JP2005515162A - マイコプラズマ・ハイオニューモニエ(Mycoplasmahyopneumoniae)を用いた単回ワクチン接種 - Google Patents
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ(Mycoplasmahyopneumoniae)を用いた単回ワクチン接種 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、約3〜10日齢の動物にマイコプラズマ・ハイオニューモニエ(Mycoplasma hyopneumoniae)ワクチンの有効量を単回ワクチン投与することにより、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に起因する、動物における疾患または障害を治療または予防する方法に関するものである。マイコプラズマ・ハイオニューモニエ ワクチンは、細胞の全体もしくは一部を不活化した調製物または修飾した生の調製物、サブユニットワクチン、または核酸もしくはDNAワクチンであることが可能である。本発明に従って投与されるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ ワクチンは、合成または組換えにより産生可能である。
マイコプラズマ・ハイオニューモニエはブタにおける地方病性肺炎の原因となる細菌性病原体である。地方病性肺炎は慢性疾患で、劣った飼料転換、成育不全、および二次的な肺感染症に罹りやすい素因を生じる。マイコプラズマ・ハイオニューモニエは気道分泌物を介して、そして母子感染により容易に伝播し、そして養豚農場に非常に蔓延する。米国における養豚のおよそ99パーセントが感染し、養豚産業には年間約3億ドルの負担となる。
加えて、サブユニットワクチンとして有用な可能性のある、組換えにより産生されるいくつかのマイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原性ポリペプチド及びタンパク質について記載されている。国際特許公報WO 96/28472では、分子量46〜48、52〜54、60〜64、72〜75、90〜94及び110〜114キロダルトンの6種類のマイコプラズマ・ハイオニューモニエタンパク質抗原について記載されており、そして52〜54、60〜64および72〜75キロダルトン抗原のタンパク質部分配列並びに46〜48キロダルトン抗原の全長ヌクレオチド及びアミノ酸配列が開示されている。
本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの感染に起因する、動物における疾患または障害を治療または予防する方法であって、約3〜約10日齢の動物にマイコプラズマ・ハイオニューモニエ ワクチンの有効量を単回投与することを含む、前記方法を含む。
本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に起因する、動物における疾患または障害を治療または予防する方法であって、約3〜約10日齢の動物にマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンの有効量を単回投与することを含む、前記方法を含む。
明確に開示するため、そして限定を目的とせずに、本発明の詳細な説明を以下の小節に分割し、本発明のいくつかの特徴、実施態様または適用について記載または例証する。
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に関する「治療または予防」の語は、本明細書では、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌の複製を阻害するか、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの伝播を阻害するか、またはマイコプラズマ・ハイオニューモニエの宿主への定着を防止すること、並びに、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に起因する疾患または障害の症状を緩和することを意味する。細菌数の縮小、肺感染部の減少、並びに/あるいは飼料摂取及び/または発育の増加がみられる場合、治療は効果を奏しているとみなされる。本発明の方法は、例えば、肺病変を予防または縮小するのに有効である。
「ブタ」の語は、本明細書では、子ブタ(piglets)、養豚(swine)、ブタ(pigs)、ブタの(porcine)、雌ブタ(sows)、若齢雌ブタ(gilts)、去勢雄ブタ(barrows)、去勢していない雄ブタ(boars)及びイノシシ(Suidae)科の動物を指す。
「バクテリン」の語は、本明細書では、ワクチンとしての使用に適したマイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の全体または一部の不活化調製物を指す。
本発明の方法に用いられる慣用的な不活化または修飾生ワクチンの調製法は、当該技術分野において知られている。
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ分離株は種々の公知の方法を用いて不活化することが可能である。例として、米国特許第5,565,205号に記載されているように細菌分離株をバイナリー エチレンイミン(BEI)で処理して、あるいは、例えばホルマリン、熱、BPL、放射線照射またはグルタルアルデヒドを用いて不活化する方法がある。
本発明の方法は、精製したマイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原性タンパク質、ポリペプチド、並びにこれらタンパク質及びポリペプチドの免疫原性フラグメントを有するサブユニットワクチンを用いて実行することが可能である。これらのタンパク質及びポリペプチドは当該技術分野において公知の技術を用いて調製可能である。さらに、タンパク質の純度または均質性を測定するのに、試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動後、染色したゲル上で単一ポリペプチドバンドを可視化するといった、当業者に周知の方法を用いることが可能である。HPLCもしくは当該技術分野において周知の他の類似の方法を用いて、より高い分解能で測定してもよい。
ワクチン処方物
本発明において用いられるワクチンの適当な調製物には、溶液または懸濁液としての注射剤があり;注射前に液体に溶解または懸濁して用いるのに適した固体型もまた調製可能である。調製物はまた乳化されたものでもよい。免疫原性を有する活性成分は、薬学的に許容可能で、そして活性成分との適合性を有するアジュバントと混合されることが多い。
本発明の方法は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原性タンパク質、ポリペプチド、並びにこれらタンパク質及びポリペプチドの免疫原性フラグメントをコードする遺伝子または核酸を用いて実施することが可能である。このような遺伝子及び核酸はin vivoにて発現させることが可能であり、そして当該技術分野において公知の技術を用いて調製可能である。
本発明の方法の別の他の実施態様では、用いられる遺伝子または核酸はDNAワクチンである。さらに、核酸または遺伝子は、当該技術分野において公知のように、リポソームまたは他のトランスフェクション促進剤と会合した形で存在することが可能である。
本発明の抗原性タンパク質配列を発現させるために、種々の宿主−発現ベクター系を利用してもよい。このような宿主−発現系は、目的とするコード配列を産生し、そして続いて精製されてもよいビヒクルに相当するが、また、適切なヌクレオチドコード配列を形質転換またはトランスフェクションすることによってin situにて本発明の方法で使用されるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ遺伝子産物を提示可能な細胞にも相当する。これらには、限定されるわけではないが、mhp3をコードする配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターを用いて形質転換した細菌(例として、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis))などの微生物;マイコプラズマ・ハイオニューモニエ遺伝子産物をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換した酵母(例として、サッカロミセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属);マイコプラズマ・ハイオニューモニエをコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例として、バキュロウイルス)に感染させた昆虫細胞系;マイコプラズマ・ハイオニューモニエをコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例として、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)に感染させた、または、同配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例として、Tiプラスミド)を用いて形質転換した植物細胞系;あるいは哺乳動物細胞ゲノム由来のプロモーター(例として、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例として、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現構築物を宿する哺乳動物細胞系(例として、COS、CHO、BHK、293、3T3)が含まれる。好ましい実施態様において、発現系は細菌系である。
本発明にしたがって、約3〜10日齢のブタに対してマイコプラズマ・ハイオニューモニエ ワクチンの有効量を単回投与することにより、その後のマイコプラズマ・ハイオニューモニエの曝露に対する有効な免疫が付与される。好ましくは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ ワクチンを約6〜約8日齢時に投与する。最も好ましくは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ ワクチンを約7日齢時に投与する。
本ワクチン接種法は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対して血清陽性の子ブタ及び血清陰性の子ブタのいずれにも防御免疫を付与する。血清陽性の子ブタとは、血清中に抗マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗体を有する子ブタを指す。血清陰性の子ブタとは、検出可能なレベルの抗マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗体を血清中に持たない子ブタを指す。
マイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリンの調製
バイナリー エチレンイミン(BEI)を用いてマイコプラズマ・ハイオニューモニエNL1042株を不活化する。
バクテリンを100mlバイアル中に−50℃で保管した。バイアルを解凍し、そして15mlに分注したものを、使用するまで5±2℃で保管する。
保存剤として、10%エチレンジアミン四酢酸(EDTA、二ナトリウムまたは四ナトリウム塩)溶液を最終濃度およそ0.07%(w/v)で加える。
動物
約1週齢のブタをワクチン接種用に選定した。ELISAアッセイにてマイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する血清学的状態を評価した。ELISA値が0.50以下のブタをマイコプラズマ・ハイオニューモニエ陰性と判断した。ELISA値が0.50より大きいブタは血清学的にマイコプラズマ・ハイオニューモニエ陽性であると判断した。
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ バクテリンであるRESPISURE−1(ファイザー社)をブタへのワクチン接種に用いた。使用する前に、マイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリン標準品と比較した相対的な抗原定量によって、ワクチンの力価を求めた。ワクチン標準品(RP=1.0)は用量あたり約8000単位の抗原(不活化前に採取した生細胞約1〜2x108CCU)を含有し、これはワクチン中のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原量を測定する固相イムノアッセイにより求められた。
曝露用接種原
曝露用接種原には、10mlに分注した肺ホモジネートを−70℃にて凍結したものを用意し、そしてこれはマイコプラズマ・ハイオニューモニエ11(L1 36)株由来と同定された。接種原を解凍して、そしてその後、Friisマイコプラズマ ブロス中に1:25の希釈度となるよう希釈し、そして投与するまで氷上に保管した。以下の各実施例において特定した日に、1:25懸濁物5mlを各ブタに経鼻接種(各鼻孔に2.5ml)した。各曝露日に、肺接種原のアリコットを培養し、細菌が混入していないことを確認した。別のアリコットを3日間の各日に逆滴定し、接種原が約106〜107変色単位(CCU)/mlのマイコプラズマ・ハイオニューモニエを含有するとの結果が示された。
ブタは、母ブタといるうちに(第(−1)日)イヤータグで区別した。ブタを一般化乱塊法に従って豚舎及び治療群に割り当てた。ブタは同腹児及び離乳後の豚舎に基づいてブロック化した。
有効性を、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に典型的な肺病変の割合に基づき評価した。治療群(ワクチン接種)のブタでは、プラセボ群のブタに比べ、肺病変部の総割合が有意に少ないと決定された(P≦0.05)。
肺全体に対する各肺葉の割合(左上(left cranial)10%、左中10%、左下(left caudal)25%、右上10%、右中10%、右下25%および副10%)を用いて、各肺葉における肉眼病変の割合に加重値を与えた。次に、肺葉全体で肺葉の加重値を合計して、肺病変部の総割合を算出した(Pointonら, 1992)。
マイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリンRESPISURE−1(ファイザー社)を3〜8日齢のブタに単回投与し、毒性マイコプラズマ・ハイオニューモニエの曝露に対する防御作用を、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対して血清陽性のブタにおいて評価した。
(実施例4)
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ バクテリン RESPISURE−1を3〜8日齢のブタに単回投与し、毒性マイコプラズマ・ハイオニューモニエの曝露に対する防御作用を、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対して血清陰性のブタにおいて評価した。
(実施例5)
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ バクテリン RESPISURE−1を3〜8日齢のブタに単回投与し、毒性マイコプラズマ・ハイオニューモニエの曝露に対する防御作用を、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対して血清陰性のブタにおいて評価した。
Claims (15)
- マイコプラズマ・ハイオニューモニエ(Mycoplasma hyopneumoniae)の感染に起因する、動物における疾患または障害を治療または予防する方法であって、約3〜約10日齢の動物にマイコプラズマ・ハイオニューモニエ ワクチンの有効量を単回投与することを含む、前記方法。
- マイコプラズマ・ハイオニューモニエ ワクチン処方物が、不活化された、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の全体または一部の調製物である、請求項1に記載の方法。
- マイコプラズマ・ハイオニューモニエ ワクチンの単回投与が、用量あたり約1x106〜約5x1010変色単位(color changing units)(CCU)を含有する、請求項2に記載の方法。
- 投与される前記ワクチンの量が約0.5〜約3.0mlである、請求項2に記載の方法。
- マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞調製物がRESPISURE−1である、請求項2に記載の方法。
- マイコプラズマ・ハイオニューモニエ ワクチンがマイコプラズマ・ハイオニューモニエ以外のウイルス性または細菌性抗原をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記ウイルス性または細菌性抗原が、ブタインフルエンザウイルス(SIV)、ブタ繁殖・呼吸疾患ウイルス(PRRSまたはブタミステリー病)、離乳後下痢(PWD)及びブタ増殖性腸炎(PPE)から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記マイコプラズマ・ハイオニューモニエ調製物が筋肉内投与される、請求項2に記載の方法。
- 前記ブタがワクチン接種25週間後まで防御される、請求項1に記載の方法。
- マイコプラズマ・ハイオニューモニエ ワクチンがアジュバントをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- マイコプラズマ・ハイオニューモニエ ワクチンがサブユニットワクチンである、請求項1に記載の方法。
- サブユニットワクチンが一つ以上の免疫原性ポリペプチドまたはタンパク質、あるいはこれらポリペプチドまたはタンパク質の免疫原性フラグメントを含む、請求項12に記載の方法。
- ポリペプチドまたはタンパク質が:P46、P65、P97、P102、P70、P50及びP44からなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- マイコプラズマ・ハイオニューモニエ ワクチンが、一つ以上の免疫原性ポリペプチドまたはタンパク質、あるいはこれらポリペプチドまたはタンパク質の免疫原性フラグメントをコードする、1つ以上の遺伝子または核酸を含み、そして該遺伝子または核酸がin vivoにおいて発現可能である、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子または核酸が:p46、p65、p97、p102、p70、p50及びp44からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
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