TWI583403B - 黴漿菌感染症用疫苗 - Google Patents
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Description
本發明係有關利用黴漿菌等各細菌中之特異性脂質抗原之擬似細菌粒子及使用該粒子之性能高、安全性高的黴漿菌感染症用疫苗及使用該疫苗之黴漿菌感染症的預防或治療方法。
已知黴漿菌感染人類、家畜甚至於寵物等動物，引起種種疾病。尤其在人類，不僅是肺炎，亦懷疑經由慢性化或反覆感染，而與氣喘、慢性閉塞性肺疾病(COPD)等呼吸器疾病、風濕性關節炎等風濕性疾病(非專利文獻1)、多發性硬化症等神經疾病等有強烈的關連性，而為導致現今稱為難病之慢性疾病最可能原因的微生物(第1圖，非專利文獻31、32)。
已知黴漿菌感染為從發燒/咳嗽/肺炎等感冒症狀而發症，轉變成氣喘、慢性閉塞性肺疾病(COPD)、多發性硬化症、風濕性疾病的病症例，此時亦知因症狀反覆再發/惡化，而逐漸轉變為慢性疾病，所以早期診斷、早期治療，尤其是預防/治療惡化(症狀逐漸惡化)或再發(症狀減輕後再度惡化)特別重要。
惟，以往的檢查方法，由於黴漿菌感染的診斷或治療過程不容易把握，詳細情形不清楚，因此現狀為很多病人不能接受適當的預防/治療。黴漿菌感染的診斷方法現在最廣泛使用的是血清診斷法，惟，以往的診斷法為大量培養肺炎黴漿菌(mycoplasma pneumonia)，使用得自該菌體粗萃取物的抗體測定法，有特異性、檢出感度、定量性的問題，所以黴漿菌感染的早期診斷有困難。
本發明人等一向著重屬於黴漿菌屬之各種細菌表面的脂質抗原，而發現複數種各種細菌特異性的脂質抗原。將該等特異性脂質抗原分離精製並決定構造，其中有幾個亦成功的化學合成(專利文獻1至8)。
對於黴漿菌感染症使用該等特異性脂質抗原的診斷藥與現有的診斷藥相比，係確立特異性/感度均高，且定量抗體價變動的測定方法，大致可解決迄今仍為問題點之一的黴漿菌感染的早期診斷。
惟，對於黴漿菌感染症的治療藥，現在作為最可期待治療效果的治療藥經實用化者為巨環系(macrolide)/新喹啉酮(new quinolone)類/四環素系等部分抗生素，但，不僅副作用大，耐性菌的出現亦是個大問題，而成為黴漿菌感染症不能期待充分的治療效果，導致重症化，轉變成慢性疾病的原因。
另一方面，對人類，黴漿菌的疫苗療法尚未開發。其理由為活疫苗、弱毒化疫苗等有安全性的問題，很難實用化，死菌疫苗等有由於培養液混入馬血清等而引起過敏反應的問題。又，為了將疫苗誘導的相關特異性抗原蛋白加以特定，進行肽或DNA解析，惟，尚不能列舉特定的有效特異性抗原蛋白。將豬或牛等家畜用之以往使用的活疫苗或弱毒疫苗等再進一步改良(專利文獻9至12)。亦開發使用蛋白抗原的疫苗(專利文獻13至15)，最近開發以與因黴漿菌感染症引起的組織損傷相關的酵素作為靶的疫苗(專利文獻16)，惟，該等都只限於肺炎抑制效果或炎症抑制效果，家畜用疫苗尚不能說是毒性少且有效的疫苗。
以往，由於尚未發現對於黴漿菌感染症有效的預防/治療方法，因此，當務之急為開發黴漿菌感染症用有效的預防/治療藥，尤其是黴漿菌感染症用的疫苗。
在製造各種病原性病毒之疫苗方面已知有作成對象病原性病毒的擬似粒子，使用該擬似病毒粒子進行免疫，獲得高免疫回應(response)，亦進行開發使用該擬似病毒粒子之高活性且安全性高的疫苗製劑(非專利文獻2)。在病毒之抗原肽方面，亦有疫苗編入微脂體等之實用化的方向(非專利文獻3)。
病毒係利用細胞的構造將構造蛋白或酵素等自己複製，並將細胞膜包覆釋出細胞外進行增殖。因此，細胞膜脂質抗原不存在，疫苗幾乎全為病毒粒子或蛋白抗原。不僅大小非常小，其表面的構成成分亦少，因此提供模擬病毒粒子，亦即，對於生物體的免疫系，提供使錯覺為病毒本體侵入的擬似病毒粒子比較簡單。
另一方面，包含黴漿菌細菌類的情況，經由DNA而可自己複製，脂質膜構成成分基本上亦獨立產生，所以膜脂質成分於各種細菌為特異性且複雜。所以除了細胞膜構成成分或膜脂質的解析困難之外，若考慮到細胞成分或膜蛋白等，則橫跨多方面，不容易單純的只用其中之1成分模擬黴漿菌本體，所謂擬似黴漿菌粒子、擬似細菌粒子的概念並不熟悉。通常，該等多數的成分中何種成分必須留下且使用何種粒子化技術可提供擬似黴漿菌粒子尚不明白，該等擬似黴漿菌粒子對於生物免疫系是否會引起黴漿菌感染錯覺的免疫回應亦不明。
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本發明以提供對於黴漿菌感染症的治療效果高且安全的疫苗，並開發有效的黴漿菌感染症的預防/治療方法為目的。以提供作為該黴漿菌感染症用疫苗有效的擬似黴漿菌粒子，以及包含一般細菌的擬似細菌粒子為目的。
本發明人等從以往即將人類或豬等各種病原性黴漿菌之各種特異性脂質抗原分離精製，尤其分別對於作為人類病原性之肺炎黴漿菌特異性脂質抗原之GGL Glc型、GGL Gal型及作為發酵黴漿菌特異性脂質抗原之GGPL-Ⅰ、GGPL-Ⅲ決定其構造後亦成功的化學合成(專利文獻1至8)(非專利文獻5)。本發明人等使用該等特異性脂質抗原，開發並確立可將血清中的抗體以高感度、特異性檢出的黴漿菌感染症的診斷法，更著眼於各個該等脂質抗原對各黴漿菌種之特異性，以製造使用該等脂質抗原之有效疫苗製劑為目標，繼續專心的研究。
從以往即盛行研究開發安定的疫苗製劑用載體，亦進行開發將免疫原塗覆在粒子表面之疫苗組成物等(專利文獻17)一起，利用微脂體作為載體，將抗原蛋白或各種過敏原等藉由疏水性肽等結合於微脂體膜表面的微脂體製劑作為診斷用或疫苗用製劑使用的技術(專利文獻18至20)。已知對使用結合抗原之磷脂質作成之微脂體，確認作為T細胞活化劑作用的例子(專利文獻21)。相對的，抗原為磷脂質抗原時，用於作為微脂體膜構成成分而吸取，利用與抗體進行反應，經由補體作用破壞微脂體性質的抗體檢出法(補體依賴性微脂體溶解檢定)，但只限用於磷脂質抗原之抗體篩選或診斷(專利文獻22、非專利文獻4)。
本發明人等著眼於黴漿菌在細菌中為最小者，幾乎無細胞壁，細胞膜構造單純且細胞膜的主要成分為脂質膜，本發明人等想到使精製之特異性脂質抗原安定且均一的微脂體粒子化。認為只要是該等微脂體粒子，作為擬似黴漿菌粒子在生體免疫系作用時，就有可能引起與黴漿菌感染相同的免疫反應之可能性。
本發明人等除了分別將肺炎黴漿菌及發酵黴漿菌2種的脂質抗原的化學合成品精製研究種種微脂體成形法之外，在安定的微脂體粒子化方面亦成功。又，將成為豬黴漿菌症原因之豬鼻黴漿菌(Mycoplasma hyorhinis)及豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)的特異性脂質抗原分離、精製後用同樣的方法可將微脂體粒子化。另，以黴漿菌細胞膜脂質構成成分的分析結果，與特異性脂質抗原一同，模擬至構成擬似粒子之脂質成分的脂肪酸組成，作成最單純的機能性粒子。
使用由此製作的擬似黴漿菌粒子，將各種模型實驗動物進行免疫，任何一種粒子都確認有可誘導強力免疫反應的疫苗效果。又，使脂質成分與黴漿菌細胞膜構成成分一致且將粒徑均一調整的擬似黴漿菌粒子的免疫誘導活性高。
從進行黴漿菌擬似粒子活性分析的結果明瞭雖為非常單純的構成成分，但可充分反映黴漿菌免疫學的活性且安定。至脂質抗原以外的磷脂質或膽固醇等脂肪酸部分為止，依據黴漿菌成分分析為準的構成成分，更能確實反映對於黴漿菌之生體內免疫回應。
以往利用微脂體之疫苗係使構成微脂體的脂質與蛋白、肽、糖質等結合並同時混入微脂體內，本發明之脂質抗原擬似細菌粒子，由於脂質抗原即為微脂體的構成成分，都為非常單純化的粒子，安定，毒性少，安全性亦高。
又，可確認呈現作為佐劑的作用效果(非專利文獻33)。以本發明特異性脂質抗原為基礎的免疫誘導活性可確認為不只誘導IgG及IgM，亦誘導黏膜性的IgA者，強烈顯示作為黏膜性免疫用佐劑的利用可能性。
本發明人等確認對於黴漿菌以外的各種病原性細菌亦適用黴漿菌的特異性脂質抗原的探討方法，各個存在有特異性脂質抗原。使用該等特異性脂質抗原，可作成在各細菌種中誘導特異活性之擬似細菌粒子。而且該等細菌類各個細胞膜構成脂質成分的脂肪酸組成不同，根據對各細菌之脂質成分分析結果，應用在黴漿菌的最適化方法，設定最適當的微脂體的組成及粒徑，可製造各細菌之擬似細菌粒子及使用該等粒子之疫苗。
由以上的見解而完成本發明。
亦即，本發明具體而言為如下所述者。
[1]由含有1種或1種以上病原性細菌之特異性脂質抗原作為微脂體構成脂質成分之微脂體粒子所構成之擬似細菌粒子。
[2]由含有1種或1種以上黴漿菌之特異性脂質抗原作為微脂體構成脂質成分之微脂體粒子所構成之擬似黴漿菌粒子。
[3]上述黴漿菌特異性脂質抗原之至少1種為從黴漿菌菌體調製物萃取後分離精製之黴漿菌特異性糖脂質之上述[2]記載的擬似黴漿菌粒子。
[4]上述黴漿菌特異性脂質抗原之至少1種為在化學或酵素合成後分離精製之特異性糖脂質之上述[2]記載的擬似黴漿菌粒子。
[5]上述黴漿菌特異性脂質抗原之至少1種為肺炎黴漿菌特異性脂質抗原或發酵黴漿菌特異性脂質抗原之上述[2]至[4]中任一項記載的擬似黴漿菌粒子。
[6]上述微脂體構成脂質成分復含有磷脂醯膽鹼、磷酸甘油及/或膽固醇之上述[2]至[5]中任一項記載的擬似黴漿菌粒子。
[7]將含有上述黴漿菌特異性脂質抗原的微脂體構成脂質成分在溶劑中混合後經由超音波處理，以使粒徑在30至300nm範圍內且其80%以上在40至200nm範圍內的條件粒子化之上述[2]至[6]中任一項記載的擬似黴漿菌粒子。
[8]在上述微脂體粒子表面存在有其他抗原性物質之擬似黴漿菌粒子，係經由上述黴漿菌特異性脂質抗原的佐劑效果，而提高上述其他抗原性物質的抗原性之上述[2]至[7]中任一項記載的擬似黴漿菌粒子。
[9]上述之其他抗原性物質為源自病毒之抗原肽之上述[8]記載的擬似黴漿菌粒子。
[10]含有上述[2]至[7]中任一項記載的擬似黴漿菌粒子作為有效成分之黴漿菌感染症的預防或治療用疫苗。
[11]上述黴漿菌感染症為肺炎、氣喘或風濕性疾病之上述[10]記載的黴漿菌感染症之預防或治療用疫苗。
[12]包含對於罹患或疑似罹患黴漿菌感染症的人類或動物，至少投予1次上述[10]或[11]記載的黴漿菌感染症的預防或治療用疫苗的步驟之黴漿菌感染症的預防或治療方法。
[13]在使用上述疫苗之黴漿菌感染症的治療方法中，在投予上述疫苗之前及/或投予後包含設定測定黴漿菌種特異性脂質抗原量或該脂質抗原特異性抗體量的步驟，並根據該測定值的程度決定下次疫苗投予時期及投予量的步驟之上述[12]記載的黴漿菌感染症的治療方法。
[14]以上述[9]記載的在粒子表面存在有源自病毒之抗原肽之擬似黴漿菌粒子作為有效成分之對於該病毒感染症的預防或治療用疫苗。
[15]上述病毒為流感病毒，上述病毒感染症為流感之上述[14]記載的疫苗。
[16]包含對於罹患或疑似罹患病毒感染症之人類或動物，投予上述[14]或[15]記載的病毒感染症的預防或治療用疫苗的步驟之病毒感染症的預防或治療方法。
[17]上述病毒為流感病毒，上述病毒感染症為流感感染症之上述[16]記載的預防或治療方法。
由含有病原性細菌之特異性脂質抗原作為微脂體構成脂質成分之微脂體粒子所形成之擬似細菌粒子。
本發明之擬似黴漿菌粒子等擬似細菌粒子可提供作為粒徑均一之安定微脂體製劑。該等擬似細菌粒子投予至人類或豬等哺乳動物，可效率佳的誘導強力液性及細胞性免疫，且黏膜性免疫之IgA誘導活性亦高，不僅可作為黴漿菌感染用的疫苗製劑使用，還可作為病毒或其他病原微生物感染症用疫苗的佐劑、IgA誘導性佐劑使用。該等疫苗製劑、佐劑製劑無毒性，可提供安全且安定的製劑，因而非常有用。尤其為IgA誘導性佐劑時，以往有效性高者只有如金屬鋁類毒性高的佐劑，所以非常的劃時代。
對於人類的黴漿菌感染症，根據本發明人等以前的研究，亦確立對所有成為該感染原因的發酵黴漿菌及肺炎黴漿菌的診斷方法，根據本發明提供的疫苗製劑，可確立以黴漿菌感染症的病態分子機構為基礎的診斷/預防/治療系統。
已知黴漿菌會感染人類、家畜，寵物等動物，引起種種疾病。已知尤其在人類，不僅為肺炎，也是氣喘(非專利文獻6、7)、慢性閉塞性肺疾病(COPD)(非專利文獻8)等呼吸器疾病，風濕性關節炎等風濕性疾病(非專利文獻9、10)，多發性硬化症(非專利文獻11)或肌肉萎縮性側索硬化症(ALS)(非專利文獻12)/多發急性神經炎症候群(Guillain-Barre syndrome)等神經疾病，溶血性貧血(非專利文獻13)等血液疾病，異位性皮膚炎等過敏性疾病，動脈炎/動脈硬化/川崎病(非專利文獻14)等心血管疾病或慢性疲勞性症候群(CFS)(非專利文獻15)/纖維肌痛症(FMS)(非專利文獻16)等精神疾病、灣岸戰爭病等的原因。
黴漿菌感染為造成氣喘、慢性閉塞性肺疾病(C0PD)、多發性硬化症、風濕性疾病等慢性難治疾病原因的最有力候補。惟，追踪慢性疾病經過之特異性定量性診斷法及治療法尚未確立，所以不能充分明瞭與病態的關連，不能進行適當的治療。(第1圖)
黴漿菌感染為從發熱/咳嗽/肺炎等感冒症狀開始發症，轉變為氣喘、慢性閉塞性肺疾病(COPD)、多發性硬化症、風濕性疾病的症例(非專利文獻17、18)。已知此時症狀反覆復發/增惡，進而轉變為慢性疾病。由於以往的檢查方法不容易把握黴漿菌感染的診斷或治療經過而不能詳細了解，因此，現狀為不能受到適當治療的病患多。(非專利文獻19)(第2圖)
已知豬、牛等家畜的黴漿菌感染症亦會引起嚴重的疾病。例如豬鼻黴漿菌或豬肺炎黴漿菌為豬呼吸器感染症的原因菌之一，牛黴漿菌(MycOplasma bovis)為牛呼吸器感染症的原因菌之一。
人類病原性黴漿菌現在已知有肺炎黴漿菌及發酵黴漿菌，本發明人等將各個黴漿菌的特異性脂質抗原2種各別分離精製，決定構造後進行化學合成(專利文獻1至8)、(非專利文獻20至27)。具體而言，肺炎黴漿菌有GGL Glc-型及GGL Gal-型2種，發酵黴漿菌有GGPL-I及GGPL-Ⅲ2種。
已知豬、牛等家畜的黴漿菌感染症亦會引起嚴重的疾病。例如在豬，豬鼻黴漿菌或豬肺炎黴漿菌為豬黴漿菌肺炎等之呼吸器感染症，在牛為由牛黴漿菌引起的的牛黴漿菌肺炎等之呼吸器感染症或黴漿菌乳房炎症等的疾病。這次，亦將豬鼻黴漿菌或豬肺炎黴漿菌各個的特異性脂質抗原分離精製，進行微脂體粒子化(第4圖)，所獲得的擬似黴漿菌粒子供給免疫活性評估實驗，確認其免疫活性效果(第13圖)。
本發明中為所謂黴漿菌的特異性脂質抗原時，可為從對象黴漿菌的膜分離精製的該黴漿菌特異性脂質抗原，惟較好使用該脂質的化學構造式為已知(GGPL-Ⅰ、GGPL-Ⅲ、GGL Glc-型或GGL Gal-型等)或根據下述(2-3)的方法決定構造，進行化學合成、精製的脂質化合物(專利文獻1至8)。例如，將對象黴漿菌的特異性脂質合成酵素特定，使用該酵素本體或將該酵素基因進行選殖(cloning)，使用形質轉換細胞，可大量獲得作為該酵素合成品之特異性脂質抗原(非專利文獻28)。
以下，對關於典型的發酵黴漿菌特異性脂質抗原的GGPL-Ⅲ之萃取、分離精製、決定構造等製造方法詳細敍述。該等方法不僅適用於其他黴漿菌的特異性脂質抗原，亦適用於披衣菌、立克次氏體、結核菌、肺炎球菌等其他病原性細菌的特異性抗原的萃取、分離精製、構造決定法微生物。
以下，將源自發酵黴漿菌特異性脂質抗原(GGPL-Ⅲ)的例子作為典型例加以說明(根據專利文獻3等的方法)。
黴漿菌用PPLO培養基的培養以如以下的方法進行。於加入10%牛血清、10%盤尼西林、0.0002%苯酚紅及1%葡萄糖的PPLO液體基礎培養基(Difco公司製造)中，於37℃進行培養。根據培養基pH值的變化確認微生物的增殖後以16,000×g離心分離1小時。重覆該操作一次，作為脂質萃取用之試料。對於200L(濕潤狀態的容量)的微生物試料用氯仿與甲醇的混合溶劑萃取脂質固體成分。
將試料浮遊在甲醇中，溶化4小時，加入倍量的氯仿，用超音波將菌體粉碎，再放置4小時。以3000rpm離心，回收上清液，濃縮，作為脂質區分試料。
將該脂質試料經由填充矽膠的管柱層析法，使用氯仿及甲醇進行分離/精製。經由薄層層析法(TLC)將脂質試料展開，用甲苯二酚(orcinol)試藥染色、精製，獲得目的糖脂質區分。
將獲得的脂質區分溶解於DMSO-d6：D20=98：2溶液，於60℃測定1H-NMR。取得在DMSO-d6100%中測定的DQF-COSY光譜歸屬之數據。
對於獲得的脂質區分經由ESI-MS測定進行分析。
將上述(3)、(4)之數據一同進行糖脂質的大略構造決定，為了確定構造，經由化學合成，以立體選擇性且位置選擇性合成各別骨架。
將獲得的化學合成品與天然物相同的在DMSO-d6：D20=98：2、60℃的條件進行1H-NMR測定，分析、比較該光譜。該結果，從合成品的光譜與天然物的光譜一致，確定絶對構造。
檢索對象黴漿菌的資料庫，使用作為候補的脂質合成酵素基因，經由形質轉換大腸菌大量合成，將對象的特異性脂質的合成酵素加以特定。亦可使用該合成酵素本體獲得酵素合成品，或可使用該合成酵素基因，在經形質轉換的形質轉換細胞內合成酵素，而在培養基內獲得大量的特異性脂質抗原。
在本說明書中稱為「擬似黴漿菌粒子」時係指對黴漿菌各菌種之特異性脂質抗原加以精製並以精製脂質抗原單獨或與其他磷脂質或膽固醇等脂質混合之脂質作為微脂體粒子者，且在感染該黴漿菌的生物體內的免疫系可引起免疫回應的微脂體粒子。
同樣的，以將病原性細菌各菌種之特異性脂質抗原精製，將精製脂質抗原單獨或與其他磷脂質或膽固醇等脂質混合之脂質作為微脂體粒子者，且在感染該病原性細菌種的生物體內的免疫系中，可引起免疫回應的微脂體粒子稱為「擬似細菌粒子」。
本發明的擬似細菌粒子中使用的細菌，典型的係實施樣態所使用的黴漿菌，惟，不僅限於黴漿菌，同樣的，只要是在細胞表面具有特異性抗原脂質之細菌類，即可將該特異性抗原脂質分離精製，提示於微脂體表面，而製造擬似細菌粒子。該等細菌類中，較好為大小或細胞表面構造與黴漿菌類似之退伍軍人病菌等立克次氏體或披衣菌等。又，該特異性抗原脂質只要可分離精製並決定構造，即亦可化學合成，又，可將該抗原脂質合成酵素的基因進行選殖，而進行酵素合成。
該方法適用於其他之幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、披衣菌、立克次氏體、結核菌、肺炎球菌等病原性細菌，同樣的可作成脂質抗原粒子利用。第6圖為各種細菌的脂質區分的比較，確認在大腸菌、綠膿菌、肺炎雙球菌、肺炎桿菌、流感桿菌及退伍軍人病菌等各種菌的特異性脂質。具體而言，將各種菌大量培養，用氯仿-甲醇區分之，用薄層層析法展開。展開後用甲苯二酚硫酸染色，檢出。
又，亦知在幽門螺旋桿菌中亦存在有特異性脂質抗原，而使用黴漿菌之上述分離精製方法，取得精製之特異性脂質抗原，以與擬似黴漿菌粒子製作方法相同的方法製作擬似幽門螺旋桿菌粒子。可確認該粒子在C57BL/6小鼠的骨髓細胞之干擾素γ之誘導活性(實施例13，第12圖)。此情況證實關於本發明擬似黴漿菌粒子的見解，亦適用於幽門螺旋桿菌等其他細菌。
「微脂體」為在內部含有水相的磷脂質雙層之微小小胞(vesicule)，將脂質在相轉移溫度以上，用充分量的水進行水合而形成，以該脂質雙層的數目為基礎進行分類時，分為由複數脂質雙層形成的多重膜微脂體(MLV)及由單一脂質雙層形成的單膜微脂體，後者更以大小為基礎，分為小的單膜微脂體(SUV)、大的單膜微脂體(LUV、REV)及巨大微脂體(GUV)，在本說明書中稱為微脂體或微脂體粒子時係指由單一脂質雙層形成的小的單膜微脂體(SUV)，直徑在數100nm以下者。在本說明書中最適當的微脂體粒徑依對象的細菌而異，較好在數10至數100nm範圍內，儘可能為均一的粒徑。例如在黴漿菌的場合最好集中在約40至200nm的範圍。
構成微脂體的磷脂質由於是生體膜的主要構成成分，因而除了毒性低，可對照投予的目的、方法，而控制粒子大小，以及經由在微脂體粒子表面導入官能基，可在微脂體中導入抗原、抗體、糖鏈等，亦可對標的部位進行標的指向化的利點，而廣泛進行活用該等利點的製劑學研究(專利文獻23至26)。該等方法在本發明中以微脂體粒子化的擬似細菌粒子作為佐劑使用時為可利用的技術。
為了以本發明擬似黴漿菌粒子等擬似細菌粒子作為疫苗投予，在粒徑及組成方面，以一定的安定品質提供是必要的。因此，微脂體粒子的粒徑測定及組成分析法的確認是重要的。
在本說明書，係利用HPLC進行微脂體粒子組成的分析。經由該HPLC分析時，使用的檢出器並無特別限制，可使用紫外線吸光檢出器或揮發性光散射檢出器(以下，稱為ELSD)等。其中，從可將如脂質的非揮發性成分以高感度檢出，可高精密度定量之點而言，以使用揮發性光散射檢出器(ELSD)較佳。
若使用HPLC進行微脂體組成的分析，則依據所使用管柱種類、使用之溶劑種類及流速，微脂體中的成分顯示特有之滯留時間(retention time)(試料在管柱內的滯留時間)。由此可研究各成分的組成。可將以HPLC溶出的各成分定量。檢出器使用具有ELSD或質量分析機的HPLC，可將微脂體成分以高感度、高精確度且簡略的分析組成，亦可同時進行更正確的定量(第5圖)。在實際的生產步驟中，品質管理經由HPLC進行分析，可確保安定的品質。
微脂體的製作本身已知有許多方法[D.W.Deeamer,P.S. Uster,“Liposome”ed.by M.J.Ostro. Marcel Dekker Inc. N.Y. Basel,1983,第27頁]。通常為渦旋法及超音波法，除此之外，乙醇注入法、醚法及逆相蒸發法等亦適用，可將該等組合使用。
例如，在渦旋法及超音波法中，將預定的脂質溶解於有機溶劑，例如甲醇、乙醇、氯仿或該等的混合物，例如甲醇與氯仿的混合物後，將該有機溶劑蒸發除去，獲得脂質的薄層。接著，在該脂質薄層中加入水性介質，進行渦旋處理或超音波處理，形成微脂體。此時，在上述水性介質中混入作為疫苗等活性成分所期望的抗原或免疫原，經由例如溶解或懸濁，可將該抗原或免疫原封入微脂體中。
脂質抗原溶解於有機溶劑時，可將合成脂質抗原與微脂體構成用脂質一同，在微脂體製造過程溶解於如上述的有機溶劑後根據常法形成微脂體。相對於微脂體量之脂質抗原的量係依脂質抗原的種類、欲封入的脂質抗原以外的抗原種類、微脂體的組合構造等而異，通常，對於構成微脂體的其他脂質1mg為5μg至500μg。
用於製作本發明擬似黴漿菌粒子等擬似細菌粒子的微脂體製作法，在該等微脂體製作法中較好為超音波法。又，本發明人等發現除了適用乙醇注入法之外，配合超音波法更可製造均一性高且安定的微脂體粒子。此外，用所期望的孔尺寸的過濾器過濾，可整理粒徑，可提供一定粒徑的安定、高品質的微脂體粒子。
黴漿菌的特異性脂質抗原由於可單獨的形成微脂體粒子，作為微脂體粒子的脂質成分，只用黴漿菌特異性脂質抗原形成的擬似黴漿菌粒子只要在粒子化後馬上投予至生體內，即引起強力免疫回應，可充分期待疫苗的活性，惟，由於粒徑亦各式各樣，不安定，所以作為疫苗/佐劑/免疫調節劑或診斷用製劑不適當。作為疫苗製劑等使用時，經由改變構成微脂體的脂質構成比例或微脂體的大小，將合成脂質抗原安定化、更接近天然的效果、安全性高最適化是必要的。微脂體的最適形係依該微脂體期待的效果而異，其效果係指作為藥品輸送系統(Drug Delivery System(DDS))的效果/抗原提示/抗體誘導/佐劑效果等。
以在黴漿菌中特異性脂質抗原的物理化學解析的基礎數值為根基，研究最適當的處理條件時，明瞭粒徑以100nm左右的粒徑最安定，可長期保存，適合作為製劑效果安定的製劑。亦即，在擬似黴漿菌粒子稱為最適合黴漿菌製劑粒子的最適化時，表示該粒徑為粒徑在30至300nm的範圍內，同時以全粒子的80%在40至200nm範圍內的條件較佳。
微脂體組成係使用黴漿菌增殖中必需之膽固醇或作為基本構成成分之磷脂醯膽鹼等磷脂質(第23圖)。天然的黴漿菌的脂肪酸長度以碳原子數16的飽和型最多，其次為碳原子數18及碳原子數14，顯示使用將該等合併之碳原子數16合成抗原的結果。若只用合成脂質抗原製作粒子，則大小或分布不均一，另，改變膽固醇與碳原子數16之飽和型磷脂醯膽鹼的比例，測定粒子系及分布。從該等結果明瞭莫耳比以脂質抗原為10至50%、磷脂醯膽鹼為20至50%、膽固醇為10至50%較佳。其係接近黴漿菌脂質解析數據的結果(非專利文獻29)。
在稱為擬似黴漿菌粒子之最適化時，係指使該微脂體組成脂質抗原：磷脂醯膽鹼：膽固醇的配合比率成為莫耳比在10至50：20至50：10至50的範圍內。同時使用之磷脂醯膽鹼的碳原子數為14至18，較好為16，以飽和型的磷脂醯膽鹼最適合。
在黴漿菌脂質抗原的鑑定/精製過程，膜脂質構成成分不複雜，係以磷脂醯膽鹼、膽固醇及脂質抗原為中心之構成，又，明瞭脂肪酸部分的組成亦非常單純，考慮該等結果，製作安定且有效果的黴漿菌擬似粒子。
實際的黴漿菌感染為溶菌、進入細胞，提示(脂質)抗原、產生抗體，引起T細胞或NKT細胞等的細胞免疫回應，而合成含有黴漿菌特異性脂質抗原的擬似黴漿菌合成微脂體粒子係誘導相同的反應。
有關該擬似細菌微脂體粒子，可根據各種作為目的的機能，而變更為最適當的構成成分或大小。
特別是，經由使用精製合成脂質抗原，不受黴漿菌以外的成分的影響，而成為非常特異性的免疫活化製劑。更好為脂肪酸的長度等最適化者。由於構成成分單純，在抗體誘導、疫苗、佐劑、細胞免疫療法等的各種用途，可成為最適合各種用途的製劑。為了觀察合成脂質抗原的特異性疫苗效果，可使用精製及合成脂質抗原、使用複數黴漿菌種或複數脂質抗原合成品來研究活性。
微脂體的作成法係以合成的脂質抗原及黴漿菌脂質解析為基礎的構成成分接近者為中心進行研究。以各個細菌的特異脂質抗原為中心之構成成分作成微脂體，以該微脂體可製作具有各個細菌特徵之免疫粒子。經由確實評估提昇合成脂質抗原及抗體等製劑效果的方法，則製劑的檢討、實用化為可能。非常接近黴漿菌的免疫活性且無活疫苗般的病原性回歸或不活化疫苗般的不純物或批量(lot)差異，毒性低。
6.合成脂質抗原粒子的免疫活性的評估法
(6-1)經由從腹腔內投予脂質抗原粒子，定量抗體誘導活性
在C57BL/6J小鼠(8週，雌性)之腹腔內進行4次腹腔內投予黴漿菌脂質抗原粒子。從抗原第1次投予至第3次投予，在每次投予前進行部分採血。從抗原第4次投予經過4天後進行部分採血(血清)。經由塗覆有特異脂質抗原之ELISA進行抗體的測定。從2次抗體可測定IgM、IgG。另，對於IgA使用2次抗體，可測定IgA的產生，亦即可測定黏膜免疫誘導活性。標識測定結果，即可進行脂質抗原的量、組成、形狀、溶劑等的最適化。
(6-2)經由從鼻腔內投予脂質抗原粒子，定量抗體誘導活性
在C57BL/6J小鼠(8週，雌性)鼻腔內進行4次鼻腔內投予黴漿菌脂質抗原粒子。從抗原第1次投予至第3次投予，在每次投予前進行部分採血。從抗原第4次投予經過4天後進行部分採血(血清)。經由塗覆有特異脂質抗原之ELISA進行抗體的測定。從2次抗體可測定IgM、IgG。另，對於IgA使用2次抗體，可測定IgA的產生，亦即可測定黏膜免疫誘導活性。標識測定結果，可進行脂質抗原的量、組成、形狀、溶劑等的最適化。
明瞭根據測定黴漿菌感染病患的血清中的抗體或抗體的變動可觀察經過(第17圖、第18圖)，該方法可原樣適應。又，用採取的血液可測定黴漿菌增殖抑制活性。
利用本發明人等開發的使用質譜儀(質量分析機)之脂質抗原檢出法(專利文獻6)，可檢出黴漿菌的種特異性糖脂質抗原本體並定量化。具體而言，使用任意的離子化(EI法、ESI法、LSI法、FAB法、MALDI法等)離子化，依照通常質量分析法的步驟取得質譜，可檢出黴漿菌的種特異性糖脂質抗原，使用定量化標準品亦可定量化。
例如，為發酵黴漿菌的特異性糖脂質抗原GGPL-I之情況，以正極模式測出在質量電荷比為924、896、658、640、420、402、328、310、184或104m/z特有的離子波峰，以負極模式測出在質量電荷比為908、880、809、642、624、404、386、312、294及168m/z特有的離子波峰。該波峰中896m/z的波峰為GGPL-I的特徵波峰，確認896m/z的波峰存在即可確認GGPL-1的存在。在欲更正確鑑定時確認上述複數的上述波峰存在。為發酵黴漿菌的特異性糖脂質抗原GGPL-Ⅲ時，以正極模式測出在質量電荷比184、239、1049或1077m/z，或以負極模式測出在質量電荷比809、823、864、988、1047或1075m/z特有的離子波峰。該波峰中1049m/z的波峰為GGPL-Ⅲ的特徵波峰，確認1049m/z的波峰存在即可確認GGPL-Ⅲ存在。另一方面，肺炎黴漿菌的特異性糖脂質抗原GGL的正極模式係添加鈉即可明確的觀察，其特有的波峰在質量電荷比185、202、347、363、405、497、525、659、687、915或943m/z的位置出現，負極模式係在質量電荷比379、635、663、891或919m/z的位置出現。該波峰中915m/z的波峰為GGL的特徵波峰，確認915m/z的波峰存在即可確認GGL存在。(又，此處的正極模式為在質量分析器用正離子將被檢對象分子離子化，負極模式為用負離子進行離子化)。
欲將該等特異性糖脂質抗原量定量化時，係合成對應至少1個該等GGPL-Ⅰ、GGPL-Ⅲ及GGL Glc-型、GGL gal-型等特異性糖脂質抗原之重氫化糖脂質，並調整階段性濃度的糖脂質標準品。對於被檢試樣，加入各濃度的脂質標準品，測定質譜，將被檢試樣特徵波峰的山高度與糖脂質標準品特有波峰的山高度相比較，採用兩者具有相同程度高的山高度時的糖脂質標準品濃度作為試樣中的特異性糖脂質抗原量。例如，在實施例15，從107cfu的培養肺炎黴漿菌萃取的特異性脂質抗原GGL量與將該特徵波峰之山高度與定量化標準品的濃度相比較，確定比50pmol少，比5pmol多。
實際上源自被檢血液等之試樣由於在脂質成分以上不只含有極大量的蛋白質，亦含有血球或其他細菌類等，所以必需進行前處理。具體而言，使用在甲醇、氯仿等有機溶劑中加入水的溶劑系，以離心分離除去試樣中大量含有的蛋白質，以含有脂質抗原的脂質區分作為下層進行萃取。另，可用使用矽膠等吸附載體之層析法或使用對於作為標的之特異性脂質抗原之抗體的親和性管柱等進行分離精製。
利用具有液體層析(LC)機能的質譜儀LC-MS，則脂質抗原的分離及質量測定可同時進行。
將本發明的脂質抗原粒子作為疫苗投予至黴漿菌感染病患或感染動物後，經過一定時間後或是經時的用上述(6-4)的方法測定源自病患或動物之試料中的特異性脂質抗原量。又，在本發明中，「試料」為含有從被檢驗者或動物採取的體液，例如全血、血漿、血清、關節液、髓液、唾液、羊水、腹水、胸水、尿液、汗水、胰液、滑液等及組織、細胞等者。由於用該等簡單的測定法可將在血清等試料中產生、殘留的黴漿菌脂質抗原直接檢出及定量，而有可迅速明瞭疫苗對於病患的效果的利點。因此，經時性的觀察脂質抗原量的變動經過，可正確的評估對應投予量、投予時期之黴漿菌增殖抑制活性，而可決定之後最適當的治療計劃。
亦即，投予含有本發明脂質抗原粒子的疫苗製劑，邊觀察根據質譜等之脂質抗原量變化的經過邊進行治療的方法，作為對於各個黴漿菌感染病患的個別治療方法而發揮威力。
在本說明書中，「疫苗」的用語為可產生免疫回應的物質，包含預防因黴漿菌感染的黴漿菌感染症的疫苗及治療黴漿菌感染症的疫苗之廣泛意義。疫苗為經製劑化，投予至人類、家畜、寵物類等動物者，製劑化或在投予時與以往的疫苗製劑相同，可適當使用藥理學容許的各種賦形劑。
以往，黴漿菌類等之病原性細菌用疫苗主要使用菌體萃取成分或不活化疫苗等，最近亦使用DNA疫苗或合成肽疫苗等。本發明使用的包含擬似黴漿菌粒子所成的疫苗為將各黴漿菌種特異性脂質抗原分離、精製使用。尤其在使用以化學方法等合成與天然的相同者時，不純物的控制或安全性高因而較佳。
在模型動物投予該擬似黴漿菌粒子的結果可確認引起極高免疫回應的疫苗機能。尤其在實施例5，對於風濕性關節炎模型兔子，預防性的預先投予時，獲得抑制關節病變之突破性結果(第10圖)。
在該特異性脂質抗原，由於具有如下述(7-3)敍述的佐劑活性，有不需副作用等問題多的佐劑的利點。
「佐劑」機能有提高樹狀細胞的抗原吸收及將樹狀細胞活化之2種功能。
成分疫苗(component vaccine)用佐劑已知有例如將結核菌的死菌菌體與礦物油混合的佛氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)或佛氏不完全佐劑等使用礦物油的佐劑、磷酸化鋁佐劑或將氫氧化鋁作為主成分的鋁佐劑(alum adjuvant)類無機佐劑等。
現在佐劑機能效果高，且在多數疫苗被認可的有效佐劑只有稱為Alum的氫氧化鋁凝膠，但在副作用之點問題多。尋求新的有效性高、副反應少的佐劑。
在本發明之擬似黴漿菌粒子中確認該2種佐劑機能(第14、16圖)，而對作為有效性高、副反應少的佐劑的期待大。
佐劑係期待對於接種的人或動物毒性更低者，作為新的，無毒性的成分疫苗用的佐劑，可使用黴漿菌合成抗原脂質。本發明含有脂質抗原的擬似微生物微脂體由於具有用於誘導免疫的佐劑活性且毒性及該本體的抗原性低，對於人類可作為疫苗等之抗原佐劑使用。尤其是在該微脂體而作為目的抗原或免疫原而封入時，獲得強力的疫苗。明瞭合成脂質抗原有效率的誘導免疫，微脂體製劑的佐劑可作為活性佐劑使用。
又，關於細胞性免疫佐劑，可採用在小鼠的延遲型過敏(DTH)反應(TH1細胞擔當)作為細胞性免疫的指標。目的的佐劑可誘導DTH反應，所以，可作為如TH1細胞參與的病原體感染防禦疫苗、該免疫療法劑或癌免疫療法劑之佐劑使用。本發明確認在黴漿菌感染症病患的血清中誘導IgA，判明對於黏膜免疫，該抗原起作用(第15圖)，尤其是可成為使流感等黏膜免疫特異性活化的佐劑。
免疫除了液性免疫及細胞性免疫以外，還有位於其中間位置以自然殺手細胞-T為代表的脂質抗原免疫。Alum係誘導液性免疫較佳，但對於細胞性免疫則幾乎無效(專利文獻27)。在持續性的病毒或感染症中，細胞性免疫或自然免疫變的重要，惟尚無對於該等免疫有效的佐劑。本發明之黴漿菌合成脂質抗原粒子具有該佐劑活性。
藉由模擬存在於黴漿菌(微生物)的膜表面作用於免疫系統的形態作成的含有脂質抗原的擬似黴漿菌粒子，獲得特異抗體的誘導或疫苗活性。
使用對於2種肺炎黴漿菌特異性脂質抗原及2種發酵黴漿菌特異性脂質抗原之抗體測定法，對於慢性難治性疾病(氣喘、COPD、多發性硬化症、風濕性疾病等)研究黴漿菌感染與病情經過的關連性，選擇以黴漿菌感染為病因的病患。對於所選擇的病患進行亦包含抗黴漿菌藥效果之黴漿菌感染治療。治療法為脂質抗原疫苗、脂質抗原抗體療法、脂質抗原關連的免疫療法、將脂質抗原減量的抗菌劑或漢藥、減輕脂質抗原作用的抗過敏劑或類固醇劑等，或將該等組合的總稱。此處提供使用ELISA法的診斷-治療系統。
關於投予方法，可對應黴漿菌感染症的病況，使用ELISA法或以黴漿菌脂質抗原作為基礎之經過觀察標識或診斷法把握病況而加以選擇。
擬似黴漿菌粒子疫苗的投予途徑可為鼻腔內、皮內、皮下、肌肉內、腹腔內、靜脈內或經口的任何一種。此時，可併用以往疫苗製劑使用的藥理學上容許的安定劑、抗氧化劑、保存劑、安定劑、濕潤劑、潤滑劑、乳化劑、影響浸透壓的鹽、著色劑、醇(alcohol)、緩衝劑等賦形劑。本發明的疫苗可與其他的抗原成分混合使用，可併用公知的黴漿菌用抗生物質等抗菌劑、抗炎症劑等藥劑。
本發明的疫苗不僅可期待治療效果，亦可期待預防效果，在有被黴漿菌感染危險時預先投予，作為預防用疫苗亦有效。
本發明的脂質抗原含有擬似細菌粒子係可將防禦黴漿菌感染的有效量，亦即，對於該感染，在人類及動物誘導免疫的量，進行單次投予或反覆投予。
用於黴漿菌感染症的預防及/或治療用時，依對象的動物而異，以每次特異性脂質抗原量在1μg至1000mg的範圍內投予。在如小鼠的小動物，1μg至200μg/次即十分有效，但投予至人類時，則以100μg至100mg/次投予較佳。又，投予量、投予時期、投予次數、投予場所等投予方法等，根據各種用途，使用上述評估法等可使最適化。(例如第24圖)
如第17、18圖所示，經由使用與和黴漿菌感染症有關連的病患所使用的相同ELISA法，將合成脂質抗原粒子作為疫苗投予後，測定血清中黴漿菌特異性抗體價，根據該價的上昇可判斷有疫苗效果。又，經由投予疫苗的治療效果可用質譜直接定量，測定黴漿菌種特異性糖脂質抗原量，進行評估。
特別是在黴漿菌感染病患或動物投予疫苗及/或其他黴漿菌用藥劑後，經過一定時間後，或邊反覆複數次投予，經時的將源自病患或動物之試料(血清等)中的特異性脂質抗原用上述(6-4)的質量分析法檢出及/或定量，經時的觀察脂質抗原量變動的經過的方法，由於對於治療對象的黴漿菌感染病患或動物可簡單、迅速且正確評估投予疫苗及/或治療藥劑的投予量、投予時期等治療方法本體的效果，所以可邊檢討治療計劃邊決定適合個個病患、動物的最適當治療計劃。
在黴漿菌感染症，慢性化且重症化的病患多，且併發合併症，而不知是否起因於黴漿菌感染的情況多，所以實際上係邊評估疫苗投予的效果邊提出接下來的投予計劃。以下表示具體的診斷/預防/治療草案的例子。
在小兒科黴漿菌肺炎領域，期待藉由早期特異性定量的診斷，在必需選擇早期抗菌劑的局面建立明確治療方針，且根據診斷法可適當的更換抗菌劑。
經由將擬似黴漿菌粒子的微脂體作為預防疫苗投予，阻止黴漿菌感染，黴漿菌為小兒髓膜炎等嚴重疾病的原因，而可預防。又，考慮川崎病(非專利文獻30)等急劇經過的疾病的原因，該等情況咸認抗體醫藥有效。
已明瞭黴漿菌肺炎的原因有複數的黴漿菌種參予，根據使用肺炎黴漿菌及發酵黴漿菌的種特異性脂質抗原的抗體測定法，研究慢性難治性疾病(氣喘、COPD、多發性硬化症、風濕性疾病、癌等)與黴漿菌感染及病況經過的關連性，選擇以黴漿菌感染為原因的病患(第17、18圖)。對於選擇的病患進行亦含有抗黴漿菌藥效果的黴漿菌感染治療。使用ELISA法測定黴漿菌的種特異性抗體價或經由質譜儀等測定黴漿菌的種特異性糖脂質抗原量，根據該價提案診斷-治療系統，並進一步提供以糖脂質抗原作為抗體醫藥或疫苗應用的製劑。
根據使用肺炎黴漿菌及發酵黴漿菌的脂質抗原的抗脂質抗原抗體測定法(ELISA法)或黴漿菌種特異性脂質抗原量測定法(質量分析法等)，邊觀察慢性疾病的經過(診斷)邊投予由本發明擬似黴漿菌粒子形成的疫苗製劑。
與肺炎的預防有關、與提昇收益效率有關，具有佐劑效果，有可減輕礦物油等佐劑的使用量或不需使用的可能性。對象為豬、雞、牛、植物等，無關其種別。咸認微生物為黴漿菌、結核菌、披衣菌等具有作為脂質抗原症候群的病原性等者亦為同樣的方法。
現在市售針對豬肺炎黴漿菌的豬肺炎黴漿菌疫苗有與過敏反應一樣反應的休克或發燒，元氣消失的副作用的報告。該等疫苗只限使用含有種種成分的菌體，要鑑定原因物質困難。又，培養豬肺炎黴漿菌菌體時使用的培養液大都為價格高的馬血清或豬血清，及含有高蛋白成分者，除了製造成本高之外，該等蛋白含量高的疫苗數次接種，過敏等副作用的表現率變高。所以期待提供在豬肺炎黴漿菌菌體構成成分中僅特定與形成肺病變有關的成分，而只由該成分所形成之疫苗(成分疫苗)。豬肺炎黴漿菌之特異性擬似細菌粒子只要是人工合成抗原，即由於不含蛋白，可開發便宜且安全的疫苗。
本發明擬似黴漿菌粒子的免疫學機能為疫苗活性、抗體誘導活性、細胞性免疫誘導活性、佐劑活性、對巨噬細胞的吞噬活性、抗原提示細胞的吸取或抗原提示粒子的機能，可作用於與NKT細胞/T細胞/B細胞活化等免疫機能控制相關的作用機序中，安全、安定、有效果的本製劑用途廣。
特別是引起肺炎或下痢等之病毒(流感或輪狀病毒等)或細菌大多從呼吸器或消化器等的黏膜進入生體內。只要可提高該進入經路的黏膜的免疫回應，即可有效的擊退該等微生物。黏膜免疫為可期待可誘導IgA之佐劑效果的本發明擬似黴漿菌粒子，經由導入該等微生物的抗原進行免疫，可提高對於該等微生物抗原的免疫效果。同時，可期待疫苗對於黴漿菌感染的效果。已知流感感染或肺炎球菌等與黴漿菌同時感染，病況會增惡，而可利用作為安全性高的混合疫苗。
又，亦可作為用於將抗菌劑、抗病毒劑等投予至生體內的「DDS」用微脂體製劑使用。
本發明中之其他用語或概念在發明實施形式的說明或實施例中有詳細的規定。用語基本上為根據IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclaturel者或以在該領域慣用的用語的意義為基礎者。為了實施發明所使用的種種技術，除了明示該出處的技術外，以公知的文獻等為基礎，只要是從業者即可容易且確實實施。例如基因工學及分子生物學的技術可根據J.Sambrook,E.F. Fritsch & T. Maniatis,”Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd edition)”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)；D.M.Glover et al. ed.,”DNA Cloning”,2nd ed.,Vol.1 to 4,(The Practical Approach Series),IRL Press,Oxford University Press(1995)；Ausubel,F.M. et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y. 1995；日本生化學會編，「續生化學實驗講課1、基因研究法Ⅱ」、東京化學同人(1986)；日本生化學會編，「新生化學實驗講課2，核酸Ⅲ(重組DNA技術)」、東京化學同人(1992)；R. Wu ed.,：Method in Enzymology”,Vol. 68(Recombinant DNA),Academic Press,New York(1980)；R. Wu et al,ed.,”:Methods in Enzymology”,Vol. 100(Recombinant DNA,Part B)&101(Recombinant DNA,Part C),Academic Press,New York(1983)；R. Wu et al,ed.,”:Methods in Enzymology”,Vol. 153(Recombinant DNA,Part D),154(Recombinant DNA,Part E)&155(Recombinant DNA,Part F),Academic Press,New York(1987)等記載的方法、引用該等方法之文獻記載方法或實質與該等同樣的方法或改變法進行。又，對於本發明使用的各種蛋白質或肽或將該等編碼的DNA可從既存的資料庫(URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等)購得。
以下，呈示實施例對本發明作更詳細且具體的說明，惟，本發明不只限於以下之例。
本說明書中引用的技術文獻、專利文獻及專利申請說明書中記載的內容為參照本發明記載的內容。
將從大量培養的豬肺炎黴漿菌萃取、精製的脂質15.46mg及市售品的高純度膽固醇3.31mg(日油(股)公司製造)用乙醇600μL溶解，將該溶液在60℃的恒溫槽中加入8.5%蔗糖溶液3mL中，進行超音波處理3分鐘(SND(股)公司製造的超音波洗淨器US-104)，製作微脂體粒子。粒徑以δ電位/粒徑/分子量測定裝置(MALVERN公司製造ZETASIZER奈米系列(nano series))測定，使集中在約100nm(第4圖)。
在合成GGPL-Ⅲ的一定量中加入改變比率的二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)(日油(股)公司製造)及膽固醇(日油(股)公司製造)，並以氯仿-甲醇溶液溶解，濃縮乾燥。在經乾燥的試樣中加入細胞培養用培養基RPM1-1640(Sigma公司製造)，於25℃用超音波處理40分鐘。該試樣的粒徑用δ電位/粒徑/分子量測定裝置(MALVERN公司製造ZETASIZER奈米系列)測定(第23圖)。
所用的磷脂醯膽鹼的脂肪酸係使用天然黴漿菌最典型的脂肪酸碳原子數16的飽和型脂肪酸，改變與膽固醇的比例，與黴漿菌脂質抗原一同作成微脂體粒子，測定粒徑及其分布。從該等結果導出以莫耳比計脂質抗原為10至50%、磷脂醯膽鹼為20至50%、膽固醇為10至50%較佳。該等為接近黴漿菌脂質分析數據的結果(非專利文獻29)。
HPLC的測定係以管柱：Water C4 1.0×150mm，移動層：100%甲醇，注入量：5μL，流量：0.05mL/分，溫度：40℃(內部、外部)、檢出器：蒸發散射檢出(ELSD)，UV(215nm)的條件進行(全為Waters公司製造)。
將各GGPL-Ⅲ濃度及其波峰面積的關係作成曲線圖結果，波峰面積係GGPL-Ⅲ濃度依賴性的增大。將各標準曲線表示於圖表。根據以上的結果，由於在ELSD中其波峰面積的動態範圍廣，在用HPLC分析檢出GGPL-Ⅲ時，認為蒸發散射檢出(ELSD)為適當(第5圖)。
質量分析為將各試樣溶解於氯仿：甲醇(2：1)溶液500μL中，將1μL用甲醇稀釋10000倍。經稀釋的試樣1μL塗在靶上。另，將基材溶液(2,5-羥基苯甲酸及三氟乙酸鈉)1μL塗在靶上，用質量分析裝置(BRUKER公司製造autoflex Ⅱ TOF/TOF)測定。根據質量分析的結果了解脂質抗原的純度高(第5圖)。
(實施例2)誘導肺炎黴漿菌合成脂質抗原的抗體
使用肺炎黴漿菌合成脂質抗原(GGL Glc-型)，用與實施例1(1-2)相同的方法調製肺炎黴漿菌擬似粒子。又，合成GGL Glc-型係可用專利文獻8等中記載的方法合成。
使用該擬似粒子，將2隻C57BL/6小鼠免疫。具體而言，將含有該粒子之溶液100μL在小鼠腹腔內接種3次(0、第14天、第35天)，從該小鼠採血，用酵素抗體免疫法(ELISA法)測定各個試樣的IgG及IgM抗體價。該結果如第7圖所示，在2隻小鼠誘導出IgG及IgM抗體。
該結果表示GGL Glc-型微脂體粒子作為擬似黴漿菌粒子作用著，在體內誘導特異性抗體。
在發酵黴漿菌的合成GGPL-Ⅲ500μg中加入1mL的生理食鹽水，進行超音波處理30分鐘，形成微脂體粒子，將該粒子接種於慢性風濕性關節炎自然發症的小鼠模型SKG小鼠的腹腔內。在接種後第4天採血，用代謝抑制試驗測定該血液的發酵黴漿菌的發育抑制活性。
該結果為在小鼠血清中可特異性誘導對於黴漿菌脂質抗原的抗體，尤其在IgG時，顯示對應稀釋度的抗體價。又，確認抑制黴漿菌的增殖(第8圖)。
該結果表示GGPL-Ⅲ微脂體粒子係作為擬似黴漿菌粒子而作用，在體內可誘導特異性抗體。
將發酵黴漿菌生菌經氣管接種於兔子(Newzealand White，雌性，約2公斤)，製作肺炎模型兔子，又同樣的經膝關節接種，製作風濕性關節炎模型兔子。實驗1為在第0日單次接種109CFU/兔子之量，製作肺炎模型兔子2隻，關節炎兔子3隻。實驗2為在第0日、第7天、第21天每次以109CFU/兔子之量接種3次，製作肺炎模型兔子3隻，關節炎兔子3隻。在該等模型兔子中，可觀察到4/6例血中的GGPL-Ⅲ的IgG抗體價急速上昇(第9圖)。
該結果證明黴漿菌不僅會引起肺炎，也會引起關節炎之慢性炎症性疾病(第1圖)。又，於實施例5，將同樣製造的模型兔子用於疫苗活性的評估。
使用與上述實施例1(1-2)相同的方法合成的發酵黴漿菌脂質抗原(GGPL-Ⅲ)，調製發酵黴漿菌擬似粒子。
與上述實施例4相同，製作發酵黴漿菌感染風濕性關節炎模型，對該等先在兔子腹腔內經由4次的發酵黴漿菌擬似粒子進行免疫時抑制發酵黴漿菌感染風濕性關節炎模型的關節病變。由該等證明合成GGPL-Ⅲ發酵黴漿菌脂質抗原粒子成為疫苗等的免疫治療藥。該等相當於合成脂質抗原免疫機能激發效果(第10圖)。
該結果顯示本案申請的擬似黴漿菌粒子(GGPL-Ⅲ)可成為預防因黴漿菌感染引起的風濕性關節疾病的疫苗。
用免疫染色法的結果(A至D)、用免疫電子顯微鏡的結果(E)，在風濕性關節炎病患的滑膜細胞內均觀察到發酵黴漿菌特異性脂質抗原(GGPL-Ⅲ)顯著量增加。
該結果表示在黴漿菌感染症中，脂質抗原係吸入免疫細胞中，搬運到粗面小胞體後參予抗原提示(非專利文獻31)途徑。從抗原提示細胞更產生誘導特異性B細胞之抗體。在T細胞或脂質抗原誘導特異性反應之NKT細胞。
使用以肺炎黴漿菌合成GGL Glc-型作為抗原之ELISA，測定黴漿菌呼吸器疾病病患血清中的IgA。在黴漿菌呼吸器疾病病患的血清中確認對於肺炎黴漿菌GGL Glc-型的IgA的抗體。由此暗示肺炎黴漿菌GGL Glc-型成為黏膜免疫佐劑。
在免疫回應中，IgA為從黏膜免疫系產生的抗體的亞型。所以，誘導對應該抗原的IgA顯示對於黏膜免疫係該抗原之作用。在人類，顯示對於黴漿菌特異性脂質抗原，誘導IgA抗體的結果為本發明之擬似黴漿菌粒子在黏膜免疫顯示強力作用。若認為具有作為擬似黴漿菌粒子免疫機能的佐劑作用(實施例10)，則將成為使對流感感染等有效的黏膜免疫特異性活化的佐劑。
從健康正常人的末梢將單核球分離，培養加入干擾素2及擬似黴漿菌粒子(GGPL-1或GGPL-Ⅲ)的試樣和不加入的試樣，回收其上清液，用酵素抗體免疫法(ELISA法)測定該上清液中干擾素γ的量。
該結果確認加入擬似黴漿菌粒子(GGPL-1、GGPL-Ⅲ)時，較介白素2單獨投予時，干擾素γ的產生量增加2倍以上(第16圖)。
該結果顯示本發明擬似黴漿菌粒子(GGPL-1及/或GGPL-Ⅲ)具有細胞免疫誘導活性。
該病患有感冒症狀。1至2個月後出現手指關節疼痛及變形，3個月後到醫院門診，診斷為年輕性風濕性關節炎。接受口服藥治療，手指關節的疼痛逐漸減輕。根據ELISA法測定該年輕性風濕性關節炎的初期病患約半年之間的肺炎黴漿菌及發酵黴漿菌的抗體價。其結果為對發酵黴漿菌特異性GGPL-Ⅲ的IgM抗體明顯上昇，証明與發酵黴漿菌的感染有關。又，在其他的檢查結果，用以往就有的黴漿菌CF法的結果為8倍，否定為黴漿菌感染症，惟，從血液中在PCR檢出發酵黴漿菌，確認感染發酵黴漿菌，且存在於血液中。
從以上的結果證明在年輕性風濕性關節炎病患的發症初期，實際上以發酵黴漿菌感染為原因的病患存在。對於該等病患，測定GGPL-Ⅲ抗體價，確認感染，儘可能在早期投予本案申請的擬似黴漿菌粒子(GGPL-Ⅲ)疫苗是有效的。亦即，在原因不明的年輕性風濕性關節炎病患可成為一部分原因特異性的治療，成為與突破性根治有關的治療法。
以同樣的方法測定肺炎黴漿菌及發酵黴漿菌的抗體價(第18圖)。
該病患因膝蓋疼痛到醫院看診。確認兩側性肺門淋巴節腫脹，診斷為類肉瘤。此時，用以往就有的檢查法之黴漿菌PA法為160倍，認為與黴漿菌感染症有關連的可能性。經由使用已含有對於黴漿菌感染症有效的抗生物質治療，雖仍持續無膝關節疼痛的狀態，但是從平成18年5月起膝關節疼痛復發。用黴漿菌PA法為80倍，雖然價比前次的降低，惟，與前次相同，經由含有對黴漿菌感染症有效的抗生物質的治療，膝關節的疼痛減輕。症狀再復發時，對發酵黴漿菌特異性GGPL-Ⅲ的IgG抗體明顯上昇，在經由治療症狀減輕的同時其抗體價亦減少，證明與發酵黴漿菌的感染症有關。
同樣的，從上述結果看到在該再復發的類肉瘤病患亦證明發酵黴漿菌感染為原因。對於該病患，投予本案申請的擬似黴漿菌粒子(GGPL-Ⅲ)疫苗可期待其效果。
測定多發性硬化症病患血清中GGL Gal-型抗體(IgG及IgM)的抗體價。從該結果看到在多發性硬化症病患，亦證明肺炎黴漿菌感染為原因。對於肺炎黴漿菌特異性脂質抗原誘導抗體，證明對該脂質抗原有疫苗活性。多發性硬化症，症狀的惡化及減輕在年中反覆數次，以年為單位漸漸惡化，為難治病，惟，對於該病患，經由本案申請的脂質抗原擬似細菌粒子，可期待投予擬似黴漿菌粒子(GGL Gal-型)疫苗等的治療效果為有效。
從健康正常人的末梢血將單核球分離，將於其加入介白素2及發酵黴漿菌合成脂質抗原GGPL-Ⅲ的試樣和不加入的試樣進行培養，回收其上清液，用酵素抗體免疫法(ELISA法)測定該上清液中干擾素γ的量並比較之。在人類末梢血單核球加入介白素2與脂質抗原者，干擾素γ產生量比未加入脂抗原者，顯著增加(第16圖)。該結果表示本案申請的擬似黴漿菌粒子(GGPL-Ⅲ)具有細胞免疫誘導活性。
如第14圖(A)所示，將金屬鎳(抗原)同時與發酵黴漿菌擬似粒子(GGPL-Ⅲ)投予至小鼠的耳朵，確認係用量依賴性(投予0.2mg/mL及1mg/mL)的具有提高抗體產生能的效果。第14圖(B)表示發酵黴漿菌擬似粒子(GGPL-Ⅲ)具有與LPS同等的細胞免疫活性。又，具有增強抗原活性的佐劑活性。從LPS開發的LipidA雖開始作為佐劑使用，惟，期待黴漿菌脂質抗原亦作為佐劑。
大量培養豬鼻黴漿菌及豬肺炎黴漿菌，用氯仿-甲醇加以區分，將該等用薄層層析法(氯仿：甲醇：0.2%氯化鈣=55：45：10)展開。展開後用甲苯二酚硫酸以免疫染色法進行染色、檢出(第13圖)。
如第4圖所示，製作使用精製脂質抗原的擬似豬肺炎黴漿菌粒子，在小鼠的腹腔內進行免疫3次。在最後接種後的第4天採血，用代謝阻止試驗測定該血液的黴漿菌發育阻止活性。其結果確認抑制黴漿菌的增殖。
大量培養幽門螺旋桿菌，用氯仿-甲醇加以區分，將該等用薄層層析法(氯仿：甲醇：0.2%氯化鈣=60：28：3)展開。
展開後用磷酸鉬染色並以使用甲苯二酚硫酸的免疫染色檢出特異脂質抗原，確認幽門螺旋桿菌的特異性脂質抗原。
使用幽門螺旋桿菌的精製特異脂質抗原，以與實施例1(1-2)相同的方法製作擬似幽門螺旋桿菌粒子。使用該擬似幽門螺旋桿菌粒子，將從C57BL/6小鼠的骨髓細胞干擾素γ的產生用酵素抗體免疫法(ELISA法)測定上清液中干擾素γ的量。該結果明瞭本專利申請的擬似幽門螺旋桿菌粒子具有干擾素γ的誘導活性。
將用與實施例1(1-2)相同的方法調製的肺炎黴漿菌擬似粒子(GGL Glc-型)在分為4群的月齡為2個月的小鼠(體重約30公克)腹腔內分別注入200μg、50μg、20μg，進行免疫4次。對照群未投予抗原。如第24圖下方所示，分4次採血，根據ELISA分別測定IgM抗體價(值為每群的平均值)。在50μg、20μg投予群雖然顯示超過截止值的高抗體價，但在200μg的高濃度投予時，抗體價未上昇。該實施例使用的肺炎黴漿菌擬似粒子(GGL Glc-型)時的最適當投予量確認以約10至100μg/1次即十分有效。假定為投予至人類時，則為約100μg至10mg/1次，在最初假定的範圍內(在小鼠等小動物為約1μg至200μg/次)，在實際的疫苗接種時，經由該等方法，可期待更方便的投予量的最適化。
該實驗為對於黴漿菌種特異性糖脂質抗原中典型肺炎黴漿菌特異性糖脂質抗原GGL進行檢討是否可將病患血清等試樣中含有的GGL量定量化的模型試驗。又，基本的步驟係根據專利文獻6的方法。
首先，預先合成GGL作為對應GGL之合成標準品，另，先合成導入6個經重氫化之[H3]之[H3]-GGL(d6-GGL)作為定量化標準品。
另一方面，用培養液培養肺炎黴漿菌，菌體量用以往方法的菌落數定量化，將脂質抗原GGL從107cfu的菌體萃取/分離精製。將該含107cfu培養肺炎黴漿菌試料與甲醇：氯仿=1：1等有機溶劑(0.8mL)充分混合，添加水(0.2mL)，經約2500至3000g離心操作，使層分離，將下層氯仿層含目的GGL(C16：0)的脂質區分與蛋白質或血球分離而獲得GGL，另用DIAION(三菱化學公司製造)的矽胶(iatrobeads)(源自二氧化矽的羥基被遮蓋)精製。
為了測定該脂質抗原的量，在上述脂質區分中濃度成為階段性的方式[H3]-GGL(C16：0)，將各個質譜以質量分析機(Bruker Daltonics公司製造)添加鈉使離子化，並以正極模式測定。(第25圖)
該結果，若同時比較目的GGL(C16：0)特徵波峰(915m/z)的波峰和[H3]-GGL(C16：0)特徵波峰(921m/z)的波峰的尖峰高度，則確認係為添加[H3]-GGL(C16：0)50pmol時及添加5pmol時的中間高度，可決定GGL(C16：0)的存在量係在50pmol至5pmol之間。亦即，明瞭在模型試樣中的培養黴漿菌菌體107cfu中，存在有50pmol至5pmol的黴漿菌特異性脂質抗原GGL(C16：0)。又，該結果顯示只要有約105cfu的菌體量存在，即可充分檢出。
所以，使用源自實際的黴漿菌感染病患的組織或血液進行測定時，不僅可馬上決定感染黴漿菌種，且可確實的判定其感染程度，亦證明在用於判定進行疫苗治療或化學療法劑治療後，或中途經過過程的治療效果方面為可非常有效利用的技術。
第11圖為表示將風濕性關節炎病患的關節組織中發酵黴漿菌特異性脂質抗原GGPL-Ⅲ用特異抗體染色的圖，此次，係顯示以實施例15記載的使用質量分析機的方法亦可檢出風濕性關節炎病患的關節組織中GGPL-Ⅲ的存在。
從風濕性關節炎病患的關節組織使用矽胶(DIAION，三菱化學公司製造)，獲得經分離精製的脂質成分。
該區分用質量分析機(Bruker Daltonics公司製造)解析時可確認表示GGPL-Ⅲ存在的1049m/z位置的波峰(第26圖)。
從疑似黴漿菌感染的肺炎病患複數人採取咽頭擦拭液，用與實施例16相同的方法，將獲得的溶出區分離子化，用質量分析機(Bruker Daltonics公司製造)解析時，如第27圖所示，可在複數試樣檢出肺炎黴漿菌特異性糖脂質抗原GGL之特異性波峰。
第1圖為黴漿菌感染與疾病關連的概念圖。
第2圖為黴漿菌感染症的急性症狀及慢性化。
第3圖為擬似細菌粒子(擬似黴漿菌粒子)的概念圖。
第4圖(A)及(B)表示微脂體粒徑的品質管理，(C)為根據粒度測定儀(zetasizer)之微脂體粒徑的測定值。
第5圖(A)至(C)為源自經精製的發酵黴漿菌之抗原脂質GGPL-I及GGPL-Ⅲ的定量分析。
第6圖為各種細菌脂質區分的比較：於大腸菌、綠濃菌、肺炎球菌、肺炎桿菌、流感菌及退伍軍人病菌(Legionella)中可確認特異性脂質的存在。
第7圖(A)及(B)為使用擬似肺炎黴漿菌粒子之IgG及IgM抗體的誘導。
第8圖(A)及(B)為經由使用擬似發酵黴漿菌粒子(合成GGPL-Ⅲ)之SKG系統小鼠(自體免疫疾病模型)的腹腔內免疫，誘導IgG及IgM抗體。
第9圖為使用發酵黴漿菌生菌製作動物模型。藉由對經氣道模型及經膝關節模型的兔子的投予實驗，觀察血中IgG抗體價之上昇(疫苗活性)。
第10圖為對使用擬似發酵黴漿菌粒子之動物模型的合成脂質抗原免疫機能促發效果(priming effect)。對於發酵黴漿菌感染風濕性關節炎模型之兔子在腹腔內以擬似發酵黴漿菌粒子進行複數次免疫，可抑制關節病變。
第11圖為源自風濕性關節炎病患之滑膜細胞內之發酵黴漿菌脂質抗原(GGPL-Ⅲ)的分布。
第12圖為幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)之脂質抗原及γ干擾素(interferon)誘導活性。
第13圖為源自動物的黴漿菌(豬鼻黴漿菌及豬肺炎黴漿菌)特異性脂質抗原的檢出。
第14圖(A)及(B)為發酵黴漿菌特異性脂質抗原(GGPL-Ⅲ)的佐劑效果。左圖為先在小鼠耳朵同時投予金屬鎳(抗原)及發酵黴漿菌擬似粒子(GGPL-Ⅲ)，而確認係用量依賴性(投予0.2mg/mL及1mg/mL)的提高抗體產生能的效果。
第15圖(A)及(B)表示含有黴漿菌肺炎的呼吸器疾病的病患血清中的血清抗體價：根據使用肺炎黴漿菌特異性抗原GGL Glc-型的ELISA法測定IgA的結果。在人類血清中可確認誘導IgA抗體，確認可作為黏膜免疫佐劑。
第16圖使用擬似黴漿菌粒子的細胞免疫活性人類的末梢血單核球，比起單獨投予干擾素2時，在加入擬似黴漿菌粒子(GGPL-Ⅰ、GGPL-Ⅲ)時確認干擾素γ的產生量增加2倍以上。從健康人的末梢血將單核球分離，將於其中加入干擾素2及脂質抗原的試樣及未加入該等的試樣加以培養，回收上清液，用酵素抗體免疫法(ELISA法)測定該上清液中干擾素γ的量。
第17圖(A)、(B)為年輕風濕性關節炎病患的肺炎黴漿菌及發酵黴漿菌抗體價的測定結果(ELISA法)。
第18圖(A)、(B)為類肉瘤(Sarcoidosis)病患的肺炎黴漿菌及發酵黴漿菌抗體價的測定結果(ELISA法)。
第19圖為多發性硬化症病患血清抗體的變動。
第20圖為小兒肺炎黴漿菌的診斷-預防-治療草案(protocol)。
第21圖為成人肺炎黴漿菌的診斷-預防-治療草案。
第22圖為自體免疫疾病等慢性黴漿菌感染症的診斷-預防-治療草案。
第23圖為黴漿菌擬似微脂體粒子組成的研究。
第24圖為黴漿菌擬似微脂體粒子投予法的最適化。
第25圖為黴漿菌特異性脂質抗原(GGL)的定量化(質量分析法)。
第26圖為沉澱於風濕性關節炎病患關節組織之發酵黴漿菌特異性脂質抗原GGPL-Ⅲ的檢出(根據質量分析裝置)。
第27圖從被檢病患的咽頭擦拭液鑑定肺炎黴漿菌特異性脂質抗原波峰。
無元件符號
Claims (11)
- 一種擬似細菌粒子，其係由含1種或1種以上對病原性細菌為特異性之脂質抗原作為微脂體構成脂質成分之微脂體粒子所構成者，前述脂質成分係由對前述病原性細菌為特異性之精製脂質抗原所單獨構成，或由前述精製脂質抗原與磷脂質及膽固醇之混合物所構成者，該擬似細菌粒子係由在感染該病原性細菌種的生物體內的免疫系中，引起免疫回應的微脂體粒子所構成，其中，該病原性細菌為幽門螺旋桿菌、結核菌或肺炎球菌，且該粒子係不含有與特異性脂質抗原不同的佐劑者。
- 一種擬似黴漿菌粒子的用途，其係用於黴漿菌感染症用疫苗的製造，該擬似黴漿菌粒子係包含：含1種或1種以上對黴漿菌為特異性之脂質抗原作為微脂體構成脂質成分之微脂體粒子，前述脂質抗原係黴漿菌特異性糖脂質，且在化學合成或酵素合成後，經分離精製者。
- 如申請專利範圍第2項所述之擬似黴漿菌粒子的用途，其中，上述黴漿菌特異性脂質抗原之至少1種為肺炎黴漿菌特異性脂質抗原或發酵黴漿菌特異性脂質抗原者。
- 如申請專利範圍第2項或第3項所述之擬似黴漿菌粒子的用途，其中，復另含有磷脂醯膽鹼及膽固醇作為上述微脂體構成脂質成分。
- 如申請專利範圍第2項或第3項所述之擬似黴漿菌粒子的用途，其係將含有上述黴漿菌特異性脂質抗原的微脂體構成脂質成分在溶劑中混合後，經由超音波處理，而於使粒徑為30至300nm範圍內且其80%以上為40至200nm範圍內的條件下進行粒子化者。
- 一種擬似黴漿菌粒子，其係由包含1種或1種以上對黴漿菌為特異性之脂質抗原作為微脂體構成脂質成分之微脂體粒子所構成，且係於上述微脂體粒子表面存在有其他抗原性物質之擬似黴漿菌粒子，且係經由上述黴漿菌特異性脂質抗原的佐劑效果，而提高該其他抗原性物質的抗原性者。
- 如申請專利範圍第6項所述之擬似黴漿菌粒子，其中，上述其他抗原性物質為源自病毒之抗原肽者。
- 一種黴漿菌感染症的預防或治療用疫苗，其係含有由申請專利範圍第2項至第5項中任一項所述之用途所製造之擬似黴漿菌粒子作為有效成分。
- 如申請專利範圍第8項所述之黴漿菌感染症之預防或治療用疫苗，其中，上述黴漿菌感染症為肺炎、氣喘或風濕性疾病者。
- 一種病毒感染症的預防或治療用疫苗，係以如申請專利範圍第7項所述之於粒子表面存在有源自病毒之抗原肽之擬似黴漿菌粒子作為有效成分者。
- 如申請專利範圍第10項所述之疫苗，其中，上述病毒為流感病毒，上述病毒感染症為流感者。
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