JPH07505629A - パスツレラ・ヘモリティカ・タイプａ−１・バクテリン−トキソイドワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−ドパクチリンートキソイドワクチン発明 の分野 本発明は、パスツレラ・ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｌＩｏ ｌｙｔｉｃａ）のワクチンの分野に関する。より詳細には、本発明は、パスツレ ラ・ヘモリティカ由来のロイコトキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原および不活性 化細胞からなり、パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１感染に対して１回の 接種でウシの免疫性を誘導することのできるバクテリンートキソイドワクチン、 該ワクチンの製造方法およびウシ科動物に対する接種方法に関する。

関連出願に対する相互参照 本願は、１９９２年３月３０日出願の米国特許出願第０７／８６０．３７７号の 一部継続出願である１９９２年４月１６日出願の米国特許出願第０７／８６９゜ ９３４号の一部継続出願である１９９２年５月４日出願の米国特許出願第０７／ ８７８．１４６号の一部継続出願である。

発明の背景 ウシの病気全体の約４０ないし８０％が呼吸器系のものである（ソリ−。エル・ イー（Ｌｉｌｌｉｅ　ＬＥ）　：　ｒザ・ボバイン・レスピラトリー・ディシー ズ・コンプレックス（Ｔｈｅ　ｂｏｖｉｎｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｄｉｓ ｅａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）　Ｊ　、カナディアン・ベタ・ジャーナル（Ｃａｎ 、　Ｙｅｔ、　Ｊ、　）第１５巻　２３３〜２４２頁、１９７４年）。ウシの呼 吸器疾患症候群（ＢＲＤＣ）は米国の畜生産業における大きな問題である。ＢＲ ＤＣはいくつかの臨床的症候群からなり、その最もありふれた２つの症候群は、 フィードロットのウシの輸送熱および乳牛に通常見られる家畜地方属性ウシ・肺 炎である。多くのウィルス、ストレスの多い経営の実情、および環境因子が輸送 熱の発生において重要であることが現在認識されている。ビー・ヘモリティカの 生物型Ａ１血清型１（タイプＡ−１）は、急性の繊維素性肝葉ウシ肺炎を起こし 、ついで、死に至らしめる臨床的疾患および病理学的要因の原因となる主要な細 菌性病因である（イエイッ、ダブリューディージ−（Ｙａｔｅｓ　ｆＤＧ）　： 　ｒア・レビュー・オン・インフエク／ヤス・ボバイン・リノトラケイティス、 ンッピング・フィーバ−・ニューモニア・アンド・ウィラルーバクテリアル・シ ネルジスム・イン・レスピラトリー・ディシーズ・オン・キャトル（Ａ　ｒｅｖ ｉｅｗ　ｏｆ　１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｏｖｉｎｅ　ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉ ｔｉｓ、ｓｈｉｐｐｉｎｇ　ｆｅｖｅｒ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ａｎｄ　ｖｉｒ ａｌ−ｂａｃｔｅ窒奄≠■ ｓｙｎｅｒｇｉｓ＋＋　ｉｎ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｏｆ 　ｃａｔｔｌｅ）　Ｊカナディアン・ジャーナル・オン・コンパラティブ・メデ ィンン（Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｍｅｄ、　）第４６巻：２２５〜２６３ 頁、１９８２年）。

カナダのサスカチェワン（Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ）での２年間の研究におい て、ビー・ヘモリティカ・タイプＡ−１が、輸送熱で死んだウシの７４％から単 離された（シーファー、ビー（Ｓｃｈｉｅｆｅｒ　Ｂ）　、ワード、ノーイー（ ｌａｒｄ　ＧＥ）　、モファットアールイ−（Ｍｏｆｆａｔ　ＲＥ）　：　ｒコ レレーンヨン・オン・マイクロバイオロジカル・アンド・ヒストロンカル・ファ インディンゲス・イン・ポバイン・フィブリナス・ニューモニア（Ｃｏｒｒｅｌ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｈｉｓｔｏｌｏ ｇｉｃａｌ　ｆｉｎｄｉｎｇｓｉｎ　ｂｏｖｉｎｅ　ｆｉｂｒｉｎｏｕｓ　ｐｎ ｅｕｍｏｎｉａ）　Ｊベタリナリー・バソロジ−（Ｖｅｔ、　Ｐａｔｈｏｌ、　 ）第１５巻＋３１３〜３２１頁、１９７８年）。サウス・ダコタ（Ｓｏｕｔｈ　 Ｄａｋｏｔａ）州立大学の獣医科学科の年報（サウス・ダコタ・ステイト・ユニ バーンティー。

デパートメント・オン・ペタリナリー・サイエンス、アニマル・ディシーズ・リ サーチ・アンド・ダイアグノスティック・ラボラトリ−アニュアル・プログレス ・リポーツ１９８７〜１９９１　（Ｓｏｕｔｈ　Ｄａｋｏｔａ　５ｔａｔｅ　Ｕ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｄｅｐａｒｔ＋＋ｅｎｔｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　 ５ｃｉｅｎｃｅ、　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ 　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｌ≠ｂ盾窒≠狽盾窒凵F ＾ｎｎｕａｌ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１９８７−１９９１）　、 　ＮＣ１０７テクニカル・コミッティー。

オン・ポバイン・レスピラトリー・ディシーズ（ＮＣ１０７Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ 　Ｃｏ＋＋ｎ１ｔｔｅｅ　ｏｎＢｏｖｉｎｅ　Ｒｅ５ｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｄｉｓ ｅａｓｅ）に提出された）によれば、肺炎にかかったウシの肺の４８．７％から ビー・ヘモリティカ・タイプＡ−１が単離されたことが明らかである。よって、 該菌が、ウシの肺炎の原因となる主要な細菌であろう。

ビー・ヘモリティカ血清型Ａ−１は、輸送熱に見られる繊維素性肺炎ウシ肺炎お よび家畜地方弱性ウシ肺炎に関連した化膿性気管支肺炎の病因である。興味深い ことに、他のビー・ヘモリティカ血清型（しばしばＳＴ２およびＳＴ４、そして ときどきＳＴ７および５Ｔ１１）は、臨床的に正常なフィードロフトのウシの鼻 腔または上部気道（ＵＲＴ）の多くの部分に存在する無害の菌である（フランク 、ジーエイチ（Ｆｒａｎｋ　ＧＨ）　二ｒホエン・バス・ソレラ・ヘモリティカ ・コロナイジズ・ザ・ネイサル・パッセージズ・オン・キャトルＪ　（Ｔｈｅｎ 　Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ　ｃｏｌｏｎｉｚｅｓ　ｔｈ ｅ　ｎａｓａｌ　ｐａｓｓａｇｅｓ　ｏｆ　ｃａｔｔｌｅ）　、ベタ・メデイ（ ＹｅｔB Ｗｅｄ、　）第８３巻：１０６０〜１０６４頁、１９８８年およびウィルキー、 ビーエヌ（ｆｉｌｋｉｅ　ＢＮ）　、シュウエン。ビーイー（Ｓｈｅｗｅｎ　Ｐ Ｅ）　：　ｒディファイニング・ザ・ロール・ザット・パスツレラ・ヘモリティ カ・ブレイズ・イン・ンッピング・フィーバ−（Ｄｅｆｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒ ｏｌｅ　ｔｈａｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ　ｐｌａ ｙｓ　ｉｎ　ｓｈｉ垂垂奄獅■ ｆｅｖｅｒ）　Ｊベタ・メディ、第８３巻：１０５３〜１０５８頁、１９８８年 ）。臨床的に正常な乳牛においては、ビー・ムルトノダ（Ｐ、　＋１ｕｌｔｏｃ ｉｄａ）がＵＲＴフローラにおいて優勢であるかもしれない。ＵＲＴフローラ中 に種々の血清型のビー・ヘモリティカも見ることができる。対照的に、ビー・ヘ モリティカ・タイプ八−１は、フィードロットの牛および乳牛のＵＲＴにおいて わずかに見いだされる（フランク、ジーエイチ　上記（１９８８年）およびウィ ルキー、ビーエヌ、シュウエン。ビーイー　上記（１９８８年））。

ウィルス感染、販売、輸送、フィードロットでの管理、および気候の急激な変化 のごときストレス因子につ／をさらすことにより、ＵＲＴのすべての部分におい てビー・ヘモリティカ・タイプＡ−１の爆発的な増殖とコロニー形成が起こる（ フランク、ノーエイチ：上記（１９８８年）およびウィルキー、ビーエヌ、シュ ウエン。ビーイー・上記（１９８８年）。他の血清型のビー・ヘモリティカには このタイプの増殖を示すものはない。輸送熱肺炎においては、ビー・ヘモリティ カ・タイプＡ−１によるＵＲＴでのコロニー形成は、臨床的疾患そして同様に続 いて起こる繊維素壊死肝葉ウシ肺炎の進行にとり不可欠である。

肺炎の病因において潜在的に重要であるにもかかわらず、ＵＲＴにおいてビー・ ヘモリティカ・タイプＡ−１の爆発的な増殖を容易ならしめるコロニー形成の機 構はほとんど理解されていない。それにもかかわらず、これらの生物が、液滴核 、コロニー形成した剥離性上皮細胞あるいは咽頭分泌物の吸引により肺に侵入す ることが明らかである。ミネソタ（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）大学において（ホワイ トジー。エルオー（Ｙｈｉｔｅｌｅｙ　ＬＯ）ら、「パスツレラ・ヘモリティカ ・アンド轡ポバイン・レスピラトリー・ディシーズ、カレント・ソーラ・オン・ インタ・バソジェネシス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ　 ａｎｄ　ｂｏｖｉｎｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅ：Ｃｕｒｒｅ ｎｔ@ｔｈｏｕｇｔｓ ｏｎ　ｉｔｓ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）　Ｊ　、ベタ・インター・メデイ（ Ｖｅｔ、Ｉｎｔ、Ｍｅｄ、）第６巻＝１〜１２頁、１９９２年）、肺胞空間へ侵 入する急速に増殖する細菌の大多数が肺胞マクロファージと相互作用するのが見 いだされた。該細菌から放出されるエンドトキンンは肺胞壁を越えて肺血管内マ クロファージ、内皮、好中球、血小板、補体およびハーゲマン（ＢａｇｅＩＩａ ｎ）因子を活性化し、細胞と炎症媒体との複雑な相互作用を誘導する。好中球の 流入によるこの炎症応答の進行は、当該疾患に関連した急激な肺の損傷の原因で ある。ビー・ヘモリティカに対する主要な激毒性因子であるロイコトキシンは、 食細胞を破壊し、肺のクリアランス機構にも同様に損傷を与えることにより該細 菌が生き延びるのを可能にするかもしれない。

過去において、ビー・ヘモリティカ・死バクテリンを用いることにより肺のパス ツレラ症の予防が試みられてきた。しかしながら、バクテリンの接種により、菌 の攻撃にさらされた後の繊維素性肺炎の進行が促進されうることが示された（ス タンフォード、ニス・イー（Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｓ、　Ｅ、　）　、　ｒサム・ レスピラトリー・アンド・エンテリツク・ディジージズ・オン・キャトル：アン ・アップディト（ＳｏｍｅＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ａｎｄ　Ｅｎｔｅｒｉｃ　 Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｏｆ　Ｃａｔｔｌｅ、＾ｎ　Ｕｐｄａｔｅ）　、モダン・ベ タリナリー・プラクティス（Ｍｏｄ、　Ｙｅｔ、　Ｐｒａｃ、　）第６５巻（４ ）：２６５〜２６８頁（１９８４年））。生ワクチンでの免疫化は、一般的にう まく行かない。なぜならば、ビー・ヘモリティカの低抗原性および健康な動物に よる急速な不活性化のためである（ヘンリー、シー・ダブリュー（Ｉｌｅｎｒｙ 、Ｃ，？、）　［シツピング・フィーバ−・ニューモニアニア・ニュー・ルック ・アット・アン・オールド・エナミー（Ｓｈｉｐｐｉｎｇ　ｆｅｖｅｒ　ｐｎｅ ｕｍｏｎｉａ：ａ　ｎｅｗ　１ｏｏｋ　ａｔ　ａｎ　ｏｌｄ　ｅｎｅ＋＋ｙ）　 Ｊベタリナリー・メデイシン（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）　、 　１２００〜１２０６頁、１９８４年秋）０より最近になって、パスツレラ・ヘ モリティカのワクチンを開発する試みが、ビー・ヘモリティカのロイコトキシン に焦点を当てるようになった。ビー・ヘモリティカとウシ・好中球との相互作用 を調べるための研究において、標準的な組織培養の培地で増殖したビー・ヘモリ ティカの対数増殖期の間に最適な細胞毒の産生がなされることが、その結果によ り示された（パルニド、シー・ニス（Ｂａｌｕｙｕｔ、　Ｃ０Ｓ、　）ら、「イ ンターラクション・オン・パスツレラ・ヘモリティカ・ウィズ・ポバイン・ニュ トロフエルズ　アイデンテイフイケイション・アンド・バーノヤル・キャラクタ リゼインヨン・オン・ア・サイトトキシン（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ ａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ　ｗｉｔｈ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｎ ｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓF Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐａｒｔｉａｌ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）　Ｊ　、Aメリカ ン・ジャーナル・オン・ベタリナリー・リサーチ（Ａｍ、　Ｊ、　Ｙｅｔ、　Ｒ ｅｓ、）第４２巻第１１号、１９２０〜１９２６頁（１９８２年））。その著者 らは、「・・・・・・なぜならこの毒素が食細胞に影響するからであり、それは 劇毒性因子と考えられる。」と結論した（同１９２５頁）。

米国特許第４．９５７．７３９号には、ロイコトキシン成分のごとき精製ビー・ ヘモリティカ抗原を含有するワクチンが教示されている。該特許において、抗原 は、無細胞上清から精製されるかまたは組換えＤＮＡ法により得られる。Ｗ○９ １／１５２３７には、ビー・ヘモリティカの繊毛蛋白、プラスミン受容体蛋白、 ５０に外膜蛋白およびロイコトキ／ンからなる群から選択される少なくとも１種 のポリペプチドを含有するワクチン組成物が開示されている。米国特許第５，０ ５５．４００号には、ワクチン製造に使用される組換え型蛋白の製造に用いるビ ー・ヘモリティカＡ−１のロイコトキシンをコードしているＤＮＡが開示されて いる。米国特許第５．０５５．４００号は、ビー・ヘモリティカ由来の細胞毒上 清の防御能力に言及し、１９８６年１月２７日出願の米国特許出願第８２１．１ ９７号（現在米国特許第５，１６５．９２４号）をかかるワクチンの例として引 用している。

細菌を含まないビー・ヘモリティカ・タイプＡ−１由来の細胞毒性培養上清をウ シに接種することにより、実験的な菌の攻撃に対する抵抗性が誘導された（「プ ロン−ディンゲス・オン・ザ・ノース・アメリカン・ンンボジウム・オン・ボッ （イン・レスピラトリー・ディシーズ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ 　Ｎｏｒｔｈ　ＡｍｅｒｉｃａｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｒ ｅ５ｐｅｒａｔｏｒｙ　Ｔｌ１ｓｅａｓｅ）　Ｊ　（アール０ダブリニー〇ロー ン（Ｒ，１，Ｌｏａｎ）編）テキサス・エイ・アンド・エム・ユニバージティー ・プレス。

カレッジ・ステイション（Ｔｅｘａｓ　Ａ＆ｌＩ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒ ｅｓｓ、ＣｏＣｏ１１ｅ　５ｔａｔｉｏｎ）　、　Ｔｅｘ。

ｐｐ、４８０〜４８１　（１９８４年）中、シュウエン。ビー・イー（Ｓｈｅｗ ｅｎ、　Ｐ、　Ｅ、　）ら、［イミユニティ−・トウ・パスツレラ・ヘモリティ カ・セロタイプ１（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｔｏ　Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅ ｍｏｌｙｔｉｃａ　５ｅｒｏｔｙｐｅ　１）　Ｊ　）　ｏロイコトキシンおよび 血清型特異的表面抗原を含有する無細胞ワクチン（ブレポンス（Ｐｒｅｐｏｎｓ ｅ）’・パスツレラ・ヘモリティカ・トキソイド：ニューシャーシ−Ｈウニイン （ｌａｙｎｅ）のアメリカン・シアナミド・カンパニー（＾＋Ｉｅｒｉｃａｎ　 Ｃｙａｎａｍｉｄ　Ｃｏ、　）社製）は、生ビー・ヘモリティカを２回接種され 、ついで、気管内に対し線菌の攻撃を受けたウシの肺炎の予防に効果的であった ことが示された（ベクトルｊディー・ティー（Ｂｅｃｈｔｏｌ、　Ｄ、　Ｔ、　 ）ら、「フィールド・トライアル・オン・ア・ノ（スツレラ・ヘモリティカ・ト キソイド・アトミニスタート・アット・スプリング・プランディング・アンド・ イン・ザ・フィードロ・ｙト（Ｆｉｅｌｄ　Ｔｒｉａｌ　ｏｆ　ａＰａｓｔｅｕ ｒｅｌｌａ　ｈａｅｗｏｌｙｔｉｃａ　Ｔｏｘｏｉｄ　ＡｄＩｌｉｎｉｓｔｅｒ ｅｄ　ａｔ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｂｒａｎｄｉｎｇ@ａｎｄ　１ｎ ｔｈｅ　Ｆｅｅｃｌｌｏｔ）　Ｊ　、アグリープラクティス（Ａｇｒｉ−１’ｒ ａｃｔｉｃｅ）　、第１２巻第２号、６〜１４頁（１９９１年３月７４月））。

当該技術分野において、例えば、１回の接種で活性のある免疫性を付与し、それ により費用のかかる繰り返し接種の必要性を減じ、かつ皮下注射または筋肉内注 射により投与されるという便利さを持つ改良されたノくスツレラ・ヘモリティカ のワクチンが必要とされている。

発明の概要 本発明により、治療上有効量のパスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−トロイコ トキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原および不活性化細胞からなり、１回の接種で ラン種におけるパスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１に対する免疫性を誘導 することのできる新規バクテリンートキソイドワクチンが提供される。

さらに本発明により、治療上有効量のパスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−ト ロイコトキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原および不活性化細胞からなり、１回の 接種でラン種におけるパスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１に対する免疫性 を誘導することのできるバクテリレートキソイドワクチンの新規製造方法であっ て、パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１を後期対数増殖期に至るに十分な 時間培養し、ピー・ヘモリティカ培養物を不活性化し；ロイコトキソイド、莢膜 抗原、可溶性抗原および不活性化ピー・ヘモリティカ細胞からなる培養液を得る ことからなる製造方法が提供される。本発明により、該方法により製造されたワ クチンも提供される。

さらに本発明により、ウシ科動物に本発明バクテリンートキソイドワクチンを投 与することからなる、ウシ科動物の新規予防接種法が提供される。

さらに本発明により、ＡＴＣＣ５５３１８株のすべての性質を有するパスツレラ ・ヘモリティカの新規生物学的純粋培養が提供される。

発明の詳細な説明 本明細書で用いる「ロイコトキシン」なる語は、文献の教示のごとく、活発に増 殖しているパスツレラ・ヘモリティカにより産生される可溶性毒素をいう。例え ば、米国特許第５．０５５．４００号、カナダ特許出願第９１００００９７号お よびツエントリー（Ｇｅｎｔｒｙ）ら、「ニュートラライノング・モノクローナ ル・アンタイボディーズ・トウ・ピー・ヘモリティカ・ロイコトキシン・アフィ ニティー−ピユーリファイ・ザ・トキンン・フロム・クルード・カルチャー・ス ーパーネイタンツ（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔ ｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　Ｐ、ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａｌｅｕｃｏｔｏｘｉｎ　ａ ｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｙ　ｔｈｅ　ｔｏｘｉｎ　ｆｒｏＩｌｌｃｒｕｄｅ 　ｃｕｌｔｕｒｅ　５ｕｐｅｒｎ≠狽≠獅狽刀j　Ｊ マイクロバイアル・パソジェネノス（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅ ｓｉｓ）第１０巻、４１１〜４１７頁（１９９１年）参照。これらの開示を出典 明示により本明細書に一体化させる。「ロイコトキソイド」は、不活性化口イコ トキンンをいう。他の文献においては、ロイコトキノンをエキ７トキシンまたは 細胞毒ともいう。

「莢膜抗原」は、本明細書においては、文献記載のごと（、ピー・ヘモリティカ 由来の可溶性莢膜多糖を意味する。例えば、インザ九ティー・ジエー（Ｉｎｚａ ｎａ、Ｔ、Ｊ、）　、　ｒカプセルズ・アンド・ビルレンス・イン・ザ・エイチ ェイビー・グループ・オン・バクテリア（Ｃａｐｓｕｌｅｓ　ａｎｄ　Ｖｉｒｕ ｌｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＩＩＡＰ　Ｇｒｏｕｐｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）　 Ｊ　、カナディアン・ジャーナル・オン・ベタ・リサーチ（Ｃａｎ、　Ｊ、　ｏ ｆＹｅｔ、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）第５４巻：８２２〜Ｓ２７　（１９９０年）： およびアトラム（八ｄｌａｍ）ら、「ヒューリフィケーンヨン、キャラクタライ ゼーション・アンド・イミュノロジカル・ブロバティーズ・オン・ザ・セロタイ プ−スペシフィック・カブスラー・ポリサッカライド・オン・パスツレラ・ヘモ リティカ（セロタイプＡ１）１オーガニスムス（Ｐｕｒｕｆｕｃａｔｉｏｎ、ｃ ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐ ｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｒｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃａｐｓ ｕｌａｒ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｏｆＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａ ｅｍｏｌｙｔｉｃａ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ＾１）ｏｒｇａｎｉｓ＋ｍｓ）　Ｊジャ ーナル・オン噛ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　）第１３０巻：２４１５〜２４２６頁（１９８４年）参照。これ らの開示を出典明示により本明細書に一体化させる。

本明細書における「可溶性抗原」なる語は、ロイコトキシンおよび莢膜抗原以外 のピー・ヘモリティカの増殖中に分泌されるグリコプロテアーゼおよびノイラミ ニダーゼのごとき可溶性抗原を意味する。例えば、レジ−（Ｒｅｇｇｉｅ）ら、 「モレキュラー・スタディーズ・オン・Ｓ　ｓ　ａ　１．ア・セロタイプ−スペ シフィック・アンティジエン・オン・パスツレラ・ヘモリティカＡ　１　（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆＳｓａｌ、　ａ　５ｅｒｏｔｙｐｅ−３ ｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏ ｌｙｔｉｃａ＾１）vイン フエクンヨン・アンド・イミユニティ−（釦ｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕ ｎｉｔｙ）第５９巻第１０号：　３３９８〜３４０６頁（１９９１年）参照。

本発明は、１の態様において、治療上有効量のパスツレラ・ヘモリティカ・タイ プＡ−トロイコトキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原および不活性化細胞がらなり 、１回の接種でウノ種におけるパスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１に対す る免疫性を誘導することのできるパスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−ドパク チリンートキソイドワクチンを提供する。本発明における使用に適するパスツレ ラ・ヘモリティカＡ−１は、弱毒化しないすべてのタイプＡ−４であると考えら れる。現在のところ、好ましい株はＡＴＣＣ５５３１８である。

一般的には、本発明ワクチンを、パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１が最 適にロイコトキシン産生するように増殖させることにより製造することができる 。好ましくは、蛋白を増強した細胞培養培地で培養し、対数増殖期の間に培養液 を得る。

本発明ワクチンを製造するための好ましい方法の１つは、治療上有効量のパスツ レラ・ヘモリティカ・タイプＡ−トロイコトキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原お よび不活性化細胞からなり、１回の接種によりウシ種におけるパスツレラ・ヘモ リティカ・タイプＡ−１に対する免疫性を誘導することのできるバクテリンート キソイドワクチンの新規製造方法である。該方法は、パスツレラ・ヘモリティカ ・タイプＡ−１を後期対数増殖期に至るに十分な時間培養することを特徴とする 。

本発明に用いるのに適した標準的な培地は、蛋白を増強した細胞培養用培地であ り、当業者により選択される。一般的には、３％熱熱情活性化子／・血清、１％ トリプトースおよび０．１％ツイン（Ｔｖｅｅｎ）　８０　（ミズーリ州セント ルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ）社のポリソルベート）または同等物を補足したＲ ＰＭＩ−１６４０が一例として挙げられる。グルコースのごとき炭水化物を培地 に添加することにより増殖を促進することができる。

ｍ菌を、種菌接種から後期対数期に至るまで増殖させる。最適なロイコトキシン 生産には、後期対数期が好ましい。一般的には、培地に種菌接種後２．５ないし ６時間かかり、当該分野で知られているように、時間に対する吸光度の関係によ り正確に調べることができる。

増殖が後期対数期にある間に、不活性化剤を培養液に添加する。好ましくは、不 活性化剤はホルマリン（米国薬局方ホルムアルデヒド溶液）のごとき固定作用の あるものであり、通常は、約１１ないし約０５％（ｖ／ｖ）といった相対的に低 い濃度で使用する。

ついで、ロイコトキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原および不活性化パスツレラ・ ヘモリティカ細胞からなる培養液を、遠心分離のごとき当該分野で知られた標準 的な方法により得る。上清か無細胞でないことが重要であり、よって、すべての 細胞を除去する濾過のごとき集菌方法は本発明の範囲内ではない。細胞を遠心分 離して濃密な水性墾濁液にすることにより、細菌の大部分は除去される。好まし くは、遠心分離を約１０．ｏｏｏｘｇで行う。培養物から細胞の大部分を除去す るための方法および条件は当業者に知られている。

本発明方法における不活性化と集菌の順序は厳密でないと考えられる。現在のと ころ、集菌の前に不活性化を行うのが好ましい。

上清を集め、不活性化の前に測定した上清ｍｌあたり１０”ないし１０＠個の細 胞が含まれている。細胞数を測定するのは困難で、実質的にバッチごとに細胞数 は変化する。本発明ワクチンにより付与される免疫性を提供するのを助ける細胞 がワクチン中に存在することの必要性により、細胞数の下限が決定される。上限 は、接種した動物に起こり得る過剰反応を回避するように決定される。不活性化 前の上清中、１０６個までのレベルが示された。

本発明方法により得られ、本発明ワクチンに使用される上清は、ロイコトキソイ ドに富む標品であり、莢膜抗原、可溶性抗原および不活性化パスツレラ・ヘモリ ティカ・タイプＡ−１細胞ならびに細胞残置からもなる。

記載した本発明ワクチンは、希釈あるいは１縮されてもよい培養上清である。

さらに他の好ましい本発明ワクチン組成物は、本発明ワクチンと他のワクチン剤 （特にＢＲＤＣの原因となる抗原）とを混合することにより得られる。その例と しては、パスツレラ・ムルトンダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｌｔｏｃｉ ｄａ）　、ヘモフィルス・ソムヌス（口ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｏｍｎｕｓ） 　、クロストリジアル−スピーシズ（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉａｌ　５ｐｅｃｉｅｓ ）　、ミコプラズマ・スピーノズ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｗａ　５ｐｅｃｉｅｓ）、 ウシ・呼吸器合胞体ウィルス、ラン・ウィルス性下痢ウィルス、ウシ・パライン フルエンザ３型ウイルスが挙げられる。

無毒化かつ滅菌された医薬上許容される担体中の活性成分として治療上有効量の 該上清を含有する医薬組成物として本発明ワクチンを製造してもよい。本発明ワ クチンの好ましい具体例は、その中でワクチンが凍結乾燥された形態であり、使 用直前に少なくとも１種のアジュバントとともに復元されるものである。かかる ワクチンは、安定性が高（、遊離エンドトキ／ンが減じられているために好まし い。そのことは、ワクチン接種後の全身的反応を減少させる。かかるアジュバン トとしては、特に、米国特許第５．０８４．２６９号に教示されているように鉱 油およびレシチンエマルジョン［ヒドロニクス・インク（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ　 Ｉｎｃ、　）のアムフィジェン（＾ｍｐｈｉｇｅｎ）　’］　、あるいは他の分 散油、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、ならびにキルＡ　（Ｑｕｉｌ ＾）のごときサポニンが挙げられる。

米国特許第５．０８４．２６９号の開示を、出典明示により本明細書に一体化さ せる。

本発明によれば、好ましくは、医薬調製物により、０．５ないし３ｍｌの間、よ り好ましくは約２ｍｌの免疫原量の活性成分および担体からなる単位用量が提供 される。

本発明の目的のためには、治療上有効量のワクチンは、１回の接種でビー・ヘモ リティカに対するラン種の免疫性を誘導する量である。より詳細には、この量は 、本発明により製造された種々のワクチン標品をウソで試験し、ビー・ヘモリテ ィカの攻撃を受けた場合、１回の接種で滴定すべき有意な数のウシの免疫性を誘 導するワクチン標品を選択することにより容易に決定される。ワクチンにより誘 導された免疫性を、実験的な細菌の攻撃に対する抵抗性により測定することがで きる。それは、死亡率の減少または消失、臨床的兆候の消失または最小限の臨床 的兆候の出現、当業者に知られた特徴的な肺の障害の減少または完全な消失によ り反映される。

望ましい投与規則は、本発明の好ましいワクチン組成物が活性のある免疫性を付 与する１回分の用量とする。追加免疫は、引き続き細菌への暴露またはストレス の可能性のある場合にはいつでも望ましいと考えられる。本発明ワクチンの投与 方式は、宿主にワクチンを送達するいかなる好適な経路であってもよい。現在の ところ、好ましくは、ワクチンを皮下注射または筋肉内注射により投与する。

好ましい凍結乾燥ワクチンは、滅菌希釈剤を含んだアジュバントとともに無菌的 に再水和されるものである。離乳、輸送、あるいはストレスまたは感染しやすい 条件に置く前に健康なウシに投与する。

実施例により、以下に本発明ワクチンの好ましい製造方法および種々のワクチン の製造方法ならびに試験方法を説明する。これらの実施例は、単に説明的なもの であって、本発明の範囲を限定するものではない。

本発明により具体化されるワクチンは、１９９２年５月１８日から米国において 市販されており、ワンーンヨット（Ｏｎｅ−３ｈｏｔ）　（ペンンルバニア州イ クストン（Ｅｘｔｏｎ）のスミスクライン・ビーチャム・アニマル・ヘルス（Ｓ ｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍ　Ａｎｉｍａｌ　ｌ１ｌｅａｌｔｈ）の登録 商標）として知られている。

本発明の実施に有用な菌株の寄託 以下の菌株の生物学的に純粋な培養の寄託を、メリーランド州ロックビル（Ｒｏ ｃｋｖｉｌｌｅ）のバークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ） 　１２３０　］のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ門ｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に対して行った。示 された受託番号は、生育試験および必要な料金の支払い後に付与された。出願の 係属中は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの長官により３７Ｃ ＦＲ１，１４および３５ＵＳＣ１２２の下、資格ありと決定された者については 上記培養の利用が可能であろう。出願に対し特許付与された場合にはすぐに上記 培養の公の利用に対するすべての制限が解除されるであろう（解除の取り消しは されない）。そのうえ、命名された寄託菌株は、寄託日より３０年間、または最 後の寄託要請後５年間、あるいは米国特許の存続期間のいずれか長い期間維持さ れるであろう。培養が死滅または不注意にも破壊、あるいはプラスミド保持菌が そのプラスミドを失った場合には、同一の分類上の種類のものど置き換えられる であろう。

菌株　寄託日　ＡＴＣＣ番号 パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１１９９２年４月９日　５５３１８実施 例１ ワクチン製剤 ビー・ヘモリティカ（Ｐ、　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）タイプＡ−１（１９９２ 年４月９日寄託、ＡＴＣＣ受入れ番号５５３１８）を、３７℃、ブレーンハート インフュージョン（ＢＨＩ）寒天上で一夜増殖させた。その後の継代を一組のエ ルレンマイヤーフラスコ、９および１９リツターのガラス瓶または種子醗酵槽中 のＢＨＩブロスにて行った。その最終生成培地は、３％熱不活化子ウつ血清、１ ％トリプトースおよび領１％ツイン８０で強化した、炭酸水素ナトリウム（０， ２％Ｗ／Ｖ）含有のＲＰＭ１１６４０組織培地からなる。アンチフオームを００ ６％最終濃度にて加えた。その最終醗酵槽を５％接種原で接種した。培養体を３ ７℃で４，５時間増殖させ、その培養体の溶解酸素含量をモニター観察し、エア レーションにより４０％のレベルに調整した。培養体を連続的に撹拌し、ｐＨ７ ，４に維持した。

接種の２５．３．２５および４．０時間後に滅菌５０％グルコースを添加するこ とで増殖を刺激した。種菌接種の４５時間後（後期対数増殖期）で、該培養体を １０℃に冷却し、ホルマリンを０．１％（Ｖ／Ｖ）の最終濃度まで加えて不活化 した。培養流体を醗酵槽中で１時間撹拌し、ついで完全に不活化するまで一定速 度で撹拌しながら５日間４℃で貯蔵した。不活化流体を遠心分離に付し、上清を 確保した。保存剤として、滅菌１０％メルチオレート（Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ ）および１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を、各々、最終濃度領０１ ％および０．０７％まで加えた。ワクチンの組立てに解凍するまで、該上清を一 ５０℃で貯蔵した。

該上清を解凍し、定量検定の結果に基づき、滅菌リン酸緩衝食塩水を添加して組 み立てた。該組立て生成物をボトル中にアリコートし、凍結乾燥し、４℃で貯蔵 した。

二相アジュバント基は、商品名：アンフィゲン（Ａ　ｍｐｈｉｇｅｎ［Ｆ］）で 市販されている５％Ｖ　／　Ｖ鉱油／レシチンエマルジョンアジュバントと、１ ２％Ｖ／Ｖ水酸化アルミニウムゲルと、食塩水（以下、「アジュバント希釈体」 という）とからなる。そのアジュバント希釈体を瓶詰めし、凍結乾燥ワクチンを 再水和するのに該ワクチンを、ワクチン接種−攻撃実験により保護能についてウ シにて試験した。

１４９６の相対細胞（ＲＵ）／用量のロイコトキソイドおよび２５８０の莢膜抗 原を凍結乾燥した多量の上清に付与し、ワクチンを調製するのに用い、本明細書 にて教示されているように、ラン科におけるビー・ヘモリティカタイプＡ−１感 染による感染症に対して一回の投与にて免疫性を誘発することが判明した。

実施例２ パスツレラ・ヘモリティカ・バクテリシートキソイドー単ワクチン接種− 用量力価測定実験 表　１ 一回の投与実験 ワクチン番号　動物の数　ワクチン接種　攻撃　剖検１５　０日　１４日　２０ 日 ２　５　０日　１４日　２０日 ３　５　０日　１４日　２０日 ４　５　０日　１４日　２０日 動物：　４００〜５５０１ｂｓ、、肉ウシ攻撃：　チェリーのリン酸緩衝食塩水 （ＣＰＢＳ）５００ｍｌ中、ビー・ヘモリティカＡ−１、異種菌株（ｈｅｔｅｒ ｏｌｏｇｏｕｓ　５ｔｒａｉｎ）、２．２ｘｌＯ’ｃｆｕ。

気管内投与。

ワクチン＝１．アジュバント希釈体で８００ＲＵロイコトキソイドおよび１３８ ＯＲＵ莢膜抗原／用量に希釈、２ｍｌ用量−筋肉的投与。

２．アジュバント希釈体で４００ＲＵロイコトキソイドおよび６９０ＲＵ莢膜抗 原／用量に希釈、２ｍｌ用量−筋肉的投与。

３、アジュバント希釈体で２００ＲＬ１ロイコトキソイドおよび３４５ＲＵ莢膜 抗原／用量に希釈、２ｍｌ用量−筋肉的投与。

４、ブラセポ（対照）、アジュバント希釈体でワクチン番号３のように希釈、２ ｍｌ用量−筋肉的投与。

ワクチン番号　動物の数　肺硬化の平均％　肺硬化の％減少１　５　０．００　 １００．００ ２　５　０．１８　９９．３０ ３　５　０．１４　９９．５０ 、ｉ　５　２７．４２　−一 実施例３ パスツレラ・ヘモリティカ・バクテリシートキソイド免疫原性実験 表　■ 一回の投与実験 ワクチン番号　動物の数　ワクチン接種　攻撃　剖検１（ＩＭ）　２０　０日　 １４日　２０日１（ＳＣ）　２０　０日　１４日　２０日２　１０　０日　１４ 日　２０日 動物：　４００〜５５０１ｂｓ６．肉ウシ攻撃：　ＣＰＢＳ５００ｍｌ中、ピー 、ヘモリティカＡ−１、異種菌株、１．６Ｘ１０’ｃ　ｆ　ｕ。

気管内投与。

ワクチン：１．アジュバント希釈体で２００ＲＵロイコトキソイドおよび３４５ ＲＵ莢膜抗原／用量に希釈、２ｍｌ用量−筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）投 与。

２、ブラセポ（対照）、アジュバント希釈体でワクチン番号１のように希釈、２ ｍｌ用量−筋肉的投与。

ワクチン番号　動物の数　肺硬化の平均％　肺硬化の％減少１　（ＩＭ）　２０ 　１．４６　９４．２０１　（ＳＣ）　２０　４．７７　８１．２０２　１０　 ２５．３２　−−一 実施例４ パスツレラ・ヘモリティカ・バクテリシートキソイド表　Ｖ −回の投与実験 ワクチン番号　動物の数　ワクチン接種　攻撃　剖検１（ＩＭ）　１０　０日　 １４日　２０日１（ＳＣ）　１０　０日　１４日　２０日２　１０　０日　１４ 日　２０日 動物、４００〜５５０］ｂｓ、、肉ウシ攻撃、ピー・ヘモリティカＡ−１，２， ５ｘｌＯ”ｃｆｕ／ｍｌを５ｍｌ。

経胸腔的肺内投与。

ワクチン　１．アジュバント希釈体で再水和、２ｍｌ用量−筋肉内（ＩＭ）また は皮下（ＳＣ）投与。

２　プラセポ（対照）、アジュバント希釈体で再水和、２ｍｌ用量−皮下投与 ワクチン番号　動物の数　死亡率　平均肺病変評点＊１　（ＩＭ）　１０　１０ ．０　８．６Ａ１　（ＳＣ）　１０　１０．０　８．５Ａ２　１０　８０．０　 １８．１” ＡとＢの間の違いは統計学的に有意である（ｐ＜０．００１）実施例５ パスツレラ・ヘモリティカ・トキソイド４力月間の免疫性実験 この実施例では、体重的４５０１ｂｓ、（２０４，５ｋｇ）の肉ウシを２０頭選 択した。１０頭の肉つシ（群１）を、以下に示すように、１回２ｍｌ用量のパス ツレラ・ヘモリティカ・バクテリンートキソイドで皮下的に接種した。別の１０ 頭のウシ（群２）を、ピー・ヘモリティカ抗原を除くパスツレラ・ヘモリティカ ・バクテリンートキソイドの全成分を含有し、対照として供する１回２ｍｌ用量 のブラセボで皮下的にワクチン接種した。ウシを、ワクチン接種の４力月７日後 で、ピー・ヘモリティカの異種菌株で気管内攻撃した（表■）。攻撃接種原は、 チェリー・リン酸緩衝食塩水（ＣＰＢＳ）１．２Ｘ１０’個のコロニー形成幹細 胞（ｃ　ｆ　ｕ）を含有するピー・ヘモリティカのブロス培養体からなる。いず れの動物も攻撃に屈しなかった。攻撃の６日後、動物を剖検した。

対照動物は攻撃後の２日間、攻撃のため体温の著しい上昇（統計的に有意）を示 したが、ワクチン接種した動物は、ワクチン接種後に１日、体温の上昇を示した 。統計分析によれば、ワクチン接種体と対照の間で、攻撃の２日後で、平均体温 において有意な差異があることがわかった。

静脈穿刺により各動物から採血した血液試料の血清を、凝集反応測定法によりピ ー・ヘモリティカ全細胞に対する、ロイコトキシン中和測定法によりロイコトキ ンンに対する、および固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により莢膜抗原に対す る抗体価について試験した。試料を、ワクチン接種前に、ワクチン接種の４力月 後（攻撃前）および攻撃の６日後（剖検の時に）に採血した。幾何平均（ＧＭ） 抗体価を各試験について計算し、ワクチン接種前の抗体価と比較して、莢膜抗原 に対する抗体価だけが、ワクチン接種の４力月後および攻撃の６日後で、ワクチ ン接種の動物（群１）にて有意に高いという結果が得られた。

剖検では、肺を摘出し、肺炎性パスツレラ症に特徴的な病変について評価した（ 表■）。影響を受けた部分を秤量し、関連する肺の割合を肺全重量のパーセント として表すことによって肺を評点した。加えて、影響のある部分の描写を包含す る視覚検査により評点した。肺全体の重量との関連で影響のある肺組織の真の重 量に基づいて測定した場合、対照動物は１９３５％の平均肺硬化を有したが、ワ クチン接種した動物の平均肺硬化は２６５％であった。影響のある肺組織の視覚 的評価は、ワクチン接種した動物で１．６８％、対照動物で１３．３５％の平均 肺硬化を与えた。これらの結果は、重量を基礎とした場合、群２と比較して群１ の肺病変が８６．３％減少したことを示し、視覚検査を用いた場合、８７．４２ ％の減少を示した。統計的分析は、ワクチン接種体と対照の間の肺硬化の差異が 有意であることを示した（ｐ＜１０５）。

剖検で皮下注射部位を注意して調べ、いずれの群の動物も肉眼で識別できる組織 反応がなかった。肺組織の病変関連領域から細菌の単離を試みた。１０頭のうち ４頭のワクチン接種体および１０頭のうち８頭の対照の肺病変から、ピー・ヘモ リティカが単離された。

これらの結果は、この生成物が、−回用量のワクチンの投与後、４力月まで安全 かつ効果的であることを示す。この生成物を用いるウシのワクチン接種は攻撃表 　■ ４力月間の免疫性実験 ワクチン番号　動物の数　ワクチン接種　攻撃　開瞼１　１０　０日　１３０日 　１３６日 （４力月、７日） ２　１０　０日　１３０日　１３６日 （４力月、７日） 動物・　肉つシ、＞６００１ｂｓ 攻撃＋　ＣＰＢＳ５００ｍｌ中、ビー−ヘモリティカＡ−１、異種菌株、１．２ Ｘ１０’ｃｆｕ／ｍｌ。

気管内投与。

ワクチン・１　付随のアジュバント希釈体で再水和した認可前の一連番号１（一 連番号２４２７５０１０、約３０５ＲＵロイコトキソイドおよび約５２９ＲＬＪ 莢膜抗原）　２ｍｌ用量−皮下投与。

２、付随のアジュバント希釈体で再水和したブラセボ（対照）。

２ｍｌ用量−皮下投与 表一■ ワクチン番号　動物の数　肺硬化の平均％＊　肺硬化の％減少１　１０　２．６ ５’　８６．３ ２　１０　１９．３５’　−一一 本：ＡとＢの間の差異は統計学的に有意である（ｐ＝０．０１６９）実施例６ パスツレラ・ヘモリティカ・バクテリシートキソイド免疫性実験の開始 実施例１の記載に従ってワクチンを製造した。［ロイコトキソイド効能＝２５４ 相対細胞／用量（１５力月の自然エイジング）、莢膜抗原効能＝７５８相対細胞 ／用量］ 平均体重５５３１ｂｓ、（２５１ｋｇ）の３０頭の肉ウシをこの実施例のために 選択した。１０頭のウシ（群Ａ）を、攻撃の７日前、１回２ｍｌ用量のパスツレ ラ・ヘモリティカ・バクテリンートキソイドで皮下投与によりワクチン接種した 。別の１０頭のウシ（群Ｂ）を同一方法で１回２ｍｌ用量のワクチンを用いて攻 撃の３日前にワクチン接種した。さらに別の１０頭のウシ（群Ｃ）を攻撃の７日 前に１回２ｍｌ用量のブラセポ（パスツレラ・ヘモリティカ抗原を除＜、ノクス ッレラ・ヘモリティカ・バクテリンートキソイドの全成分を含有し、対照として 供する）で皮下注射した。ワクチン接種の７日後（群ＡおよびＣ）またはワクチ ン接種の３日後（群Ｂ）、ピー・ヘモリティカの異種菌株でウシを気管内投与に より攻撃した。攻撃接種体は、チェリーのリン酸緩衝食塩水（ＣＰＢＳ）５００ ｍｌ中、３．０Ｘ１０”コロニー形成細胞（ｃ　ｆ　ｕ）含有のピー・ヘモリテ ィカのブロス培養基からなった。群Ｂ中の１頭の動物および群Ｃ中の１頭の動物 が攻撃に屈し、できる限り早く剖検に付した。他のすべての動物は攻撃の６日後 に剖検した。

動物の３分の２の攻撃前の体温は４０℃であり、それで攻撃後のいずれの時期に おいても、いずれの群においても、攻撃による体温の著しい上昇は見られなかっ た。

静脈穿刺により各動物から採血した血液試料の血清を、凝集反応測定法によりピ ー・ヘモリティカ全細胞に対する、ロイコトキノン中相測定法によりロイコトキ ノンに対する、および固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により莢膜抗原に対す る抗体価について試験した。ワクチン接種前、攻撃の直前である、ワクチン接種 の７日後（群ＡおよびＣ）およびワクチン接種の３日後（群Ｂ）に、ならびに攻 撃の６日後（剖検の時点で）に試料を採血した。幾何平均（ＧＭ）抗体価を各試 験について計算し、３種のすべての抗原に対する有意な応答が、ワクチン接種の ７日後での群Ａの動物において見られ、ワクチン接種の３日後の群Ｂの動物にて 、またはプラセポ投与の７日後の群Ｃの動物にてそのような応答が観察されない という結果が得られた。

剖検では、肺を摘出し、肺炎性パスツレラ症に特徴的な病変について評価した。

影響を受けた部分を秤量し、関連する肺の割合を肺全重量のパーセントとして表 すことによって肺を評点した。加えて、影響のある部分の描写を包含する視覚検 査により評点した。肺全体の重量との関連で影響のある肺組織の真の重量に基づ いて測定した場合、対照動物は２６６％の平均肺硬化を有したのに対して、攻撃 の７日前にワクチン接種した動物は１２．７％の平均肺硬化を示し、攻撃の３日 前にワクチン接種した動物は３６．１％の平均肺硬化を有した。影響ある肺組織 の視覚評点は、平均肺硬化が７日のワクチン接種を受けた場合で８．６％、３日 のワクチン接種を受けた場合で２８．７％、そしてプラセポ対照の場合で１７． ８％であった。これらの結果は、重量を基礎とした場合、群Ｃと比較して群への 肺病変が５２．３％減少したことを示し、視覚検査を用いた場合、５１．７％の 減少を示した。

統計的分析より、群Ａと群Ｂの間の肺硬化の差異が有意であり（ｐ＜０．０５） 、群ＡとＣの間ではそうでないことがわかった。３日のワクチン接種を受けたも のとブラセボ対照を比較した場合、肺病変の減少は何ら観察されなかった。

剖検で皮下注射部位を注意して調べた。３つのすべての群のうち、約５０％の動 物が注射部位で組織反応の形跡を有した。肺組織の病変関連領域から細菌の単離 を試みた。１０頭の７日ワクチン接種体うち５頭の、１０頭の３日ワクチン接種 体のうち８頭の、および１０頭のプラセボ対照のうち７頭の肺病変から、ピー・ ヘモリティカが単離された。

これらの結果は、この生成物を一回用量にて投与すると、動物をワクチン接種の ７日後に攻撃した場合、肺損傷を減少させることができるが、ワクチン接種の３ 日後では減少させることができないことを示す。攻撃の７日前にウシをこの生成 物でワクチン接種すると、攻撃に対する耐性が強化された。

結論 すべての実験で該ワクチンの安全性は確認された。都合の悪い反応は何ら観察さ れなかった。さらに、３種の異なる一連のワクチンを３．　ＯＯＯｉ１以上の動 物に投与して安全性が得られた。試験にてワクチン接種したもののうち３．５％ にて局所反応が得られ、その多くは一時的であった。他の反応はほとんど観察さ れなかった。

抗原吸光実験を行い、ワクチンの非保護投与量レベルを測定した。該実験はワク チンにおける保護と抗原量の間で明確な関係を示した。

該実験において示される結果は、このワクチンが効能を有し、安全であることを 示した。この生成物を用いるウシのワクチン接種（筋肉内または皮下経路のいず れにおいても）は、抗原に対する耐性を亢進した。このことは、対照動物と比較 してワクチン接種体で観察される肺病変度の有意な減少に反映される。このワク チンを開発および試験するこれらの研究にて用いた実験用攻撃モデルは、自然の 条件下、そのようなレベルの攻撃に暴露される動物はありそうもないほどに十分 に激しいものであった。したがって、通常の条件下では、このワクチンは、より 良好に作用すると結論するのが無難である。さらには、ウシの呼吸器疾患症候群 用のワクチンのような、ウィルスおよび細菌成分を配合した一種またはそれ以上 の多価ワクチンの成分としてこのワクチンを用いてもよい。

フロントページの続き （３１）優先権主張番号　８７８，１４６（３２）優先口　１９９２年５月４日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＡＵ、ＢＲ，ＣＡ、ＪＰ、ＵＳ （７２）発明者　ダヤル、クリシュナスウォーミー・イエンガー アメリカ合衆国ネブラス力州６８５０６、リンカーン、ニス・セブンティフィフ ス・ストリート２３３６番 （７２）発明者　カウフマン、トーマス・ジェームズアメリカ合衆国ネブラスカ 州６８５２２、リンカーン、ダブリュ・ジーン・サークル１５００番 （７２）発明者　ニュージャム、レックス・ステイーブンアメリカ合衆国ネブラ ス力州６８５１６、リンカーン、ニス・フォーティサード・ストリート６８００ 番

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．治療上有効量のパスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１（Ｐａｓｔｅｕｒ ｅｌｌａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ　Ｔｙｐｅ　Ａ−１）・ロイコトキソイド、莢 膜抗原、可溶性抗原および不活性化細胞からなり、１回の接種でウシ種における パスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１に対する免疫性を誘導することのでき るバクテリン−トキソイドワクチン。
2. ２．ロイコトキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原および不活性化パスツレラ・ヘモ リティカがＡＴＣＣ５５３１８株由来である請求項１記載のワクチン。
3. ３．さらに治療上有効量の１種またはそれ以上のウシの呼吸器疾患の病因となる 付加的な抗原からなる請求項１記載のワクチン。
4. ４．ワクチンが凍結乾燥されており、使用前に少なくとも１種のアジュバントと ともに再水和される請求項１記載のワクチン。
5. ５．さらに２種のアジュバントからなる請求項４記載のワクチン。
6. ６．アジュバントが１２％（ｖ／ｖ）水酸化アルミニウムゲルおよびアムフィジ ェン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ（Ｒ））からなる請求項５記載のワクチン。
7. ７．免疫性の持続期間が約４カ月である請求項１記載のワクチン。
8. ８．治療上有効量のパスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１・ロイコトキソイ ド、莢膜抗原、可溶性抗原および不活性化細胞からなり、１回の接種でウシ種に おけるパスツレラ・ヘモリティカ・タイプＡ−１に対する免疫性を誘導すること のできるバクテリン−トキソイドワクチンの製造方法であって、パスツレラ・ヘ モリティカ・タイプＡ−１を後期対数増殖期に至るに十分な時間培養し；ピー・ ヘモリティカ培養物を不活性化し；ロイコトキソイド、莢膜抗原、可溶性抗原お よび不活性化ピー・ヘモリティカ細胞からなる培養液を得ることからなる製造方 法。
9. ９．ピー・ヘモリティカがＡＴＣＣ５５３１８株である請求項８記載の方法。
10. １０．該ピー・ヘモリティカが後期対数増殖期に至るまでの該十分な時間が約２ ．５ないし６時間である請求項８記載の方法。
11. １１．ピー・ヘモリティカ培養がホルマリンで不活性化される請求項８記載の方 法。
12. １２．遠心分離により上清を得る請求項８記載の方法。
13. １３．蛋白を増強した細胞培養培地でビー・ヘモリティカを培養する請求項１３ 記載の方法。
14. １４．細胞培養培地がＲＰＭＩ−１６４０および約３％の子ウシ・血清、約１％ のトリプトースならびに０．１％のツイン（Ｔｗｅｅｎ）８０からなる請求項１ ３記載の方法。
15. １５．請求項８記載の方法により製造されるワクチン。
16. １６．ワクチンが凍結乾燥されており、使用前に少なくとも１種のアジュバント とともに再水和される請求項１５記載のワクチン。
17. １７．さらに２種のアジュバントからなる請求項１６記載のワクチン。
18. １８．ワクチンがアジュバント１２％（ｖ／ｖ）水酸化アルミニウムゲルおよび アンフィジェン（Ｒ）からなる請求項１７記載のワクチン。
19. １９．該動物に請求項１または１５記載のバクテリン−トキソイドワクチンを投 与することからなるウシ科動物の予防接種法。
20. ２０．該投与が筋肉内または皮下注射である請求項１９記載の方法。
21. ２１．ワクチンが凍結乾燥形態であり、使用前に少なくとも１種のアジュバント とともに復元される請求項１９記載の方法。
22. ２２．ワクチンが２種のアジュバントからなる請求項２１記載の方法。
23. ２３．アジュバントが１２％（ｖ／ｖ）水酸化アルミニウムゲルおよびアンフィ ジェン（Ｒ）である請求項１９記載の方法。
24. ２４．ＡＴＣＣ５５３１８とすべて同じ性質を有するパスツレラ・ヘモリティカ の生物学的に純粋な培養。