로포룸의 불활성 세포배양산물로 구성된다. 본 발명의 접종물은 반추동물이 간농양 및/또는 족부패증을 유발시키는 F.네크로포룸에 감염된 경우, 예를 들면 이러한 반추동물이 항생물질로 정기적으로 처리되거나 소가 높은 비율의 곡물을 함유하는 농축사료를 공급받는 경우에 특히 유용성을 갖는다.

Description

소 및 양을 면역화시키기 위한 액티노미세스 피오게네스 및 액티노미세스 피오게네스/푸조박테리움 네크로포룸 백신
[발명의 배경]
목초지에서 자라는 소에 있어서, 간 농양은 심각한 경제적인 문제로서, 미국에서는 해마다 3백만 이상의 간이 폐기 처분되며 이를 계산해보면 1500만 달러 이상의 손실을 초래하고 있다. 이러한 계산은 간 및 기타 다른 기관의 폐기처분을 기본으로 한 것으로, 사료공급 효율의 저하 및 체중 증가분의 감소로 인한 경제적 손실을 포함되지 않았다. 많은 연구로부터 간 농양이 있는 소는 건강한 간을 가진 소에 비교하여 체중이 저하(평균 4~5%)되고, 사료공급 효율이 감소(평균 7%)된다. 곡물을 먹이는 소의 평균 간 농양 발생률은 약 25~30%이다.
소의 간 농양은 농양이 전위 상피내의 감염의 제1병소에 대해 부수적인 질병 복합체의 일부이다. 그 병원성은 다음과 같이 요약될 수 있다. (1) 전위 장애는 섬유소를 많이 함유하는 음식에서 곡식으로의 갑작스런 사료변화에 수반되는 산혈증, 곡식이 많은 사료(때때로 완전한 고농축 사료)의 장기간 공급 또는 전위상피의 외래 물체 침투에 의해 발생한다. (2) 전위에 존재하는 박테리아가 상피에 침입하여 전위 벽에 병소 농양을 형성한다. (3) 박테리아가 문맥 순환계에 침입하여 그 다음 농양을 형성하는 선세포 조직에 배치되어 간에 운반된다.
F. 네크로포름은 반추동물의 간 농양의 주요 병원물질이다. 이 세균은 지난 1800년대 이후 동물 및 사람의 병원체로서 인식되어 왔으며 가축 및 야생동물의 다수의 회사성 질병상태에 관여한다. 이 세균은 또한 간 농양 이외에도 족 부패증, 족농양, 송아지 디프테리아의 주요 병원물질이며, 흔히 유선염, 자궁근 충염 및 구강의 괴사성 병변의 경우로부터 분리된다.
간에서 확인된 F.네크로포룸의 능력은 백혈구독소(또는 로이코시딘)이라 불리는 독소를 만드는데 기여하는 것이다. 이 독소는 물에 용해되며, 단백질성을 가지고 소의 백혈구에 특이적이다. 백혈구독소는 정상의 방어기작을 부여함으로써 직접적으로, 또한 호중구 및 대식세포로부터 간세포로 방출되는 세포분해산물에 의해 초래되는 손상에 의해 간접적으로, F.네크로포룸이 간에 정착되는 것을 도와주는 것으로 추정된다. 그러므로 F.네크로포룸으로부터 만들어진 백혈구독소는 간의 F.네크로포룸 감염에 중요한 역할을 한다.
F.네크로포룸은 그람-음성균이며, 비포자 형성체이고, 부동성이며, 매우 혐기성인 다형성 균이다. 형태학적으로 이 균은 짧은 로드로부터 예리하고 둥근 말단을 가진 사상성 로드로 변화한다. 세포길이는 오훼 돌기체 직경 0.5~0.7㎛로부터 사상체 100㎛ 이상까지이다. 표면 콜로니는 직경 1~2mm의 원형이며 투명에서부터 불투명까지 존재하며 α 또는 β용혈현상을 유발시키는 몇몇 균주를 포함한다. 이 세균은 최종 pH 5.0~6.3 정도의 약산성에서 글루코즈, 프룩토즈 및 말토즈를 발효시킨다. 이 세균은 유산염을 초산염, 프로피온산염 및 부틸산염으로 발효시킨다. 부틸산염은 유산염 발효로부터 생성되는 주요산물이다. 인돌은 펩톤으로부터 생성된다. F.네크로포룸은 사람 및 동물의 구강, 위장강 및 요생식로내의 정상균상으로부터 분리된다. 이 세균은 또한 토양에서 생존하는 것으로 알려져 있다.
F.네크로포룸은 4가지 생물형(A, B, AB, C)으로 설명된다. 간 농양으로부터 가장 흔히 분리되는 생물형 A는 전위벽 농양을 지배하는 생물형 B보다 더 병원성을 가진다. 생물형 AB는 분리하기가 어려우며 생물형 A와 B의 중간수준의 병원성을 가진다. 생물형 C는 비병원성을 가진다.
종래에 간 괴사에 대항하여 소 및 양을 면역화시키기 위한 시제로서 F.네크로포룸 박테린을 사용하는 것이 제안되었다(유럽특허출원 제86048호, 1991년 12월 11일). 특히, 독성 F.네크로포룸 분리물은 β-프로피오락톤을 사용하여 불활성화시킨 다음 부가제를 가하였다. 또한 아베 등(Abe at al., Infection and Immunity, 13; 1473~1478, 1976)은 48시간 동안 F.네크로포룸을 증식시켰다. 이것을 원심 분리시키고 염으로 3회 세척한 다음 포르말린(염 0.4%)으로 불활성화시켰다. 이 불활성화된 세포를 쥐에 주사하여 면역성을 생기게 하였다. 마지막 효능 촉진제 주사 2주 후에, 각 쥐는 F.네크로포룸 생존 세포로 챌린지되었다. 죽은 세포로 면역화된 쥐 및 생존세포로 챌린지된 쥐는 28일 까지 간, 폐 또는 비장 내에서 검출될 만한 박테리아가 존재하지 않았다. 이는 포르말린처리된 죽은 F.네크로포룸으로 쥐를 면역화시킴으로써 감염에 대한 보호가 이루어졌다고 결론지을 수 있다. 가르시아 등(Garcia et al., Canadian J. Comp. Med, 38 : 222-226, 1974)은 F.네크로포룸의 알룸-침전 톡소이드의 효능을 평가하기 위한 현장실험을 수행하였다. 백신 제제는 고주파음 분해에 의해 파열된 세척세포(백혈구독소 첨가)를 함유하였다. 가장 유망한 결과는 15.5mg 단백질의 세포질 톡소이드를 주사함으로써 달성되었다. 이 그룹의 경우 간 농양 발생률이 평균 35%인 대조용 그룹보다 10% 감소되었다. 마지막으로 에머리 등(Emery et al., Vet. Microbiol., 12 : 255~268, 1986)은 F.네크로포룸의 18-시간 배양 상청액을 겔 여과시킴으로써 물질을 제조하였다. 이것은 생존 F.네크로포룸으로부터 챌린지된 것에 비해 현저한 면역성을 유도해내었다. 이 주사된 제제는 내독소 및 대부분의 백혈구 독성을 함유하였다.
1994년 1월 6일자로 공고된 PCT출원 WO 94/00556에는 신규한 F.네크로포룸 로이코톡시드 백신 및 F.네크로포룸으로부터 백혈구 독소의 합성을 향상시키는 방법과 백혈구 독소 백신을 제조하는 방법이 발표되어 있다. 특히, 이 공보는 백혈구 독소의 생성을 최대화하기 위해 F.네크로포룸 박테리아를 약 35~41℃의 온도에서 pH 약 6.5~8로 4~10 시간 동안 증식배지에서 배양시키는 것이 유리하다고 설명하고 있다. 그 다음 배양을 끝내고 백혈구독소가 함유된 상청액을 분리하여 불활성화시킴으로써 백신을 형성한다.
액티노미세스 피오게네스는 그람 양성균이며 구간균성 모양으로서 동물 및 사람의 다수의 화농성 상태(파이오바실로시스)와 관계가 있는 조건성 균이다. 이것은 흔히 F.네크로포룸을 포함한 다른 박테리아와 혼합 배양물 형태로 분리된다. 소의 간 농양 및 우족 부패증의 경우 A.피오게네스는 두 번째로 흔하게 분리되는 병원체이다. 이 균은 간 농양 및 족 부패증 이외에도 흔히 폐, 유선, 관절 및 자궁 등과 같은 여러 기관의 화농성 감염으로부터 분리된다. 병원성에 원인이 되는 몇몇 요인에는 외독소(용혈소 또는 백혈구 독소)와 단백질 분해효소, DN아제 및 뉴라미니다제와 같은 효소가 있다. 또한 소의 A.피오게네스는 F.네크로포룸을 포함한 다른 박테리아와 공동상승적으로 상호작용을 하므로 이 배합물은 개개 종보다 유독성이 강하다는 것이 밝혀졌다. 그러나 지금까지 간 농양 및/또는 족 부패증에 대항하여 소 및 양을 면역화시키기 위한 어떠한 A.피오게네스 유도 백신 또는 접종물도 제조되지 않았다.
본 발명은 간농양 및/또는 족 부패증의 발생을 감소시키거나 예방하기 위해 소 또는 양에 투여하기 위한 신규한 접종물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 이러한 접종물 및 이를 제조하는 방법과 이러한 접종물의 투여를 통해 소나 양의 간 농양 및/또는 족 부패증의 발생을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 첫 번째 특징에 따르면 본 발명은 A. 피오게네스 유도 접종물에 관한 것이며, 두 번째 특징에 따르면 A. 피오게네스의 비활성 세포 배양산물 형태의 제1박테리아 성분과 F.네크로포룸의 비활성 세포 배양산물 형태의 제2박테리아 성분을 함유하는 다가 접종물에 관한 것이다.
[본 발명의 개요]
본 발명은 소 및 양과 같은 반추동물을 면역화시키고 간 농양 및/또는 족 부패증의 발생률을 감소시키기 위해 소 및 양을 접종시키기 위한 접종물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 접종물을 제조하는 방법 및 소 및 양에 있어서 앞서 기술한 질병의 발생을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 특징에 따르면, 소 또는 양에 투여하기 위한 접종물은 박테리아 성분 및 이와 혼합 가능한 캐리어를 함유한다. 박테리아 성분은 기본적으로 A.피오게네스의 불활성 세포 배양산물로 구성된다. 예를 들면 이 성분은 분리된 A.피오게네스 세포, A.피오게네스 셀룰라 서브유니트 또는 프라그멘트, 세포 배양물 중 A.피오게네스 세포에 의해 만들어진 상청액 및 그 혼합물로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 캐리어는 알루미나 하이드록사이드 또는 오일을 기본으로 하거나 금속성인 염부가제와 같은 여러 가지 적합한 부가제 중의 하나를 사용할 수 있다.
A.피오게네스는 브레인 하트 인퓨젼 브로쓰(Brain Heart Infusion broth) 또는 RPMI 1640 배지와 같은 증식 배지 내에서 35~90℃로 12~48시간 동안 밤새 배양을 통해 A.피오게네스 균주의 세포 배양물을 형성시킴으로써 제조된다. 배양기간의 말기에(약 36시간 후가 가장 바람직함), 세포 배양산물을 포르말린, β-프로피오락톤, 열, 방사선 또는 기타 공지의 어떠한 불활성화 방법에 의해서 불활성화시킨다. 특히 바람직한 형태는 완전한 세포 배양물을 불활성화시키고 2일 동안 냉각시키는 것이다. 그 다음 이 불활성화 세포 배양물을 원심분리시키고 상청액인 항원성 물질을 회수한다. 앞서 기술한 바와 같이 또 다른 방법의 경우에는 완전한 세포 배양물, 분리된 세포 또는 셀룰라 서브유니트를 항원성 물질로서 사용할 수 있다. 어떠한 경우든 불활성화 및 분리 후에 항원성 물질을 적합한 부가제 캐리어와 혼합하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 제1 및 제2박테리아 성분 및 이와 혼합 가능한 캐리어를 함유하는 것을 특징으로 하는 소 또는 양에 투여하기 위한 다가 접종물을 제공한다. 제1박테리아 성분은 A.피오게네스의 불활성 세포 배양산물로 구성되며 제2박테리아 성분은 F.네크로포룸의 불활성 세포 배양산물로 구성된다. 제1A.피오게네스-유도 박테리아 성분은 앞서 기술한 바와 같이 제조된다. 즉 본 발명에 따르는 A.피오게네스 접종물로 제조된다. 제2F.네크로포룸-유도 박테리아 성분은 본 명세서에서 참고문헌으로 소개되는 PCT출원 WO 94/00556에 기재된 방법으로 제조된다.
보다 상세히 기술하면, 다가 백신용 F.네크로포룸 제2박테리아 성분은 세포 배양물 중의 F.네크로포룸 세포에 의해 만들어지는 불활성화 백혈구독소-함유 상청액의 형태이다. F.네크로포룸의 배양은 브레인 하트 인퓨전 브로쓰와 같은 적합한 증식배지 내에서 약 35~41℃의 온도로 pH 약 6.5~8에서 약 4~9시간 동안 생물형 A균주를 배양하는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 F.네크로포룸 균주는 ATCC 액세션 No. 55329를 가진다. 배양 마지막 단계에서, 백혈구독소 상청액을 분리하고 임의의 공지의 방법에 의해서, 바람직하게는 포르말린의 사용을 통해서 불활성화시킨다. 그 다음, 이 불활성화시킨 항원성 물질을 A.피오게네스 백신 제조에서 언급한 것과 같은 형태의 적합한 부가제와 혼합할 수 있다.
본 발명에 따르는 최종 다가 접종물은 각각 제1 및 제2세포 배양물로부터 유도되는 제1 및 제2박테리아 성분을 혼합함으로써 제조된다. 박테리아 성분은 최종 다가 접종물 중에 약 1:1(V/V)의 비로 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르는 접종물은 A.피오게네스가 현저한 병원성 물질이 되는 경우에 특히 유용하다. 예를 들면, 놀랍게도 간 농양 및/또는 족 부패증의 발생률을 감소시켜 주는 항생물질로 소 또는 양을 정기적으로 처리한 경우(예를 들면, 사료공급), 감염동물 중 높은 비율의 동물의 그 농양 균상 내에 A.피오게네스를 나타내 보인다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 간 농양 및/또는 족 부패증의 발생률을 감소시키기 위해 티로신, 클로르테트라실린, 옥시테트라실린, 박시트라신 및 그 혼합물과 같은 항생물질로 정기적인 레짐으로 반추동물을 처리하는 경우, 이러한 동물도 또한 본 발명의 접종물로 치료되어야 한다. 이렇게 하여 간 농양 및/또는 족 부패증의 발생률을 보다 더 감소시킬 수 있을 것이다.
또한, 약 90중량% 이상을 곡물로 섭취하는 것을 포함하여 고농축 사료를 공급받는 소는 간 농양의 발생률이 높다(50% 이상)는 것은 공지의 사실이다. 이제 농축사료를 공급받는 소의 간 농양 중 높은 비율이 박테리아 검사시 A.피오게네스를 나타내 보인다는 것이 발견되었다. 그러므로 농축사료를 공급받는 소도 또한 본 발명의 접종물로 치료함으로써 현저하게 이점을 얻을 수 있다.
다음의 실시예는 다가 A.피오게네스-유도 접종물의 바람직한 제조방법 및 사용과 A.피오게네스 및 F.네크로포룸 항원성 성분을 함유하는 다가 접종물의 바람직한 제조방법 및 사용을 설명한다. 그러한 이러한 실시예는 단지 설명을 위해 제시되는 것은 아니며, 본 발명의 전체적인 범주를 제한하려는 것은 아니다.
(실시예 1)
본 실시예에서 항생물질인 티로신과 함께 또는 없이 사료를 공급받는 사육장소의 간 농양의 균상을 검사하였다. 총 36개의 티로신이 공급된 소의 간 농양을 검사하였으며, 이어서, 41개의 티로신이 공급되지 않은 소의 간 농양을 검사하였다. 이 조사로부터 티로신이 공급된 동물의 간 농양에서 높은 비율의 A.피오게네스가 존재하였다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 티로신이 공급된 동물의 경우, F.네크로포룸의 역할은 감소되며 A.피오게네스가 티로신이 공급되지 않은 동물에서 보다 큰 역할을 나타내는 것으로 추정된다. 이 조사의 결과를 다음의 표에 나타내었다.
[표 1]
티로신이 공급된 또는 공급되지 않은 소의 간 농양의 균상
간 농양에서 발견되는 F.네크로포룸의 기원은 잘 알려져 있으나, A.피오게네스의 근원은 밝혀진 것이 없다. A.피오게네스는 호기성 균이므로 전위의 정상적인 서식균은 아니다. 그러나 이 박테리아는 전위의 외벽 균상의 성분이 될 수 있다(전위벽에 부착된 박테리아). 조건성 또는 호기성 박테리아는 광범위한 혈액공급으로 산소가 제공되는 전위벽에 부착됨으로써 혐기성 조건하에서 생존하는 기회를 갖는다. 전위벽에 근접해 있음으로써 박테리아가 문맥 순환계에 도달하는 기회가 증가하며 그럼으로써 간으로 들어간다. 박테리아는 잠복상태로 존재하고 있으며, 조건이 도움이 되는 상태가 되면(예를 들면, 간으로 들어간 상태) 증식하게 된다. 균은 티로신에 매우 민감하기 때문에 티로신이 공급된 소의 A.피오게네스의 높은 발생률은 놀랄 만한 일이다.
(실시예 2)
본 실시예에서는 완전 농축 사료(100% 곡물)를 공급받는 소의 간 농양을 세균학적으로 조사하였다. 완전 농축사료를 사용하는 사육장의 경우 간 농양의 발생률이 높다(50% 이상)는 것을 공지의 사실이다. 본 조사에서는 24마리의 동물의 간을 검사하여 이 중 19개가 농양이 있다는 것을 발견하였다. 이 농양 중 18개를 배양하여, 12개의 농양에서 F.네크로포룸을 발견하였으며 17개의 농양에서 A.피오게네스를 발견하였다. 이 데이터는 다음의 표 2에 요약하였다.
[표 2]
완전 농축사료를 공급받는 소의 간 농양의 균상
실시예 1 및 실시예 2에서 설명한 테스트를 기본으로 할 때, 간 농양을 유발하는 데에 있어서 F.네크로포룸과 A.피오게네스 사이에 공동 상승적인 상호작용이 존재한다는 것을 알 수 있다. A.피오게네스의 존재는 F.네크로포룸의 유독성을 향상시켜주며, 또한 그 역도 가능하다. 표 3은 각각의 박테리아의 특성 및 상호작용을 나타낸 것이다.
[표 3]
(실시예 3)
본 실시예에서 일가 A.피오게네스 백신의 제조방법 및 다가 A.피오게네스/F.네크로포룸 백신의 제조방법을 설명한다.
A.피오게네스 백신
적합한 A.피오게네스 균주는 브레인 하트 인퓨젼 브로쓰(DIFCO 연구소, Detroit, MI) 또는 RPMI 1640 배지(GIBCO 연구소, Grand Island, NY) 내에서 증식시킨다. 증식 배지를 A.피오게네스의 밤새 배양물(1~5% 접종물 크기)로 접종하고 이것을 35~39℃에서 12~48시간 동안 5% CO2대기압 하에서(표준기압을 사용할 수도 있음) 배양시킨다. 배양 말기에 0.3%~0.4%(vol./vol. 기준) 포르말린을 가함으로써 불활성화시킨다. 이 불활성화된 전 배양물을 얼음 욕조 내에서 냉각시킨 다음 1일 또는 2일간 냉장시킨다. 그 다음 이 불활성 세포 배양물을 원심분리시키고(15~30분간 13500g), 상청액인 항원물질을 회수한다. 또 다른 방법으로는 항원물질로서 전세포 배양물(박테린) 또는 셀룰라 서브유니트를 사용할 수 있다.
그 다음 이 항원물질을 적합한 부가제(예를 들면, 수산화 알루미늄 또는 기타 시중 구입 가능한 오일을 기본으로 하는 또는 금속성인 염 부가제)와 혼합함으로써 백신을 완성시킨다. 그 다음 이 백신을 양 또는 소에 통상적으로 투여함으로써(1회 이상 백신주사) 동물 내에 항체를 생기게 하고 동물의 간이나 발 또는 기타 다른 기관에 A.피오게네스가 생성되는 것을 예방한다.
A.피오게네스/F.네크로포룸 백신
F.네크로포룸 로이코톡시드 백신성분은 사전-감소된(0.05% 시스테인 Hcl) 혐기적으로 살균된 브레인-하트 인퓨젼 브로쓰(DIFCO 연구소, Detroit, MI) 내에서 39℃에서 7시간 동안(650nm에서 흡광도 0.8) F.네크로포룸 생물형 A 균주(예를 들면, 균주 25, ATCC 액세션 No.55329)를 증식시킴으로써 제조된다. 이것을 4℃에서 30분간 13500g으로 원심 분리한 다음, 0.45㎛ 막 필터(Micron Separation, Inc., Westborough, MA)를 통해 여과한 후 0.3% 포르말린으로 불활성화시킴으로써 배양 상청액을 얻는다. 포르말린으로 불활성화시키기 이전과 이후의 세포 배양물 상청액 중의 F.네크로포룸 백혈구 독소 및 단백질 농도를 분석한다.
불활성화 상청액에 리비 부가제(사전 혼합됨, 살균형태, Ribi Immunochein Research, Inc., Hamilton, MT) 또는 앞서 기술한 바와 같은 기타 부가제를 90% 백혈구독소 상청액/10% 부가제 수준으로 혼합한다. 그 다음 이 혼합물을 균등기내에서 유화시킨다.
다가 백신을 제조하기 위해서 A.피오게네스 백신과 F.네크로포룸 백신 성분을 1:1 V/V로 혼합한다. 그 다음 이 다가 백신을 소 또는 양에 통상적으로 투여할 수 있다(일반적으로 1회 이상 주사).
본 발명의 일가 또는 다가 백신은 반추동물에 적절한 항체를 생기게 하기 위해 비경구 주사 또는 기타 공지방법을 통해 통상적으로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 1회 또는 간격을 두고 여러 회 투여될 수 있다.
없음.

Claims (44)

  1. 간 농양의 발생률을 감소시키기 위해 소나 양에 투여하기 위한 접종물에 있어서,
    상기 접종물은 기본적으로 액티노미세스 피오게네스(Actinomyces Progenes)의 불활성 세포 배양산물로 구성되는 박테리아 성분과 상기 세포 배양산물과 혼합가능한 캐리어를 함유하는 것을 특징으로 하는 접종물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양산물은 분리된 A.피오게네스 세포, A.피오게네스 셀룰라 서브유니트, A.피오게네스 세포에 의해 만들어지는 상청액 및 이들의 혼합물로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 접종물.
  3. 제1항에 있어서,
    부가제를 함유하는 것을 특징으로 하는 접종물.
  4. 간 농양의 발생률을 감소시키기 위해 소나 양에 투여하기 위한 접종물의 제조방법에 있어서,
    A.피오게네스 박테리아 균주의 배양물을 증식 배지내에서 형성시키는 단계,
    상기 배양물에서 상기 박테리아가 증식하도록 하는 단계,
    상기 배양물로부터 세포 배양산물을 회수하여 불활성화시키는 단계로서 여기서 상기 세포 배양산물은 분리된 A.피오게네스 세포, A.피오게네스 셀룰라 서브유니트, A.피오게네스 세포에 의해 만들어지는 상청액 및 이들의 혼합물로 구성된 군 중에서 선택되는 단계, 및
    상기 세포 배양산물을 이와 혼합가능한 캐리어와 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 배양을 약 35~39℃에서 약 24~48시간동안 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 증식 배지는 브레인 하트 인퓨젼(Brain Heart Infusion) 증식 배지로 구성되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 세포 배양산물은 A.피오게네스 세포에 의해 만들어진 상청액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제4항에 있어서,
    수산화 알루미늄 및 오일을 기본으로 하는 또는 금속성인 염 부가제로 구성된 군 중에서 선택된 부가제와 상기 세포 배양산물을 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 소나 양의 간 농양의 발생률을 감소시키는 방법에 있어서,
    상기 간 농양의 발생률을 감소시키는 항생물질로 상기 소나 양을 정기적으로 처리하는 단계, 및
    기본적으로 A.피오게네스의 불활성 세포 배양산물로 구성되는 박테리아 성분과 상기 세포 배양산물과 혼합가능한 캐리어를 함유하는 접종물을 상기 소나 양에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항생물질은 티로신, 클로르테트라시클린, 옥시테트라시클린, 바시트라신 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 항생물질은 티로신인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 세포 배양산물은 분리된 A.피오게네스 세포, A.피오게네스 셀룰라 서브 유니트, A.피오게네스 세포에 의해 만들어지는 상청액 및 이들의 혼합물로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 접종물.
  13. 제9항에 있어서,
    부가제를 함유하는 것을 특징으로 하는 접종물.
  14. 완전 농축 사료를 공급받는 소의 간 농양의 발생률을 감소시키는 방법에 있어서,
    상기 소에게 약 95중량% 이상의 곡물을 함유하는 농축 사료를 공급하는 단계, 및
    기본적으로 A.피오게네스의 불활성 세포 배양산물로 구성되는 박테리아 성분과 상기 세포 배양산물과 혼합가능한 캐리어를 함유하는 접종물을 상기 소에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 세포 배양산물은 분리된 A.피오게네스 세포, A.피오게네스 셀룰라 서브유니트, A.피오게네스 세포에 의해 만들어지는 상청액 및 이들의 혼합물로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 접종물.
  16. 제14항에 있어서,
    부가제를 함유하는 것을 특징으로 하는 접종물.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 농축 사료는 실질적으로 완전히 곡물인 것을 특징으로 하는 접종물.
  18. 간 농양 및/또는 족 부패증의 발생률을 감소시키기 위해 소나 양에 투여하기 위한 접종물에 있어서,
    상기 접종물은 제1 및 제2박테리아 성분과 이와 혼합가능한 캐리어를 함유하며, 상기 제1박테리아 성분은 A.피오게네스의 불활성 세포 배양산물로 구성되고 상기 제2박테리아 성분은 F.네크로포룸의 불활성 세포 배양산물로 구성되는 것을 특징으로 하는 접종물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 세포 배양산물은 분리된 A.피오게네스 세포, A.피오게네스 셀룰라 서브유니트, A.피오게네스 세포에 의해 만들어지는 상청액 및 이들의 혼합물로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 접종물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 세포 배양산물은 세포 배양액 중의 A.피오게네스에 의해 만들어진 상청액인 것을 특징으로 하는 접종물.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 F.네크로포룸의 세포 배양산물은 세포 배양물 중의 F.네크로포룸에 의해 만들어지는 백혈구독소-함유 상청액을 함유하는 것을 특징으로 하는 접종물.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 제1 및 제2박테리아 성분은 상기 접종물 중에 약 1:1(v/v) 비로 존재하는 것을 특징으로 하는 접종물.
  23. 제18항에 있어서,
    부가제를 함유하는 것을 특징으로 하는 접종물.
  24. 간 농양 및/또는 족 부패증의 발생률을 감소시키기 위해 소나 양에 투여하기 위한 다가 접종물의 제조방법에 있어서,
    상기 제조방법은,
    A.피오게네스 박테리아 균주의 제1배양물을 제1증식 배지내에서 형성시키는 단계,
    상기 제1배양물에서 상기 A.피오게네스 박테리아가 증식하도록 하는 단계,
    상기 제1배양물로부터 제1세포 배양산물을 회수하여 불활성화시키는 단계로서 여기서 상기 제1세포 배양산물은 분리된 A.피오게네스 세포, A.피오게네스 셀룰라 서브유니트, A.피오게네스 세포에 의해 만들어지는 상청액 및 이들의 혼합물로 구성된 군 중에서 선택되는 단계,
    F.네크로포룸 박테리아 균주의 제2배양물을 제2증식 배지내에서 형성시키는 단계,
    상기 제2배양물에서 상기 A.피오게네스 박테리아가 증식하여 상청액 중에 백혈구독소를 만들도록 하는 단계,
    상기 제2배양물로부터 백혈구독소-함유 상청액을 회수하여 불활성화시킴으로써 제2세포 배양산물을 형성시키는 단계, 및
    상기 제1 및 제2세포 배양산물을 이와 혼합가능한 캐리어와 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 A.피오게네스의 배양을 약 35~41℃에서 약 12~48시간동안 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 제1 및 제2증식 배지는 브레인 하트 인퓨젼 증식 배지로 구성되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  27. 제24항에 있어서,
    상기 제1세포 배양산물은 세포 배양물 중 A.피오게네스 세포에 의해 만들어진 상청액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  28. 제24항에 있어서,
    수산화 알루미늄 및 오일을 기본으로 하는 또는 금속성인 염 부가제로 구성된 군 중에서 선택된 부가제와 상기 제1 및 제2세포 배양산물을 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  29. 제24항에 있어서,
    상기 F.네크로포룸 박테리아 균주는 생물형 A 균주이며, 상기 F.네크로포룸의 증식은 약 35~41℃의 온도에서, pH 약 6.5~8로 약 4~9시간동안 배양시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  30. 제24항에 있어서,
    상기 F.네크로포룸 균주는 ATCC 액세션 No. 55329를 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  31. 소나 양의 간 농양 및/또는 족 부패증의 발생률을 감소시키는 방법에 있어서,
    상기 간 농양 및/또는 족 부패증의 발생률을 감소시키는 항생물질로 상기 소나 양을 정기적으로 처리하는 단계, 및
    제1 및 제2박테리아 성분과 이와 혼합가능한 캐리어를 함유하는 접종물을 상기 소나 양에 투여하는 단계로서, 상기 제1박테리아 성분은 A.피오게네스의 불활성 세포 배양산물로 구성되며 제2박테리아 성분은 F.네크로포룸의 불활성 세포 배양산물로 구성되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 항생물질은 티로신, 클로르테트라시클린, 옥시테트라시클린, 바시트라신 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 항생물질은 티로신인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제31항에 있어서,
    상기 제1박테리아 성분은 분리된 A.피오게네스 세포, A.피오게네스 셀룰라 서브유니트, A.피오게네스 세포에 의해 만들어지는 상청액 및 이들의 혼합물로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제31항에 있어서,
    상기 접종물은 부가제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제31항에 있어서,
    상기 제1박테리아 성분은 세포 배양액 중의 A.피오게네스에 의해 만들어진 상청액인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제31항에 있어서,
    상기 제2박테리아 성분은 세포 배양물 중의 F.네크로포룸에 의해 만들어지는 백혈구독소-함유 상청액을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제31항에 있어서,
    상기 제1 및 제2박테리아 성분은 상기 접종물 중에 약 1:1(v/v) 비로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 완전 농축 사료를 공급받는 소의 간 농양 및/또는 우족부패증의 발생률을 감소시키는 방법에 있어서,
    상기 소에게 약 90중량% 이상의 곡물을 함유하는 농축 사료를 공급하는 단계, 및
    제1 및 제2박테리아 성분과 이와 혼합가능한 캐리어를 함유하는 접종물을 상기 소나 양에 투여하는 단계로서, 상기 제1박테리아 성분은 A.피오게네스의 불활성 세포 배양산물로 구성되며 제2박테리아 성분은 F.네크로포룸의 불활성 세포 배양산물로 구성되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 제1박테리아 성분은 분리된 A.피오게네스 세포, A.피오게네스 셀룰라 서브유니트, A.피오게네스 세포에 의해 만들어지는 상청액, 및 이들의 혼합물로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 제1박테리아 성분은 A.피오게네스 세포에 의해 만들어진 상청액인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제39항에 있어서,
    상기 농축 사료는 실질적으로 완전히 곡물인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제31항에 있어서,
    상기 접종물은 부가제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제39항에 있어서,
    상기 제2박테리아 성분은 세포 배양물 중의 F.네크로포룸에 의해 만들어지는 백혈구독소-함유 상청액을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
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