ES2550458T3 - Vacuna monodosis con Mycoplasma hyopneumoniae - Google Patents
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Abstract
Una vacuna que contiene una bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en cerdos causado por una infección por Mycoplasma hyopneumoniae; en la que dicha vacuna es administrada en una única dosis a dichos cerdos a los 3 días de edad; y en la que dicha única dosis es eficaz en el tratamiento o en la prevención de los síntomas causados por una infección por Mycoplasma hyopneumoniae.
Description
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Las vacunas para su uso en la presente invención proporcionan una inmunidad protectora, tanto en lechones seropositivos como en lechones seronegativos para M. hyo. Los lechones seropositivos se refieren a aquellos lechones que tienen en el suero anticuerpos contra M. hyo. Los lechones seronegativos se refieren a aquellos lechones que no tienen en el suero niveles detectables de anticuerpos contra M. hyo.
La presente invención esta adicionalmente ilustrada, pero no limitada, por los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Preparación de una bacterina de M. hyo
Se usa etiIenoimina binaria (BEI) para la inactivación de la cepa de M. hyo NL1042.
Al final del periodo de crecimiento, el pH del cultivo se elevó hasta 7,8 0,2, y el pH se mantuvo en este intervalo durante al menos una hora. En ese momento se añadió una solución acuosa filtrada estéril de bromhidruro de 2brometilamina (BEA) a una concentración final de aproximadamente 4,0 mM. En presencia de un elevado pH, el BEA cambia químicamente a BEI. El cultivo se incubó a 37 + 2 ºC con agitación constante durante al menos 24 horas.
Después de la incubación de 24 horas, se añadió una solución acuosa filtrada estéril de tiosulfato de sodio a una concentración final de aproximadamente 4 mM para neutralizar el exceso de BEI. El cultivo se incubó a 37 + 2 ºC con agitación constante durante 24 horas adicionales.
Después de la inactivación, pero antes de la neutralización con tiosulfato de sodio, se tomó una muestra representativa y se ensayó para comprobar que se había completado la inactivación. Se inoculó medio reciente que contenía un 0,0026 % de rojo fenol con un inóculo del 5 -20 % y se incubó a 37 + 2 ºC durante al menos una semana antes del análisis del cambio de color, lo que es indicativo de que no se ha conseguido la inactivación. Se ensayó la esterilidad de las muestras en bruto en caldo de tioglucolato a 37 + 2 ºC, y en caldo de tripticasa de soja a la temperatura ambiente. El cultivo inactivado puede transferirse a recipientes de almacenamiento estériles y almacenarse de 2 a 8 ºC hasta su ensamblaje.
La potencia se determinó mediante un ensayo serológico in vitro para cuantificar el antígeno en el recipiente final. La potencia de las vacunas usadas en el estudio de eficacia determina la potencia mínima que debe estar presente en la vacuna en la fecha de caducidad.
Se ensayaron muestras a granel o del recipiente final del producto completado de cada serie o de la primera subserie para la comprobación de M. hyo como sigue.
La bacterina se almacenó a -50C en viales de 100 ml. Los viales se descongelaron y se almacenaron subalícuotas de 15 ml a 5 +/-2C hasta su uso.
Para ensayar la potencia de la serie ensamblada se comparó una muestra de la serie con una referencia y se determinaron las unidades de RP para la serie. Una serie o una subserie deberían contener preferiblemente al menos 6,33 RP al inicio de la datación, y al menos 5,06 RP a lo largo de la datación.
RP se refiere a la potencia relativa. Las RP pueden ser determinadas mediante una cuantificación relativa del antígeno en comparación con una vacuna de referencia. En este caso la referencia tiene por definición una RP = 1,0, El producto de dosis única de la presente invención tiene preferiblemente una RP de 6,33, lo que es 6,33 veces la referencia.
Se añade mertiolato como conservante a una concentración final no superior al 0,01 % (p/v).
Se añade una solución de ácido etilendiaminotetraacético al 10 % (EDTA, sal disódica o tetrasódica) como conservante a una concentración final de aproximadamente el 0,07 % (p/v).
Ejemplo 2
Animales
Para la vacunación se seleccionaron cerdos de aproximadamente una semana de edad. Se evaluó el estado serológico con respecto a M. hyo mediante un ensayo de ELISA. Los cerdos con un valor de ELISA < 0,50 se consideraron negativos para M. hyo. Los cerdos con un valor de ELISA mayor de 0,50 se consideraron serológicamente positivos para M. hyo.
Vacunas
Se usó la bacterina de M. hyo de RESPISURE -1 (Pfizer Inc.) para vacunar a los cerdos. Se determinó la potencia de la vacuna antes de su uso mediante una cuantificación relativa del antígeno en comparación con una bacterina de referencia de M. hyo. La vacuna de referencia (RF = 1,0) contenía aproximadamente 8.000 unidades del antígeno
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(aproximadamente entre 1 y 2 x 108 CCU de células viables recogidas antes de la inactivación) por dosis, determinadas mediante un inmunoensayo en fase sólida que medía la cantidad de antígeno de M. hyo en la vacuna.
Como placebo se usó el mismo coadyuvante líquido (AMPHIGEN) usado en la formulación de RESPISURE -1 (es decir, sin células bacterianas).
Inóculo de exposición
El inóculo de exposición fue proporcionado en forma de alícuotas de 10 ml de homogeneizado de pulmón congelado a -70 ºC, y fue identificado como un derivado de la cepa de M. hyo 11 (L1 36). El inóculo se descongeló y después se diluyó con un caldo Friis Mycoplasma para conseguir una dilución de 1:25, y se mantuvo en hielo hasta su administración. Cada cerdo recibió una dosis intranasal de 5 ml (2,5 ml por fosa nasal) de la suspensión 1:25 los días especificados en cada uno de los siguientes ejemplos. El día de la exposición se cultivó una alícuota del inóculo de pulmón para confirmar la ausencia de contaminación bacteriana. Se retrovaloró una segunda alícuota cada uno de los 3 días, los resultados indicaron que el inóculo contenía aproximadamente 106 -107 unidades de cambio de color (CCU)/ml de M. hyo.
Procedimiento experimental
Los cerdos fueron identificados con etiquetas auriculares mientras todavía estaban en la piara [Día (-1)]. Los cerdos fueron asignados a corrales y a grupos de tratamiento de acuerdo con un diseño en bloque aleatorio generalizado. Los cerdos se bloquearon basándose en el corral de camada y posterior al destete.
En el Día 0 los cerdos fueron vacunados bien con una dosis intramuscular de 2 ml de la bacterina de M. hyo RESPISURE -1 (Pfizer Inc.) o bien con una dosis intramuscular de 2 ml de placebo. Cada cerdo recibió una dosis intranasal de 5 ml de la suspensión 1:25 del inóculo de exposición en los días especificados en cada uno de los siguientes ejemplos. Diariamente se monitorizaron todos los cerdos y se comprobaron los signos de enfermedad clínica.
En un momento específico después del primer día de exposición, todos los cerdos fueron sacrificados y se les realizó una necropsia. Se extrajeron los pulmones y se evaluaron. El análisis post-mortem incluía una estimación del grado de patología asociada con la enfermedad respiratoria por mycoplasma.
Se analizó cada lóbulo pulmonar y las lesiones se delimitaron para estimar el porcentaje de implicación de cada lóbulo. Se registró el grado de las lesiones macroscópicas presentes.
Análisis de los datos
La eficacia se evaluó basándonos en el porcentaje de lesiones pulmonares típicas de una infección por M. hyo. Se determinó que los cerdos de un grupo de tratamiento (vacunados) tenían un porcentaje total de pulmones con lesiones que era significativamente (P < 0,05) menor que en los cerdos del grupo con placebo.
Porcentaje total de pulmón con lesiones
Se ponderó el porcentaje de implicación macroscópica de cada lóbulo mediante el uso de las siguientes proporciones entre los lóbulos pulmonares individuales y la masa pulmonar total: craneal izquierdo 10 %, intermedio izquierdo 10 %, caudal 25 izquierdo%, craneal derecho; 10 %, intermedio derecho 10 %, caudal derecho 25 % y accesorio 10 %. Después se sumaron los valores de los lóbulos pulmonares ponderados para todos los lóbulos, para producir el porcentaje total de pulmón con lesiones (Pointon y col„ 1992).
Ejemplo 3
La protección frente a la exposición a M. hyo virulento se evaluó en cerdos serológicamente positivos para M. hyo mediante el uso de una única dosis de la bacterina de M. hyo RESPISURE -1 (Pfizer Inc), administrada a cerdos de entre 3 y 8 días de edad.
Se llevaron a cabo cinco réplicas de ensayos de potencia para RESPISURE -1 en el momento de la vacunación o próximo. Se determinó la potencia relativa (RP) mediante una cuantificación del antígeno relativo en comparación con una vacuna de referencia. La vacuna de referencia, que tiene una RP = 1,0, contenía aproximadamente 8.000 unidades del antígeno de M. hyo. Las RP de estos cinco ensayos eran de 5,42, de 3,96, de 4,71, de 5,49 y de 4,36, respectivamente.
En el Día 0, los cerdos del Grupo de Tratamiento T02 (véase la Tabla 1, a continuación) fueron vacunados con una dosis intramuscular de 2 ml de la bacterina de M. hyo RESPISURE -1 (Pfizer Inc.). Los cerdos del Grupo T01 fueron vacunados intramuscularmente con 2 ml de un placebo. Cada cerdo recibió una dosis intranasal de 5 ml de la suspensión 1:25 del inóculo de exposición los Días 178, 179 y 180. En cada uno de los 3 días se cultivó una alícuota del material de exposición en el momento de la inoculación para confirmar la ausencia de contaminación bacteriana. Se retrovaloró una segunda alícuota para confirmar que la solución madre de exposición contenía aproximadamente 107 CCU/ml de M. hyo. Diariamente se monitorizaron todos los cerdos y se comprobaron los signos de enfermedad
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clínica.
Después de treinta días de la primera exposición, todos los cerdos fueron sacrificados y se les realizó una necropsia. Se extrajeron los pulmones y se evaluaron. El análisis post-mortem incluía una estimación del grado de patología asociada con la enfermedad respiratoria por mycoplasma. Se analizó cada lóbulo pulmonar y las lesiones se delimitaron para estimar el porcentaje de implicación de cada lóbulo. Se registró el grado de las lesiones macroscópicas presentes
Tabla 1
Exposición el Exposición el Exposición el
Grupo de Compuesto de Vacunados el
Número
tratamiento vacunación Día 0
Día 178 1 Día 179 1 Día 180 1
T01 Placebo 26 26 26 26 26
T02 Vacuna 26 26 24 2 22 3 22 3
1 Inóculo virulento de M. hyo2 Los cerdos 71 y 73 fueron eliminados del estudio antes de la exposición debido a que ambos animales perdieron las etiquetas de sus orejas y por lo tanto no pudo determinarse la identidad de cada animal.3 El cerdo 36 se encontró muerto el Día 178 debido a complicaciones anestésicas. El cerdo 31 se encontró muerto el Día 179 debido a complicaciones anestésicas.
Los resultados de las lesiones de pulmón se resumen en la Tabla 2. Los resultados indicaban que los cerdos vacunados (T02) tenían un porcentaje de la media de mínimos cuadrados significativamente menor (P = 0,0385) de las lesiones del pulmón neumónico que los cerdos con placebo (T01) (2,0 frente a 4,5 %).
Tabla 2. Resumen del porcentaje de lesiones de pulmón totales
Tratamiento Compuesto Número de cerdos Media de mínimos cuadrados Intervalo
T01 Placebo 26 4,5 a Desde 0 hasta 36,75
T02 Vacuna 22 2,0 b Desde 0 hasta 13,75
a, b Los valores con un superíndice diferente son estadísticamente significativos (P = 0,0385)
Los resultados indican que una única vacunación de los cerdos de aproximadamente una semana de edad con la bacterina de M. hyo RESPISURE -1, indujo protección frente a una posterior exposición a M. hyo virulenta.
Ejemplo 4
Se evaluó la protección frente a la exposición a M. hyo virulento en cerdos serológicamente negativos para M. hyo mediante el uso de una única dosis de la bacterina de M. hyo RESPISURE -1, administrada a cerdos de entre 3 y 8 días de edad.
Se llevaron a cabo cinco réplicas de ensayos de la vacuna en el momento de la vacunación o próximo. Se determinó la RP mediante una cuantificación del antígeno relativo en comparación con una vacuna de referencia. La vacuna de referencia, que tiene una RP = 1,0, contenía aproximadamente 8.000 unidades del antígeno de M. hyo. Las RP de estos cinco ensayos eran de 5,42, de 3,96, de 4,71, de 5,49 y de 4,36, respectivamente.
En el Día 0, los cerdos del Grupo de Tratamiento T02 fueron vacunados con una dosis intramuscular de 2 ml de la bacterina de M. hyo RESPISURE -1. Los cerdos del Grupo T01 fueron vacunados intramuscularmente con 2 ml de un placebo. Cada cerdo recibió una dosis intranasal de 5 ml de la suspensión 1:25 del inóculo de exposición los Días 173, 174 y 175. En cada uno de los 3 días se cultivó una alícuota del material de exposición en el momento de la inoculación para confirmar la ausencia de contaminación bacteriana. Se retrovaloró una segunda alícuota para confirmar que la solución madre de exposición contenía aproximadamente 106 CCU/ml de M. hyo. Diariamente se monitorizaron todos los cerdos y se comprobaron los signos de enfermedad clínica.
Veintinueve días después del primer día de exposición, todos los cerdos fueron sacrificados y se les realizó una necropsia. Se extrajeron los pulmones y se evaluaron. El análisis post-mortem incluía una estimación del grado de patología asociada con la enfermedad respiratoria inducida por M. hyo. Se analizó cada lóbulo pulmonar y las lesiones se delimitaron para estimar el porcentaje de consolidación en cada lóbulo. Se registró el grado de lesiones macroscópicas presentes.
La Tabla 3 resume el diseño experimental.
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