ES2211866T3 - Vacuna de toxoide de bacterina de pasteurella haemolytica tipo a-1. - Google Patents
Vacuna de toxoide de bacterina de pasteurella haemolytica tipo a-1.Info
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Abstract
ESTE INVENTO RELATA AL CAMPO DE LAS VACUNAS PASTEURELLA HAEMOLYTICA. MAS PARTICULARMENTE, EL INVENTO RELATA A UNA VACUNA TOXOIDE-BACTERIN CAPAZ DE INDUCIR LA INMUNIDAD EN ESPECIES BOVINAS EN UNA DOSIS CONTRA LA INFECCION TIPO A-1 PASTEURELLA HAEMOLYTICA COMPRENDIENDO EL LEUCOTOXOIDE DERIVADO DE LA PASTEURELLA HAEMOLYTICA, EL ANTIGENO CAPSULAR, LOS ANTIGENOS SOLUBLES Y LAS CELULAS, LOS METODOS PARA HACER LA VACUNA Y LOS METODOS DE VACUNAR ANIMALES BOVINOS
Description
Vacuna de toxoide de bacterina de Pasteurella
haemolytica tipo A-1.
Esta invención se refiere al campo de las vacunas
de Pasteurella haemolytica. Más particularmente, la
invención se refiere a una vacuna de toxoide de bacterina capaz de
inducir inmunidad en la especie bovina en una dosis contra
infecciones de Pasteurella haemolytica de tipo
A-1 que comprende leucotoxoide, antígeno capsular,
antígenos solubles y células desactivadas derivados de
Pasteurella haemolytica, métodos para preparar la vacuna y
métodos de vacunación de animales bovinos.
De aproximadamente un 40 a un 80% de todas las
enfermedades del ganado bovino implican el sistema respiratorio
(Lillie L.E.: "The bovine respiratory disease complex",
Can. Vet. J. 15: 233-242, 1974). El complejo
respiratorio bovino (CRB) es un problema importante en la industria
ganadera bovina de EE.UU. El CRB consiste en varios síndromes
clínicos, siendo los dos más comunes fiebre del embarque de ganado
de carne y neumonía enzoótica de ternero observada habitualmente en
terneros de leche. Aunque se reconoce ahora que numerosos virus,
prácticas de gestión estresantes y factores ambientales son
importantes en la génesis de la fiebre del embarque, el biotipo A
serotipo 1 (tipo A-1) de P. haemolytica es el
agente bacteriano principal responsable de la enfermedad clínica y
de los eventos patofisiológicos que conducen a pleuroneumonía
lobular fibrinosa aguda y a la posterior muerte (Yates, W.D.G.:
"A review of infectious bovine rhinotracheititis, shipping fever
pneumonia and viral-bacterial synergism in
respiratory disease of cattle", Can. J. Comp. Med. 46:
225-263, 1982).
En un estudio de dos años realizado en
Saskatchewan, Canadá, se aisló el tipo A-1 de P.
haemolytica de los pulmones del 74% del ganado bovino que murió
de neumonía por fiebre del embarque (Schiefer B., Ward G.E.,
Moffatt R.E.: "Correlation of microbiological and histological
findings in bovine fibrinous pneumonia", Vet. Pathol. 15:
313-321, 1978). Los informes de progreso anuales
durante el periodo de cinco años de 1987 a 1991 del Departamento de
Ciencia Veterinaria de la Universidad Estatal de Dakota del Sur
(South Dakota State University, Department of Veterinary Science,
Animal Disease Research and Diagnostic Technical Committee on
Bovine Respiratory Disease) reveló que el tipo A-1
de P. haemolytica se aisló del 48,7% de los pulmones
neumónicos bovinos. Por tanto, parece ser el agente bacteriano
principal que causa neumonía en ganado bovino.
El serotipo de tipo A-1 de P.
haemolytica es el patógeno responsable de la pleuroneumonía
lobular necrosante fibrinosa observada en fiebre del embarque y de
la bronconeumonía purulenta asociada a neumonía enzoótica de
ternero. De forma interesante, otros serotipos de P.
haemolytica (frecuentemente ST2 y ST4 y ocasionalmente ST7 y
ST11) son habitantes inocuos de muchas áreas de la cavidad nasal o
del tracto respiratorio superior (TRS) de ganado de carne
clínicamente normal (Frank G.H., "When Pasteurella haemolytica
colonizes the nasal passages of cattle", Vet. Med.
83: 1060-1064, 1988 y Wilkie B.N., Shewen P.E.;
"Defining the role that Pasteurella haemolytica plays in
shipping fever", Vet. Med. 83: 1053-1058,
1988). En terneros de leche clínicamente normales, P.
multocida puede predominar en la flora del TRS, en el que
pueden encontrarse también diversos serotipos de P.
haemolytica. En contraposición, el tipo A-1 de
P. haemolytica es apenas detectable en el TRS de terneros de
carne y de leche (Frank G.H.: supra (1988) y Wilkie B.N.,
Shewen P.E.: supra (1988)).
La exposición de terneros a factores estresantes
tales como infección viral, comercialización, embarque,
procesamiento cárnico y cambios bruscos de clima conduce a un
crecimiento explosivo y una colonización por P. haemolytica
de tipo A-1 en todas las áreas del TRS (Frank G.H.:
supra (1988) y Wilkie B.N., Shewen P.E.: supra
(1988)). No es conocido ningún otro serotipo de P.
haemolytica que exhiba este tipo de aumento. En la neumonía de
fiebre del embarque, la colonización del TRS con P.
haemolytica de tipo A-1 es un prerrequisito
importante para el desarrollo de la enfermedad clínica y de la
pleuroneumonía lobular necrosante fibrinosa posterior.
Id.
A pesar de su importancia potencial en la
patogénesis de la neumonía, el mecanismo de colonización que
facilita la proliferación explosiva de P. haemolytica de
tipo A-1 en el TRS es poco comprendido. Sin
embargo, es evidente que estos organismos entran en el pulmón a
través de la aspiración de núcleos de gotitas, células epiteliales
descamadas colonizadas o secreciones faríngeas. En la Universidad
de Minnesota (Whiteley L.O. et al.: "Pasteurella
haemolytica and bovine respiratory disease: Current thoughts on
its pathogenesis" Vet. Int. Med. 6: 1-12,
1992), se encontró que grandes números de bacterias de crecimiento
rápido que entraban en los espacios alveolares interaccionaban con
macrófagos alveolares. La endotoxina liberada por las bacterias
cruza la pared alveolar y activa los macrófagos intravasculares
pulmonares, el endotelio, los neutrófilos, las plaquetas, el
complemento y el factor de Hageman, conduciendo a complejas
interacciones de células y mediadores inflamatorios. La progresión
de esta respuesta inflamatoria con el influjo de neutrófilos es
responsable de la lesión pulmonar aguda que está asociada a la
enfermedad. La leucotoxina, uno de los factores de virulencia
importantes de P. haemolytica, puede posibilitar que la
bacteria sobreviva destruyendo las células fagocíticas y dañando
los mecanismos de eliminación pulmonar. Id.
La prevención de la pasteurelosis neumónica se ha
intentado en el pasado mediante el uso de bacterinas muertas de
P. haemolytica. Sin embargo, se ha demostrado que la
vacunación con bacterinas puede potenciar el desarrollo de neumonía
fibrinosa después de la exposición por aplicación de la infección
(Sanford S.E. "Some Respiratory and Enteric Diseases of Cattle:
An Update", Med. Vet. Prac. 65(4):
265-268 (1984)). La inmunización con vacunas vivas
ha sido generalmente un fracaso debido a la baja antigenicidad de
P. haemolytica y la rápida desactivación por el animal sano.
(Henry C.W., "Shipping fever pneumonia: a new look at an old
enemy" Veterinary Medicine, 1200-1206,
septiembre (1984)).
Más recientemente, los intentos por desarrollar
una vacuna de Pasteurella haemolytica se han centrado en la
leucotoxina de P. haemolytica. En un estudio para determinar
la interacción de P. haemolytica con neutrófilos bovinos,
los resultados demostraron que la producción óptima de citotoxina
ocurría durante la fase de crecimiento logarítmico bacteriano para
P. haemolytica que creció en medio de cultivo de tejido
estándar. (Baluyut C.S. et al., "Interaction of
Pasteurella haemolytica with Bovine Neutrophils: Identification and
Partial Characterization of a Cytotoxin", Am. J. Vet.
Res. Vol. 42, nº 11, páginas 1920-1926 (1982)).
Los autores concluyeron que "...puesto que esta toxina afectaba a
las células fagocíticas, se consideró que era un factor de
virulencia". Id. en la página 1925.
La patente de EE.UU. 4.957.739 presenta una
vacuna que contiene un antígeno purificado de P.
haemolytica, tal como un componente de leucotoxina, en la que
el antígeno se purifica de un sobrenadante exento de células o se
obtiene mediante tecnología de ADN recombinante. El documento WO
91/15237 describe una composición de vacuna que contiene al menos
un polipéptido inmunogénico del grupo de proteína fimbrial de P.
haemolytica, proteína de receptor de plasmina, una proteína de
membrana externa de 50 K y leucotoxina. El documento US 5.055.400
describe ADN que codifica la leucotoxina de P. haemolytica
A-1, que se utiliza para producir proteína
recombinante para la preparación de vacunas. El documento US
5.055.400 se refiere a la capacidad protectora del sobrenadante
citotóxico de P. haemolytica y cita el documento de número
de serie de EE.UU. 821.197, presentado el 27 de enero de 1986,
ahora documento US 5.165.924, como ejemplo de dicha vacuna.
La vacunación de terneros con sobrenadante de
cultivo citotóxico exento de bacterias de P. haemolytica de
tipo A-1 indujo resistencia ante la aplicación de
la infección experimental (Shewen, P.E. et al., "Immunity
to Pasteurella haemolytica Serotype 1" en Proceedings
of the North American Symposium on Bovine Respiratory Disease
(R.W. Loan. Ed.). Texas A & M University Press, College Station.
Tex. pág. 480-481 (1984)). Se mostró que una vacuna
exenta de células que contenía leucotoxina y antígenos de
superficie específicos de serotipo (Presponse® toxoide de
Pasteurella haemolytica: American Cyanamid Co., Wayne, N.J.)
era eficaz en la prevención de neumonía en terneros vacunados dos
veces después de una aplicación intratraqueal de la infección con
P. haemolytica viva (Bechtol. D.T. et al., "Field
Trial of a Pasteurella haemolytica Toxoid Administered at
Spring Branding and in the Feedlot"
Agri-Practice, vol. 12, nº 2, pág.
6-14 (marzo/abril de 1991).
Continúa la necesidad en la técnica de vacunas de
Pasteurella haemolytica mejoradas, tales como una vacuna
que confiera inmunidad en una dosis única, eliminando así el
requisito de una costosa administración repetida, y de una vacuna
que ofrezca la conveniencia de administrarse por vía subcutánea o
intramuscular.
Jericho et al. describen (en
Vaccine, vol. 8, nº 4, pág. 315-320 (1990)),
el uso de bacterinas desactivadas con formalina de P.
haemolytica en una composición de vacuna. Como se describe en la
misma, en el método de producción de la vacuna, se hace crecer un
cultivo de P. haemolytica y después se centrifuga. El
sedimento resultante se resuspende e desactiva después. El
sobrenadante resultante, sin embargo, se filtra, se liofiliza, se
reconstituye en agua destilada, se dializa y se congela, sin
desactivarse. En contraposición, la preparación de la composición
de vacuna actualmente reivindicada implica la adición de un agente
desactivante directamente al fluido de cultivo que contiene tanto
células como componentes solubles, produciendo así una composición
de vacuna que comprende tanto bacterinas como componentes solubles
desactivados, incluyendo leucotoxoide.
Se proporciona mediante la presente invención una
nueva vacuna de toxoide de bacterina capaz de inducir inmunidad en
la especie bovina en una dosis contra la infección por
Pasteurella haemolytica de tipo A-1,
obtenible mediante la reconstitución de una composición liofilizada
que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de leucotoxoide,
antígeno capsular, antígenos solubles y células desactivadas de
P. haemolytica de tipo A-1, con al menos un
adyuvante antes del uso.
Se proporciona además mediante la invención una
composición de vacuna de toxoide de bacterina de dosis única contra
la infección por Pasteurella haemolytica de tipo
A-1 en la especie bovina que consiste esencialmente
en una cantidad terapéuticamente eficaz de leucotoxoide, antígeno
capsular, antígenos solubles, células desactivadas de P.
haemolytica de tipo A-1, gel de hidróxido de
aluminio y una emulsión de aceite mineral/lecitina.
Se proporciona además también mediante la
presente invención un nuevo método de preparación de la vacuna de
toxoide de bacterina de dosis única o composición de vacuna contra
la infección por Pasteurella haemolytica de tipo
A-1 en la especie bovina descrita anteriormente,
que comprende las etapas de:
- (a)
- cultivar células de P. haemolytica de tipo A-1 durante un tiempo suficiente para que dicho cultivo de P. haemolytica alcance la fase de crecimiento logarítmico tardío;
- (b)
- desactivar el cultivo de P. haemolytica;
- (c)
- recoger el sobrenadante de cultivo del mismo que comprende leucotoxoide, antígeno capsular, antígenos solubles y células de P. haemolytica desactivadas a una densidad en el intervalo de aproximadamente 10^{3} a aproximadamente 10^{8} células/ml;
- (d)
- añadir al sobrenadante de cultivo en la etapa (c) vehículo(s) y/o diluyente(s) farmacéuticamente aceptables;
- (e)
- liofilizar el producto de (d); y
- (f)
- reconstituir el producto liofilizado de (e) con al menos un adyuvante antes del uso;
o:
- (a1)
- cultivar células de P. haemolytica de tipo A-1 durante un tiempo suficiente para que dicho cultivo de P. haemolytica alcance la fase de crecimiento logarítmico tardío;
- (b1)
- recoger el sobrenadante de cultivo del mismo que comprende leucotoxina, antígeno capsular, antígenos solubles y células de P. haemolytica a una densidad en el intervalo de aproximadamente 10^{3} a aproximadamente 10^{8} células/ml;
- (c1)
- añadir al sobrenadante de cultivo en la etapa (b1) un agente desactivante;
- (d1)
- añadir al sobrenadante de cultivo desactivado en la etapa (c1) vehículo(s) y/o diluyente(s) farmacéuticamente aceptables;
- (e1)
- liofilizar el producto de (d1); y
- (f1)
- reconstituir el producto liofilizado de (e1) con al menos un adyuvante antes del uso.
Se proporciona también mediante la invención la
vacuna o composición de vacuna producida mediante la misma.
Se proporciona además mediante la invención un
nuevo uso de leucotoxoide, antígeno capsular, antígenos solubles y
células desactivadas de Pasteurella haemolytica de tipo
A-1 en la fabricación de una vacuna de toxoide de
bacterina de dosis única contra la infección por P.
haemolytica de tipo A-1 en animales bovinos, y
en el que la vacuna está en forma liofilizada y se reconstituye
antes del uso con al menos un adyuvante.
Se proporciona además también mediante la
invención un cultivo biológicamente puro de Pasteurella
haemolytica que tiene un nº ATCC 55318 o cepas idénticas a la
misma.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "leucotoxina" designa una toxina soluble producida
haciendo crecer activamente Pasteurella haemolytica como se
muestra en la bibliografía. Véanse por ejemplo la patente de EE.UU.
5.055.400; la solicitud de patente canadiense 91000097 y Gentry
et al., "Neutralizing monoclonal antibodies to P.
haemolytica leukotoxin affinity-purify the toxin
from crude culture supernatants", Microbial Pathogenesis,
10: 411-417 (1991). "Leucotoxoide" es el
término utilizado para describir leucotoxina desactivada. La
leucotoxina se designa alternativamente en la bibliografía mediante
otros identificadores tales como exotoxina o citotoxina.
Lo que se quiere indicar por "antígeno
capsular", como se utiliza en la presente memoria, es designar
un polisacárido capsular soluble de P. haemolytica como se
describe en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Inzana T.J.,
"Capsules and Virulence in the HAP Group of Bacteria", Can.
J. of Vet. Research, 54: S22-S27 (1990); y
Adlam et al., "Purification, characterization and
immunological properties of the serotype-specific
capsular polysaccharide of Pasteurella haemolytica (serotype
A1) organisms", J. Gen. Microbiol. 130:
2415-2426 (1984).
Lo que se quiere indicar por "antígeno
soluble", como se utiliza en la presente memoria, es designar
antígenos solubles sembrados durante el crecimiento de P.
haemolytica distintos de leucotoxina y antígeno capsular, tales
como glicoproteasa y neuraminidasa. Véase, por ejemplo, Reggie
et al., "Molecular Studies of Ssa1, a
Serotype-Specific Antigen of Pasteurella
haemolytica A1", Infection and Immunity, vol. 59, nº
10, 3398-3406 (1991).
En un aspecto, esta invención proporciona una
vacuna de toxoide de bacterina de dosis única contra la infección
por Pasteurella haemolytica de tipo A-1 en la
especie bovina, obtenible mediante la reconstitución de una
composición liofilizada que comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de leucotoxoide, antígeno capsular, antígenos solubles y
células desactivadas de P. haemolytica de tipo
A-1, con al menos un adyuvante antes del uso. La
Pasteurella haemolytica de tipo A-1 adecuada
para uso en esta invención se cree que es cualquier tipo
A-1 que no esté atenuado. La cepa preferida es
actualmente el nº ATCC 55318.
La vacuna de esta invención puede prepararse
generalmente haciendo crecer Pasteurella haemolytica de tipo
A-1 para la producción óptima de leucotoxina,
preferiblemente en un medio de cultivo de células enriquecido con
proteína, y recogiendo los fluidos de cultivo durante la fase
logarítmica.
Una de las técnicas preferidas para preparar la
vacuna de la invención es un nuevo método de preparación de vacuna
de toxoide de bacterina capaz de inducir inmunidad en la especie
bovina en una dosis contra la infección por Pasteurella
haemolytica de tipo A-1, que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de leucotoxide, antígeno capsular,
antígenos solubles y células desactivadas derivados de
Pasteurella haemolytica. El método comprende cultivar
Pasteurella haemolytica de tipo A-1 durante
un tiempo suficiente para que dicha Pasteurella haemolytica
alcance la fase de crecimiento logarítmico tardío.
El medio de cultivo estándar adecuado para uso en
la invención es un medio de cultivo celular que está enriquecido
con proteína y puede seleccionarse por un experto en la técnica. Es
un ejemplo RPMI-1640 generalmente enriquecido con
3% de suero bovino de ternero desactivado térmicamente, 1% de
triptosa y 0,1% de Tween 80 (polisorbato de Sigma, St. Louis, MO) o
similares. El crecimiento puede estimularse mediante la adición de
carbohidratos tales como glucosa al medio.
Las bacterias se hacen crecer en el medio desde
la inoculación hasta la fase de crecimiento logarítmico. Para una
producción óptima de leucotoxina, se prefiere la fase de
crecimiento logarítmico tardío. Ésta está generalmente en el
intervalo de 2,5 a 6 horas después de la inoculación del medio con
las bacterias, y puede determinarse exactamente mediante la
relación de la densidad óptica con el tiempo, como es conocido en
la técnica.
Mientras el crecimiento está en la fase
logarítmica tardía, se añade un agente desactivante a los fluidos
de cultivo. Preferiblemente, el agente desactivante es un fijador,
tal como formalina (solución de formaldehído, USP), que se utiliza
habitualmente a una concentración relativamente baja de
aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5% v/v.
Los fluidos de cultivo que comprenden el
leucotoxoide, el antígeno capsular, antígenos solubles y las
células de Pasteurella haemolytica desactivadas se recogen
después mediante técnicas estándar conocidas por los expertos en la
técnica, tales como centrifugación. Es importante que el
sobrenadante no esté exento de células, por tanto los métodos de
recogida tales como la filtración, que eliminaría todas las
células, no están dentro del alcance de esta invención. La mayoría
de las bacterias se eliminan mediante centrifugación de las células
hasta una suspensión acuosa concentrada densa. La centrifugación
ocurre preferiblemente a una fuerza de aproximadamente 10.000 x g.
Los métodos y condiciones para eliminar la mayoría de las células
del cultivo están dentro de las habilidades de la técnica.
El orden de desactivación y recogida en el método
de esta invención no se cree que sea crítico. Actualmente, se
prefiere desactivar antes de recoger.
El sobrenadante se recoge y contiene de
aproximadamente 10^{3} a aproximadamente 10^{8} células/ml de
sobrenadante medido antes de la desactivación. El número de células
es difícil de medir, y puede variar sustancialmente de lote a lote.
El límite inferior está regido por la necesidad de tener algunas
células en la vacuna que ayuden a proporcionar la inmunidad
conferida por la vacuna de la invención. El límite superior está
regido por evitar la posible hipersensibilización de los animales
ante la vacunación. Se han demostrado niveles de hasta 10^{6}
células/ml antes de la desactivación en el sobrenadante.
El sobrenadante producido mediante este método y
utilizado para la vacuna de la invención es una preparación rica en
leucotoxoide que comprende también antígeno capsular, antígenos
solubles y células de Pasteurella haemolyticus de tipo
A-1 desactivadas y desechos celulares.
La vacuna de la invención tal como se indica es
el sobrenadante de cultivo, que puede concentrarse o diluirse o
no.
Aún otras composiciones de vacuna preferidas de
esta invención son el resultado de combinar la vacuna de esta
invención con otros agentes vacunales, particularmente antígenos de
otros patógenos de CRB. Es un ejemplo ilustrativo una composición
de vacuna formada por la combinación de antígenos de Pasteurella
multocida, Haemophilus somnus, especies de
Clostridial, especies de Mycoplasma, virus
respiratorio sincitial bovino, virus de diarrea viral bovina y
virus de parainfluenza bovina de tipo 3.
Las vacunas de la invención pueden prepararse en
forma de composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad
terapéuticamente eficaz del sobrenadante como ingrediente activo en
un vehículo no tóxico y estéril farmacéuticamente aceptable.
La vacuna de la presente invención se ha
liofilizado y se reconstituye con al menos un adyuvante justo antes
del uso. Dicha vacuna proporciona una estabilidad aumentada y una
reducción de la endotoxina libre, lo que reduce las reacciones
sistémicas post-vacunales. Dichos adyuvantes
incluyen, entre otros, una emulsión de aceite mineral y lecitina
[Amphigen®; Hydronics, Inc.] como se muestra en la patente de
EE.UU. 5.084.269 u otros aceites dispersados, hidróxido de
aluminio, dipéptido de muramilo y saponinas tales como Quil A.
Según la presente invención, una preparación
farmacéutica proporciona preferiblemente una dosis unitaria de
entre 0,5 y 3 ml, y más preferiblemente de aproximadamente 2 ml de
una preparación estéril de una cantidad inmunogénica de los
ingredientes activos y el vehículo.
Con los fines de esta invención, una cantidad
terapéuticamente eficaz de vacuna es aquella cantidad que induce
inmunidad en la especie bovina contra la infección por P.
haemolytica de tipo A-1 en una dosis. Más
específicamente, esta cantidad puede determinarse fácilmente
ensayando una serie de preparaciones de vacuna realizadas según la
invención en ganado bovino y seleccionando la preparación de vacuna
que inducía inmunidad en una dosis en un número estadísticamente
significativo de ganado bovino cuando se aplicaba infección con
P. haemolytica. La inmunidad inducida por la vacuna puede
medirse mediante la resistencia a la aplicación de la infección
experimental reflejada por una mortalidad reducida o ausente, la
ausencia de señales clínicas o mínimas y la reducción o la completa
eliminación de las lesiones pulmonares características como es
conocido por los expertos en la técnica.
Un régimen de dosificación deseable implica la
administración de una dosis de la composición de vacuna deseada de
esta invención para conferir inmunidad activa. Se cree deseable una
dosis de recuerdo siempre que sea probable un estrés o exposición
posteriores. El modo de administración de las vacunas de la
invención puede ser cualquier vía adecuada que suministre la vacuna
al hospedador. Actualmente, la vacuna se administra preferiblemente
por vía subcutánea o mediante inyección intramuscular.
La vacuna liofilizada de la presente invención se
rehidrata asépticamente preferiblemente con el adyuvante que
contiene diluyente estéril. Preferiblemente, la vacuna se administra
a ganado bovino sano un mínimo de 7-10 días antes
de destete, embarque o exposición a condiciones de estrés o
infecciosas.
Los ejemplos siguientes ilustran métodos
preferidos para preparar la vacuna de la invención y para preparar
y ensayar una serie de vacunas. Estos ejemplos son sólo
ilustrativos y no limitan el alcance de la presente invención.
Se ha comercializado una vacuna realizada
mediante esta invención en los Estados Unidos desde aproximadamente
el 18 de mayo de 1992, y es conocida como
One-Shot^{TM} (marca comercial de SmithKline
Beecham Animal Health, Exton, PA).
Se realizó un depósito de cultivos biológicamente
puros de la siguiente cepa en el American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland. El número de acceso
indicado se asignó después de un ensayo de viabilidad exitoso, y se
abonaron las tasas necesarias. El acceso a dichos cultivos estará
disponible durante la litispendencia de la solicitud de patente para
aquel determinado por el Comisario que esté autorizado para ello
según 37 CFR 1.14 y 35 USC 122. Todas las restricciones sobre la
disponibilidad de dichos cultivos para el público se retirarán
irrevocablemente tras la concesión de una patente basada en la
solicitud. Además, los depósitos designados se mantendrán durante
un periodo de treinta (30) años desde la fecha de depósito, o
durante cinco (5) años después de la última solicitud del depósito;
o durante la validez de la patente de EE.UU., lo que sea más largo.
En caso de que un cultivo se vuelva no viable o se destruya
inadvertidamente, o en el caso de cepas que contienen plásmidos, la
pérdida de su plásmido, se reemplazará por un cultivo o cultivos
viables de la misma descripción taxonómica.
| Cepa | Fecha de depósito | Nº ATCC |
| Pasteurella haemolytica de tipo A-1 | 9 de abril de 1992 | 55318 |
Se hizo crecer durante una noche a 37ºC P.
haemolytica de tipo A-1 (depositada el 9 de
abril de 1992, número de acceso ATCC 55318) en agar de infusión de
cerebro y corazón (ICC). Se realizaron pasadas posteriores en caldo
de ICC en una serie de matraces Erlenmeyer, bombonas de 9 y 19
litros o fermentadores de siembra. El medio de producción final
consiste en medio de cultivo de tejido RPMI 1640 que contiene
bicarbonato de sodio (0,2% p/v), enriquecido con 3% de suero bovino
de ternero desactivado térmicamente, 1% de triptosa y 0,1% de Tween
80. Se incluyó antiespumante a 0,06% de concentración final. El
fermentador final se sembró con un inóculo al 5%. Los cultivos se
hicieron crecer durante 4,5 horas a 37ºC y se monitorizó el
contenido de oxígeno disuelto del cultivo y se controló mediante
aireación a un nivel de un 40%. El cultivo se agitó continuamente y
se mantuvo a pH 7,4. Se estimuló el crecimiento mediante la adición
de glucosa estéril al 50% a las 2,5, 3,25 y 4,0 horas después de la
inoculación. A las 4,5 horas después de la inoculación (en la fase
de crecimiento logarítmico tardío), el cultivo se enfrió a 10ºC y se
inactivó con formalina, añadida a una concentración final de 0,1%
(v/v). Se agitaron los fluidos de cultivo en el fermentador durante
1 hora, y después se almacenaron a 4ºC con agitación constante
durante cinco días para completar la desactivación. Los fluidos
desactivados se centrifugaron y se retuvo el sobrenadante. Se
añadieron mertiolato estéril al 10% y ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) al 10% como conservantes a
concentraciones finales de 0,01% y 0,07%, respectivamente. El
sobrenadante se almacenó a -50ºC hasta que se descongeló para
combinación.
El sobrenadante se descongeló, y basándose en los
resultados de ensayos cuantitativos, se combinó con la adición de
solución salina tamponada con fosfato estéril. El producto combinado
se dividió en alícuotas en botellas y se liofilizó y almacenó a
4ºC.
El sistema adyuvante bifásico consiste en el
adyuvante emulsión de aceite mineral/lecitina al 5% v/v
comercializado con el nombre comercial Amphigen® y gel de hidróxido
de aluminio al 12% v/v y solución salina (en adelante "diluyente
adyuvante"). El diluyente adyuvante dual se embotelló y se
utilizó para rehidratar la vacuna liofilizada.
Se ensayaron las capacidades protectoras de la
vacuna en ganado bovino mediante experimentos de aplicación de la
infección-vacunación.
Se asignó una dosis unitaria relativa (UR) de
1496 por dosis de leucotoxoide y de 2580 de antígeno capsular al
sobrenadante bruto liofilizado, que se utilizó para preparar la
vacuna que se encontraba que inducía inmunidad en una dosis ante la
infección por P. haemolytica de tipo A-1 en
la especie bovina como se muestra en la presente memoria.
- Animales:
- 181-250 kg, vacuno de carne,
- Aplicación
- de la infección: P. haemolytica A-1, cepa heteróloga, 2,2 x 10^{9} ufc en 500 ml de solución salina tamponada con fosfato de Cherry (CPBS). Administración intratraqueal.
- Vacunas:
- 1. Diluida a 800 UR de leucotoxoide y 1380 UR de antígeno capsular por dosis con diluyente adyuvante. Dosis de 2 ml. Administración intramuscular.
- 2. Diluida a 400 UR de leucotoxoide y 690 UR de antígeno capsular por dosis con diluyente adyuvante. Dosis de 2 ml. Administración intramuscular.
- 3. Diluida a 200 UR de leucotoxoide y 345 UR de antígeno capsular por dosis con diluyente adyuvante. Dosis de 2 ml. Administración intramuscular.
- 4. Placebo (medio de control). Diluida como la vacuna nº 3 con diluyente adyuvante. Dosis de 2 ml. Administración intramuscular.
- Animales:
- 181-250 kg, vacuno de carne
- Aplicación
- de la infección: P. haemolytica A-1, cepa heteróloga, 1,6 x 10^{9} ufc en 500 ml de CPBS. Administración intratraqueal.
- Vacunas:
- 1. Diluida a 200 UR de leucotoxoide y 345 UR de antígeno capsular por dosis con diluyente adyuvante. Dosis de 2 ml. Administración intramuscular (IM) o subcutánea (SC).
- 2. Placebo (medio de control). Diluido como la vacuna nº 1 con diluyente adyuvante. Dosis de 2 ml. Administración intramuscular.
\newpage
- Animales:
- 181-250 kg, vacuno de carne,
- Aplicación
- de la infección: P. haemolytica A-1, 5 ml de 2,5 x 10^{9} ufc/ml. Inyección intrapulmonar transtorácica bilateral.
- Vacunas:
- 1. Rehidratada con diluyente adyuvante. Dosis de 2 ml. Administración intramuscular (IM) o subcutánea (SC).
- 2. Placebo (medio de control). Rehidratada con diluyente adyuvante. Dosis de 2 ml. Administración subcutánea.
*La diferencia entre A y B es estadísticamente
significativa (p<0,001).
Se seleccionaron veinte terneros de carne de
aproximadamente 204,5 kg para este ejemplo. Se vacunaron diez
terneros de carne (grupo 1) por vía subcutánea con una dosis de 2 ml
de toxoide de bacterina de Pasteurella haemolytica como se
describe a continuación. Se vacunaron adicionalmente 10 terneros
(grupo 2) por vía subcutánea con una dosis de 2 ml de placebo que
contenía todos los componentes del toxoide de bacterina de
Pasteurella haemolytica excepto los antígenos de P.
haemolytica, y sirvieron como controles. Se aplicó la infección
a los terneros por vía intratraqueal a los cuatro meses y siete días
después de la vacunación con una cepa heteróloga de P.
haemolytica (Tabla VII). El inóculo de aplicación de la
infección consistía en un caldo de cultivo de P. haemolytica
que contenía 1,2 x 10^{7} unidades formadoras de colonias (ufc) en
500 ml de solución salina tamponada con fosfato de Cherry (CPBS).
Ningún animal sucumbió a la aplicación de la infección. Se tomaron
necropsias a los animales seis días después de la aplicación de la
infección.
Los animales control exhibieron un marcado
aumento (estadísticamente significativo) de la temperatura corporal
debido a la aplicación de la infección durante dos días después de
la aplicación de la infección, mientras que los animales vacunados
mostraron un aumento durante un día después de la aplicación de la
infección. El análisis estadístico indicó una diferencia
significativa de las temperaturas corporales medias a los dos días
después de la aplicación de la infección entre vacunados y
controles.
Se ensayaron en suero de muestras de sangre
recogidas de cada animal mediante punción venosa las titulaciones de
anticuerpo de células completas de P. haemolytica mediante un
ensayo de aglutinación, de leucotoxina mediante un ensayo de
neutralización de leucotoxina, y de antígeno capsular mediante un
ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA). Las muestras se
recogieron antes de la vacunación, 4 meses después de la vacunación
(antes de la aplicación de la infección) y seis días después de la
aplicación de la infección (al mismo tiempo que la necropsia). Se
calcularon las medias geométricas (MG) de las titulaciones de
anticuerpo para cada ensayo, y los resultados indicaron que sólo las
MG de las titulaciones de anticuerpo de antígeno capsular eran
significativamente mayores en los animales vacunados (grupo 1) a los
4 meses después de la vacunación y a los 6 días después de la
aplicación de la infección en comparación con las titulaciones antes
de la vacunación.
En la necropsia, se extirparon los pulmones y se
evaluaron las lesiones características de pasteurelosis neumónica
(Tabla VIII). Se calificaron los pulmones pesando las áreas
afectadas y expresando el porcentaje de implicación pulmonar como
porcentaje del peso total de los pulmones. Además, se calificaron
los pulmones mediante inspección visual incluyendo fotos de las
áreas afectadas. Los animales vacunados tuvieron una consolidación
pulmonar media de un 2,65%, mientras que los animales control
tuvieron una consolidación pulmonar media de un 19,35% cuando se
evaluaron basándose en el peso real del tejido pulmonar afectado en
relación con el peso del pulmón completo. La calificación visual del
tejido pulmonar afectado proporcionó una consolidación pulmonar
media de un 1,68% de animales vacunados y de un 13,35% para animales
control. Estos resultados mostraron una reducción de un 86,3% de las
lesiones pulmonares en el grupo 1 en comparación con el grupo 2
basándose en el peso, y una reducción de un 87,42% cuando se utilizó
la inspección visual. El análisis estadístico mostró que la
diferencia en la consolidación pulmonar entre vacunados y controles
era significativa (p<0,05).
Los sitios de inyección subcutánea se examinaron
cuidadosamente en la necropsia, y ninguno de los animales en grupo
alguno tuvo ninguna reacción de tejido visible. Se intentaron
aislamientos microbianos de las áreas portadoras de lesiones de
tejido pulmonar. Se aisló P. haemolytica de las lesiones
pulmonares de 4 de 10 vacunados y de 8 de 10 controles.
Estos resultados han mostrado que este producto
es seguro y eficaz hasta cuatro meses después de la administración
de una dosis única de vacuna. La vacunación de ganado bovino con
este producto potenció su resistencia a la exposición por aplicación
de la infección.
- Animales:
- Vacuno de carne, >272 kg.
- Exposición:
- P. haemolytica A-1, cepa heteróloga. 1,2 x 10^{7} ufc en 500 ml de CPBS. Administración intratraqueal.
- Vacunas:
- 1. Preautorizada nº de serie 1 (nº de serie 24275010 de aproximadamente 305 UR de leucotoxoide y aproximadamente 529 UR de antígeno capsular) rehidratada con diluyente adyuvante acompañante. Dosis de 2 ml. Administración subcutánea.
- 2. Placebo (medio de control) rehidratado con diluyente adyuvante acompañante. Dosis de 2 ml. Administración subcutánea.
* La diferencia entre A y B es estadísticamente
significativa (p= 0,0169)
Se preparó la vacuna como se describe en el
ejemplo 1. [potencia de leucotoxoide= 254 unidades relativas/dosis
(15 meses de envejecimiento natural), potencia de antígeno capsular=
758 unidades relativas/dosis].
Se seleccionaron treinta terneros de carne con un
peso medio de 251 kg para este ejemplo. Se vacunaron diez terneros
(grupo A) por vía subcutánea con una dosis de 2 ml de toxoide de
bacterina de Pasteurella haemolytica siete días antes de la
aplicación de la infección. Se vacunaron otros diez terneros (grupo
B) de la misma manera con una dosis de 2 ml de vacuna tres días
antes de la aplicación de la infección. Se inyectaron diez terneros
adicionales (grupo C) siete días antes de la aplicación de la
infección por vía subcutánea con una dosis de 2 ml de placebo que
contenía todos los componentes del toxoide de bacterina de
Pasteurella haemolytica excepto los antígenos de P.
haemolytica, y sirvieron como controles. Se aplicó la infección
a los terneros por vía intratraqueal a los siete días después de la
vacunación (grupos A y C) o a los tres días después de la vacunación
(grupo B) con una cepa heteróloga de P. haemolytica. El
inóculo de aplicación de la infección consistía en un caldo de
cultivo de P. haemolytica que contenía 3,0 x 10^{8}
unidades formadoras de colonias (ufc) en 500 ml de solución salina
tamponada con fosfato de Cherry (CPBS). Un animal del grupo B y otro
del grupo C sucumbieron a la aplicación de la infección y se realizó
su necropsia tan pronto como fue posible. En todos los demás
animales se realizó la necropsia seis días después de la aplicación
de la infección.
Las temperaturas corporales antes de la
aplicación de la infección de dos tercios de los animales fueron de
40ºC, de modo que no se exhibió ningún aumento marcado de la
temperatura corporal debido a la aplicación de la infección en
ningún momento después de la aplicación de la infección en ninguno
de los grupos.
Se ensayaron en el suero de muestras de sangre
recogidas de cada animal mediante punción venosa las valoraciones de
anticuerpos de células enteras de P. haemolytica mediante un
ensayo de aglutinación, de leucotoxina mediante un ensayo de
neutralización de leucotoxina, y de antígeno capsular mediante un
ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA). Las muestras se
recogieron antes de la vacunación, siete días después de la
vacunación (grupos A y C) y tres días después de la vacunación
(grupo B), que fue inmediatamente antes de la aplicación de la
infección, y seis días después de la aplicación de la infección (en
el momento de la necropsia). Se calcularon las medias geométricas
(MG) de las titulaciones de anticuerpo para cada ensayo, y los
resultados indicaron que se obtuvo una respuesta significativa a los
tres antígenos en animales del grupo A a los siete días después de
la vacunación, y no se observó dicha respuesta en animales del grupo
B a los tres días después de la vacunación o en animales del grupo C
a los siete días después de la administración de placebo.
En la necropsia, se extirparon los pulmones y se
evaluaron las lesiones características de pasteurelosis neumónica.
Los pulmones se calificaron pesando las áreas afectadas y expresando
el porcentaje de implicación pulmonar como porcentaje del peso total
de los pulmones. Además, los pulmones se calificaron mediante
inspección visual incluyendo fotos de las áreas afectadas. Los
animales vacunados siete días antes de la aplicación de la infección
tuvieron una consolidación pulmonar media de un 12,7%, los vacunados
tres días antes de la aplicación de la infección tuvieron una
consolidación pulmonar media de un 36,1%, mientras que los animales
control tuvieron una consolidación pulmonar media de un 26,6% cuando
se evaluaron basándose en el peso real del tejido pulmonar afectado
en relación con el peso del pulmón completo. La calificación visual
del tejido pulmonar afectado proporcionó una consolidación pulmonar
media de un 8,6% para vacunados de siete días, de un 28,7% para
vacunados de tres días, y de un 17,8% para controles de placebo.
Estos resultados mostraron una reducción de un 52,3% de las lesiones
pulmonares en el grupo A en comparación con el grupo C basándose en
el peso, y una reducción de un 51,7% cuando se utilizó inspección
visual. El análisis estadístico mostró que la diferencia en la
consolidación pulmonar entre el grupo A y el grupo B era
significativa (p<0,05), pero no entre los grupos A y C. No se
observó ninguna reducción de las lesiones pulmonares cuando se
compararon vacunados de tres días con los controles de placebo.
Los sitios de inyección subcutánea se examinaron
cuidadosamente en la necropsia. Aproximadamente un 50% de los
animales de los tres grupos tenía cierta evidencia de reacciones de
tejido en el sitio de inyección. Se intentaron aislamientos
microbianos de las áreas portadoras de lesiones de tejido pulmonar.
Se aisló P. haemolytica de lesiones pulmonares de 5 de 10
vacunados de siete días, 8 de 10 vacunados de 3 días y 7 de 10
controles de placebo.
Estos resultados han mostrado que este producto,
cuando se administra en una dosis única, es capaz de reducir la
lesión pulmonar cuando se aplica la infección a los animales siete
días después de la vacunación, pero no a los tres días después de la
vacunación. La vacunación de ganado bovino con este producto siete
días antes de la aplicación de la infección potenció su resistencia
a la exposición por aplicación de la infección.
Todos los estudios confirmaron la seguridad de la
vacuna. No se observaron reacciones adversas. Se probó también la
seguridad en la administración de tres diferentes series de la
vacuna a más de 3.000 animales en condiciones de campo. El ensayo
dio como resultado reacciones localizadas en un 3,5% de los
vacunados, siendo transitorias muchas de ellas. Se observaron pocas
de otras reacciones.
Se emprendió un estudio de extinción de antígeno
para determinar el nivel de dosificación no protectora de la vacuna.
El estudio fue exitoso, indicando una relación definida entre la
protección y la cantidad de antígenos en la vacuna.
El análisis de los resultados presentados en los
estudios reveló que esta vacuna es eficaz y segura. La vacunación de
ganado bovino con este producto (por vía intramuscular o subcutánea)
potenció su resistencia a la exposición por aplicación de la
infección. Esto se reflejó por una reducción significativa de la
extensión de las lesiones pulmonares observada con vacunados en
comparación con animales control. Los modelos de aplicación de la
infección experimental empleados en estos estudios que conducen al
desarrollo y ensayo de esta vacuna fueron suficientemente estrictos
como para que en condiciones naturales la probabilidad de que un
animal se exponga a dicho nivel de aplicación de la infección sea
remota. Por lo tanto, es seguro concluir que esta vacuna debería
actuar aún mejor en condiciones de campo. Se pretende utilizar
además esta vacuna como componente de una o más vacunas
multivalentes que contienen componentes virales y bacterianos, tales
como vacunas para el complejo respiratorio bovino.
Claims (21)
1. Una vacuna de toxoide de bacterina de dosis
única contra la infección por Pasteurella haemolytica de tipo
A-1 en la especie bovina, obtenible mediante la
reconstitución de una composición liofilizada que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de leucotoxoide, antígeno capsular,
antígenos solubles y células desactivadas de P. haemolytica
de tipo A-1, y en la que la composición está en
forma liofilizada y se reconstituye antes del uso con al menos un
adyuvante antes del uso.
2. La vacuna de la reivindicación 1, en la que
las células de P. haemolytica están a una densidad en el
intervalo de aproximadamente 10^{3} a aproximadamente 10^{8}
células/ml de sobrenadante antes de la desactivación.
3. La vacuna de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en la que el leucotoxoide, el antígeno capsular,
los antígenos solubles y las células de P. haemolytica
desactivadas derivan de la cepa de nº ATCC 55318 o de cepas
idénticas a la misma.
4. La vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una cantidad
terapéuticamente eficaz de uno o más antígenos adicionales de
patógenos de enfermedades respiratorias bovinas.
5. La vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición liofilizada se
reconstituye con dos adyuvantes.
6. La vacuna de la reivindicación 5, en la que
los adyuvantes son hidróxido de aluminio y una emulsión de aceite
mineral/lecitina.
7. Una composición de vacuna de toxoide de
bacterina de dosis única contra la infección por Pasteurella
haemolytica de tipo A-1 en la especie bovina
como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 6,
que consiste esencialmente en una cantidad terapéuticamente eficaz
de leucotoxoide, antígeno capsular, antígenos solubles y células
desactivadas de P. haemolytica de tipo A-1,
gel de hidróxido de aluminio y una emulsión de aceite
mineral/lecitina.
8. Un método de preparación de una vacuna de
toxoide de bacterina de dosis única contra la infección por
Pasteurella haemolytica de tipo A-1 en la
especie bovina como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 o una composición de vacuna contra la
infección por Pasteurella haemolytica de tipo
A-1 en la especie bovina como se define en la
reivindicación 7, que comprende las etapas de:
- (a)
- cultivar células de P. haemolytica de tipo A-1 durante un tiempo suficiente para que dicho cultivo de P. haemolytica alcance la fase de crecimiento logarítmico tardío;
- (b)
- desactivar el cultivo de P. haemolytica;
- (c)
- recoger el sobrenadante de cultivo del mismo que comprende leucotoxoide, antígeno capsular, antígenos solubles y células de P. haemolytica desactivadas a una densidad en el intervalo de aproximadamente 10^{3} a aproximadamente 10^{8} células/ml;
- (d)
- añadir al sobrenadante de cultivo en la etapa (c) vehículo(s) y/o diluyente(s) farmacéuticamente aceptables;
- (e)
- liofilizar el producto de (d); y
- (f)
- reconstituir el producto liofilizado de (e) con al menos un adyuvante antes del uso;
o:
- (a1)
- cultivar células de P. haemolytica de tipo A-1 durante un tiempo suficiente para que dicho cultivo de P. haemolytica alcance la fase de crecimiento logarítmico tardío;
- (b1)
- recoger el sobrenadante de cultivo del mismo que comprende leucotoxina, antígeno capsular, antígenos solubles y células de P. haemolytica a una densidad en el intervalo de aproximadamente 10^{3} a aproximadamente 10^{8} células/ml;
- (c1)
- añadir al sobrenadante de cultivo en la etapa (b1) un agente desactivante;
- (d1)
- añadir al sobrenadante de cultivo desactivado en la etapa (c1) vehículo(s) y/o diluyente(s) farmacéuticamente aceptables;
- (e1)
- liofilizar el producto de (d1); y
- (f1)
- reconstituir el producto liofilizado de (e1) con al menos un adyuvante antes del uso.
9. El método de la reivindicación 8, en el que la
P. haemolytica es la cepa de nº ATCC 55318 o cepas idénticas
a la misma.
10. El método de la reivindicación 8 o la
reivindicación 9, en el que dicho tiempo suficiente para que dicho
cultivo de P. haemolytica alcance la fase de crecimiento
logarítmico tardío es de aproximadamente 2,5 a 6 horas.
11. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en el que el cultivo de P.
haemolytica se desactiva con formalina o dicho agente
desactivante es formalina.
12. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, en el que el sobrenadante se recoge
mediante centrifugación.
13. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, en el que las células de P.
haemolytica se cultivan en un medio de cultivo celular
enriquecido en proteína.
14. El método de la reivindicación 13, en el que
el medio de cultivo celular comprende RPMI-1640 y
aproximadamente 3% de suero bovino de ternero, aproximadamente 1% de
triptosa y 0,1% de dispersante Tween 80®.
15. Uso de una composición que comprende
leucotoxoide, antígeno capsular, antígenos solubles y células
desactivadas de Pasteurella haemolytica de tipo
A-1 en la fabricación de una vacuna de toxoide de
bacterina de dosis única contra la infección por P.
haemolytica de tipo A-1 en animales bovinos, y
en el que la composición está en forma liofilizada y se reconstituye
antes del uso con al menos un adyuvante.
16. Uso según la reivindicación 15, en el que las
células de P. haemolytica están a una densidad en el
intervalo de aproximadamente 10^{3} a aproximadamente 10^{8}
células/ml de sobrenadante antes de la desactivación.
17. Uso según la reivindicación 15 o la
reivindicación 16, en el que la administración de la vacuna es
intramuscular o subcutánea.
18. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17, en el que la vacuna comprende dos
adyuvantes.
19. Uso según la reivindicación 18, en el que los
adyuvantes son gel de hidróxido de aluminio y una emulsión de aceite
mineral/lecitina.
20. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 19, en el que las células desactivadas se
preparan desactivando un cultivo de P. haemolytica en la fase
de crecimiento logarítmico tardío con formalina.
21. Un cultivo biológicamente puro de
Pasteurella haemolytica que tiene un nº ATCC 55318 o cepas
idénticas a la misma.
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| US878146 | 1992-05-04 |
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