TWI329514B - One dose vaccination with mycoplasma hyopneumoniae - Google Patents

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1329514 A7 B7 五、發明説明（i ) 發明領域 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係關於對年齡大約三（3 )至十（1 0 )天大 小之動物投用單一劑量之有效量的豬肺炎黴漿菌疫苗以治 療或預防動物經豬肺炎黴漿菌感染所引起的疾病或病症之 方法。豬肺炎黴漿菌疫苗可爲全部或部分去活化的細胞或 經修飾之活製劑、次單元疫苗、或核酸或D N A疫苗。依 .據本發明投用之豬肺炎黴漿菌疫苗可經合成或重組方式製 作。 發明背景 豬肺炎黴漿菌是導致豬感染地方性肺炎的細菌性病原 菌。地方性肺炎是一種慢性疾病，其會導致飼料轉化變差 、發育不良，並可能造成次發性肺部感染。豬肺炎黴漿菌 易由呼吸道分泌物及由母豬傳染給小豬，並在養豬場造成 流行。大約有9 9%的美國豬群受到感染，造成養豬工業 每年損失約三億美元。 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 多數已知用以對抗豬肺炎黴漿菌的疫苗均是豬肺炎黴 漿菌經佐劑化去活化之全部細胞製劑。此外’可經合成或 經選殖以及重組表現的豬肺炎黴漿菌基因製成免疫性多胜 肽或蛋白質的疫苗。活體內能表現該多胜肽或蛋白質之豬 肺炎黴漿菌基因亦可作爲疫苗。 全部細胞去活化的豬肺炎黴漿菌疫苗之實施例包括 RESPISURE 及 STELLAMUNE，市售有 Pfizer Inc.，USA ° 此外，目前已描述許多以重組方式製作之猪肺炎黴發 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -4- 1329514 A7 _B7___ 五、發明説明（2 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 菌產生免疫性多胜肽及蛋白質作爲次單元疫苗。在國際專 利公告W0 96/28472中描述六種分子量爲 46-48、52-54、60-64 '72-75' 9 0 - 9 4及1 1 0 — 1 1 4千道爾頓之豬肺炎黴漿菌蛋 白質抗原，以及揭示52 — 54、60 — 64以及72_ 7 5千道爾頓抗原之部分的蛋白質序列以及4 6 - 4 8千 道爾頓抗原之全長核苷酸及胺基酸序列。 選殖編碼豬肺炎黴漿菌蛋白質P46 (即P46)之 基因亦描述於 Futo et al. ( 1995; J. Bacteriol 177:1915-1917)。相同集團的硏充結果顯示活體外表現的基因產物 可用於診斷豬肺炎黴漿菌感染之抗體反應，而對其它黴漿 菌無交互反應性（Futo et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33:680-683)。使用描述於Futo et al.之p 4 6基因序列及 診斷的方法，進一步的揭示於歐洲專利公告第 0 4 7 5 185 A 1 號。 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製

Wise and Kim ( 1987，J. Bacteriol·，169:5546-5555)報 導四種豬肺炎黴漿菌的完整型膜蛋白，稱爲p 7 0、 p 6 5 ( P 6 5，supra ) 、p50 以及 P44，後三者係 經共價鍵結的脂質附著修飾，並可誘發強烈的體液免疫反 應。其免疫反應的保護效應則尙未經硏究。編碼P 6 5蛋 白質之基因已被選殖，且其序列以及作爲疫苗及診斷法方 面之用途已描述於美國專利第5，7 8 8，9 6 2號。 國際專利公告W0 9 1/1 5 5 9 3描述五種視分 子量爲1 05、90 ' 85、70以及43千道爾頓之豬 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ' -5- 1329514 A7 B7___ 五、發明説明（3 ) (諳先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 肺炎黴漿菌蛋白質。並提供編碼8 5千道爾頓蛋白質（蛋 白質C )之基因全長序列，及編碼其他四種蛋白質的部分 核苷酸序列。 美國專利第5，2 5 2，3 2 8號（頒給Faulds)掲 示免疫反應性豬肺炎黴漿菌蛋白質（分子量爲3 6、4 1 '44、48、64 '68、74.5、79、88.5 、9 6以及1 2 1千道爾頓）胺基端的序列。揭示的其它 蛋白質以電泳的移動性而非經蛋白質序列確認其視分子量 爲22 . 5、34以及5 2千道爾頓。美國專利第號 5，252，328係使用此類蛋白質作爲疫苗製劑，但 並無報導疫苗試驗之結果。 國際專利公告W0 9 5/0 9 8 70揭示生化方法 純化豬肺炎黴漿菌黏著素，其爲黴漿菌的完整型膜蛋白， 可黏著在宿主上呼吸道上皮的纖毛。 W 0 95/09870亦提出此類蛋白質之測定及 用途，例如用於疫苗及診斷法。 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製

King et al.之硏究報告（1997;Vaccine 15:25-35)揭示 Mhpl(124千道爾頓黏著素），其爲P97之變種 品系。

Wilton et al. ( 1 998, Microbiology 1 44:1 93 1 - 1 943 )確 認P97之94千道爾頓變種。此外，p97基因爲操縱 子的一部分，該操縱子亦編碼第二個蛋白質（稱爲 P 1 0 2 )，其預測之分子量大約爲102千道爾頓（

Hsu et al，1 998，Gene 214:13-23) 。Minion and Hsu 在國際 本纸铁尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -6- 1329514 A7 __B7_ 五、發明説明（4 ) 專利公告W〇 99/26664中使用P102作爲疫 苗，但亦無疫苗試驗報告。 目前已知的豬肺炎黴漿菌疫苗尙無可作爲在豬年齡大 約3至1 0天大小時的有效單劑。用此種疫苗可免除多重 投服，從而使對豬群大量接種疫苗之成本及勞力大爲降低 。因此，須要可以單一劑量疫苗接種於年齡約3至約’1 0 天大小之豬的有效豬肺炎黴漿菌疫苗以保護並預防由豬肺 炎黴漿菌引起的疾病或病症。 本發明槪要 本發明提供一種治療或預防由動物經豬肺炎黴漿菌引 起感染的疾病或病症之方法，包含對年齡約3至約1 0天 大小的動物投用有效量之單一劑量的豬肺炎黴漿菌疫苗。 本發明方法不需要投用爲了產生及/或維持免疫力對 抗豬肺炎黴漿菌的額外劑量。本發明方法的單一劑量疫苗 接種可保護血淸陰性及血淸陽性之豬隻對抗劇毒的豬肺炎 黴漿菌之刺激。本發明方法可有效的治療或預防因豬肺炎 黴漿菌感染引起的症狀，色括例如預防以及降低豬肺臟之 損害。 本發明方法包含對豬投用有效量之單一劑量的豬肺炎 黴漿菌疫苗，其中豬肺炎黴漿菌疫苗包含全部或部分的細 胞製劑，例如菌苗或經修飾之活製劑、次單元疫苗，例如 次單元疫苗，其係包含一種或多種源自豬肺炎黴漿菌之多 胜肽或蛋白質、該多胜肽或蛋白質產生免疫性的斷片、或 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智楚財產局員工消費合作社印製 1329514 A7 _B7_ 五、發明説明（5 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一種或多種編碼該蛋白質 '多胜肽或產生免疫性的斷片， 能在活體內表現的豬肺炎黴漿菌華因。豬肺炎黴漿菌疫苗 中提供之豬肺炎黴漿菌多胜肽、蛋白質、產生免疫性的斷 片以及基因或核酸可使用習知技藝合成或重組製作。 依據本發明投用之豬肺炎黴漿菌疫苗，可包括額外的 成份，例如佐劑。可使用各種包括本文描述及技藝上已知 的佐劑。 發明之詳細描述 本發明包含一種治療或預防動物經豬肺炎黴漿菌感染 引起的疾病或病症的方法，包含對年齡約3至約1 0天大 小的動物投用有效量之單一劑量的豬肺炎黴漿菌疫苗。 本發明方法之單一劑量疫苗接種，不需要爲了對豬產 生及/或維持免疫力對抗豬肺炎黴漿菌而投用額外劑量。 爲了說明本揭示，而非限制本發明之方法，本發明之 詳細描述可分成以下之兩個部份，以描述或說明本發明某 些特色、具體實施例或用途。 經濟部智慧財產局58工消費合作社印製 在某些具體實施例中，用於本發明方法之疫苗，包含 以部分或全部細胞豬肺炎黴漿菌去活化的製劑（菌苗）或 經修飾之活疫苗以及醫藥學上可接受的載體，或部分的或 全部細胞豬肺炎黴漿菌去活化的製劑（菌苗）或經修飾之 活疫苗及佐劑。 在其它特定的具體實施例中，用於本發明方法之疫苗 包含產生免疫性的蛋白質或多肽或其斷片以及醫藥學上可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -8- 1329514 A7 B7 ___ 五、發明説明（6 ) 接受的載體、或產生免疫性的蛋白質或多肽或其斷片以及 佐劑》 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 定義以及縮寫 本文術語中關於豬肺炎黴漿菌感染之％治療或預防' 係指抑制豬肺炎黴漿菌細菌複製、抑制豬肺炎黴漿菌傳輸 、或爲預防豬肺炎黴漿菌在其宿主中生長、以及緩和豬肺 炎黴漿菌感染引起的疾病或病症之症狀。若能降低細菌量 、降低肺部的感染及/或增加食物攝入及/或生長，則該 處理方法可視同爲治療。本發明方法，例如可有效的預防 或降低肺臟損害。 經濟部智祛財產局員工消費合作社印製 本文術語之''豬肺炎黴漿菌疫苗”意指用於預防或治 因感染療豬肺炎黴漿菌引起的病症或疾病之疫苗。豬肺炎 黴漿菌疫苗可包括任何有效治療或預防豬經豬肺炎黴漿菌 感染之疫苗。本發明中使用之豬肺炎黴漿菌疫，包括例如 :全部或部分的豬肺炎黴漿菌細胞製劑、去活化的或經修 飾之活疫苗、次單元疫苗，其具有一種或多種源自豬肺炎 黴漿菌之多胜肽或蛋白質、或該蛋白質或多胜肽產生免疫 性的斷片、或編碼一種或多種源自豬肺炎黴漿菌多胜肽或 蛋白質、或其產生免疫性的斷片之一種或多種豬肺炎黴漿 菌基因或核酸，且該基因或核酸能在豬之活體內表現。豬 肺炎黴漿菌多胜肽、蛋白質、該多胜肽及蛋白質產生免疫 性的斷片、或豬肺炎黴漿菌基因或核酸可使用已知技藝合 成或重組製作。本發明方法使用之較佳豬肺炎黴漿菌疫苗 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐) -9 - 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 Ϊ329514 A7 〜--^__-_ 五、發明説明（7 ) 爲菌Fq * 本文術語之"動物"意指所有非人類動物，包括哺乳 動物。 本文術語之 ''豬"意指小豬、豬、豬隻、豬、母豬、 雌豬、閹豬、野豬及豬屬之成員。 較佳者，本發明方法係施用於非人類之哺乳動物；最 佳者爲豬。 本文術語之"菌苗"意指適用於作爲疫苗之去活化的 €部或部分的豬肺炎黴漿菌細胞製劑。 本文術語之w有效量"意指於投用後可充分引起患者 免疫反應的豬肺炎黴漿菌疫苗量。免疫反應包含（而未限 制）先天誘發的、細胞的及/或體液免疫反應。 去活化的（部分的或全部細胞）以及經修飾之活疫苗 本發明方法中使用之製備去活化的或經修飾之活疫苗 的方法爲技藝上已知的方法。 可用於單一劑量疫苗接種方法之豬肺炎黴漿菌菌苗， 可得自各種公開的來源。例如，豬肺炎黴漿菌菌苗可製備 自豬肺炎黴漿菌的分離株。許多豬肺炎黴漿菌的分離株是 熟悉此技藝的專業人士所習知，並可購自例如：American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas，VA 20110-2209。此類分離株包括例如：A T T C 第 25095、25617、25934'27714 以 及2 7 7 1 5號》 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-10- 1329514 A7 ____B7__ 五、發明説明（8 ) 豬肺炎黴漿菌的分離株亦可使用已知的技藝直接的得 自天然或實驗室中感染豬隻受損害的肺臟。 (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 豬肺炎黴漿菌的分離株可使用各種已知方法去活化， 例如用雙體性乙烯亞胺（Β Ε I )處理菌株，描述於美國 專利第5，565，205號，或用例如甲醛、加熱、 B P L、輻射照射或戊二醛去活化。 適用於本發明方法之豬肺炎黴漿菌菌苗亦可得自各種 商業來源。該來源包括（但非限於）：RESPIFEND ( Fort Dodge, American Home Products) 、HYORESP ( Me rial Ltd) 、M + P A C ( Schering Plough ) 、PROSYSTEM M (

Intervet ) 、INGLEVAC M ( Boehringer ) ' RESPISURE (

Pfizer Inc.)、及 STELLAMUNE MYCOPLASMA ( Pfizer Inc·)。 應用於本發明方法之豬肺炎黴漿菌菌苗，較佳的來源 .爲 RESPISURE 及 STELLAMUNE MYCOPLASMA。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 應用於本發明方法之豬肺炎黴漿菌菌苗，尤佳的來源 爲 RESPISURE-1 ( Pfizer Inc.)，其中內含品系 P-5722-3 (NL1042)，來自 Purdue

University, USA。 較佳者，係將品系P - 5 7 2 2 — 3品系用Β Ε .1去 活化並佐以市售之佐劑，較佳者爲AMPHIGEN ( Hydronics， USA)。較佳的劑量約2 . 0毫升。一般可用習見的防腐劑 硫柳汞/EDTA。可添加入載體，較佳者爲PBS »製 備經修飾之活疫苗，例如經一系列培養以使菌株毒性衰減 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -11 - 1329514 經濟部智悲財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（9 ) 則爲已知的技藝。 次單元疫苗 本發明方法可使用具有純化的豬肺炎黴漿菌產生免疫 性的蛋白質、多胜肽以及該蛋白質及多胜肽產生免疫性的 斷片的次單元疫苗。該蛋白質以及多胜肽可使用已知的技 藝製備。此外，可使用熟悉此技藝的專業人士熟知的方法 測定蛋白質純度或均一性，例如將樣品進行聚丙烯醯胺凝 膠電泳，接著觀察染色凝膠的單一多肽條帶β使用 Η P L C或其它技藝上已知的相似方法進行測定可有較高 的解析度。 在特定的具體實施例中，本發明使用的疫苗，包含至 少一個豬肺炎黴漿菌蛋白質，例如（但非限於）： Ρ46、Ρ65、Ρ97'Ρ102、Ρ70、Ρ50& 及 Ρ 4 4。 在其它具體實施例中，本發明方法使用的疫苗包含豬 肺炎黴漿菌菌苗（去活化的全部或部分的細胞或經修飾之 活菌）或豬肺炎黴漿菌蛋白質或多肽或其產生免疫性的斷 片以及至少一個其它抗原（去活化的全部或部分的細胞或 經修飾之活菌）或產生免疫性的或抗原性的蛋白質、多肽 或其產生免疫性的斷片，較佳者爲病毒的、細菌的或寄生 蟲的多肽。其它病原體以及蛋白質、多胜肽或其產生免疫 性的斷片之實施例’包括（但非限於）：豬流行性感冒病 毒（S I V)、豬生殖以及呼吸疾病病毒（PRRS或不 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨ΟΧ2ί>7公釐） " -12 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1329514 A7 B7 五、發明説明（10) 明的豬疾病）、後-斷奶期腹瀉（P w D )以及豬增殖性 腸炎（P P E )病毒。該組成物有利於作爲組合疫苗。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在進一步的特定具體實施例中，該蛋白質或多胜肽產 生免疫性的斷片之序列包含本發明方法使用之產生免疫性 的蛋白質及多胜肽，包括（但非限於）：P 4 6、P 6 5 、卩97、？102、？70、？50以及卩44，至少 10、至少20、至少30、至少40、至少50或至少 100個鄰近的胺基酸。 此外，應用於疫苗之豬肺炎黴漿菌蛋白質爲相當純或 均質的蛋白質。本發明方法使用的蛋白質或多胜肽，一般 係純化自使用編碼此類蛋白質之重組核苷酸序列進行表現 之宿主細胞。該蛋白質可用各種技藝上已知的方法純化。 參閱，例如 ''Methods In Enzymology〃，1990，Academic Press, Inc., San Diego, ^ Protein Purification: Principles and practice"，1982，Springer-Verlag, New York。 純化的豬肺炎黴漿菌多胜肽以及蛋白質以及其產生免 疫性的斷片亦可使用習知的合成方法製備。 經濟部智慧財產局資工消費合作社印" 疫苗製劑 用於本發明疫苗的適當製劑，包括注射體，可爲液體 溶液或懸浮液；亦可爲適用於在注射之前製備成溶液或懸 浮液的固體形式。製劑亦可爲乳化製劑。產生免疫性的活 性成分一般可與醫藥學上可接受且與有效成份相容的佐劑 混合。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） -13- 1329514 A7 B7 五、發明説明（Ή) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 可調製成疫苗之多胜肽爲中性的或鹽類形式。肽之自 由胺基可與無機酸，例如：氯化氫或磷酸、或有機酸，例 如：乙酸、草酸、酒石酸、順丁烯二酸等，形成醫藥學上 可接受的鹽類包括酸加成鹽。自由羧基團亦可與無機鹼， 例如：鈉、鉀、銨、鈣、或氫氧_化鐵、及有機的鹼，例如 :異丙胺、三甲胺、2 -乙胺基乙醇、組織胺酸、普魯卡 因等形成鹽類。 用於本發明之疫苗製劑包含有效免疫量的豬肺炎黴漿 菌抗原以及醫藥學上可接受的載體。疫苗製劑包含有效免 疫量的一種或多種抗原以及醫藥學上可接受的載體。醫藥 學上可接受的載體爲技藝上所熟知，包括（但非限於）： 生理食鹽水、緩衝的生理食鹽水、葡萄糖、水、甘油、滅 菌之等張緩衝水溶液、及其組合。該可接受的載體之實施 例爲內含一種或多種安定劑，例如：穩定劑、水解的蛋白 質、乳糖等之生理上平衡的培養液。較佳之載體爲滅菌之 載體。調配物應適用於投藥模式。 經濟部智楚財凌局員工消費合作社印製 可用標準方法使用純化的抗原作爲疫苗製劑。例如， 純化的蛋白質應能調至適當的濃度，與任何適當的疫苗佐 劑調製並包裝後使用。適當的佐劑可包括（但非限於）： 礦物質凝膠’例如：氫氧化銘；表面活性物質，例如：溶 血卵磷脂；糖苷，例如：皂素以及皂素衍生物，例如：Quil A或GPI-0100;陽離子性表面活性劑，例如： DDA (四級烴銨鹵化物、聚醣醛酸多元醇；多元陰離子 以及多原子的離子；聚丙烯酸、非離子性嵌段聚合物，例 本紙張尺度適财關家標準（CNS ) A4規格（210X297公楚) -14- 1329514 Α7 Β7 五、發明説明（12) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 如：聚醣醛酸 F-127 ( B.A.S.F.，USA) ; Avridine 以及 Rantidine ;肽類；重組突變不穩定的毒素，例如：白毒素 (rml T)或霍亂毒素（CT);化學結合物或靠近 近端分子運送者；礦物油，例如：Montanide ISA-50 (Seppic, Paris, France), carbopol， Amphigen (Hy dronics, USA), Omaha, NE. USA, Alhydrogel, (Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark)、油乳狀液，例如：礦物油乳劑， 例如BayolF/Arlacel A以及水、或植物油乳劑、水以及乳化 劑，例如：卵磷脂；明礬、M D P、N —乙醯基一胞壁基 _ 1 一蘇胺醯基—D —異麩胺醯胺酸（t h r - MDP) 經濟部智慈財產局貸工消費合作钍印^ 、N —乙醯基-去甲一胞壁基-1 一丙胺醯基一 D -異麩 胺醯胺酸、NT -乙醯基胞壁基_ 1 _丙胺醯基—D-異麩 胺醯胺醯基_ 1 一丙胺酸—2 -（ 1 — _2 / _二棕櫚醯 基—s η —甘油基- 3 —羥基磷醯基氧基）—乙胺；膽固 醇細胞激動素以及佐劑結合物。多原子的離子亦可作爲分 散、增稠以及防結塊劑，其可使疫苗在經過長期間沈降之 後的非懸浮液再度懸浮。佐劑結合物可爲水溶性、封包的 (控制或延釋的）或微封包的形式。 抗原亦可倂入應用於疫苗調配物之脂球體，或聯結至 多糖及/或其它聚合物。重組抗原之實例爲半抗原，即爲 可選擇地與同源的抗體反應的免疫性分子，但不具產生免 疫性不能引起免疫反應，半抗原可共價結合至載體或產生 免疫性的分子；例如，大的蛋白質，例如血淸白蛋白，因 而賦予耦合的半抗原免疫產生性。半抗原-載體可調製成 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -15- 1329514 A7 ____B7__ 五、發明説明（13) 疫苗。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 基因以及核酸疫苗 本發明方法可使用編碼產生免疫性的蛋白質、多胜肽 以及該蛋白質以及多胜肽產生免疫性的斷片之豬肺炎黴漿 菌基因或核酸。該基因以及核酸可在活體內表現並可使用 已知的技藝製備。 在特定的具體實施例中，本發明使用的疫苗包含至少 一個編碼豬肺炎黴漿菌蛋白質，例如（但非限於）： P46、P65、P97、P102、P70、P50 以 及P 4 4之基因或核酸。 在進一步的特定具體實施例中，本發明方法使用編譯 豬肺炎黴漿菌蛋白質或多胜肽產生免疫性的斷片的基因或 核酸，本發明方法使用之產生免疫性的蛋白質以及多胜肽 ，色括（但非限於）：P46、P65、P97、 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 P102、P7 0、P5 0以及P44，彼具有之序列包 含至少10、至少20、至少30、至少40、至少50 或至少1 0 0個彼鄰近的胺基酸。 在本發明方法其它的具體實施例中，基因或核酸可用 已知的方法投用，例如使用DNA注射槍。 在本發明方法另一具體實施例中，使用之基因或核酸 爲D NA疫苗。此外，核酸或基因中可與技藝上已知的脂 球體或其它轉染作用促進藥劑相聯結。 製備及傳輸D N A疫苗之方法爲技藝上已知的方法。 ^纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格< 210X 297公釐) -16- 1329514 A7 B7 五、發明説明（14) 參閱例如：Krishnan，B. R, vv Current Status of DNA vaccines in veterinary medicine" , Advanced Drug Delivery Reviews, Elsevier Science ( 2 0 0 0 )。 表現系統 可利用各種宿主表現載體系統表現本發明之抗原性蛋 白質序列。不但可製作出該編碼重要序列的宿主表現系統 載體以及純化表現的蛋白質，且適當的核苷酸編碼序列轉 形的或轉染的細胞亦可用本發明方法原位展現豬肺炎黴漿 菌基因產物。此類宿主包括（但非限於）：微生物，例如 內含mh p 3編碼序列之重組噬菌體D NA、質體DNA 或黏接質體D NA表現載體轉形的細菌（例如大腸桿菌、 枯草芽孢桿菌）：內含豬肺炎黴漿菌基因產物編碼序列之 重組酵母菌表現載體轉形的酵母菌（例如：酵母菌、畢赤 酵母）；內含豬肺炎黴漿菌編碼序列之重組病毒表現載體 (例如桿狀病毒）感染的昆蟲細胞系統；內含豬肺炎黴漿 菌編碼序列之重組病毒表現載體（例如：花椰菜鑲嵌病毒 、C aMV ;菸草花葉病毒、TMV)感染的或重組質體 表現載體（例如T i質體）轉形的植物細胞系統；或內含 源自哺乳動物的細胞基因組之啓動子（例如：金屬锍基組 胺酸三甲基內鹽啓動子）或來自哺乳動物的病毒之啓動子 (例如腺病毒晚期啓動子；牛痘病毒7.5K啓動子）的 重組表現構築體之哺乳動物的細胞系統（例如：C 0 S、 CH0、BHK ' 293、3T3)。在較佳的具體實施 本纸浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} --- 訂 經濟部智慧財產局貞工消費合作社印製 -17- 1329514 A7 _____ ___B7_ 五、發明説明（15) 例中，表現系統是細菌的系統。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 豬肺炎黴漿菌多胜肽以及蛋白質以及其產生免疫性的 斷片亦可使用活重組病毒性的以及細菌的載體（例如腺病 毒或沙門桿菌）表現及運送。實際的載體亦爲習知的載體 且可立即得自技藝或可由熟悉此技藝的專業人士使用已知 的方法構築。 劑量及投藥模式 依據本發明，對年齡大約3至1 0天的豬投用有效量 之單一劑量豬肺炎黴漿菌疫苗可提供有效的免疫力對抗以 後豬肺炎黴漿菌之刺激。較佳者，豬肺炎黴漿菌疫苗投用 在年齡大約六至約八天。最佳者，豬肺炎黴漿菌疫苗投用 在年齡大約七天。 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 有效的單一劑量投藥之豬肺炎黴漿菌菌苗用量每劑量 含有約lx 1 〇6至約5χ 1 01。顏色變化單位（CCU) 。較佳者，提供有效免疫力之單一劑量緖肺炎黴獎菌菌苗 中含有約lx 1〇8至5x 101DCCU /劑量，更佳者約 5x 1 〇8至 5x 1 OHCCU/劑量。 依據本發明，當投用較佳的菌苗產物RESPISURE-1時 ，單一劑量投藥之RESPISURE-1用量約〇 . 5至約3 · 0 毫升’較佳者約1 · 5毫升至約2 . 5毫升，更佳者約2 毫升。 本發明方法中包含一種或多種蛋白質或多胜肽或該蛋 白質或多胜肽產生免疫性的斷片次單元疫苗之藉肺炎黴獎 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -18- 1329514 A7 B7 五、發明説明（16) 菌疫苗，其有效的用量約〇.01微克至約200微克。 本發明方法中包含編碼產生免疫性的蛋白質或多胜肽 或該蛋白質或多胜肽產生免疫性的斷片之一種或多種豬肺 炎黴漿菌基因或核酸（較佳者DNA)的豬肺炎黴漿菌疫 苗，其有效的用量約0·1微克至約200毫克。 依據本發明，投藥可經習知的路徑達成，包括：口服 、鼻腔內、黏膜塗覆、經皮、以及非經腸（例如：靜脈內 '腹腔內、皮膚內、皮下或肌肉內）路徑。投藥亦可使用 非注射針的傳輸裝置達成。投藥可使用組合路徑達成，例 如先使用非經腸路徑投藥，接著使用黏膜路徑投藥。較佳 的投藥路徑是肌肉內投藥。 本發明疫苗的有效劑量（免疫量）亦可從源自模式供 試系統之劑量反應曲線以外差法取得。 本疫苗接種方法提供血淸陽性的小豬以及血淸陰性的 小豬對豬肺炎黴漿菌的保護免疫力。血淸陽性的小豬意指 血淸中帶有對抗豬肺炎黴漿菌抗體之小豬。血淸陰性的小 豬意指小豬血淸中不帶有可偵測的對抗豬肺炎黴漿菌抗體 含量之小豬。 本發明進一步的用下列實施例說明（但非限制）》 實施例1 製備豬肺炎黴漿菌菌苗 用雙體性乙烯亞胺（Β Ε I )去活化豬肺炎黴漿菌品 系 N L 1 0 4 2。 在生長期終止時，培養液中之酸鹼度增加至7 . 8 土 纸張尺度適用中國國家標準（ CNS ) Α4規格（210X 297公釐) ~ -19- (請先閱請背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經滴部智竑財產局員工消費合作社印製 物514 A7 B7 五、發明説明（17) (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 〇 · 2，將此酸鹼度範圍維持至少一個小時。此時’加入 2 -溴乙胺溴化氫（B E A )之濾器滅菌水溶液’最終濃度 大約4 _ 0毫莫耳濃度。升高的酸鹼度’使BEA行化學 變化成爲BEI 。培養液在37±2°C、固定的振盪下反 應至少2 4小時》 於反應2 4小時之後，加入硫代硫酸鈉濾器滅菌水溶 液’最終濃度大約4毫莫耳濃度以中和過量的B E 1 。培 養液在3 7± 2 °C、固定的振盪下再反應2 4小時。 去活化後，於硫代硫酸鈉中和之前反應，取樣及測試 去活化是否完成。在內含0.0026%酚紅之新鮮培養 液中接種5 - 2 0%接種體，在檢驗顏色改變（代表去活 化失敗）之前於3 7 ± 2 t下反應至少一週。散裝樣品在 硫乙醇酸酯培養液體中，3 7± 2 °C下測試是否失去活性 ’及用trypticase大豆培養液在室溫下測試是否失去活性。 去活化的培養物可轉移至滅菌之貯存容器並儲存在2 _ 8 °C下直到組裝爲止。 經滴部智竓財產局肖工消费合作社印製 在最終容器中經活體外血淸的測試測定藥效以定量抗 原。用於疫苗藥效之硏究測定疫苗終止使用之前必須存在 之最小藥效。 對各系列的或第一批次系列的完成產物之散裝或最終 容器樣品進行以下之豬肺炎黴漿菌測試。 菌田於-5 C下儲存在1 〇 〇毫升之管形瓶內。將管形 瓶解凍並分裝成1 5毫升，儲存在5 + /— 2。(：直到使用 爲止。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公整） -20- 1329514 經濟部智毡財產局员工消費合作社印一私 A7 B7 五、發明説明（18) 爲了測試組裝系列的藥效，將一系列的樣本與參考文 疫苗相比較’測定一系列的R P單位。較佳之系列的或次 系列的疫苗在開始計時之前應含有至少6 . 3 3 R P，在 計時後至少應含有5 . 0 6 R P。 RP意指相對的藥效。RP可由相較於參考疫苗之相 對的抗原量加以測定。在此案例中參考疫苗之R p其定義 =1 . 0。本發明之單一劑量產物，較佳者之RP爲 6 . 33，即爲參考疫苗之6 . 33倍。 加入硫柳汞作爲防腐劑，最終濃度不超過〇 . 〇 1 ( w / v )。 加入1 0%乙烯—二胺四乙酸（EDTA，二鈉或四 鈉鹽）溶液作爲防腐劑，最終濃度大約〇 . 〇 7% (w/ v ) ° 實施例2 動物 選擇年齡大約一週的豬隻接種疫苗。血淸中豬肺炎黴 漿菌的狀態係用酵素聯結免疫抗體檢測法測定評估。將酵 素聯結免疫抗體檢測法數値S 0 . 5 0的豬隻視爲豬肺炎 黴漿菌陰性。酵素聯結免疫抗體檢測法數値大於0 . 50 的豬隻視爲豬肺炎黴漿菌血清陽性。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-21 - 1329514 A7 _ ___B7___ 五、發明説明（19) 疫苗 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用豬肺炎黴漿菌菌苗RESPISURE-l ( Pfizer Inc.) 接種豬隻。在使用之前與參考豬肺炎黴漿菌菌苗互相比較 其抗原量以測定疫苗藥效。固相免疫測定測量疫苗內豬肺 炎黴漿菌抗原之含量，顯示參考苗（RP = 1 . 〇)每劑 量內含約8 0 0 0單位之抗原（在去活化之前收穫自約 1至2 X 1 0 8 C C U之活細胞）》 使用用於調製 RESPISURE-1之相同液體佐劑（ AMPPHIGEN)作爲安慰劑（即無細菌的細胞）。 接種體刺激 接種體刺激，係使用冷凍於-7 0 °C下、並經確認爲豬 肺炎黴漿菌品系1 1之衍生品系（L 1 3 6 )之1 〇毫 經濟部智毯財產局S(工消費合作社印製 升的肺臟均質液樣本。接種體解凍後用Fdis黴漿菌屬液體 培養基以1:25稀釋，並保存於冰中直到投用爲止。在 下列各實施例中，各豬隻於特定的天數鼻腔內的接種5毫 升劑量（鼻孔每2 . 5毫升）之1 : 2 5懸浮液。各於刺 激當日，用等量肺臟接種體樣本進行培養以證實彼不含細 菌的污染。使用第二個等量樣本各進行逆滴定3天，顯示 接種體內含大約1 〇6_ 1 〇7顏色變化單位（CCU) / 毫升之豬肺炎黴漿菌° 實驗的步驟 小豬尙未與母豬分離之前〔天（-1 )〕即用耳標確認 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) ' -22 - 1329514 A7 B7 五、發明説明（20) 。指定豬隻的畜欄並依據一般性的隨機嵌段設計分組。依 據胎別及斷奶後畜欄對豬隻進行嵌段分組。 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於第0天，對豬隻以肌肉內接種2毫升劑量之豬肺炎 黴漿菌菌苗RESPISURE-l(PfizerInc.)，或肌肉內接種2 毫升劑量的安慰劑。於下列各實施例中各豬於特定的天數 時在鼻腔內接種5毫升劑量之刺激接種體的1:25懸浮 液。每天監測所有豬隻並檢查臨床疾病的症候。 在第一天剌激之後於特定時間，將所有豬隻安樂死並 驗屍。移除肺並進行評估。驗屍檢驗包括估計與黴漿菌呼 吸疾病病理學相關的程度。檢查各肺葉，並估計各肺葉損 害之百分比。紀錄大體損害之程度。 數據分析 功效評估係用豬肺炎黴漿菌感染後肺臟損害之百分比 表示。處理（接種）組的豬隻係測定其總肺臟損害顯著的 (P S 0 . 0 5 )低於安慰劑組豬隻之百分。 經濟部智楚財產局員工消費合作社印製 總肺臟損害百分比 各肺葉涉及大體損害之百分比係用以下各肺葉對肺臟 總重之比例進行加權：左上葉1 0 %、左中葉1 0 %、左 尾葉25%、右上葉10%、右中葉10%、右尾葉25 %、及附葉1 0 %。然後總合加權的肺葉値產生總肺臟損 害百分比（Pointonetal.,1992)。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） -23- 1329514 經濟部智祛財產局肖工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（21 ) 實施例3 對抗劇毒性的豬肺炎黴漿菌刺激之保護作用係對年齡 3至8天大的豬隻投用單一劑量豬肺炎黴漿菌菌苗 RESPISURE-1以評估豬隻是否爲豬肺炎黴漿菌血淸陽性（ 正性）。 在疫苗接種時間附近進行五重複之疫苗藥效測定。相 較於參考疫苗對抗原進行相對的定量測定RP。參考疫苗 具有之RP=1.0，內含約80〇〇單位之豬肺炎黴漿 菌抗原。此類五次測定得到之R分別爲5 . 4 2、 3.96、4. 71、5. 49 及 4. 36° 於第0天，將處理組的豬隻T02 (參閱以下之表1 )以肌肉內接種2毫升劑量的豬肺炎黴漿菌菌苗 RESPISURE-1 ( Pfizer Inc. ) .。T 0 1 組的豬隻則以肌肉內 接種2毫升的安慰劑。於第1 78、1 79以及1 80天 各豬鼻腔內的得到5毫升劑量（每個鼻孔2·5毫升）之 刺激接種體的1: 25懸浮液。於各3天，將等量樣本之 刺激材料於接種時進行培養以證實不含細菌的污染。將第 二個等量樣本逆滴定以證實刺激原料內含大約1 07 C C U/毫升之豬肺炎黴漿菌。每日監測所有豬隻並檢查 臨床疾病的症候。 於第一天刺激之後三十天，將所有豬隻安樂死及驗屍 。移除肺並評估。驗屍檢驗包括估計與豬肺炎黴漿菌誘發 的呼吸疾病病理學相關的程度。 檢查各肺葉，並估計各肺葉損害之百分比》紀錄大體 本紙乐尺度適用中國國家榇準（CNS)A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-24- 1329514 A7 Β7 五、發明説明（22 ) 損害之程度。 表 1 處 理 疫苗化 數目 接種 刺激（第 刺激（第 刺激（第 組 合物 (第0天） 178〗天） 1791 天） 180丨天） T01 安慰劑 26 26 26 26 26 T02 疫苗 26 26 242 223 2?3 1劇毒的豬肺炎黴漿菌接種體 2豬隻7 1以及7 3因爲在進行刺激硏究之前喪失耳標 判定動物各而移除。 3豬3 6因爲麻醉倂發症於第1 7 8天死亡。豬3 醉倂發症於第179天死亡。 肺臟損害結果總結於表2。接種的豬隻（T〇 2 炎性肺臟損害百分比之最小平方平均値顯著的（Ρ = 〇 · 0001)比安慰劑豬隻（Τ01)低（2 . 〇v s . 4.5%)。 法 無 麻 爲 肺 -----J----- (錆先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 經濟部智祛財產局員工消費合作社印製 表2總肺腺 1損害百分 比摘要 處理 化合物 豬隻數目 LS平均値 丁01 安慰劑 26 4.5a T02 疫苗 22 2.0b 不同之上標値，在統計上不同 （Ρ

張 紙 本 尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0X297公釐） -25 - 1329514 A7 B7 五、發明説明（23) 硏究結果指出年齡大約一週的豬隻用豬肺炎黴漿菌菌 苗RESP ISURE-1進行單一的疫苗接種可誘發保護 對抗劇毒性豬肺炎黴漿菌後續的刺激。 實施例4 對抗劇毒的豬肺炎黴漿菌刺激之保護作用係對年齡3 至8天大的豬隻投用單一劑量豬肺炎黴漿菌菌苗 RESPISURE-1以評估豬隻是否爲豬肺炎黴漿菌血淸陰性（ 負性）。 在疫苗接種時間附近進行五重複之疫苗藥效測定。相 較於參考疫苗對抗原進行相對的定量測定RP。參考疫苗 具有之RP = 1 . 0，內含約8 0 0 0單位之豬肺炎黴漿 菌抗原。此類五次測定得到之R分別爲5 . 4 2、 3.96、4.71、5. 49 及 4. 36° 於第0天，將處理組的豬隻T 0 2肌肉內的接種2毫 升劑量的豬肺炎黴漿菌菌苗RESPISURE-1。T 0 1組的豬 隻則肌肉內的接種2毫升的安慰劑。於第1 7 3、1 74 以及1 7 5天各豬鼻腔內的得到5毫升劑量（每個鼻孔 2.5毫升）之剌激接種體的1:25懸浮液。於各3天 ，將等量樣本之刺激材料於接種時進行培養以證實不含細 菌的污染。將第二個等量樣本逆滴定以證實刺激原料內含 大約1 06 C CU/毫升之豬肺炎黴漿菌。每日監測所有 豬隻並檢查臨床疾病的症候。 於第一天刺激之後二十九天，將所有豬隻安樂死及驗 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2!0X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智祛財產局員工消費合作社印製 -26- 1329514 A7 B7 五、發明説明（24) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 屍。移除肺並評估。驗屍檢驗包括估計與豬肺炎黴漿菌誘 發的呼吸疾病病理學相關的程度。檢查各肺葉，並估計各 肺葉損害之百分比。紀錄統合損害之程度。 表3總結實驗設計。 表 3 處理組 疫苗接種 數 接種（ 刺激（第 刺激（第 刺激（第 化合物 巨 第0天） 173天丨） 174天丨） 175天】） T01 安慰劑 26 26 252 24Λ 24 T02 疫苗 26 26 233 205 20 1劇毒的豬肺炎黴漿菌。 2豬1 2 3於第1 9天因發生慢性敗血症的多發性關節炎而 安樂死。 3緖2 2 2於第4 0天死亡。屍體檢驗發現大量的心包液及 心包膜出血。豬1 〇 2因爲直腸下垂於第9 5天安樂死。 猪2 0 4於第1 4 5天死亡。因爲屍體嚴重降解所以沒有 進ί了屍體檢驗β 經濟部智慈財凌局員工消費合作社印製 4藉2 4 4因麻醉倂發症爲於第1 7 4天（於刺激後第一天 )死亡。 53豬隻發生ΝΕΕΑ» 肺臟損害結果總結於表4。整體分析指出接種的豬隻 (τ 〇 2 )肺炎性肺臟損害百分比之最小平方平均値顯著 的（Ρ = 〇 · 0001)比安慰劑豬隻（Τ01)低（ ) A4^ ( 210X297^ ) -27- 1329514 A7 B7 五、發明説明（ 25 0 9 % ) 表 4·總肺臟損害百分比之摘要 肺臟損害之百分比

I 處理 化合物 豬隻數目 LS平均値 範圍 T01 安慰劑 注 24 5.9a 0至36 T02 疫苗 20 0.3' Η -1 不同上標之 値’在統計上不同（p = 〇 . 0001 貪 硏究結果指出豬隻用豬肺炎黴漿菌菌苗rESIPUre ONE 進行單一的疫苗接種可誘發保護對抗劇毒性豬肺炎黴漿菌 後續的實驗性刺激。 實施例5 對抗劇毒的豬肺炎黴漿菌刺激之保護作用係對年齡3 至8天大的豬隻投用單一劑量豬肺炎黴漿菌菌苗 RESPISURE-1以評估豬隻是否爲豬肺炎黴漿菌血淸陰性（ 負性）。 在疫苗接種時間附近進行五重複之菌苗藥效測定。相 較於參考疫苗對抗原進行相對的定量測定R P。參考疫苗 具有之RP=1 · 〇 ，內含約8000單位之豬肺炎黴漿 菌抗原。此類五次測定得到之r分別爲5 · 4 2、 3. 96、4.71、5.49 及 4. 36。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 订 經濟部智慧財產局員工"費合作社印製 -28- 1329514 A7 B7 五、發明説明（26) 於第0天，將處理組的豬隻το 2肌肉內的接種2毫 升劑量的豬肺炎黴漿菌菌苗。Τ〇 1組的豬隻則肌肉內的 接種2毫升的安慰劑。於第76、77及78天各豬鼻腔 內的得到5毫升劑量（每個鼻孔2 . 5毫升）之刺激接種 體的1 : 2 5懸浮液。於各3天，將等量樣本之刺激材料 於接種時進行培養以證實不含細菌的污染。將第二個等量 樣本逆滴定以證實刺激原料內含大約1〇6 CCU/毫升 之豬肺炎黴漿菌。每日監測所有豬隻並檢查臨床疾病的症 候。 於第一天刺激之後二十九天，將所有豬隻安樂死及驗 屍。移除肺並評估。驗屍檢驗包括估計與豬肺炎黴漿菌誘 發的呼吸疾病病理學相關的程度。檢查各肺葉，並估計各 肺葉損害之百分比。紀錄統合損害之程度。 表5總結實驗設計。 (諳先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經漓部智慧財產局8工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -29- 1329514 A7 B7 五、發明説明（27 表 處理組 疫苗接種 化合物_ 數目 接種 (第0天） 刺激 (第176天 刺激 (第177天'） 刺激(第 178天 T01 安慰劑 26 26 232 23 23 S3 T02 疫苗 26 26 213 21 21 ir C j 1劇毒的豬肺炎黴漿菌接種體 2豬隻2 3 7及2 3 9於第一 1 一天測試發現其爲豬肺炎黴 漿菌正性。將此類小豬於硏究的第1 4天移除並安樂死。 豬2 2 0在第三天發現被母豬壓死。 3豬隻2 3 8、2 4 0以及2 7 7於第一1—天測試發現其 爲豬肺炎黴漿菌正性。將此類小豬於硏究的第1 4天移除 並安樂死。豬2 8 0因爲厭食及消瘦於第7天安樂死。豬 1 7 7發生慢性消瘦症候群，於第4 0天安樂死。 肺臟損害結果總結於表6。整體分析指出接種豬隻（ T 0 2 )的肺炎性肺臟損害百分比之最小平方平均値顯著 事 項 再 麥 訂 低 NIX IX ο T 隻 豬 劑 慰 安 比 的

S 經濟部智祛財產局員工消費合作社印製 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -30- 1329514 A7 B7 五、發明説明（28) 表 6.總肺臟損害百分比之摘要 同 不 上 統 在 値 數 之 標 上 同 不 ο --裝-- 注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智.½財產局g (工消費合作社印製 肺臟損害百分比 治療 化合物 豬隻數目 LS平均 範圍 請 T01 安慰劑 23 9.9a 0 至 40.5 先 閲 讀 T02 疫苗 21 0.5b 0至5 背 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -31 -

Claims (1)

1329514 A8 B8 X&. D8 六、申請專利範圍 - ；_ —__________I 附件3: 第9 1 1 14057號專利申請案 β 中文申請專利範圍替換本 民國99年5月24日修正 一種去活性之豬肺炎黴發菌（£； 〇〆α ·? m α 全細胞製劑於製備供治療或預防動物因感染 豬肺炎黴漿菌所引起之疾病或病症的單一劑量豬肺炎黴發 菌疫苗上之用途，其中該單一劑量豬肺炎黴漿菌疫苗含有 至少約1x1 08顏色變化單位（CCU)且係給予對豬肺炎黴漿菌 呈血清陽性反應或血清陰性反應之年齡約3至約10天之動 物。 2 ·如申請專利範圍第1項之用途，其中該動物係豬。 3.如申請專利範圍第2項之用途，其中該豬對豬肺炎 黴漿菌呈血清陽性反應。 4·如申請專利範圍第2項之用途，其中該豬對豬肺炎 黴漿菌呈血清陰性反應。 5. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該豬經疫苗接 種後受保護達25週。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先聞部背面之注意事項再填寫本頁) 6. 如申請專利範圍第！項之用途，其中該單一劑量豬 肺炎黴漿菌疫苗含有每劑量約lxlO8至5χ10ι()顏色變化單 位（CCU) 〇 7. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該單一劑量豬 肺炎黴漿菌疫苗含有每劑量約5xl08至5χ10|()顏色變化單 位（CCU)。 8. 如申請專利範圍第丨項之用途，其中給予該疫苗之 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公羞）_ 1

經 濟 部· 智 慧 財* 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 1329514 A8 B8 C8 ________ D8 六'申請專利範圍 量係約0 · 5至約3 · 0 m 1。 9.如申請專利範圍第1項之用途，其中給予該疫苗之 量係約1 · 5至約2.5 m 1。 1 〇.如申請專利範圍第1項之用途，其中給予該疫苗 之量係約2 m 1。 1 1 .如申請專利範圍第1項之用途，其中該豬肺炎黴 獎囷全細胞製劑係RESPISURE-1。 12·如申請專利範圍第1項之用途，其中該豬肺炎黴 ^菌疫苗進一步包含非豬肺炎黴漿菌之病毒性或細菌性抗 原。 1 3 .如申請專利範圍第1 2項之用途，其中該病毒性或 細菌性抗原係選自：豬流行性感冒病毒（SIV)、豬生殖及呼 吸疾病病毒（PRRS或神祕的豬疾病）、斷奶後腹瀉（PWD)及 豬增殖性腸炎（ΡΡΕ)。 1 4.如申請專利範圍第1項之用途，其中該豬肺炎黴 漿菌全細胞製劑係經肌肉內給予。 1 5，如申請專利範圍第1項之用途，其中該豬肺炎黴 漿菌疫苗進一步包含佐劑。 1 6.如申請專利範圍第1 5項之用途，其中該佐劑選 自：礦物質凝膠；表面活性物質，諸如溶血卵磷脂；糖 苷，其包含皂素或皂素衍生物，諸如Quil Α或GP 1-0100; Pluronic多元醇；多元陰離子；非離子性嵌段聚合物、礦物 油、油乳狀液、植物油乳狀液、水及乳化劑，諸如卵磷 脂；明礬、細胞因子、CpG寡核苷酸、MDP、N-乙醯基-胞 請 先 閱

面 之 注 I 旁 裝 訂 線 本纸張又度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -2- 1329514 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 壁基-L-蘇胺醯基-D-異麩胺醯胺（thr-MDP)、N-乙醯基-去 甲-胞壁基-L-丙胺醯基-D-異麩胺醯胺、N-乙醯基-胞壁基-L-丙胺醯基-D-異麩胺醯胺基-L-丙胺酸- 2-(1’，2’-二棕櫚醯 基-sn-甘油基-3-羥基磷醯基氧）-乙胺；白毒素（rmLT);及 AMPHIGEN。 17.如申請專利範圍第1項之用途，其中該豬肺炎黴 漿菌疫苗進一步包含藥學上可接受之載體。 (請先閱策背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!0><297公釐） -3-