JPH11507377A

JPH11507377A - ウシおよびヒツジの免疫のためのアクチノマイセス・パイオジェネス（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびアクチノマイセス・パイオジェネス（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）／フソバクテリウム・ネクロフォラム（ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）ワクチン類

Info

Publication number: JPH11507377A
Application number: JP9502121A
Authority: JP
Inventors: ティー．ジー．ナガラジャ; エム．エム．チェンガッパ
Original assignee: カンザスステイトユニバーシティリサーチファウンデーション
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-06-29
Also published as: BR9610775A; EP0837695A1; WO1996040237A1; CA2223754C; MX9709785A; AR003432A1; DE69638358D1; AU6270996A; ATE506074T1; EP1535626A3; CA2223754A1; AU713257B2; EP1535626A2; KR19990022534A; EP0837695A4; EP1535626B1

Abstract

(57)【要約】ウシまたはヒツジのような反芻動物を免疫しその肝膿瘍および／または腐蹄症頻度を低下させるために投与される新規接種物が提供される。本発明は、第１の面において、適切な担体中にＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞培養物由来不活化細胞培養産物（例えば、細胞から得られた上清）を含むＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）由来ワクチンに関する。第２の面において、担体中に少なくとも第１および第２の菌成分を含む多価ワクチンに関し、前記第１成分はＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）の不活化細胞培養産物を含み、一方、第２の成分はＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)の不活化細胞培養産物を含む。本発明の接種物は、反芻動物が特にＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）感染を受け、肝膿瘍および／または腐蹄症になるような場合に有用性を見いだし、例えば、動物を定期的に抗生物質で処理し、または、ウシに対して高穀物含量濃縮物食を給餌する場合である。

Description

【発明の詳細な説明】ウシおよびヒツジの免疫のためのアクチノマイセス・パイオジェネス (ACTINOMYCES PYOGENES)およびアクチノマイセス・パイオジェネス (ACTINOMYCES PYOGENES)／フソバクテリウム・ネクロフォラム (FUSOBACTERIUM NECROPHORUM)ワクチン類発明の背景１．発明の分野本発明は、肝膿瘍および／腐蹄症の発生を低減するかまたは防止するため、ウシまたはヒツジに対して投与するための新規接種物に広く関する。さらに詳細には、本発明は、上記接種物、これを調製する方法、およびウシおよびヒツジにおける肝膿瘍および／または腐蹄症の発生を前記接種物の投与によって低減する方法に関する。本発明は、第１の面において、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）由来接種物に関し、第２の面において、Ａ．パイオジェネスの不活化細胞培養産物の形態の第１の菌成分とＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)の不活化細胞培養産物の形態の第２の菌成分を含む多価接種物に関する。２．先行技術の説明飼育場のウシにおける肝膿瘍は深刻な経済問題であり、米国において３００万以上の肝に診断宣告がなされ毎年１５００万ドルの推定損害を引き起こしている。この推定値は、主に、肝および他の臓器に対する診断宣告に基づいており、給餌効率の低下と体重増加減少に由来する経済的損失が含まれていない。いくつかの研究では、健常な肝を有するウシに比較して、膿瘍肝を有するウシでは、体重増加が低下し（平均４−５％）かつ給餌効率低下を有する（平均７％）ことが確認されている。穀物を給餌したウシにおける膿瘍肝の発生頻度は、約２５−３０％となっている。ウシにおける肝膿瘍は、第１胃上皮における感染の原発病巣に膿瘍化が続発している疾患合併症の一部である。その病理は、下記のように要約される；（１）第１胃病巣が、非常に不消化の食料から高穀物に食事が急激に変化した後に起こるアシドーシス、高穀物食の長期投与（時に全濃縮物食と称される）、または時には異物の第１胃通過によって誘発される；（２）第１胃中に存在する菌が上皮に侵入し、第１胃壁に病的な膿瘍を形成する；および（３）菌が門脈循環に入り肝まで運ばれ、そこで実質に局在し、その後膿瘍形成が起こる。Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)は、第１胃を有する動物において肝膿瘍の主要な病因である。この菌は、１８００年代後半から動物およびヒトの病原性物質として認められており、家畜と野生動物における数多くの壊死性疾患状態と関連している。前記菌はまた、肝膿瘍の他、腐蹄症、脚膿瘍、子ウシのジフテリアの主な病因であり、乳腺炎、子宮炎症例および口腔の壊死性病巣から頻繁に単離されている。肝で樹立するＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)の能力は、ロイコトキシン（すなわち、ロイコシジン）と称されるトキシンの産生による。このトキシンは可溶性で蛋白質性であり、ウシ白血球に対して特異性を有している。このロイコトキシンは、正常の防御系に障害を及ぼすことによって直接的に、および間接的には好中球およびマクロファージから肝細胞に放出される細胞溶解性産物によって起こる障害によって、肝においてＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)の樹立を助けると考えられている。したがって、Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum) によって入念に調製されたロイコトキシンは、肝のＦ．ネクロフォラム(F.necro phorum)感染に重大な役割を果たしている。Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)は、グラム陰性の、胞子非形成性の、非運動型の、厳密な意味で嫌気性の、多形性の菌である。この菌は、形態学的には、短い桿菌からとがった先端および丸い先端を有する糸状体（filamentous）まで変化する。細胞長さは、直径が０．５−０．７μｍの烏口状体から１００μｍを越える糸状体まである。表面コロニーは直径が１−２ｍｍであり、円状で、透明から乳白色で、一部の株は、αまたはβ溶血を起こす。この菌は、グルコース、フラクトース、およびマルトースをごくわずかであるが発酵させ、最終ｐＨは５．０−６．３である。それは、乳酸を酢酸、プロピオン酸および酪酸に発酵させる。酪酸は、乳酸発酵の主要産物である。インドールは、ペプトンから産生される。Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)は、ヒトおよび動物の口腔、消化管腔、および泌尿器管における正常菌網から単離されてきた。前記菌は、また、土壌中でも生存できることが知られている。Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)の４種のバイオタイプ（Ａ、Ｂ、ＡＢおよびＣ）が記載されてきた。バイオタイプＡは肝膿瘍から最も頻繁に単離されており、バイオタイプＢよりも病原性が強く、第一胃壁膿瘍に多い。バイオタイプＡＢは単離されることが稀で、バイオタイプＡおよびＢのそれの中間の病原性を有している。バイオタイプＣは、非病原性である。過去において、Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)バクテリシンを肝膿瘍に対してウシおよびヒツジを免疫するための物質として利用することが提案された。１９９１年１２月１１日付けＥＰＯ出願第４６０４８０号。特に、毒性の強いＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)単離物は、βプロピオラクトンを用い、次に、アジュバンドを添加することによって、不活化される。さらに、アべら（感染および免疫（Infectionand Immunity），13:1473-1478，1976）は、Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)を４８時間増殖させた。遠心分離によって細胞を得て、生理食塩水で３回洗浄し、ホルマリン（生理食塩水０．４％）で不活化した。不活化細胞を次にマウスに注入し、免疫性を導入した。最終の追加抗原刺激注入２週後に各マウスをＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)の生細胞で抗原投与した。死細胞で免疫され生細胞で抗原投与したマウスは、肝、肺または牌臓中で検出可能な菌を２８日後まで全く有していなかった。マウスをホルマリン死滅Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)で免疫すると感染に対して防御が付与される、と結論した。Ｇａｒｃｉａら(Canadian J．Comp．Med.，38:222-226,1974 )は、Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)のアルミニウム（alum）沈殿トキソイドの効果を評価するため、野外試験を実施した。このワクチン調製物は、超音波によって破砕した洗浄した細胞（ロイコトキシンを含有する可能性なし）で構成されていた。最も有望な結果が、細胞質トキソイド１５．５ｍｇ蛋白質を注入することによって得られた。この群では、肝膿瘍の頻度は、対照群の平均３５％から１０％にまで低下していた。最後に、Ｅｍｅｒｙら（Vet.Microbiol.，12:255 -268,1986）は、Ｆ．ネクロフォラム（F.necrophorum）の１８時間培養上清のゲル濾過によって物質を調製した。これは、生Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum )による抗原投与に対して有意な免疫性を惹起した。この注入調製物は、エンドトキシンおよびロイコトキシン活性の大半を含んでいた。１９９４年１月６日公開ＰＣＴ公報ＷＯ９４／００５５６は、新規Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)ロイコトキシド(toxid)ワクチン類ならびにＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)からのロイコトキシン調製を増大させる方法、およびロイコトキシンワクチンの製造方法を述べている。特に、この公報では、ロイコトキシン産生を最大にするため、Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)菌が温度約３５−４１℃でｐＨ約６．５−８の増殖培地中で約４−１０時間、有利に培養されることを開示している。その後、培養を停止し、ロイコトキシン保有上清を分離し不活化し、ワクチンを形成させる。Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）は、グラム陽性、球桿菌形状の通性嫌気性菌であり、動物およびヒトにおけるいくつかの発熱原性状態（“パイロバシロシス(Pyobacillosis)”と称される）に関連している。それは、Ｆ．ネクロフォラム（F.necrophorum）を含む他の細菌との混合培養において頻繁に単離される。ウシにおける肝膿瘍および腐蹄症において、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）が、最も頻繁に分離される病原体として第２位に位置している。前記菌はまた、肝膿瘍および腐蹄症の他に、肺、乳腺、関節および子宮のようないくつかの臓器の発熱性感染から頻繁に単離されている。Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）の病理メカニズムについては、まだ、十分に分かっていない。病原性に寄与する因子の一部に、エクソトキシン類（ヘモライシンまたはロイコトキシン）および蛋白質加水分解酵素、ＤＮａｓｅ類、およびノイラミニダーゼのような酵素類が含まれる。また、ウシにおいてＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）がＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)を含む他の菌類と相乗的に相互作用し、その組合せは、それぞれの種よりもより毒性が高いことの証拠も同様にある。しかし、ウシおよびヒツジを肝膿瘍および／または腐蹄症に対して免疫するためのＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）由来ワクチン類または接種物類は、過去において全く調製されたことがなかった。発明の概要本発明は、ウシおよびヒツジを免疫し、肝膿瘍および／または腐蹄症のその発生頻度を低下させるための接種物に関する。さらに、本発明は、上記接種物を調製する方法、およびウシおよびヒツジにおける上記病原性状態の頻度を低下させる方法に関する。本発明の一面では、菌成分および後者と混合された共存性担体を含むウシまたはヒツジに投与するための接種物が、提供される。前記菌成分は、基本的に、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）の不活化細胞培養産物で構成される；たとえば、前記成分は、分離Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞、Λ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞サブユニットまたは断片類、細胞培養物中のＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞によって調製された上清およびそれらの混合物で構成される群から選択される。前記担体は、水酸化アルミニウムまたは油基材または金属塩アジュバント類のような適切なアジュバント類のいくつかのうちのひとつであることができる。Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）接種物は、ブレインハートインフュージョン（Brain Heart Infusion）培地またはＲＰＭＩ１６４０培地のような増殖培地中で３５−３９℃で１２−４８時間、インキュベーションすることによるオーバーナイト培養を用いてＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）株の細胞培養物を形成することによって、調製される。インキュベーション時間の終点において（最も好適には約３６時間後）、細胞培養産物をホルマリン、β−プロピオラクトン、熱、放射線、またはその他不活化のために公知のいかなる方法をも用いて、不活化する。特に好適な態様では、全細胞培養物を不活化し２日間冷却する。その後、この不活化細胞培養物を遠心分離し、上清の抗原性物質を回収する。先にも述べたように、これとは別の操作では、全細胞培養物、上清細胞または細胞性サブユニットを前記の抗原性物質として用いることができる。いかなる場合でも、所望に応じて不活化および分離の後に、前記抗原性物質を適切なアジュバント担体と混合する。本発明は、また、ウシまたはヒツジに投与するための共存性担体中に第１および第２の菌成分類を含む多価接種物を包含する。第１の菌成分は、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）の不活化細胞培養産物を含み、第２の成分は、Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)の不活化細胞培養産物を含む。第１のＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）由来菌成分は上記に述べたようにして調製され、すなわち、本発明に従ってＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）接種物を使用する。第２のＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)由来菌成分は、本文で参考として引用したＰＣＴ公報第ＷＯ９４／００５５６号に記載の方法で調製される。さらに詳細に述べれば、多価ワクチンのためのＦ．ネクロフォラム(F.necroph orum)第２菌成分は、細胞培養物中のＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)細胞によって調製された不活化ロイコトキシン含有上清の形状である。Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)の培養では、好適には、ブレインハートインフュージョン培地のような適切な増殖培地中で約３５−４１℃の温度で約６．５−８のｐＨで約４−９時間、バイオタイプＡ株を培養することを必要とする。好適なＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)株は、ＡＴＣＣ寄託番号５５３２９を有している。培養段階終了時において、ロイコトキシン上清を分離し、好適にはホルマリン使用によるいかなる公知の手段によっても、不活化できる。その後、この不活化抗原性物質を、Ａ．パイオジェネス(A．pyogenes)ワクチン調製を参考として、記載された同一種の適切なアジュバントと混合することができる。本発明によれば、最終の多価接種物は、それぞれの第１および第２の細胞培養物に由来する第１および第２の菌成分と混合することによって、調製される。好適には、前記菌成分は、約１：１(v/v)比率で最終多価接種物中に存在する。本発明の接種物は、Ａ．パイオジェネス(A．pyogenes)が明らかな病因性物質となった場合において、特に有用性を有するであろうと判明した。たとえば、ウシまたはヒツジを肝膿瘍および／または腐蹄症頻度を低下させる抗生物質により定期的に処理した場合、かなりのパーセントの感染動物がその膿瘍菌網においてＡ．パイオジェネス(A．pyogenes)を発現することが見いだされたが、このことは予測されたことではなかった。したがって、肝膿瘍および／または腐蹄症の頻度を低下させるために反倒動物にチロシン、クロロテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、バシトラシン、およびそれらの混合物のような抗生物質を定期的に処方しても、これらの動物は、また、本発明の接種物で処理すべきである。このようにして、肝膿瘍および／または腐蹄症の頻度がさらに低下するであろう。さらに、少なくとも約９０％重量の穀物を含む高濃縮物食を投与されたウシは、肝膿瘍の頻度が高い（５０％を越える）ことが公知である。現在、濃縮物食投与ウシ由来肝膿瘍のうちで高いパーセントの肝膿瘍が、菌検査でＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）を発現することが分かってきた。したがって、濃縮物食給餌ウシは、大いに、本発明の接種物による処理で恩恵を受けることができる。好適な態様の詳細な説明下記の実施例では、１価Ａ．パイオジェネス(A．pyogenes)由来接種物の製造と使用のための好適な技術と、Ａ．パイオジェネス(A．pyogenes)およびＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)抗原性成分を含む多価接種物の製造と使用のための好適な技術を説明している。しかし、これらの実施例が例示のためのみであり、そのいずれも本発明の全範囲を限定していないことを理解されたい。実施例１この実施例では、抗生物質チロシン投与または非投与飼育場ウシ由来肝膿瘍の菌網を検査した。チロシン投与ウシ由来総計３６個の肝膿瘍をチロシン非投与ウシ由来肝膿瘍４１個とともに検査した。本検査で、チロシン投与動物の肝膿瘍でＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）頻度が高いことが明らかになった。したがって、チロシン投与動物ではＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)の役割が低下し、Ａ．パイオジェネス(A．pyogenes)がチロシン非投与動物の場合よりも大きな役割を果たすであろうと推定された。この検査の結果を、下記の表に示した。肝膿瘍中に見られるＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)の由来は周知であるが、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）の由来については、理解されていない。Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）は好気性であるので、第一胃の正常な居住者ではない；しかし、この菌は、第一胃の上皮（epimural）菌網の成分であることができる（第一胃壁に結合した菌）。通性嫌気性または好気性菌は、血液供給がさかんに酸素を供給する第一胃壁に固着することによって、嫌気性条件下で生存できるチャンスが高い。第一胃に極めて近接していることが、菌が門脈循環に入りそれによって肝に入る機会を高めている。菌は休止状態で留まり、条件（肝への侵入のような）が整ったならば、増殖できた。チロシン投与ウシにおいてＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）の発生頻度がより高いことは、この菌がチロシンに感受性であるが故に、驚くべきことである。実施例２この実施例では、全濃縮物食（１００％穀物）を給餌されたウシの肝膿瘍を細菌学的に調べた。全濃縮物食を利用した飼育場は、肝膿瘍発生頻度が高い（５０％を越える）ことが公知である。本研究では、動物２４匹の肝を調べ、１９個が膿瘍を有していることが分かった。これらの膿瘍のうち１８個を培養し、Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)が１２例で観察され、一方、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）は、１７個の膿瘍で観察された。このデータを下記の第２表で要約した。実施例１および２に記載の試験に基づけば、肝膿瘍を起こす際にＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)とＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）の間に相乗的相互作用があると考えられる。Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）の存在は、Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)等の活性を増大させることができる。第３表は、それぞれの菌とそれらの相互作用の特徴を示している。実施例３この実施例では、１価のＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）ワクチンの調製ならびに多価Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）／Ｆ．ネクロフォラム(F.necroph orum)ワクチンの調製についても、記載した。Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）ワクチンＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）の適切な株をブレインハートインフュージョン培地（DIFCO Laboratories、Detroit、MI）またはＲＰＭＩ１６４０培地（GIB CO Laboratories、Grand Island、NY）で増殖させる。増殖培地にＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）のオーバーナイト（一晩）培養物（１−５％接種物量）を接種し、５％CO₂雰囲気で１２−４８時間、３９℃でインキュベーションする（標準的な雰囲気も同様に使用できる）。インキュベーション時間の終点で、ホルマリンを vol/volで（０．３−０．４％）添加し、培養物を不活化する。不活化した全培養物を氷浴で冷却し、１日乃至２日間冷蔵する。その後、不活化細胞培養物を遠心分離し（１３，５００ｇで１５−３０分間）、上清の抗原性物質を回収する。別の操作では、全細胞培養物（細菌ワクチン）または細胞サブユニットを抗原性物質として使用できる。前記抗原性物質をその後適切なアジュバント（例水酸化アルミニウムまたは他の市販の油基材または金属性塩アジュバント）と混合し、ワクチンを完成させる。このワクチンを次に従来通りにヒツジまたはウシに投与し（１回以上のワクチン接種で）、この動物に抗体を惹起することができ、動物の肝または脚、またはその他臓器のいかなるものにおいてもＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）の樹立を防止するであろう。Ａ．パイオジエネス（A.pyogenes）／Ｆ．ネクロフオラム(F.necrophorum)ワクチンＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)ロイコトキソイドワクチン成分は、Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)バイオタイプＡ株（例株２５，ＡＴＣＣ寄託番号５５３２９）を前還元処理(０．０５％システインHCl)した嫌気性殺菌ブレインハートインフュージョン培地(DIFCO Laboratories、Detroit、MI)中で７時間、３９℃で増殖させることによって、調製する（６００ｎｍにおける吸光度０．８）。培養上清は、４℃で３０分間１３，５００gで遠心分離し、０．４５μ ｍのフィルター(Micron Separations，Inc.，Westborough，MA)で濾過し、次に０．３％ホルマリンで不活化し、得られる。細胞培養物上清中のＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)ロイコトキシンおよび蛋白質濃度は、ホルマリンによる不活化の前後においてアッセイする。この不活化上清を、上記のようにして、９０％ロイコトキシン上清／１０％アジュバントのレベルでリビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント(前混合、無菌形態、Ribi Immunochem Research Inc.，Hamilton，MA)と混合することによって得られる。その後、この混合物をホモジナイザーで乳化する。多価ワクチン調製のため、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）ワクチンおよびＦ．ネクロフォラム（F.necrophorum)ワクチン成分を、１：１v/v ベースで混合する。多価ワクチンを、その後、ウシまたはヒツジに対して従来通りに（通常、１回以上の注入による）投与できる。反芻動物において適切な抗体類産生を惹起するため、本発明の１価または多価ワクチン類は腹腔内注入またはその他の公知の技術によって従来通りに投与できる。上記投与は一度に、またはある時間にわたって複数回、投与できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/02 Ｃ１２Ｎ 1/02 1/14 1/14 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (54)【発明の名称】ウシおよびヒツジの免疫のためのアクチノマイセス・パイオジェネス（ＡＣＴＩＮＯＭＹＣＥＳＰＹＯＧＥＮＥＳ）およびアクチノマイセス・パイオジェネス（ＡＣＴＩＮＯＭＹＣＥＳＰＹＯＧＥＮＥＳ）／フソバクテリウム・ネクロフォラム（ＦＵＳＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭＮＥＣＲＯＰＨＯＲＵＭ）ワクチン類

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）の不活化細胞培養産物および該細胞培養産物と混合した化学的に安定な担体から構成される菌成分を含む、肝膿瘍頻度をウシまたはヒツジにおいて低下させるためにそこに投与するための接種物。２．前記細胞培養産物が、分離されたＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞サブユニット、Ａ．パイオジェネス（A. pyogenes）細胞によって調製された上清およびその混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の接種物。３．アジュバントを含む請求項１に記載の接種物。４．下記の段階からなる、肝膿瘍頻度を低下させるためにウシまたはヒツジに投与するための接種物を調製する方法：増殖培地中においてＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）菌株の培養物を形成すること；前記培養物中で前記菌を増殖させること；分離されたＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞、Ａ．パイオジェネス（A. pyogenes）細胞サブユニット、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞によって調製された上清およびそれらの混合物からなる群から選ばれる、前記培養物からの細胞培養産物を得て不活化すること；および前記細胞培養産物を化学的に安定な担体と混合すること。５．前記培養を約３５−３９℃の温度で約２４−４８時間実施する段階を含む請求項４に記載の方法。６．前記増殖培地がブレインハートインフュージョン（Brain Heart Infusion）増殖培地を含む請求項４に記載の方法。７．前記細胞培養産物がＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞によって調製された上清である請求項４に記載の方法。８．前記細胞培養産物を、水酸化アルミニウムおよび油基材または金属製塩アジュバント類から構成される群から選ばれたアジュバントと混合する段階を含む請求項４に記載の方法。９．下記の段階からなる、ウシまたはヒツジにおける肝膿瘍頻度を低下させる方法；前記肝膿瘍頻度を低下させる抗生物質で前記ウシまたはヒツジを定期的に処理すること；および前記ウシまたはヒツジに、少なくとも、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）の不活化細胞培養産物および前記細胞培養産物と混合した化学的に安定な担体から構成される菌成分を含む接種物を投与すること。１０．前記抗生物質が、チロシン、クロロテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、バシトラシンおよびその混合物から構成される群から選択される請求項９に記載の方法。１１．前記抗生物質がチロシンである請求項１０に記載の方法。１２．前記細胞培養産物が、分離されたＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞サブユニット、Ａ．パイオジェネス（ A.pyogenes）細胞によって調製された上清、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる請求項９に記載の方法。１３．アジュバントを含む請求項９に記載の方法。１４．下記の段階からなる、全濃縮物食を給餌されたウシにおける肝膿瘍頻度を低下させる方法；前記ウシに少なくとも約９５重量％の穀物を含む濃縮物食を給餌すること；および前記ウシに、少なくともＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）の不活化細胞培養産物および前記細胞培養産物と混合した化学的に安定な担体から構成される菌成分を含む接種物を投与すること。１５．前記細胞培養産物は、分離されたＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞サブユニット、Ａ．パイオジェネス（ A.pyogenes）細胞によって調製された上清、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる請求項１４に記載の方法。１６．アジュバントを含む請求項１４に記載の方法。１７．前記濃縮物食が基本的に完全に穀物である請求項１４に記載の方法。１８．化学的に安定な担体中の第１および第２の菌成分類を含み、前記第１の菌成分は、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）の不活化細胞培養産物を含み、前記第２の菌成分は、Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)の不活化細胞培養産物を含むことを特徴とする、肝膿瘍および／または腐蹄症頻度をウシまたはヒツジにおいて低下させるために投与するための接種物。１９．前記Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）の細胞培養産物が、分離されたＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞サブユニット、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞によって調製された上清および、それらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１８に記載の接種物。２０．前記細胞培養産物が、細胞培養物中のＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）によって調製された上清である請求項１９に記載の接種物。２１．Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)の前記細胞培養産物が、細胞培養物中のＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)細胞によって産生されたロイコトキシン含有上清を含む請求項１８に記載の接種物。２２．前記第１および第２の菌成分が前記接種物中に約１：１(v/v)比で存在する請求項１８に記載の接種物。２３．アジュバントを含む請求項１８に記載の接種物。２４．下記の段階からなる、肝膿瘍および／または腐蹄症頻度をウシまたはヒツジにおいて低下させるために投与するための多価接種物を調製する方法：第１増殖培地中においてＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）菌株の第１培養物を形成すること；前記第１培養物中で前記Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）菌を増殖させること；前記第１培養物から、分離されたＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞サブユニット、Ａ．パイオジェネス（A.py ogenes）細胞によって調製された上清、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる第１細胞培養産物を得て不活化すること；第２増殖培地中においてＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)菌株の第２培養物を形成すること；前記第２培養物中で前記Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)菌を増殖させることおよび上清中にロイコトキシンを調製させること；前記第２培養物からロイコトキシン含有上清を得て不活化し、第２細胞培養産物を形成させること；および前記第１および第２細胞培養産物を化学的に安定な担体と混合すること。２５．約３５−４１℃の温度で約１２−４８時間、前記Ａ．パイオジェネス（A. pyogenes）の培養を実施する段階を含む請求項２４に記載の方法。２６．前記第１および第２の増殖培地がブレインハートインフュージョン培地を含む請求項２４に記載の方法。２７．前記第１培養産物が、細胞培養物中にＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞によって調製された上清である請求項２４に記載の方法。２８．前記第１および第２の細胞培養産物を水酸化アルミニウムおよび油基材または金属製塩アジュバント類からなる群から選ばれるアジュバントと混合する段階を含む請求項２４に記載の方法。２９．前記Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)菌株がバイオタイプＡ株であり、前記Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)の増殖が約３５−４１℃の温度で約４−９時間、ｐＨ６．５−８で培養する段階を含む請求項２４に記載の方法。３０．前記Ｆ．ネクロフォラム(F.necrophorum)株がＡＴＣＣ寄託番号５５３２９を有している請求項２４に記載の方法。３１．下記の段階からなる、肝膿瘍および／または腐蹄症頻度をウシまたはヒツジにおいて低下させる方法；前記肝膿瘍および／または腐蹄症頻度を低下させる抗生物質で前記ウシまたはヒツジを定期的に処理すること；および前記ウシまたはヒツジに、化学的に安定な担体中に第１および第２の菌成分を含む接種物を投与すること、前記第１の菌成分は、Ａ．パイオジェネス（A.pyog enes）の不活化細胞培養産物を含み、前記第２の菌成分は、Ｆ．ネクロフォラム (F.necrophorum)の不活化細胞培養産物を含む。３２．前記抗生物質が、チロシン、クロロテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、バシトラシン、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる請求項３１に記載の方法。３３．前記抗生物質がチロシンである請求項３２に記載の方法。３４．前記第１の菌成分が、分離されたＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞サブユニット、Ａ．パイオジェネス（ A.pyogenes）細胞によって調製された上清、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる請求項３１に記載の方法。３５．前記接種物がアジュバントを含む請求項３１に記載の方法。３６．前記第１の菌成分が細胞培養中のＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞によって調製された上清である請求項３１に記載の方法。３７．前記第２の菌成分が、細胞培養中のＦ．ネクロフォラム（F.necrophorum ）細胞によって調製されたロイコトキシン含有上清を含む請求項３１に記載の方法。３８．前記第１および第２の菌成分が前記接種物中で約１：１(v/v)比で存在する請求項３１に記載の方法。３９．下記の段階からなる、濃縮物食を給餌されたウシにおける肝膿瘍および／または腐蹄症頻度を低下させる方法；前記ウシに少なくとも約９０重量％の穀物を含む濃縮物食を給餌すること；および前記ウシに対して、化学的に安定な担体中に第１および第２の菌成分を含む接種物を投与すること、前記第１の菌成分は、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）の不活化細胞培養産物を含み、前記第２の菌成分は、Ｆ．ネクロフォラム(F.nec rophorum)の不活化細胞培養産物を含む。４０．前記第１の菌成分は、分離されたＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞、Ａ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞サブユニット、Ａ．パイオジェネス（ A.pyogenes）細胞によって調製された上清、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる請求項３９に記載の方法。４１．前記第１の菌成分がＡ．パイオジェネス（A.pyogenes）細胞によって調製された上清である請求項４０に記載の方法。４２．前記濃縮物食が基本的に完全に穀物食である請求項３９に記載の方法。４３．前記接種物がアジュバントを含む請求項３９に記載の方法。４４．前記第２の菌成分がＦ．ネクロフォラム(F.necrophorum)細胞によって調製されたロイコトキシン含有上清を含む請求項３９に記載の方法。