CN102448488B - 支原体感染症用疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供对于支原体感染治疗效果好且安全的疫苗以及开发支原体感染的有效治疗方法，并且，本发明的目的是提供支原体样粒子以及包含常见细菌的细菌样粒子作为有效的支原体感染症用疫苗。本发明中，通过含有支原体等病原性细菌特异性脂质抗原作为构成脂质体脂质成分的脂质体粒子，可提供支原体样粒子等的细菌样粒子。通过给予所述支原体样粒子，在活体内能诱导强的免疫活性，可提供支原体感染预防用或治疗用的优异疫苗。

Description

支原体感染症用疫苗
技术领域
本发明涉及一种利用支原体等各细菌中的特异性脂质抗原的细菌样粒子以及使用该粒子的高安全性的高性能支原体感染症用疫苗，以及使用该疫苗的支原体感染症的预防或治疗方法。 
背景技术
已知支原体感染人类、家畜甚至宠物等动物，引起种种疾病。尤其对于人类，怀疑不仅肺炎与支原体有强烈的关联性，也怀疑通过慢性化或反复感染，哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等呼吸系统疾病、风湿性关节炎等风湿性疾病(非专利文献1)、多发性硬化症等神经疾病等与支原体也有强烈的关联性，因而支原体最有可能成为导致现今称为疑难杂症的慢性疾病的致病微生物(图1，非专利文献31、32)。 
已知支原体感染可从发烧、咳嗽、肺炎等感冒症状而发病，转变成哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、多发性硬化症和风湿性疾病的病例，还已知此时因症状反复复发、加重，会逐渐转变为慢性疾病，所以，早期诊断、早期治疗，尤其是预防、治疗加重(症状逐渐恶化)或复发(症状减轻后再度恶化)特别重要。 
但是，由于以往的检查方法不容易把握支原体感染的诊断或治疗经过而不能详细了解病情，因此，现状为大量患者不能受到适当治疗。作为支原体感染的诊断方法，现在最广泛使用的是血清诊断法，以往的诊断法为大量培养肺炎支原体(mycoplasma pneumonia)，使用来自该菌体的粗提取物进行抗体测定法，在特异性、检测灵敏度、定量性方面存在问题，所以支原体感染的早期诊断仍具有困难。 
本发明人等从现状出发，着眼于属于支原体属的各种细菌表面的脂质抗原，从而发现了多种细菌特异性脂质抗原。将上述特异性脂质抗原分离纯化并确定结构，也成功地进行了其中几个的化学合成(专利文献1～8)。 
与以往的诊断药相比，对于支原体感染症使用上述特异性脂质抗原 的诊断药，可建立具有特异性和灵敏度高、定量测定抗体效价变化的方法，大致可解决迄今仍为问题点之一的支原体感染的早期诊断问题。 
然而，对于支原体感染症的治疗药，作为现在最可预期治疗效果的治疗药，实用化的有大环内酯类(macrolide)、新喹诺酮(new quinolone)类、四环素类等部分抗生素，但上述抗生素不仅副作用大，耐药菌的出现也是个大问题，对支原体感染症无法预期到充分的治疗效果，进一步成为导致病情加重进而转变成慢性疾病的原因。 
另一方面，对于人类，尚未开发支原体的疫苗疗法。其理由是活疫苗、减毒疫苗等有安全性问题，很难实用化，死疫苗等存在因培养液混入马血清等而引起过敏反应问题。此外，为了鉴定疫苗诱导的相关特异性抗原蛋白，进行肽或DNA解析，但尚不能列举鉴定的有效特异性抗原蛋白。将猪或牛等家畜用的以往使用的活疫苗或减毒疫苗等再进一步改良(专利文献9～12)。还开发了使用蛋白抗原的疫苗(专利文献13～15)，最近开发以与支原体感染症引起的组织损伤相关的酶作为靶点的疫苗(专利文献16)，但上述疫苗都只限于肺炎抑制效果或炎症抑制效果，对于家畜用疫苗也还不能说是毒性少且有效的疫苗。 
综上，由于尚未发现对于支原体感染症有效的预防和治疗方法，因此，开发支原体感染症用的有效的预防/治疗药，尤其是支原体感染症用的疫苗成为当务之急。 
在制造各种病原性病毒疫苗方面，已知有制成对象病原性病毒样粒子，使用该病毒样粒子进行免疫，获得高免疫应答，使用该病毒样粒子也可推进开发高活性且高安全性的疫苗制剂(非专利文献2)。在病毒的抗原肽方面，也有加入脂质体等的疫苗使其实用化的动向(非专利文献3)。 
病毒是利用细胞机理将结构蛋白或酶等自我复制，并用细胞膜包覆后向细胞外释放进行增殖。因此，不存在细胞膜脂质抗原，疫苗几乎全为病毒粒子或蛋白抗原。病毒不仅大小非常小，其表面的构成成分也少，因此提供仿真病毒粒子，即提供对于生物体的免疫系统引起病毒自身侵入错觉的病毒样粒子比较简单。 
另一方面，对包含支原体的细菌类的情况，可通过DNA自我复制，基本上也独立产生脂质膜构成成分，所以膜脂质成分对于各种细菌为特异性且复杂的。所以除了细胞膜构成成分或膜脂质的解析困难之外，若考虑到细胞成分或膜蛋白等，则横跨多个领域，很难简单地只用其中的1个成分模拟支原体本身，所谓支原体样粒子、细菌样粒子的概念并不成熟。通常，尚不明确上述多种的成分中何种成分必须留下且使用何种粒子化技术可提供支原体样粒子，也不明确上述支原体样粒子对于生物免疫系统是否会引起支原体感染错觉的免疫应答。 
以往技术 
专利文献 
专利文献1：日本发明专利第3735388号 
专利文献2：日本发明专利第3551525号 
专利文献3：日本发明专利第3717962号 
专利文献4：国际公开2007/023583(WO2007/023583) 
专利文献5：特开2007-238470号公报 
专利文献6：国际公开2007/145361(WO2007/145361) 
专利文献7：国际公开2007/145362(WO2007/145362) 
专利文献8：日本特开2009-7279号公报 
专利文献9：日本特开2009-73855号公报 
专利文献10：日本特表2004-537543号公报 
专利文献11：日本特表2004-518655号公报 
专利文献12：日本特表2004-536106号公报 
专利文献13：日本特开2006-311824号公报 
专利文献14：日本特表2005-515162号公报 
专利文献15：日本特表2003-513935号公报 
专利文献16：日本特表2009-500007号公报 
专利文献17：日本特表2006-503830号公报 
专利文献18：日本特开2005-145959号公报 
专利文献19：日本特表2002-526436号公报 
专利文献20：国际公开2002/098465(WO2002/098465) 
专利文献21：日本特开2008-37831号公报 
专利文献22：日本特开2001-69977号公报 
专利文献23：日本特开2002-241313号公报 
专利文献24：日本发明专利第2828391号 
专利文献25：日本特开2004-010481号公报 
专利文献26：日本发明专利申请2007-288728号公报 
专利文献27：日本发明专利第2828391号 
非专利文献 
非专利文献1：松田和洋特集マイコプラズマ感染症の基礎と臨床慢性関節リウマチの関節破壊原因物質としてのMycoplasma fermentans特異コリン含有糖リン脂質微生物と臨床30：75-79(2003) 
非专利文献2：Influenza virus-like particle vaccines.Haynes JR.Expert Rev.Vaccines.2009 Apr；8(4)：435-45.Review 
非专利文献3：Immunobiology of human papillomavirus infection and vaccination implications for second generation vaccines.Stanley M.Gissmann L.Nardelli-Haefliger D.Vaccine.2008 Aug 19：26 Suppl10：K62-7，Review. 
非专利文献4：Mol.Immunol.25：10，1025-1031，1988 
非专利文献5：Matsuda K，Saito M，Yamamoto N，Encyclopedia of Life Science.Vol.1 p748-755，Nature publishing group，(2001) 
非专利文献6：M.Kraft Q.&Hamid，J Allergy Clin Immunol 117，1197-1198(2006). 
非专利文献7：M.Kraft，G.H.Cassell，J.E.Henson，H.Watson，J.Williamson，B.P.Marmion，C.A.Gaydos&R.J.Martin，Am J Respir Crit Care Med 158，998-1001.(1998) 
非专利文献8：F.Meloni，E.Paschetto，P.Mangiarotti，M.Crepaldi，M.Morosini，A.Bulgheroni&A.Fietta，J Chemother 16，70-76.(2004) 
非专利文献9：J.Haier，M.Nasralla，A.R.Franco&G.L.Nicolson，Rheumatology(Oxford)38，504-509.(1999) 
非专利文献10：H.W.Clark，M.R.Coker-Vann，J.S.Bailey&T.M.Brown，Ann Allergy 60，394-398.(1988) 
非专利文献11：E.Maida，J.Neurol 229，103-111.(1983) 
非专利文献12：G.L.Nicolson，M.Y.Nasralla，J.Haier&J.Pomfret，J Clin Neurosci 9，525-529.(2002) 
非专利文献13：F.Daxbock，K.Zedtwitz-Liebenstein，H.Burgmann&W.Graninger，Ann Hematol 80，180-182.(2001) 
非专利文献14：C.Leen，S.&Ling，Arch Dis Child 75，266-267.(1996) 
非专利文献15：J.Nijs，G.L.Nicolson，P.De Becker，D.Coomans&K.De Meirleir，FEMS Immunol Med Microbiol 34，209-214.(2002) 
非专利文献16：G.K.Endresen，Rheumatol Int 23，211-215.(2003) 
非专利文献17：松田和洋、只野—有富桂子、飯田—田中直子、新宮佑子、富山哲雄、原澤亮、森田大児、楠進、日本マイコプラズマ学会雑誌第34号45-46(2007) 
非专利文献18：Matsuda，K等，日本マイコプラズマ学会雑誌，第31号35-36(2004) 
非专利文献19：松田和洋，日本マイコプラズマ学会雑誌，第35号41-43(2008) 
非专利文献20：Miyachi.A.，Miyazaki，A.，Shingu，Y.，Matsuda，K.，Dohi，H.，Nishida，Y.，Carbohydrate Research 344：36-43(2009) 
非专利文献21：Nishida，Y.，Takamori，Y.，Ohrui，H.，Ishizuka，I.，Matsuda，K.，Yamada，T.，Kobayashi，K.，Tetrahedron lett.40：2371-2374(1999) 
非专利文献22：Nishida，Y.，Takamori，Y.，Matsuda，K.，Ohrui，H.，Yamada，T.，Kobayashi，K.，J.Carbohydr Chem.18：65-72(1999) 
非专利文献23：Matsuda，K.，Ishizuka.I.，Kasama，T.，Handa，S.，Yamamoto，T.，Biochim.Biophys.Acta 1349：1-12(1997) 
非专利文献24：Matsuda，K.，Li，J-L.，Harasawa，R.，Yamamoto N.Biochem.Biophys.Res.Com.233：644-649(1997) 
非专利文献25：Matsuda，K.，Harasawa，R.，Li，J.L.，Kasama，T.，Taki，T.，Handa，S.，Yamamoto，N.，Microbiolo.Immunol.39：307-313(1995) 
非专利文献26：Matsuda，K.，Kasama，T.，Ishizuka，I.，Handa，S.， Yamamoto，N.，Taki，T.J.Biol.Chem.269：33123-33128(1994) 
非专利文献27：Nishida，Y.，Ohrui，H.，Meguro，H.，Ishizawa，M.，Matsuda，K.，Taki，T.，Handa，S.，Yamamoto，N.，Tetrahedron Lett，35：5465-5468(1994) 
非专利文献28：Ishida，N.，Irikura，D.，Matsuda，K.，Sato，S.，Sone，T.，Tanaka，M.，Asano，K.，Molecular Cloning ans Expression of a NovelCholonephosphotransferasae Involved in Glycerophospholipid Biosynthesus of Mycoplasma fermentans，Curr Microbiol(2009in press) 
非专利文献29：Matsuda，K.，Li，J-L.，Harasawa，R.，Yamamoto N.Phosphocholine-containing glycoglyerolipids(GGPL-I and GGPL-Ⅲ)are species-specific major immunodeterminants of Mycoplasma fermentans.Biochem.Biophys.Res.Com.233：644-649(1997) 
非专利文献30：C.Leen，S.&Ling，Arch Dis Child 75，266-267，(1996) 
非专利文献31：kawahito，Y.，Ichinose，S.，Sano，H.，Tsubouchi，Y.，Kohno，M.，Yoswhikawa，T.，Tokunaga，D.，Hojo，T.，Harawsawa，R.，Nakano，T.，Matsuda K，Mycoplasma fermentans glycolipid-antigen as a pathogen of rheumatoid arthritis.Biochem.Biophys.Res.Com.369：561-566(2008) 
非专利文献32：M.F.Barile，Mycoplasma and leukemia，Ann N.Y.Acad Sci 143：557-572(1967) 
非专利文献33：Sato.N.，Oizumi，T.，Kinbara，M..Funayama，H.，Sato，S.，Matsuda，K.，Endo，Y.FEMS Immunology and Microbiology 59：33-41(2010) 
发明内容
本发明的目的是提供对于支原体感染症的治疗效果好且安全的疫苗以及开发有效的支原体感染症的预防和治疗方法。而且，本发明的目的是提供支原体样粒子以及进一步包含常见细菌的细菌样粒子作为有效的该支原体感染症用疫苗。 
本发明人等分离纯化以往人类或猪等各种病原性支原体的各种特异性脂质抗原，尤其对于作为人类病原性的肺炎支原体特异性脂质抗原 的GGL Glc型、GGL Gal型及作为发酵支原体特异性脂质抗原的GGPL-I、GGPL-Ⅲ，分别确定其结构后，还成功进行了化学合成(专利文献1～8)(非专利文献5)。本发明人等使用上述特异性脂质抗原，开发并建立了可以高灵敏度、特异性地检测血清中抗体的支原体感染症的诊断法，更进一步着眼于上述各脂质抗原对各支原体种的特异性，以使用上述脂质抗原制造有效的疫苗制剂为目标，继续进行研究。 
从以往盛行的研究开发稳定的疫苗制剂用载体，在开发将免疫原涂覆在粒子表面的疫苗组合物等(专利文献17)的同时，也在开发利用脂质体作为载体，将抗原蛋白或各种过敏原等借助疏水性肽等结合在脂质体膜表面的脂质体制剂作为诊断用或疫苗用制剂使用的技术(专利文献18～20)。此外，已知使用结合了抗原的磷脂制成的脂质体确认具有T细胞活化剂作用的例子(专利文献21)。相反，抗原为磷脂抗原时，虽用作为脂质体膜构成成分进行吸收，利用与抗体的反应和通过补体作用使脂质体被破坏的性质的抗体检测法(补体依赖性脂质体溶解检测)，但只限用于磷脂抗原的抗体筛选或诊断(专利文献22、非专利文献4)。 
本发明人等着眼于支原体在细菌中为最小、几乎无细胞壁、细胞膜结构简单且细胞膜的主要成分为脂质膜这些方面，考虑对纯化的特异性脂质抗原进行稳定且均一的脂质体粒子化。联想到只要是上述脂质体粒子，作为支原体样粒子在与活体免疫系统作用时，就有引起与支原体感染相同的免疫应答的可能性。 
本发明人等除了分别将肺炎支原体及发酵支原体2种的脂质抗原的化学合成品进行纯化，并研究各种脂质体成形法的基础上，在稳定的脂质体粒子化方面也取得成功。此外，成为猪支原体症原因的猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)及猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)的特异性脂质抗原分离、纯化后，用同样的方法可将脂质体粒子化。进一步地，以支原体细胞膜脂质构成成分的解析结果，与特异性脂质抗原一起，还模拟至构成模拟粒子的脂质成分的脂肪酸组成，制成最简单的功能性粒子。 
使用由此制作的支原体样粒子，对各种模型实验动物进行免疫，可确认任何一种粒子都具有诱导强的免疫应答的疫苗效果。特别是，使脂 质成分与支原体细胞膜构成成分一致且将粒径进行均一调整的支原体样粒子具有高的免疫诱导活性。 
从进行支原体样粒子活性分析的结果表明，虽为非常简单的构成成分，但可充分反映支原体免疫学的活性，并且稳定。包括脂质抗原以外的磷脂或胆固醇等脂肪酸部分，通过基于支原体成分分析的构成成分，更准确地反映活体内对于支原体的免疫应答。 
以往利用脂质体的疫苗是使构成脂质体的脂质与蛋白、肽、糖等结合并同时混入脂质体内，由于脂质抗原即为脂质体的构成成分，因此本发明的脂质抗原细菌样粒子完全是非常简单的粒子，具有稳定、毒性小、安全性也高的特点。 
此外，可确认呈现作为佐剂的作用效果(非专利文献33)。可确认以本发明的特异性脂质抗原为基础的免疫诱导活性不只诱导IgG及IgM，还诱导粘膜性的IgA，强烈显示作为粘膜性免疫用佐剂的可利用性。 
对于支原体以外的各种病原性细菌，本发明人等也适用支原体特异性脂质抗原的研究方法，确认存在各个特异性脂质抗原。使用上述特异性脂质抗原，可制成诱导对各细菌种具有特异性活性的细菌样粒子。而且，上述细菌类各自的构成细胞膜的脂质成分的脂肪酸组成不同，根据对各细菌的脂质成分分析结果，应用支原体的最优化方法，设定最适当的脂质体的组成及粒径，可制造各细菌的细菌样粒子及使用上述粒子的疫苗。 
由以上观点而完成本发明。 
即，具体而言，本发明为如下所述。 
[1]一种细菌样粒子，其特征在于，所述细菌样粒子由脂质体粒子制成，所述脂质体粒子含有1种或多于1种的病原性细菌特异性脂质抗原作为构成脂质体的脂质成分(liposome-consitituting lipid component)。 
[2]一种支原体样粒子，其特征在于，所述支原体样粒子由脂质体粒子制成，所述脂质体粒子含有1种或多于1种的支原体特异性脂质抗 原作为构成脂质体的脂质成分。 
[3]如上述[2]记载的支原体样粒子，其中，前述支原体特异性脂质抗原的至少1种是从支原体菌体配制物提取后，经分离纯化的支原体特异性糖脂。 
[4]如上述[2]记载的支原体样粒子，其中，前述支原体特异性脂质抗原的至少1种是在化学合成或酶合成后，经分离纯化的特异性糖脂。 
[5]如上述[2]～[4]中任一项记载的支原体样粒子，其中，前述支原体特异性脂质抗原的至少1种为肺炎支原体特异性脂质抗原或发酵支原体特异性脂质抗原。 
[6]如上述[2]～[5]中任一项记载的支原体样粒子，其特征在于，作为前述构成脂质体的脂质成分，进一步含有磷脂酰胆碱、磷酸甘油及/或胆固醇。 
[7]如上述[2]～[6]中任一项记载的支原体样粒子，其中，将含有前述支原体特异性脂质抗原的构成脂质体的脂质成分在溶剂中混合后，通过超声波处理，以使粒径在30～300nm范围内、且粒子的80％以上在40～200nm范围内的条件下进行粒子化。 
[8]如上述[2]～[7]中任一项记载的支原体样粒子，其特征在于，所述支原体样粒子为使其他抗原性物质存在于前述脂质体粒子表面的支原体样粒子，通过前述支原体特异性脂质抗原的佐剂效果，提高所述其他抗原性物质的抗原性。 
[9]如上述[8]记载的支原体样粒子，其中，前述其他抗原性物质为源自病毒的抗原肽。 
[10]一种支原体感染症的预防或治疗用疫苗，其中，含有如上述[2]～[7]中任一项记载的支原体样粒子作为有效成分。 
[11]如上述[10]记载的支原体感染症的预防或治疗用疫苗，其中，前述支原体感染症为肺炎、哮喘或风湿性疾病。 
[12]一种支原体感染症的预防或治疗方法，其特征在于，包含对于罹患或疑似罹患支原体感染症的人类或动物至少给予1次如上述[10] 或[11]记载的支原体感染症的预防或治疗用疫苗的步骤。 
[13]如上述[12]记载的支原体感染症的治疗方法，其特征在于，在使用前述疫苗治疗支原体感染症的治疗方法中，在给予前述疫苗之前及/或之后，设置测定支原体种特异性脂质抗原量或该脂质抗原特异性抗体量的步骤，并包含根据该测定值的大小决定下次疫苗给药时机及给药量的步骤。 
[14]一种病毒感染症的预防或治疗用疫苗，其特征在于，将如上述[9]记载的、在粒子表面存在源自病毒的抗原肽的支原体样粒子作为有效成分。 
[15]如上述[14]记载的疫苗，其中，前述病毒为流感病毒，前述病毒感染症为流感。 
[16]一种病毒感染症的预防或治疗方法，其特征在于，包含对于罹患或疑似罹患病毒感染症的人类或动物给予如上述[14]或[15]记载的病毒感染症的预防或治疗用疫苗的步骤。 
[17]如上述[16]记载的预防或治疗方法，其中，前述病毒为流感病毒，前述病毒感染症为流感病毒感染症。 
细菌样粒子，其特征在于，该细菌样粒子由脂质体粒子制成，所述脂质体粒子含有病原性细菌特异性脂质抗原作为构成脂质体的脂质成分。 
本发明的支原体样粒子等细菌样粒子可提供作为粒径均一的稳定的脂质体制剂。将上述细菌样粒子给予人类或猪等哺乳动物，可高效率地诱导强的体液性免疫和细胞性免疫，且粘膜性免疫的IgA诱导活性也高，不仅可作为支原体感染症用的疫苗制剂使用，还可作为病毒或其他病原微生物感染症用疫苗的佐剂、IgA诱导性佐剂使用。上述疫苗制剂、佐剂制剂无毒性，可提供安全且稳定的制剂，因而非常有用。此外，尤其为IgA诱导性佐剂时，由于作为现有的有效性高的佐剂，只有如金属铝这样高毒性的佐剂，因而具有非常划时代的意义。 
对于人类的支原体感染症，根据本发明人等以前的研究，也建立对 所有成为该感染症原因的发酵支原体及肺炎支原体的诊断方法，根据本发明提供的疫苗制剂，可建立以支原体感染症的病理分子机制为基础的诊断系统、预防系统和治疗系统。 
附图说明
图1为支原体感染与疾病关联的概念图。 
图2为支原体感染症的急性症状及慢性化。 
图3为细菌样粒子(支原体样粒子)的概念图。 
图4脂质体粒径的质量管理(C)为根据粒度测定仪(zetasizer)的脂质体粒径的测定值。 
图5源自经纯化的发酵支原体的抗原脂质GGPL-I及GGPL-Ⅲ的定量分析。 
图6为各种细菌脂质成分的比较：在大肠杆菌、绿脓菌、肺炎球菌、肺炎杆菌、流感嗜血杆菌及军团菌(Legionella)中，可确认特异性脂质的存在。 
图7为使用肺炎支原体样粒子诱导IgG和IgM抗体。 
图8为通过使用发酵支原体样粒子(合成GGPL-Ⅲ)的SKG系统小鼠(自体免疫疾病模型)的腹腔内免疫，诱导IgG及IgM抗体。 
图9为使用发酵支原体活菌制作动物模型。通过对经气管模型及经膝关节模型的兔子给药实验，观察血中IgG抗体效价的上升(疫苗活性)。 
图10为对使用发酵支原体样粒子的动物模型的合成脂质抗原免疫功能引发效应(priming effect)。对于发酵支原体感染风湿性关节炎模型的兔子，在腹腔内以发酵支原体样粒子进行多次免疫，可抑制关节病变。 
图11为源自风湿性关节炎患者的滑膜细胞内的发酵支原体脂质抗原(GGPL-Ⅲ)的分布。 
图12为幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的脂质抗原及干扰素-γ诱导活性。 
图13为源自动物的支原体(猪鼻支原体及猪肺炎支原体)特异性脂质抗原的检测。 
图14为发酵支原体特异性脂质抗原(GGPL-Ⅲ)的佐剂效果。左图为先在小鼠耳朵同时给予金属镍(抗原)及发酵支原体样粒子(GGPL-Ⅲ)，确认是用量依赖性(给予0.2mg/mL及1mg/mL)的提高抗体产量的效果。 
图15表示含有支原体肺炎的呼吸系统疾病的患者血清中的血清抗体效价：根据使用肺炎支原体特异性抗原GGL Glc-型的ELISA法测定IgA的结果。确认在人类血清中可诱导IgA抗体，确认作为粘膜免疫佐剂。 
图16支原体样粒子的细胞免疫活性。使用人类的末梢血单核细胞，比起单独给予白介素-2时，在加入支原体样粒子(GGPL-I、GGPL-Ⅲ)时，确认干扰素-γ的产量增加2倍以上。从健康人的末梢血分离单核细胞，培养在其中加入白介素-2及脂质抗原的样品及未加入上述物质的样品，回收上清液，用酶抗体免疫法(ELISA法)测定该上清液中干扰素-γ的量。 
图17为年轻风湿性关节炎患者的肺炎支原体及发酵支原体抗体效价的测定结果(ELISA法)。 
图18为结节病(sarcoidosis)患者的肺炎支原体及发酵支原体抗体效价的测定结果(ELISA法)。 
图19为多发性硬化症患者血清抗体的变化。 
图20为小儿肺炎支原体的诊断-预防-治疗方案。 
图21为成人肺炎支原体的诊断-预防-治疗方案。 
图22为自体免疫疾病等慢性支原体感染症的诊断-预防-治疗方案。 
图23为支原体样脂质体粒子组成的研究。 
图24为支原体样脂质体粒子给药法的最优化。 
图25为支原体特异性脂质抗原(GGL)的定量(质谱分析法)。 
图26为沉淀于风湿性关节炎患者关节组织的发酵支原体特异性脂质抗原GGPL-Ⅲ的检测(通过质谱分析装置)。 
图27为从被检患者的咽拭子鉴定肺炎支原体特异性脂质抗原峰。 
具体实施方式
1.关于支原体感染症 
已知支原体会感染人类、家畜甚至宠物等动物，引起种种疾病。尤其对于人类，支原体不仅为肺炎的原因，也是以下疾病的原因：哮喘(非专利文献6、7)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)(非专利文献8)等呼吸系统疾病、风湿性关节炎等风湿性疾病(非专利文献9、10)、多发性硬化症(非专利文献11)或肌萎缩侧索硬化症(ALS)(非专利文献12)/格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)等神经疾病、溶血性贫血(非专利文献13)等血液疾病、异位性皮肤炎等过敏性疾病、动脉炎/动脉硬化/川崎病(非专利文献14)等心血管疾病或慢性疲劳综合征(CFS)(非专利文献15)/纤维肌痛症(FMS)(非专利文献16)等精神疾病、海湾战争综合征等。 
支原体感染被认为造成哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、多发性硬化症、风湿性疾病等慢性顽固性疾病最有力的候选原因。但是，尚未确立追踪慢性疾病发展经过的特异性定量性诊断法及治疗法，所以不能充分表明与病情的关联，不能进行适当的治疗。(图1) 
支原体感染有从发热、咳嗽、肺炎等感冒症状开始发病，转变为哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、多发性硬化症、风湿性疾病的病例(非专利文献17、18)。已知此时症状反复复发、恶化，进而转变为慢性疾病。由于以往的检查方法不容易把握支原体感染的诊断或治疗经过而不能详细了解病情，因此，现状为大量患者不能受到适当治疗。(非专利文献19)(图2) 
已知猪、牛等家畜的支原体感染症也会引起严重的疾病。例如，猪鼻支原体或猪肺炎支原体为猪呼吸系统感染症的致病菌之一，牛支原体(Mycoplasma bovis)为牛呼吸系统感染症的致病菌之一。 
2.关于支原体特异性抗原脂质 
(2-1)病原性支原体特异性脂质抗原的种类 
作为人类病原性支原体，现在已知有肺炎支原体及发酵支原体，本发明人等将各个支原体特异性脂质抗原中的2种分别分离纯化，确定结构后进行化学合成(专利文献1～8、非专利文献20～27)。具体而言，肺炎支原体有GGL Glc-型及GGL Gal-型2种，发酵支原体有GGPL-I及GGPL-Ⅲ2种。 
已知猪、牛等家畜的支原体感染症也会引起严重的疾病。例如，在猪中，猪鼻支原体或猪肺炎支原体引起猪支原体肺炎等呼吸系统感染症；在牛中，牛支原体引起牛支原体肺炎等呼吸系统感染症或支原体乳腺炎等疾病。这次，也将猪鼻支原体或猪肺炎支原体各自的特异性脂质抗原分离纯化，进行脂质体粒子化(图4)，对所获得的支原体样粒子进行免疫活性评估实验，确认其免疫活性效果(图13)。 
(2-2)支原体特异性脂质抗原的制造方法 
本发明中所谓“支原体特异性脂质抗原”，可为从对象支原体的膜分离纯化的该支原体特异性脂质抗原，优选使用在该脂质的化学结构式为已知的情况(GGPL-I、GGPL-Ⅲ、GGL Glc-型或GGL Gal-型等)或使用根据下述(2-3)的方法确定结构后进行化学合成、纯化的脂质化合物(专利文献1～8)。例如，另外，可确定对象支原体的特异性脂质合成酶，使用该酶本身或将该酶基因进行克隆，使用转化细胞，可大量获得作为其酶合成品的特异性脂质抗原(非专利文献28)。 
以下，对于典型的发酵支原体特异性脂质抗原GGPL-Ⅲ的提取、分离纯化、确定结构等制造方法进行详细叙述。这些方法不仅适用于其他支原体特异性脂质抗原，也在微生物上适用于衣原体、立克次氏体、结核杆菌、肺炎球菌等其他病原性细菌的特异性脂质抗原的提取、分离纯化、结构确定。 
(2-3)支原体特异性脂质抗原的分离、纯化、结构确定 
以下，将源自发酵支原体特异性脂质抗原(GGPL-Ⅲ)的例子作为典型例进行说明(根据专利文献3等的方法)。 
(1)糖脂的分离、纯化 
用PPLO培养基按照以下的方法培养支原体。加入10％牛血清、10％青霉素、0.0002％酚红及1％葡萄糖的PPLO液体培养基(Difco社制造)中，37℃进行培养。根据培养基pH值的变化确认微生物的增殖后，以16,000×g离心分离1小时。重复该操作一次，作为脂质提取用的样品。对200L(湿润状态的容量)的微生物样品用氯仿与甲醇的混合溶剂提取脂质成分。 
(2)脂质的提取(GGPL-Ⅲ) 
将样品悬浮在甲醇中溶解4小时，加入两倍量的氯仿，用超声波将菌体粉碎，再放置4小时。以3000rpm离心，回收上清液，浓缩，作为脂质成分样品。 
将该脂质样品通过填充硅胶的柱层析色谱法，使用氯仿及甲醇进行分离、纯化。通过薄层层析色谱法(TLC)将脂质样品展开，用苔黑酚试剂染色、纯化，获得目标糖脂成分。 
(3)NMR分析 
将获得的脂质成分溶解于DMSO-d6∶D2O＝98∶2溶液，于60℃测定1H-NMR。获得在100％DMSO-d6中测定的DQF-COSY光谱归属的数据。 
(4)质谱分析 
对获得的脂质成分通过ESI-MS测定进行分析。 
(5)结构确定及化学合成 
将上述(3)、(4)的数据一起进行糖脂大致的结构确定，为了确定结构，通过化学合成，以立体选择性及位置选择性合成各个骨架。 
(6)通过与化学合成品的数据比较，确定结构 
将获得的化学合成品与天然物在相同的DMSO-d6∶D2O＝98∶2、60℃的条件下进行1H-NMR测定、分析、比较该光谱。从合成品的光谱与天然物的光谱一致的结果，确定绝对结构。 
(2-4)酶合成法(根据非专利文献28的方法) 
检索对象支原体的数据库，使用作为候选的脂质合成酶基因，通过转化大肠杆菌大量合成，确定对象的特异性脂质合成酶。也可使用该合成酶本身获得酶合成品；或可使用该合成酶基因，在经转化的转化细胞内进行酶合成，在培养基内获得大量的特异性脂质抗原。 
3.关于本发明中的细菌样粒子作为对象的细菌 
在本说明书中，所谓“支原体样粒子”是指将支原体各菌种的特异性脂质抗原加以纯化，将纯化的脂质抗原单独作为脂质体粒子或与其他磷脂或胆固醇等脂质混合的脂质作为脂质体粒子，且在感染该支原体的生物体内的免疫系统中，可引起免疫应答的脂质体粒子。 
同样地，所谓“细菌样粒子”是指将病原性细菌各菌种的特异性脂质抗原加以纯化，将纯化的脂质抗原单独作为脂质体粒子或与其他磷脂或胆固醇等脂质混合的脂质作为脂质体粒子，且在感染该病原性细菌种的生物体内的免疫系统中，可引起免疫应答的脂质体粒子。 
本发明的细菌样粒子中使用的细菌，典型的是实施方式所使用的支原体，但是，不仅限于支原体，同样地，只要是在细胞表面具有特异性抗原脂质的细菌类，即可将该特异性抗原脂质分离纯化，在脂质体表面呈递而制造细菌样粒子。上述细菌类中，特别适用于大小或细胞表面结构与支原体类似的军团菌等立克次氏体或衣原体等。此外，只要该特异性抗原脂质可分离纯化并确定结构，就可进行化学合成，或可将该抗原脂质合成酶的基因进行克隆而进行酶合成。 
该方法适用于其他的幽门螺旋杆菌、衣原体、立克次氏体、结核杆菌、肺炎球菌等病原性细菌，同样地，可制成脂质抗原粒子加以利用。图6为各种细菌的脂质成分的比较，确认了大肠杆菌、绿脓菌、肺炎球菌、肺炎杆菌、流感嗜血杆菌和军团菌等各种菌的特异性脂质。具体而言，将各种菌大量培养，用氯仿-甲醇分离，用薄层层析色谱法展开。展开后用苔黑酚硫酸染色，检测。 
此外，还已知在幽门螺旋杆菌中存在有特异性脂质抗原，可使用支原体的上述分离纯化方法，取得纯化的特异性脂质抗原，以与支原体样 粒子制作方法相同的方法制作幽门螺旋杆菌样粒子。可确认该粒子在C57BL/6小鼠的骨髓细胞的干扰素-γ的诱导活性(实施例13，图12)。此情况证实，关于本发明支原体样粒子的观点也适用于幽门螺旋杆菌等其他细菌。 
4.细菌样脂质体粒子的制作方法 
(4-1)关于脂质体 
“脂质体”为在内部含有水相的磷脂双层的微泡，将脂质在相转移温度以上用足量的水进行水合而形成，以该脂质双层的数目为基础进行分类时，分为由多个脂质双层形成的多层脂质体(MLV)及由单一脂质双层形成的单膜脂质体，后者进一步以大小为基础，分为小单层脂质体(SUV)、大单层脂质体(LUV、REV)及巨脂质体(GUV)。在本说明书中，称为脂质体或脂质体粒子时，是指由单一脂质双层形成的小单层脂质体(SUV)，直径在数百纳米以下。在本说明书中，最适当的脂质体粒径依对象细菌而异，优选在数十至数百纳米范围内，尽可能为均一的粒径。例如对于支原体，最好集中在约40～200nm的范围。 
由于构成脂质体的磷脂是生物膜的主要构成成分，具有以下优点：毒性低；可根据给药目的、方法而控制粒子大小；以及通过在脂质体粒子表面导入官能基，可在脂质体中导入抗原、抗体、糖链等；可对目标部位进行靶向(目标指向化)。因此，广泛进行了利用这些优点的制剂学研究(专利文献23至26)。在本发明中以脂质体粒子化的细菌样粒子作为佐剂使用时，上述方法为可利用的技术。 
(4-2)含有脂质抗原的脂质体粒子的分析法(图5) 
为了以本发明的支原体样粒子等细菌样粒子作为疫苗给药，在粒径及组成方面，有必要总是以一定的稳定质量来提供细菌样粒子。因此，脂质体粒子的粒径测定及组成分析法的建立是重要的。 
在本说明书中，利用HPLC进行脂质体粒子的组成分析。通过该HPLC分析时，使用的检测器并无特别限制，可使用紫外线吸收检测器或蒸发光散射检测器(以下，称为ELSD)等。其中，从可将如脂质等非挥发性成分以高灵敏度检测、可高精密度定量的观点而言，以使用蒸 发光散射检测器(ELSD)较佳。 
若使用HPLC进行脂质体的组成分析，则依据所使用色谱柱种类、使用的溶剂种类及流速，脂质体中的成分显示特有的保留时间(样品在色谱柱内滞留的时间)。由此可研究各成分的组成。可将以HPLC溶出的各成分定量。使用具有检测器为ELSD或质谱分析仪的HPLC，可将脂质体成分以高灵敏度、高精确度且简便地进行组成分析，也可同时进一步进行正确的定量(图5)。在实际的生产步骤中，质量管理通过HPLC进行分析，可确保稳定的质量。 
(4-3)本发明特异性脂质抗原的脂质体化方法 
已知脂质体的制作本身有许多方法[D.W.Deeamer，P.S.Uster，“Liposome”M.J.Ostro编著，Marcel Dekker Inc.N.Y.巴塞尔，1983，第27页]。通常为涡旋法及超声波法，除此之外，可适用乙醇注入法、醚法及逆相蒸发法等，也可将上述方法组合使用。 
例如，在涡旋法及超声波法中，将预定的脂质溶解于有机溶剂，例如甲醇、乙醇、氯仿或上述的混合物(例如甲醇与氯仿的混合物)之后，将该有机溶剂蒸发除去，获得脂质的薄层。接着，在该脂质薄层中加入水性介质，进行涡旋处理或超声波处理，形成脂质体。此时，在上述水性介质中混入作为疫苗等活性成分的所期望的抗原或免疫原，通过例如溶解或悬浊，可将该抗原或免疫原封入脂质体中。 
脂质抗原溶解于有机溶剂时，可将合成的脂质抗原与构成脂质体用的脂质一起，在脂质体制造过程溶解于如上述的有机溶剂后，根据常规方法形成脂质体。相对于脂质体的量，脂质抗原的量根据脂质抗原的种类、欲封入的脂质抗原以外的抗原种类、脂质体的组合结构等而不同，通常，相对于1mg构成脂质体的其他脂质，脂质抗原的量为5μg～500μg。 
用于制作本发明的支原体样粒子等细菌样粒子的脂质体制作法，在上述脂质体制作法中优选为超声波法。此外，本发明人等发现在先使用乙醇注入法基础上，配合超声波法更可制造均一性高且稳定的脂质体粒子。此外，用所期望的孔径的过滤器过滤，可调整粒径，可提供一定粒径的稳定、高质量的脂质体粒子。 
(4-4)本发明含有脂质抗原的脂质体粒子的最优化 
由于支原体特异性脂质抗原可单独形成脂质体粒子，作为脂质体粒子的脂质成分，只要是仅用支原体特异性脂质抗原形成的支原体样粒子在粒子化后马上给予活体内即引起强的免疫应答，可充分预期疫苗的活性，但是，由于粒径不均一、不稳定，所以不适合作为疫苗、佐剂、免疫调节剂或诊断用制剂。作为疫苗制剂等使用时，有必要通过改变构成脂质体的脂质构成比例或脂质体的大小，进行最优化，使合成脂质抗原的稳定化而更接近天然的效果、安全性高。脂质体的最适形态依该脂质体预期的效果而异，其效果是指作为药物传递系统(Drug Delivery System(DDS))的效果、抗原呈递、抗体诱导、佐剂效果等。 
基于支原体特异性脂质抗原的物理化学分析的基础数据，研究最适当的处理条件时，发现粒径以100nm左右的粒径最稳定，可长期保存，适合作为制剂效果稳定的制剂。即，在支原体样粒子中，进行被称为最适合的脂质体制剂粒子的最优化时，粒径可以在30～300nm的范围内，同时优选全部粒子的80％在40～200nm范围内的条件。 
另外，脂质体组成是使用支原体增殖中必需的胆固醇和作为基本构成成分的磷脂酰胆碱等磷脂(图23)。天然支原体的脂肪酸长度以碳原子数16的饱和型最多，其次为碳原子数18及碳原子数14，显示使用其中调配了碳原子数16合成抗原的结果。若仅用合成脂质抗原制作粒子，则大小或分布不均一，此外，改变胆固醇与碳原子数16的饱和型磷脂酰胆碱的比例，测定粒子体系及分布。从上述结果发现，作为摩尔比，优选脂质抗原为10～50％、磷脂酰胆碱为20～50％、胆固醇为10～50％。这些接近于支原体脂质分析数据的结果(非专利文献29)。 
在谈及支原体样粒子的最优化时，是指使它的脂质体组成，以摩尔比计，脂质抗原∶磷脂酰胆碱∶胆固醇的配合比例在10～50∶20～50∶10～50的范围内。同时使用的磷脂酰胆碱的碳原子数为14～18，优选为16，以饱和型的磷脂酰胆碱最适合。 
在支原体脂质抗原的鉴定、纯化过程中，膜脂质构成成分不复杂，是以磷脂酰胆碱、胆固醇及脂质抗原为中心的构成，此外，发现脂肪酸部分的组成也非常简单，考虑上述结果，制作稳定且有效果的支原体样粒子。
1.本发明细菌样粒子的特征 
实际的支原体感染为溶菌、吸收进细胞、呈递(脂质)抗原、产生抗体、引起T细胞或NKT细胞等的细胞免疫应答，而含有支原体特异性脂质抗原的支原体样合成脂质体粒子可诱导相同的反应。 
另外，有关该细菌样脂质体粒子，可根据各种目的功能，而变为最适的构成成分或大小。 
特别是，通过使用纯化合成脂质抗原，完全不受支原体以外的成分的影响，而成为非常特异性的免疫活化制剂。进一步优选脂肪酸的长度等最优化后的物质。由于构成成分简单，在抗体诱导、疫苗、佐剂、细胞免疫疗法等的各种用途中可成为最适合的制剂。为了观察合成脂质抗原的特异性疫苗效果，可使用纯化及合成脂质抗原、使用多个支原体种类或多个脂质抗原合成品来研究活性。 
脂质体的制成法是以合成的脂质抗原及支原体脂质解析为基础的、构成成分接近者为中心进行研究。以各个细菌的特异性脂质抗原为中心的构成成分制成脂质体，以该脂质体可制作具有各个细菌特征的免疫粒子。通过正确评估提升合成脂质抗原及抗体等制剂效果的方法，则有可能进行制剂的研究和实用化。非常接近支原体的免疫活性，且没有活疫苗这样的病原性复发、或灭活疫苗这样的不纯物或批次(lot)差异，毒性低。 
2.合成脂质抗原粒子的免疫活性的评估法 
(6-1)通过从腹腔内给予脂质抗原粒子，对抗体诱导活性进行定量 
在C57BL/6J小鼠(8周龄，雌性)的腹腔内4次腹腔内给予支原体脂质抗原粒子。从第1次给药至第3次给予抗原，在每次给药前进行部分采血。从第4次给予抗原经过4天后进行部分采血(血清)。通过涂覆有特异性脂质抗原的ELISA进行抗体的测定。使用二抗可测定IgM、IgG。此外，使用针对IgA的二抗，可测定IgA的产生， 即可测定粘膜免疫诱导活性。标识测定结果，即可进行脂质抗原的量、组成、形状、溶剂等的最优化。 
(6-2)通过从鼻腔内给予脂质抗原粒子，对抗体诱导活性进行定量 
在C57BL/6J小鼠(8周龄，雌性)鼻腔内4次鼻腔内给予支原体脂质抗原粒子。从第1次给药至第3次给予抗原，在每次给药前进行部分采血。从第4次给予抗原经过4天后进行部分采血(血清)。通过涂覆有特异性脂质抗原的ELISA进行抗体的测定。使用二抗可测定IgM、IgG。此外，使用针对IgA的二抗，可测定IgA的产生，即可测定粘膜免疫诱导活性。标识测定结果，可进行脂质抗原的量、组成、形状、溶剂等的最优化。 
(6-3)对人类通过脂质抗原粒子的诱导抗体的评估法 
发现根据支原体感染患者的血清中的抗体测定或抗体的变化可进行跟踪观察(图17、图18)，该方法可直接适用。此外，用采取的血液可测定支原体增殖抑制活性。 
(6-4)根据质谱的脂质抗原的检测、定量 
利用本发明人等开发的、使用质谱仪(质谱分析仪)的脂质抗原检测法(专利文献6)，可检测支原体的种特异性糖脂抗原本身并进行定量。具体而言，使用任意的离子化方法(EI法、ESI法、LSI法、FAB法、MALDI法等)离子化，依照通常质谱分析法的步骤获得质谱，可检测支原体的种特异性糖脂抗原，使用定量标准品也可进行定量。 
 例如，在发酵支原体的特异性糖脂抗原GGPL-I的情况下，在正离子模式下，测出在质荷比为924、896、658、640、420、402、328、310、184或104m/z的特有的离子峰，在负离子模式下，测出在质荷比为908、880、809、642、624、404、386、312、294及168m/z特有的离子峰。该峰中，896m/z的峰为GGPL-I的特征峰，因而确认896m/z的峰存在即可确认GGPL-I的存在。在想进行更正确地鉴定时，可确认上述多个峰存在。在发酵支原体的特异性糖脂抗原GGPL-Ⅲ的情况下，以正离子模式测出在质荷比184、239、1049或1077m/z，或以负离子模式测出在质荷比809、823、864、988、1047或1075m/z特有的离子峰。该峰 中，1049m/z的峰为GGPL-Ⅲ的特征峰，确认1049m/z的峰存在即可确认GGPL-Ⅲ存在。另一方面，肺炎支原体的特异性糖脂抗原GGL的正离子模式加钠即可清楚地观察，其特有的峰在质荷比185、202、347、363、405、497、525、659、687、915或943m/z的位置出现，负离子模式是在质荷比379、635、663、891或919m/z的位置出现。该峰中915m/z的峰为GGL的特征峰，确认915m/z的峰存在即可确认GGL存在。(注，此处的正离子模式为在质谱分析器用正离子将被检对象分子离子化的情况，负离子模式为用负离子进行离子化的情况)。 
欲将上述特异性糖脂抗原量进行定量时，合成上述GGPL-I、GGPL-Ⅲ及GGL Glc-型、GGL gal-型等特异性糖脂抗原的至少一种所对应的含重氢的糖脂，并配制浓度逐级变化的糖脂标准品。对于被检样品，加入各浓度的脂质标准品，测定质谱，将被检样品特征峰的峰高度与糖脂标准品特有峰的峰高度相比较，采用两者具有同等程度高的峰高度时的糖脂标准品浓度作为样品中的特异性糖脂抗原量。例如，在实施例15，从107cfu的培养肺炎支原体菌提取的特异性脂质抗原GGL量为将该特征峰的峰高度与定量标准品的浓度相比较，确定为小于50pmol、大于5pmol。 
由于实际上源自被检血液等的样品除脂质成分外，不仅含有极大量的蛋白质，还含有血细胞或其他细菌类等，所以必需进行前处理。具体而言，使用在甲醇、氯仿等有机溶剂中加入水的溶剂体系，以离心分离除去样品中大量含有的蛋白质，以含有脂质抗原的脂质成分作为下层进行提取。此外，可用使用硅胶等吸附载体的层析色谱法或使用对于作为目标特异性脂质抗原的抗体的亲和性色谱柱等进行分离纯化。 
利用具有液相色谱(LC)功能的质谱仪LC-MS，则可同时进行脂质抗原的分离及质谱测定。 
(6-5)通过质谱，跟踪观察脂质抗原量变化及给药量的最优化。 
将本发明的脂质抗原粒子作为疫苗给予支原体感染患者或感染动物后，经过一定时间后或是经时的用上述(6-4)的方法测定源自患者或动物的样品中的特异性脂质抗原量。注，在本发明中，“样品”为含 有从被检验者或动物采取的体液，例如全血、血浆、血清、关节液、髓液、唾液、羊水、腹水、胸腔积液、尿、汗、胰液、滑液等及组织、细胞等。由于用上述简单的测定法可将在血清等样品中残存的支原体脂质抗原直接检测及定量，具有可迅速了解疫苗对于患者的效果的优点。因此，跟踪观察脂质抗原量的经时变化，可正确评估对应于给药量、给药时机的支原体增殖抑制活性，而可决定之后最适当的治疗计划。 
即，给予含有本发明脂质抗原粒子的疫苗制剂，在通过质谱等跟踪观察脂质抗原量变化的同时进行治疗的方法，作为对于各个支原体感染患者的个别治疗方法而发挥作用。 
7.关于含有细菌样粒子的疫苗活性或佐剂活性 
(7-1)关于疫苗 
在本说明书中，“疫苗”的用语为可产生免疫应答的物质，包含因支原体感染的支原体感染症的预防疫苗及支原体感染症的治疗疫苗的宽泛含义。疫苗为经制剂化而给予人类、家畜、宠物类等动物的物质，制剂化或在给药时与以往的疫苗制剂相同，可适当使用药理学容许的各种赋形剂。 
(7-2)支原体样粒子的疫苗功能 
以往，支原体类等的病原性细菌用疫苗主要使用菌体提取成分或灭活疫苗等，最近也使用DNA疫苗或合成肽疫苗等。本发明使用的支原体样粒子制成的疫苗为将各支原体种特异性脂质抗原分离、纯化使用。尤其在使用以化学方法等合成与天然相同的物质时，因控制不纯物或安全性高而优选。 
向模型动物给予该支原体样粒子的结果确认疫苗具有可引起极高免疫应答的功能。尤其在实施例5中，对于风湿性关节炎模型兔子，预防性的预先给药时，获得抑制关节病变的突破性结果(图10)。 
此外，该特异性脂质抗原由于具有如下述(7-3)叙述的佐剂活性，因此具有无需使用副作用等问题多的佐剂的优点。 
(7-3)支原体样粒子的佐剂功能 
“佐剂”功能有提高树状细胞的抗原吸收及将树状细胞活化2种功能。 
成分疫苗(component vaccine)用佐剂已知有以下几种，例如将结核杆菌的死菌菌体与矿物油混合的弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)或弗氏不完全佐剂等使用矿物油的佐剂、磷酸化铝佐剂或将氢氧化铝作为主成分的铝佐剂(alum adjuvant)类无机佐剂等。 
现在佐剂功能效果好，且在多数疫苗中被认可的有效佐剂只有名为Alum的氢氧化铝凝胶，但副作用方面的问题多。因此正在寻求新的有效性高、副作用少的佐剂。 
本发明的支原体样粒子确认具有上述2种佐剂功能(图14、图16)，而有希望作为有效性高、副作用少的佐剂。 
预期对于接种的人或动物毒性更低，作为新的、无毒性的成分疫苗用的佐剂，可使用支原体合成抗原脂质。本发明含有脂质抗原的微生物样脂质体由于具有诱导免疫的佐剂活性、且毒性及自身的抗原性低，因此对于人类可作为疫苗等的抗原的佐剂使用。尤其是在该脂质体中，将作为目标的抗原或免疫原封入时，可获得强力的疫苗。理解到合成脂质抗原可有效地诱导免疫，因此脂质体制剂的佐剂活性可作为佐剂使用。 
此外，关于细胞性免疫佐剂，可采用小鼠的迟发型超敏(DTH)反应(TH1细胞负责)作为细胞性免疫的指标。目标佐剂可诱导DTH反应，所以，可作为如TH1细胞参与的病原体感染防御疫苗、该免疫疗法制剂或癌免疫疗法制剂的佐剂使用。本发明确认在支原体感染症患者的血清中诱导IgA，表明该抗原对于粘膜免疫起作用(图15)，尤其是成为使流感等粘膜免疫特异性活化的佐剂。 
除了体液免疫及细胞性免疫以外，免疫还有位于其中间位置的、以自然杀伤T细胞为代表的脂质抗原免疫。Alum诱导体液免疫较佳，但对于细胞性免疫则几乎无效(专利文献27)。在持续性的病毒或感染症中，细胞性免疫或自然免疫变得重要，但尚无对于上述免疫有效的佐剂。而本发明的支原体合成脂质抗原粒子具有该佐剂活性。 
8.支原体感染症用的预防或治疗用疫苗制剂及治疗用的方案 
(8-1)支原体感染症用的预防或治疗用疫苗 
借助模拟存在于支原体(微生物)的膜表面作用于免疫系统的形态而制成的含有脂质抗原的支原体样粒子，获得特异抗体的诱导或疫苗活性。 
使用对于2种肺炎支原体特异性脂质抗原及2种发酵支原体特异性脂质抗原的抗体测定法，对于慢性顽固性疾病(哮喘、COPD、多发性硬化症、风湿性疾病等)研究支原体感染与病情发展的关联性，选择以支原体感染为病因的患者。对于所选择的患者进行包括抗支原体药效果的支原体感染治疗。治疗法为脂质抗原疫苗、脂质抗原抗体疗法、脂质抗原关联的免疫疗法、脂质抗原减量的抗菌剂或中药、减轻脂质抗原作用的抗过敏剂或类固醇剂等，或上述组合的总称。此处提供使用ELISA法的诊断-治疗系统。 
(8-2)给药形态、给药方法 
关于给药方法，可对应支原体感染症的病情，使用ELISA法或以支原体脂质抗原作为基础的跟踪观察标识或诊断法把握病情而可进行选择。 
支原体样粒子疫苗的给药途径可为鼻腔内、皮内、皮下、肌肉内、腹腔内、静脉内或口服的任何一种。此时，可并用以往疫苗制剂使用的药理学上容许的稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、影响浸透压的盐、着色剂、醇、缓冲剂等赋形剂。本发明的疫苗可与其他的抗原成分混合使用，可并用公知的支原体用抗生素等的抗菌剂、抗炎症剂等药剂。 
另外，本发明的疫苗不仅可预期治疗效果，也可预期预防效果，在有被支原体感染危险时，预先给药，作为预防用疫苗也有效。 
(8-3)给药量 
本发明含有脂质抗原的细菌样粒子为可防御支原体感染的有效量(即，对于该感染诱导人类及动物免疫的量)，进行单次给药或反复给药。 
用于支原体感染症的预防及/或治疗用时，根据对象动物不同，给药量不同，每次特异性脂质抗原量在1μg～1000mg的范围内。对如小鼠这样的小型动物，1μg～200μg/次就十分有效，但给予人类时，则优选以100μg～100mg/次给药。此外，给药量、给药时机、给药次数、给药位置等给药方法等，根据各种用途，使用上述评估法等可使最优化。(例如图24) 
(8-4)评估方法 
如图17、图18所示，通过使用与支原体感染症有关联的患者所使用的相同ELISA法，将合成脂质抗原粒子作为疫苗给予后，测定血清中支原体特异性抗体效价，根据该效价的上升可判断有疫苗效果。此外，通过给予疫苗的治疗效果可用质谱直接定量测定支原体种特异性糖脂抗原量来进行评估。 
特别是对支原体感染患者或动物给予疫苗及/或其他支原体用药剂后经过一定时间，或在反复多次给药的同时，经时地用上述(6-4)的质谱分析法对源自患者或动物的样品(血清等)中的特异性脂质抗原进行检测及/或定量从而经时地跟踪观察脂质抗原量的变化方法，对于作为治疗对象的支原体感染患者或动物，可简单、迅速且正确地评估给予疫苗及/或治疗药剂的给药量、给药时机等治疗方法本身的效果，所以，可一边修改治疗计划，一边决定适合各个患者、动物的最适当的治疗计划。 
对于支原体感染症，慢性化且重症化的患者多，且并发合并症而不知是否起因于支原体感染的情况多，所以实际上是一边评估给予疫苗的效果、一边提出接下来的给药计划。以下列举具体的诊断、预防、治疗方案的例子。 
(8-5)小儿肺炎支原体的诊断-预防-治疗方案(图20) 
在小儿科支原体肺炎领域，预期借助早期特异性定量的诊断，在必需选择早期抗菌剂的情况下建立明确的治疗方针，且根据诊断法可适当的更换抗菌剂。 
通过将以支原体样粒子形式的脂质体作为预防疫苗给予，阻止支原 体感染，可预防以支原体为原因的小儿髓膜炎等严重疾病。此外，考虑川崎病(非专利文献30)等急剧发展的疾病的原因，上述情况可考虑抗体医药有效。 
(8-6)成人肺炎支原体的诊断-预防-治疗方案(图21) 
已明了支原体肺炎的原因有多种支原体参与，根据使用肺炎支原体及发酵支原体的种特异性脂质抗原的抗体测定法，研究慢性顽固性性疾病(哮喘、COPD、多发性硬化症、风湿性疾病、癌等)与支原体感染及病情发展的关联性，选择以支原体感染为原因的患者(图17、图18)。对于选择的患者进行包括抗支原体药效果的支原体感染治疗。使用ELISA法测定支原体的种特异性抗体效价或通过质谱仪等测定支原体的种特异性糖脂抗原量，根据该效价提出诊断-治疗系统，进一步提供以糖脂抗原作为抗体医药或疫苗应用的制剂。 
(8-7)自体免疫疾病等慢性支原体感染症的诊断-预防-治疗方案(图22) 
根据使用肺炎支原体及发酵支原体的脂质抗原的抗脂质抗原抗体测定法(ELISA法)或支原体种特异性脂质抗原量测定法(质谱分析法等)，一边进行慢性疾病的跟踪观察(诊断)，一边给予由本发明的支原体样粒子制成的疫苗制剂。 
(8-8)猪等家畜支原体感染症的诊断-预防-治疗(图13) 
能预防肺炎，同时提升收益效率。具有佐剂效果，有减轻矿物油等佐剂的使用量或不需使用矿物油等佐剂的可能性。对象为猪、鸡、牛、植物等，对种无限制。微生物为支原体、结核杆菌、衣原体等具有作为脂质抗原综合征的病原性等也考虑为同样的方法。 
现在市售的针对猪支原体肺炎的猪肺炎支原体疫苗有过敏样反应的休克或发烧引起精神不振的副作用的报告。上述疫苗由于使用含有多种成分的菌体，要鉴定原因物质很困难。此外，培养猪肺炎支原体菌体时使用的培养液大都为价格高的马血清或猪血清以及含有高蛋白成分多，除了制造成本高之外，数次接种上述蛋白含量高的疫苗，会使过敏等副作用的发生率变高。所以预期提供确定在猪肺炎支原体菌体构成成分中仅与形成肺病变有关的成分，仅由该成分所制成的疫苗(成分疫 苗)。对猪肺炎支原体的特异性细菌样粒子，只要是人工合成抗原，由于不含蛋白，就可开发便宜且安全的疫苗。 
9.细菌样粒子的其他用途 
本发明的支原体样粒子的免疫学功能为疫苗活性、抗体诱导活性、细胞性免疫诱导活性、佐剂活性、对巨噬细胞的吞噬活性、抗原呈递细胞的吸收或抗原呈递粒子的功能，可作用于与NKT细胞、T细胞、B细胞活化等免疫功能控制相关的作用机制，由于安全、稳定、有效，因此本制剂的用途很广。 
特别是引起肺炎或腹泻等的病毒(流感或轮状病毒等)或细菌大多从呼吸系统或消化系统等的粘膜进入活体内。只要可提高该进入通道粘膜的免疫应答，即可有效的击退上述微生物。可预期粘膜免疫即可诱导IgA的佐剂效果的本发明支原体样粒子，通过导入上述微生物的抗原进行免疫，可有效提高对于上述微生物抗原的免疫。同时，可预期对于支原体感染的疫苗效果。已知流感感染或肺炎球菌等与支原体同时感染，病情会恶化，而可利用作为安全性高的混合疫苗。 
此外，也可作为用于将抗菌剂、抗病毒剂等给予活体内的“DDS”用脂质体制剂使用。 
10.其他 
本发明中的其他用语或概念在发明实施方式的说明或实施例中有详细的规定。用语基本根据IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature或以在该领域惯用的用语的意义为基础。为了实施发明所使用的种种技术，除了明示该出处的技术外，以公知的文献等为基础，只要是本领域的技术人员，就可容易且毫无困难地实施。例如基因工学及分子生物学的技术可根据J.Sambrook，E.F.Fritsch&T.Maniatis，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版)”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约(1989)；D.M.Glover等编著，“DNA Cloning”，第二版，Vol.1-4，(The Practical Approach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，纽约，N.Y.1995；日本生化学 会编，「続生化学実験講座1、遺伝子研究法II」、東京化学同人(1986)；日本生化学会，「新生化学実験講座2、核酸III(組換えDNA技術)」、東京化学同人(1992)；R.Wu编著：Method in Enzymology”，Vol.68(Recombinant DNA)，Academic Press，纽约(1980)；R.Wu等编著，“Methods in Enzymology”，Vol.100(Recombinant DNA，Part B)&101(Recombinant DNA，Part C)，Academic Press，纽约(1983)；R.Wu等编著，“Methods in Enzymology”，Vol.153(Recombinant DNA，Part D)，154(Recombinant DNA，Part E)&155(Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，纽约(1987)等记载的方法、引用上述方法的文献记载方法或实质与上述同样的方法或改变法进行。此外，对于本发明使用的各种蛋白质或肽或编码上述蛋白质或肽的DNA可从已有的数据库(URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等)得到。 
实施例 
以下，通过所示实施例对本发明作更详细且具体的说明，但本发明不只限于以下例子。 
本说明书中引用的技术文献、专利文献及专利申请说明书中记载的内容作为本发明记载内容的参考。 
(实施例1)用于制作病原性支原体样粒子的预备实验 
(1-1)脂质体粒子粒径的最优化 
将从大量培养的猪肺炎支原体提取纯化的脂质15.46mg及市售品的高纯度胆固醇3.31mg(日油株式会社制造)用乙醇600μL溶解，将该溶液在60℃的恒温槽中加入8.5％蔗糖溶液3mL中，进行超声波处理3分钟(株式会社エスエヌデイ社制造的超声波洗净器US-104)，制作脂质体粒子。粒径以δ电位/粒径/分子量测定装置(MALVERN社制造ZETASIZER纳米系列(nano series))测定，集中在约100nm(图4)。 
(1-2)支原体样脂质体粒子组成的研究 
在一定量的合成GGPL-Ⅲ中，加入改变比例的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)(日油株式会社制造)及胆固醇(日油株式会社制造)，并以氯仿-甲醇溶液溶解，浓缩干燥。在干燥的样品中，加入细胞培养用培养基RPMI-1640(SIGMA制造)，于25℃用超声波处理40分钟。该样品的粒径用δ电位/粒径/分子量测定装置(MALVERN社制造ZETASIZER纳米系列)测定(图23)。
所用的磷脂酰胆碱的脂肪酸为使用天然支原体最典型的脂肪酸碳原子数16的饱和型脂肪酸，改变与胆固醇的比例，与支原体脂质抗原一起制成脂质体粒子，测定粒径及其分布。从上述结果导出，以摩尔比计，优选脂质抗原为10～50％、磷脂酰胆碱为20～50％、胆固醇为10～50％。这些接近于支原体脂质分析数据的结果(非专利文献29)。 
(1-3)脂质抗原的质量管理 
HPLC的测定是以色谱柱：Waters C4 1.0×150mm，流动相：100％甲醇，进样量：5μL，流速：0.05mL/分钟，温度：40℃(内部、外部)、检测器：蒸发光散射检测器(ELSD)，UV(215nm)的条件进行(全部为Waters社制造)。 
将各GGPL-Ⅲ浓度与其峰面积的关系制成曲线图的结果是，峰面积随GGPL-Ⅲ浓度依赖性地增大。将各标准曲线表示于图表。根据以上的结果，由于在ELSD中，其峰面积的动态范围广，在用HPLC分析检测GGPL-Ⅲ时，认为蒸发光散射检测器(ELSD)是适当的(图5)。 
质谱分析为将各样品溶解于氯仿∶甲醇(2∶1)溶液500μL中，将1μL用甲醇稀释10000倍。经稀释的样品1μL涂在靶上。进一步将基质溶液(2，5-羟基苯甲酸及三氟乙酸钠)1μL涂在靶上，用质谱分析装置(BRUKER社制造autoflex Ⅱ TOF/TOF)测定。根据质谱分析的结果说明脂质抗原的纯度很高(图5)。 
(实施例2)诱导肺炎支原体合成脂质抗原的抗体 
使用合成的肺炎支原体脂质抗原(GGL Glc-型)，用与实施例1(1-2)相同的方法配制肺炎支原体样粒子。此外，合成GGL Glc-型可用专利文献8等中记载的方法合成。 
使用该粒子免疫2只C57BL/6小鼠。具体而言，将含有该粒子的溶液100μL在小鼠腹腔内接种3次(第0天、第14天、第35天)，从该小鼠采血，用酶抗体免疫法(ELISA法)测定各个样品的IgG及IgM抗体效价。该结果如图7所示，在2只小鼠诱导出IgG及IgM抗体。 
该结果表示GGL Glc-型脂质体粒子作为支原体样粒子发挥作用，在体内诱导特异性抗体。 
(实施例3)通过发酵支原体样粒子(合成GGPL-Ⅲ)诱导特异性抗体 
在发酵支原体的合成GGPL-Ⅲ500μg中，加入1mL的生理盐水，进行超声波处理30分钟，形成脂质体粒子，将该粒子接种于慢性风湿性关节炎自然发病的小鼠模型SKG小鼠的腹腔内。在接种后第4天采血，用代谢抑制试验测定该血液的发酵支原体的发育抑制活性。 
该结果为，在小鼠血清中可特异性诱导对于支原体脂质抗原的抗体，尤其是IgG时，显示对应于稀释度的抗体效价。此外，确认抑制支原体的增殖(图8)。 
该结果表示GGPL-Ⅲ脂质体粒子作为支原体样粒子而发挥作用，在体内可诱导特异性抗体。 
(实施例4)制作发酵支原体感染症动物模型 
将发酵支原体活菌经气管接种于兔子(新西兰白兔，雌性，约2公斤)，制作肺炎模型兔子，又同样地经膝关节接种，制作风湿性关节炎模型兔子。实验1为在第0天单次接种109CFU/兔子的量，制作2只肺炎模型兔子、3只关节炎兔子。实验2为在第0天、第7天、第21天分别每次以109CFU/兔子的量接种3次，制作3只肺炎模型兔子、3只关节炎兔子。在上述模型兔子中，可观察到，6例中有4例血中的GGPL-Ⅲ的IgG抗体效价急速上升(图9)。 
该结果证明支原体不仅会引起肺炎，也会引起关节炎等多种慢性炎症性疾病(图1)。此外，实施例5中，将同样制造的模型兔子用于疫苗活性的评价。 
(实施例5)对发酵支原体感染症动物模型的疫苗效果 
使用与上述实施例1(1-2)相同的方法，使用合成的发酵支原体脂质抗原(GGPL-Ⅲ)，配制发酵支原体样粒子。 
与上述实施例4相同，制作发酵支原体感染风湿性关节炎模型，对上述兔子预先在腹腔内通过4次的发酵支原体样粒子进行免疫的情况下，抑制发酵支原体感染风湿性关节炎模型的关节病变。由此证明，合成的GGPL-Ⅲ发酵支原体脂质抗原粒子可成为疫苗等的免疫治疗药。上述效果相当于合成脂质抗原免疫功能引发效应(图10)。 
该结果显示，本申请的支原体样粒子(GGPL-Ⅲ)可成为因支原体感染引起的风湿性关节疾病的预防疫苗。 
(实施例6)源自风湿性关节炎患者的滑膜细胞内发酵支原体的脂质抗原(GGPL-Ⅲ)的分布：(图11) 
方法1：免疫染色从风湿性关节患者分离滑膜细胞，抗GGPL-Ⅲ抗体及阴性对照以小鼠IgM进行染色。 
方法2：免疫电子显微镜从风湿性关节患者分离滑膜细胞，以抗GGPL-Ⅲ抗体作为一抗，以附有金胶体的IgG及IgM作为二抗，进行GGPL-Ⅲ的检测。 
(根据非专利文献31的方法) 
用免疫染色法的结果(A～D)、用免疫电子显微镜的结果(E)，在风湿性关节炎患者的滑膜细胞内，均观察到发酵支原体特异性脂质抗原(GGPL-Ⅲ)显著量地增加。 
该结果表示，在支原体感染症中，脂质抗原被吸收进免疫细胞中，转运到粗面内质网后参与抗原呈递(非专利文献31)途径。从抗原呈递细胞进一步产生诱导特异性B细胞的抗体。在T细胞或脂质抗原诱导特异性反应的NKT细胞。 
(实施例7)使用支原体呼吸系统疾病患者血清中肺炎支原体特异抗原GGL Glc型测定IgA 
使用以合成的肺炎支原体GGL Glc-型作为抗原的ELISA，测定支原体呼吸系统疾病患者血清中的IgA。在支原体呼吸系统疾病患者的血 清中，确认针对肺炎支原体GGL Glc-型的IgA抗体。由此暗示肺炎支原体GGL Glc-型可成为粘膜免疫佐剂。 
在免疫应答中，IgA为从粘膜免疫系统产生的抗体的亚型。所以，诱导针对其抗原的IgA显示对于粘膜免疫系统起其抗原的作用。在人类，显示诱导针对支原体特异性脂质抗原的IgA抗体的结果为本发明的支原体样粒子在粘膜免疫方面显示强的作用。若认为具有作为支原体样粒子免疫功能的佐剂作用(实施例10)，则将成为对流感感染等特异性活化有效的粘膜免疫的佐剂。 
(实施例8)支原体样粒子的细胞免疫活性 
从健康人的末梢血中分离单核细胞，培养加入白介素-2及支原体样粒子(GGPL-1或GGPL-Ⅲ)的样品和未加入上述物质的样品，回收其上清液，用酶抗体免疫法(ELISA法)测定该上清液中干扰素-γ的量。 
该结果确认，加入支原体样粒子(GGPL-1、GGPL-Ⅲ)时，较白介素-2单独给药时，干扰素-γ的产量增加2倍以上(图16)。 
该结果显示，本发明的支原体样粒子(GGPL-1和/或GGPL-Ⅲ)具有细胞免疫诱导活性。 
(实施例9)研究支原体样粒子疫苗有效的疾病 
(9-1)根据ELISA法测定年轻性风湿性关节炎患者的肺炎支原体及发酵支原体的抗体效价(图17) 
该患者有感冒症状。1至2个月后出现手指关节疼痛及变形，3个月后到医院门诊，诊断为年轻性风湿性关节炎。接受口服药治疗，手指关节的疼痛逐渐减轻。根据ELISA法测定该年轻性风湿性关节炎的初期患者约半年之间的肺炎支原体及发酵支原体的抗体效价。其结果为，发酵支原体特异性GGPL-Ⅲ的IgM抗体明显上升，证明与发酵支原体的感染有关。此外，根据其他的检查结果，用以往的支原体CF法检测的结果为8倍，否定为支原体感染，但从血液中在PCR检测发酵支原体，确认血液中存在发酵支原体感染。 
从以上的结果证明，在年轻性风湿性关节炎患者的发病初期，实际 上存在以发酵支原体感染是其原因的患者。对于上述患者，测定GGPL-Ⅲ抗体效价，确认感染，尽可能在早期给予本申请的支原体样粒子(GGPL-Ⅲ)疫苗是有效的。即，对原因不明的年轻性风湿性关节炎患者一部分有可能进行原因特异性的治疗，成为可突破性根治的治疗法。(9-2)根据ELISA法测定结节病患者肺炎支原体及发酵支原体的抗体效价结果 
以同样的方法测定肺炎支原体及发酵支原体的抗体效价(图18)。 
该患者因膝盖疼痛到医院就诊。确认两侧性肺门淋巴节肿胀，诊断为结节病。此时，用以往的检查法支原体PA法为160倍，认为与支原体感染有关联的可能性。通过使用含有对支原体感染有效的抗生素治疗，虽然持续膝关节不疼痛的状态，但是从平成18年(2006年)5月起膝关节疼痛复发。用支原体PA法为80倍，虽然抗体效价比前次的降低，但与前次相同，通过含有对支原体感染有效的抗生素治疗，膝关节的疼痛减轻。症状复发时，对发酵支原体特异性GGPL-Ⅲ的IgG抗体明显上升，在通过治疗症状减轻的同时其抗体效价也降低，证明与发酵支原体的感染症有关。 
同样地，从上述结果看到，该复发的结节病患者中可证明发酵支原体感染是其原因。对于该患者，给予本申请的支原体样粒子(GGPL-Ⅲ)疫苗可预期有效。 
(9-3)多位多发性硬化症患者血清中肺炎支原体(GGL Gla-型)的IgG及IgM抗体效价的变化(图19) 
测定多发性硬化症患者血清中GGL Gal-型抗体(IgG及IgM)的抗体效价。从该结果看到，在多发性硬化症患者中，可证明实际上肺炎支原体感染为其原因。由于可诱导对于肺炎支原体特异性脂质抗原的抗体，证明对该脂质抗原有疫苗活性。对于多发性硬化症，其症状的恶化及减轻在一年中反复数次，以年为单位渐渐恶化，为顽固性病，但对于该患者，可预期通过给予由本申请的脂质抗原细菌样粒子制成的支原体样粒子(GGL Gal-型)疫苗等的治疗效果为有效。 
(实施例10)通过合成的支原体脂质抗原产生干扰素-γ 
从健康人的末梢血分离单核细胞，培养向其中加入白介素-2及合成的发酵支原体脂质抗原GGPL-Ⅲ的样品和未加入上述物质的样品，回收其上清液，用酶抗体免疫法(ELISA法)测定该上清液中干扰素-γ的量并比较。在人类末梢血单核细胞中，相比未加入脂抗原的样品，加入白介素-2与脂质抗原的样品干扰素-γ的产量显著增加(图16)。该结果表示，本申请的支原体样粒子(GGPL-Ⅲ)具有细胞免疫诱导活性。 
(实施例11)发酵支原体特异性脂质抗原(GGPL-Ⅲ)的佐剂效果(图14) 
如图14(A)所示，将金属镍(抗原)同时与发酵支原体样粒子(GGPL-Ⅲ)给予小鼠的耳朵，确认是用量依赖性(给予0.2mg/mL及1mg/mL)的、具有提高抗体产量的效果。图14(B)表示发酵支原体样粒子(GGPL-Ⅲ)具有与LPS同等的细胞免疫活性。此外，具有增强抗原活性的佐剂活性。由LPS开发的LipidA虽开始作为佐剂使用，预期支原体脂质抗原也作为佐剂。 
(实施例12)使用猪肺炎支原体的特异性纯化脂质抗原的支原体样粒子的疫苗效果 
大量培养猪鼻支原体及猪肺炎支原体，用氯仿-甲醇加以分离，将上述用薄层层析色谱法(氯仿∶甲醇∶0.2％氯化钙＝55∶45∶10)展开。展开后，用苔黑酚硫酸以免疫染色法进行染色后检测(图13)。 
如图4所示，制作使用纯化脂质抗原的猪肺炎支原体样粒子，在小鼠的腹腔内进行3次免疫。在最后接种后的第4天采血，用代谢抑制试验测定该血液的支原体发育抑制活性。其结果确认抑制支原体的增殖。 
(实施例13)幽门螺旋杆菌的特异性脂质抗原及其检测(图12) 
大量培养幽门螺旋杆菌，用氯仿-甲醇加以分离，将其用薄层层析色谱法展开(氯仿∶甲醇∶0.2％氯化钙＝60∶28∶3)。 
展开后，用磷酸钼染色并以使用苔黑酚硫酸的免疫染色检测特异性脂质抗原，确认为幽门螺旋杆菌的特异性脂质抗原。 
使用幽门螺旋杆菌的纯化特异性脂质抗原，以与实施例1(1-2)相 同的方法制作幽门螺旋杆菌样粒子。使用该幽门螺旋杆菌样粒子，从C57BL/6小鼠的骨髓细胞产生干扰素-γ，用酶抗体免疫法(ELISA法)测定上清液中干扰素-γ的量。该结果表明，本申请的幽门螺旋杆菌样粒子具有干扰素-γ的诱导活性。 
(实施例14)支原体样脂质体粒子给药法的最优化 
将用与实施例1(1-2)相同的方法配制的肺炎支原体样粒子(GGLGlc-型)在分为4组的、月龄为2个月的小鼠(体重约30g)腹腔内分别注入200μg、50μg、20μg，进行4次免疫。对照组未给予抗原。如图24下方所示，分4次采血，根据ELISA测定各自的IgM抗体效价(值为每组的平均值)。在50μg、20μg给药组虽然显示超过临界值的高抗体效价，但在200μg的高浓度给药时，抗体效价未上升。确认该实施例使用的肺炎支原体样粒子(GGL Glc-型)情况下，最适当的给药量以约10～100μg/次就十分有效。假定为给予人类时，则为约100μg～10mg/次。最初假定的范围内(在小鼠等小型动物为约1μg～200μg/次)，在实际的疫苗接种时，通过上述这样的方法，可预期更方便地最优化给药量。 
(实施例15)支原体种特异性糖脂抗原的检测及定量 
该实验为对于支原体种特异性糖脂抗原中典型肺炎支原体特异性糖脂抗原GGL进行研究，是否可将患者血清等样品中含有的GGL量进行定量的模型试验。此外，基本的步骤是根据专利文献6的方法。 
即，首先，预先合成GGL作为对应GGL的合成标准品，导入6个重氢[H3]，合成[H3]-GGL(d6-GGL)作为定量标准品。 
另一方面，用培养液培养肺炎支原体，菌体量用以往方法的菌落数进行定量，将脂质抗原GGL从107cfu的菌体提取、分离纯化。将该含107cfu培养肺炎支原体的样品与甲醇∶氯仿＝1∶1等有机溶剂(0.8mL)充分混合，添加水(0.2mL)，经约2500～3000g离心操作，使分层，将下层含目标GGL(C16:0)的脂质成分的氯仿层与蛋白质或血细胞分离而获得GGL。另用DIAION((三菱化学)社制造)的硅凝胶(IATROBEADS)(来自二氧化硅的羟基被保护的物质)纯化。 
为了测定该脂质抗原的量，在上述脂质成分中以[H3]-GGL(C16:0)浓度逐级变化的方式添加，通过质谱分析仪(ブルカ一ダルトニクス社制造)添加钠使离子化，并以正离子模式测定各自的质谱图。(图25) 
该结果是，若同时比较目标GGL(C16:0)特征峰(915m/z)的峰和[H3]-GGL(C16:0)特征峰(921m/z)的峰的峰高度，则可确认是添加[H3]-GGL(C16:0)为50pmol时及5pmol时的中间高度，可确定GGL(C16:0)的存在量是在50pmol至5pmol之间。即，表明在模型样品中的培养支原体菌体107cfu中，存在有50pmol至5pmol的支原体特异性脂质抗原GGL(C16:0)。此外，该结果显示，只要有约105cfu的菌体量存在，即可充分检测。 
所以，使用源自实际的支原体感染患者的组织或血液进行测定时，不仅可马上确定感染支原体种，且可准确地判定其感染程度，也证明在用于判定进行疫苗治疗或化学疗法剂治疗后，或中途发展过程的治疗效果方面可为非常有效利用的技术。 
(实施例16)风湿性关节炎患者的关节组织中发酵支原体特异性脂质抗原GGPL-Ⅲ的检测 
图11为表示将风湿性关节炎患者的关节组织中发酵支原体特异性脂质抗原GGPL-Ⅲ用特异抗体染色的图，此次是显示以实施例15记载的使用质谱分析仪的方法检测风湿性关节炎患者的关节组织中GGPL-Ⅲ的存在。 
从风湿性关节炎患者的关节组织获得经使用硅凝胶(DIAION，(三菱化学)社制造)分离纯化的脂质成分。 
用质谱分析仪(ブルカ一ダルトニクス社制造)解析时，可确认该成分表示GGPL-Ⅲ存在于1049m/z位置的峰(图26)。 
(实施例17)疑似支原体感染患者的临床样品的解析 
从多位疑似支原体感染的肺炎患者采集咽拭子，用与实施例16相同的方法，将获得的溶出成分离子化，用质谱分析仪(ブルカ一ダルトニクス社制造)解析时，如图27所示，可在多个样品检测到肺炎支原 体特异性糖脂抗原GGL的特异性峰。 

Claims (19)

1.一种细菌样粒子，其特征在于，所述细菌样粒子由脂质体粒子制成，所述脂质体粒子含有1种或多于1种的病原性细菌特异性脂质抗原作为构成脂质体的脂质成分，将所述病原性细菌特异性的纯化脂质抗原单独作为脂质体粒子，或将所述纯化脂质抗原与其他磷脂或胆固醇混合作为脂质体粒子；所述细菌样粒子由在感染该病原性细菌种的生物体内的免疫系统中，引起免疫应答的脂质体粒子制成。
2.如权利要求1所述的细菌样粒子，其中，所述脂质抗原为化学合成或酶合成的特异性脂质抗原。
3.如权利要求1或2所述的细菌样粒子，其中，所述病原性细菌选自幽门螺旋杆菌、衣原体、立克次氏体、结核杆菌及肺炎球菌。
4.如权利要求3所述的细菌样粒子，其中，所述病原性细菌为幽门螺旋杆菌。
5.一种支原体样粒子，其特征在于，所述支原体样粒子由脂质体粒子制成，所述脂质体粒子含有1种或多于1种的支原体特异性脂质抗原作为构成脂质体的脂质成分，前述脂质抗原是在化学合成或酶合成后，经分离纯化的特异性糖脂，并且，所述支原体样粒子是作为支原体感染症用疫苗有效的支原体样粒子。
6.如权利要求5所述的支原体样粒子，其中，前述支原体特异性脂质抗原的至少1种为肺炎支原体特异性脂质抗原或发酵支原体特异性脂质抗原。
7.如权利要求5所述的支原体样粒子，其中，前述支原体特异性脂质抗原的1种为GGPL-I、GGPL-Ⅲ、GGL Glc型或GGL Gal型。
8.如权利要求5～7中任一项所述的支原体样粒子，其特征在于，作为前述构成脂质体的脂质成分，进一步含有磷脂酰胆碱及胆固醇。
9.如权利要求8所述的支原体样粒子，其中，以摩尔比计，前述支原体特异性脂质抗原∶磷脂酰胆碱∶胆固醇的含有比率为10～50％：20～50％：10～50％。
10.如权利要求9所述的支原体样粒子，其中，前述磷脂酰胆碱的碳数为14～18。
11.如权利要求10所述的支原体样粒子，其中，前述磷脂酰胆碱的碳数为16，且为饱和型磷脂酰胆碱。
12.如权利要求5～7中任一项所述的支原体样粒子，其中，将含有前述支原体特异性脂质抗原的构成脂质体的脂质成分在溶剂中混合后，通过超声波处理，以使粒径在30～300nm范围内、且粒子的80％以上在40～200nm范围内的条件下进行粒子化。
13.一种具有佐剂作用的支原体样粒子，其特征在于，所述支原体样粒子为使其他抗原性物质存在于脂质体粒子表面的支原体样粒子，所述脂质体粒子为1种或多于1种的纯化的支原体特异性脂质抗原单独构成的脂质体粒子，或所述纯化的脂质抗原与其他磷脂或胆固醇混合而成的脂质体粒子，前述纯化的脂质抗原是在化学合成或酶合成后，经分离纯化的特异性糖脂，通过前述支原体特异性脂质抗原的佐剂效果，提高所述其他抗原性物质的抗原性。
14.如权利要求13所述的支原体样粒子，其中，前述支原体特异性脂质抗原的至少1种为肺炎支原体特异性脂质抗原或发酵支原体特异性脂质抗原。
15.如权利要求13所述的支原体样粒子，其中，前述支原体特异性脂质抗原的1种为GGPL-I、GGPL-Ⅲ、GGL Glc型或GGL Gal型。
16.如权利要求13～15中任一项所述的支原体样粒子，其中，前述其他抗原性物质为源自病毒的抗原肽。
17.一种支原体感染症的预防或治疗用疫苗，其中，含有如权利要求5～12中任一项所述的支原体样粒子作为有效成分，前述支原体感染症为肺炎、哮喘或风湿性疾病。
18.一种病毒感染症的预防或治疗用疫苗，其特征在于，将如权利要求16所述的、在粒子表面存在源自病毒的抗原肽的支原体样粒子作为有效成分。
19.如权利要求18所述的疫苗，其中，前述病毒为流感病毒，前述病毒感染症为流感。
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Immunization with a mycobacterial lipid vaccine improves pulmonary pathology in the guinea pig model of tuberculosis;Christopher C.Dascher et.al.;《International Immunology》;20031231;第15卷(第8期);摘要部分，第918页右栏第28行至第919页右栏第3行，第924页右栏第7-10行，图2 *
Ken B.Waites et.al..Mycoplasma pneumoniae and Its Role as a Human Pathogen.《CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS》.2004,第17卷(第4期),
Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas;SHUMEL RAZIN et.al.;《MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS》;19981231;第62卷(第4期);1094-1156页 *
Mycoplasma pneumoniae and Its Role as a Human Pathogen;Ken B.Waites et.al.;《CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS》;20041031;第17卷(第4期);697-728页 *
Preliminary data on efficacy of Mycoplasma gallisepticum vaccines containing different adjuvants in laying hens;Barbour EK et.al.;《Vet Immunol Immunopathol》;19901031;第26卷(第2期);115-123页 *
SHUMEL RAZIN et.al..Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas.《MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS》.1998,第62卷(第4期),

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