JPH01500119A - Ｇｍ２に対する抗体の産生を賦活又は増強させるためのワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＧＭ２に対する抗体の産生を賦活又は増強させるためのワクチン 発明の背景 本出願は１９８６年５月７日付出願のＵ、Ｓ、出願Ｎｏ．１８６０，６６３の一 部継続出願であり、その出願内容は参照により本願明細Ｓに包含される。

本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅから交付番号 ＣＡ−３６１２０及びＣＡ−０８７４８で政府補助を受けてなされた。米国政府 は本発明の一部権利を有している。

本明細書には、多数の文献がカッコ内のアラビア数字で参照されている。これら の参照文献は請求の範囲の直ぐ前の明細書の末尾に掲載されているので参照され たい。本発明当時の当業界の技術水準をより詳しく理解するために、前記文献の 開示内容も参照により本願用ｌ１８Ｓに包含されるものとする。

ガングリオシドは、神軽外胚菓性メラノーマ及びその他の腫瘍の突起した細胞表 面成分である。３種のガングリオシド、即ちモノシアロガングリオシドＧＨ２と ジシアロガングリオシドＧＤ２及びＧＤ３は、モノクローナル抗体（１Ａｂｓ） を用いて受動免疫し且つ癌ワクチンを用いて能動免疫するためのターゲットとし て機能し得る可能性があるので、腫瘍免疫学者にとっては特に興味深いものであ る。ＣＨ２、ＧＤ２及びＧＤ３が正常な脳及び他の組織内に存在しているにもか かわらず（１）、これらのガングリオシドはマウス及びヒトにおいて免疫原性を 示す。マウス鵬＾ｂｓはＣＨ２（２）　、　ＧＤ２　（３，４）及びＧＤ３　（ ５−８）に対して産生された。またＣＨ２（９−１２）、　ＧＤ２　（１１，１ ３，１４）及びＧＤ３　（１５）に対する反応性を有するヒト血清及びヒト−Ａ ｂｓが同定されている。

過去千年間に亘り、本発明者らは各種メラノーマ細胞ワクチンを用いて数種のメ ラノーマ患者群に免疫性を与えた（１６−２０）。

これらワクチンの試みは、自己及び同種メラノー９の細胞表面抗原に対するメラ ノーマ患者の体液免疫応答を血清学的に分析した本発明者らの研究（２１）に基 づいて行なわれたものであり、各ワクチンはヒトにおいて免疫原付であると公知 のメラノーマ表面抗原を含むように構築した。ワクチンを接種した患者ではワク チン中の異種血清成分及びＨＬＡ−関連同種抗原に対する抗体が直ちに産生され たが、まれにではあるが、より制限されたメラノーマ抗体例えばクラス１　（ｕ ｎｉｑｕｅ）　、或いはＧＤ２又は他のクラス２　（ｓｈａｒｅｄ）メラノーマ 抗原に対して誘導された（ｅｌｉｃｉｔｅｄ）抗体も産生された。マウスにおけ るワクチン研究と平行して、腫瘍抗原に対する血清学的応答を促進する免疫化方 法を同定した（２２−２４）。ＧＤ３の場合、マウスにおいてＧＤ３−発現腫瘍 細胞（ｅＸｐｒＯ３ｓｉｎ（Ｊ　ｔｔｌｌｏｏｒ　ｃｅｕｓ）又は精製ＧＨ２を 用いて免疫化すると極めてまれにしかＧＨ２抗体が産生されなかったが、Ｇ１４ ２とアジュバント例えばバチラスＣａ１ｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）又 はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ　Ｒ５９５とを含むワクチンはは るかに有効であった（２４）。

ＬｉＶｉｎｇＳｔＯｎら（２２，２３）には、ＢＣＧ及び５ａｌｉｏｎｅｌｌａ が免疫原性反応を賦活する際のアジ１バントとして有用である旨が教示されてい る。しかしながら、ＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎらにはＧＤ３に対する抗体ユバントを 使用する旨は少しも教示乃至示唆されていない。また、ＬｉＶｉｎｇＳｔＯｎら はアジュバントとして５ａｌｌｌＯｎｅｌｌａ　ｌｌ１ｉｎｎｅＳＯｔａＲ５９ ５を使用することを開示していない。

Ｔａｉらはメラノーマ患者の研究過程でＧＤ３の免疫原性を同定した（１２）。

しかしながら、ＴａｉらにはＧＤ３に対する抗体を賦活又は増強させるためにＢ ＣＧ又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　１ｎｎｅｓｏｔａ　Ｒ５９５を使用する旨は少 しも教示乃至示唆されていない。

Ｉｒ１ｅら（１９８５年１２月１０日付発行米国特ｒＦｍ　４，５５７，９３１ ＞には、ＧＤ３に対する抗体を高めるためにＧ）＋２とアジュバントを組合せて 使用する旨が開示されている。しかしながら、Ｉｒ１ｅらはアジュバントとして リポソーム又は血清アルブミンを使用している。

また、Ｉｒ１ｅらには、ＧＤ３に対する抗体を賦活又は増強させるためにＢＣＧ 又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｓ＋１ｎｎｅｓｏｔａ　Ｒ５９５を使用する旨は少 しも教示乃至示唆されていない。

本研究で、本発明者らは第■期メラノー７患者におけるＧＤ３−含有ワクチンの 免疫原性を研究した。２種のタイプのワクチン、即ち高レベルのＧＤ３を含有す る全細胞ワクチン及び精製ＧＨ２と適宜微生物アジュバントを含有するワクチン を使用した。

１肛立ｌ且 本発明は、ワクチンを投与した被検体（ｓｕｂｊｅｃｔ）におけるＧＤ３に対す る抗体の産生を賦活又は増強させるためのワクチンを提供する。ワクチンは、被 検体における抗体の産生を賦活又は増強させるに有効な間の精製Ｇ１４２と有効 量の微生物アジｌバントと薬学的に許容され得るキャリアとを含む。微生物アジ ュバント（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｄｊｕｖａｎｔ）はバチラス（ｂａｃｉｌｌ ｕｓ）Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ又は５ａｌｉｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅ ｓｏｔａ　Ｒ５９５であり得る。

本発明は、被検体におけるＧＤ３に対する抗体の産生を賦活又は増強させるため の方法をも提供する。この方法は、本発明のワクチンを有効量被検体に投与する ことからなる。

本発明は、癌に冒されている被検体において癌を処置する方法をも提供する。こ の方法は、本発明のワクチンを有効は被検体に投与することからなる。

本発明は、癌に冒されている被検体において癌を防止する方法をも提供する。こ の方法は、本発明のワクチンを有効量被検体に投与することからなる。

図面の簡単な説明 第１図は、第■期メラノーマ患者に全細胞ワクチン又は精製Ｇ’Ｈ２ガングリオ シドワクチンを用いて免疫化後のＧＨ２抗体応答を示す。各カーブは個々の患者 の応答を表わす。矢印はＣｙ注入又はワクチン注入時を示す。ブースターワクチ ン中に使用したアジュバントはＢＣＧをＲ５９５に代えたとき以外は最初のワク チンに使用したアジ１バントと同一であった。

第２図はワクチンを接種したメラノーマ患者の血清中のＧＨ２抗体を免疫染色法 で検出したものである。同一のＴ１．Ｃプレートをレゾルシノールで染色するか （最左端）、又はＥＬＩＳＡで１＝１６０及び１：３２０のＧＨ２／ＢＣＧ　＋ 　ＧＨ２抗体価のワクチンを接種した患者の血清と反応させた。Ｄ及びＥでは、 Ｃｙで処理し且つＥＬＴＳＡで１：８０及び１　：　１６０のＧ）１２／ＢＣＧ 　：　ＧＭ２抗体価のワクチンを接種した患者の血清を用いた。ＦではＥＬＩＳ Ａで１＝２０のＧＨ２／Ｒ５９５：　ＧＨ２抗体価のワクチンを接種した患者の 血清を用いた。

１皿型ＪコＬ飢乳里 本発明は、ワクチンを投与した被検体におけるＧＤ３に対する抗体（ａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ａｇａｉｎｓｔ　ＧＤ３）の産生を賦活又は増 強させるためのワクチンを提供する。前記ワクチンは、被検体における抗体の産 生を賦活又は増強させるに有効な社の精製ＧＨ２と有効量の微生物アジュバント と薬学的に許容され得るキャリアとを含む。好ましくは、被検体はヒトであり、 ０Ｍ２はＧＤ３の脂質部分と微生物アジュバントの細胞膜間の疎水性結合により 微生物アジュバントに結合している。

薬学的に許容され得るキャリアは任意の公知のキャリアであり得る。しかしなが ら、現在好ましいキャリアはリン酸緩衝食塩水である。

好ましい微生物アジュバントはバチラスＣａｌ＠ｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎである 。しかし、微生物アジ１バントが５ａｌｌｌＯｎＯＩＩａ　１ｉｎｎｅｓＯｔａ Ｒ５９５でもよい。

各種母の精ｌ　ＧＤ３が使用され得る。しかし、ワクチン中のましい存在量は約 ５０〜３００埒である。また、各種けの５ａｌｌＯ−ｎｅｌｌａ　ｎ＋１ｎｎｃ ｓｏｔａ　Ｒ５９５が使用され（７る。しかし、ワクチン中の好ましい存在量は 約０．２〜１．５ηである。更に、各種母のバチラスＣａ１ｎ＋ｅｔｔｅ−Ｇｕ ｅｒｉｎが使用され得る。しかし、ワクチン中の好ましい存在ｍは約１０５〜３ ×１０７生存単位（ｖｉａｂｌｅ　ｕｎｉｔｓ）テある。

本発明は、癌に苦しんでいる被検体に本発明のワクチンを投与することを提供す る。ワクチンの投与により被検体中に産生された抗体が効果的に癌を処置する。

本発明は、癌にかかりやすい被検体に本発明のワクチンを投与することを提供す る。ワクチンの投与により被検体中に産生された抗体が効果的に癌を予防する。

癌にかかりやすい被検体には癌素質を有する被検体及び以前癌にかかった被検体 が包含される。

本発明のワクチンで処置又は予防される癌は神経外胚葉起源のものであり得る。

特に、神経外胚葉性癌としてはメラノーマが挙げられる。

本発明は、被検体においてＧＨ２に対する抗体の産生な賦活又は増強させるため の方法にも関する。前記方法は、本発明のワクチンを有効量被検体に投与するこ とからなる。

本発明は、癌に胃されている被検体において癌を処置する方法にも関する。前記 方法は、本発明のワクチンを有効量被検体に投与することからなる。

本発明は更に、癌に冒されている被検体において癌を予防する方法にも関する。

前記方法は、本発明のワクチンを有効を被検体に投与することからなる。

ワクチンは、皮下、皮肉又は筋肉内に投与される。ワクチンを１回投与しても、 １回投与後ブースター注射してもよい。ブースターは最初の投与から１２〜１６ 週間後に投与されるのが好ましい。

好ましくは、本発明の方法では、ＧＨ２の脂質部分と微生物アジュバントのＩ８ 胞膜間の疎水性結合により微生物アジュバントに結合しているＧＨ２を使用する 。微生物アジュバントはｓａ　１１０−ｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ　Ｒ５ ９５又はバチラスＣａ１ｍｃｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎであり得る。

癌を処置又は防止する方法は神経外胚菓起源の癌を特徴とする特に、神経外胚菓 性癌としてはメラノーマが挙げられる。

まず、ワクチンを投与する前に有効量のシクロホスファミドが投与され得る。投 与時期はワクチンの投与前であればよい。

しかし、ワクチン投与の約３〜７日前にシクロホスファミドを投与するのが好ま しい。また、シクロホスファミドの使用組も任意である。しかし、好ましい量は 約１〜５００１１ｇ／７ｄである。

１監叉皇 （動物） ２〜５力月齢のＩＢＡＬＢ／Ｃ−Ｃ５７ＢＬ　／６　Ｆｌ（Ｒ６）マウスをＴｈ ｅ　Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｈ［ ’）から入手した。

（ＩＪｉ細胞） ＪＢ−ＲＨセルラインのＢｅｒｋｅｌｈａｌｌｌｌｅｒら（２６）による由来（ ｄｅｒｉｖａ−ｔｉｏｎ）及び血清学的分析に使用したＪＢ−Ｒ１１−１６サブ クローンの本発明者らによる由来、並びにこのサブクローンを０Ｍ２の例外的な 発現体（ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）として特徴付ける血清 学的生化学的分析は文献に記載されている（２．２６）。ＪＢ−ＲＨに対する（ 血清学的アッセイ） ワクチン接種後２週間間隔でマウスの眼窩後り洞（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ 　５ｉｎｕｓ）から採血し、血清学的テスト用血清サンプル（約０．１ｄ）を− ２０℃で保存した。免疫付着反応（ＩＡ）、主に免疫グロブリンＭ　（ｒｏｂ） 及びプロティンＡ（Ｐ＾）を検出する補体依存性細胞毒性アッセイ（家兎の補体 を使用する）及び主にＩＩＪＧを検出する抗−１１Ｇアツセイは、文献（２２， ３７，３８）に記載されている如〈実施した。Ｐ＾、抗−１ｇＧ及びＩＡアッセ イの結果を顕微鏡により分析し、最高抗体価として表示した。その結果、インジ ケータレッド細胞を有するターゲット細胞の２０％がその細胞周界（ｃｅｌｌ　 ｐｅｒｉｓ＋ｅｔｅｒｓ）の５０％以上に付着していた。

精製ガングリオシドを用いてＩＡ反応性を阻害する阻害テストを、文献（２）に 記載されている如〈実施した。各種母のガングリオシドをクロロホルム：メタノ ール（２：１）に溶解させ、希釈管（ａｘ　５０ａｍ　）に分注し、デシケータ 内で乾燥させた。３０ρの血清を４℃にて１１Ｉ８間ガングリオシドと反応させ た後、ＪＢ−ＲＨセルを用いてＩ＾アッセイにかけた。

（０Ｍ２ニ対するＲ５９５及びバチラスＣａ１ｇ＋ｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（Ｂ ＣＧ）の結合能力） ５Ｇ４のＧＨ２を各種母のＢＣＧ及びＲ５９５と混合し、凍結乾燥した。

得られた粉末をワクチン作成時と同様にして再懸濁し、１５　、６００ｘ（９で 遠心により沈降させ、上清及びペレット中のＧＨ２を検出すべくＳ層りロントゲ ラフイー（ＴＬＣ）を実施した。

り生育させた。ワクチン接種口に細胞を機械的に除去しくｄｉｓ−Ｉｏｄｇｅｄ ）　、コバルト６０源から１０，０００ラドを照射し、計数した。

細胞（５Ｘ１Ｇ’　）を文献（２２）に記載されている如＜　０．２ｄ標準食塩 水中で５０４のＨＰＬＡと混合した。文献（２）に記載されている如く細胞を抽 出し、ＴＬＣを実施し、デンシトメータ走査法を用いてガングリオシドを足固す る（２）ことによりワクチンのガングリオシド含量を測定した。ＪＢ−ＲＨ細胞 （５×１０７）は６０ＪＩ９のＧＨ２を含有していた。

（従来のワクチン） 等客間の食塩水中のＧＨ２及び完全フロインドアジュバント（ＤＩｒＣＯＬａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＨＴ）を文献（２２）に記載されてい る如く乳化させた。ＨＰｌ八及びＢＣＧ　ＮＪ胞堅壁骨格ＢＣＧ　ＣＷＳ）（Ｒ ｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、　ＨａＩｌｌｉｌｉｔｏｎ、　ＨＴ）をイントラ リピド（Ｃｕｔｔｅｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｂｅｒｋｅ ｌｙ、　ＣＡ）に添加し、これを用いて乾燥ガングリオシドを懸濁させた。

（細菌含有ワクチン） Ｊ−５［、Ｃｏ１１とＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｉｎｎｅｓｏｔａ（Ａｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ ｅ、　ＨＤ）及びＳａｌｍＯｌｌｅｌｌａ　１ｌｉｎｎｅＳＯｔａ変異体Ｒ５９ ５（Ａ　ｌａｂａｍａ大学のＪｅｒｒｙ　ＨｃＧｈｅｅ博士より快く提供された ）を文献（２１）に記載されている如く　１％酢酸中で加熱し、洗浄し、ワクチ ン又はＢＣＧ　（Ｔｉｃｅ系；　ｔｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｌ１ｌｉｎｏ ｉｓ　Ｈｅｄｉｃａｌｃｅｎｔｅｒ）を超音波処理により蒸留水中に再懸濁させ 、乾燥ＧＨ２を収容した管中に導入した。懸濁液を凍結乾燥させ、ワクチン接種 口に投与直前に標準食塩液に再懸濁させた。

（リポソームワクチン） ２００１１ｇのＧＨ２をレシチン９．３ＩｌＩｙ、スフィンゴミ１リン９．３〜 及びコレステロール（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏ ｕｉｓ、　Ｎｏ）１８．４１１９と混合してリポソーム製剤１を調製した。リポ ソーム１は、マイクロチップを有するプローブ超音波処理機（モデル１８５：Ｂ ｒｏｎｓｏｎ　５ｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　Ｃｏ、、Ｄａｎｂｕｒｙ、　ＣＴ）を 用いてエネルギーレベル７で５秒間超音波処理して作成した。ＧＨ２２００Ｊ４ ．ホスファチジルフリン８００ｉＪ９．　ｍｌレステｎ−ル６００１１ｇ及びジ ャチルホスフェート３０埒を用いてリポソーム製剤２ａ及び２ｂを調製した。リ ポソーム２ａはリポソーム１と同様にしてプローブ超音波処理機を用いて作成し たが、リポソーム２ｂは水浴超音波処理機（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ　１２；　Ｂｒ ａｎｓｏｎｉｃ　Ｃ１ｅａｎｉｎｏ　Ｅｑｕｉｕ＋ｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ　。

５ｈｅｌｔＯｎ　ＣＴ）を用いて５秒間超音波処理して作成した。リポソームに 混入すべきアジュバントは超音波処理前にＧＨ２に添加した。これらのアジ１バ ントには、リボイディラミンＣＰ−２０，９６１（Ｐｆｉｚｅｒ、　Ｇｒｏｔｏ ｎ、　ＣＴ）、スイス・バーゼルにあルＣＩＢＡ−Ｇｅｉ１ｇｙのり、　Ｇ、　 Ｂｒａｕｎ教授のご厚意で提供されたムラミルジペプチド（ＨＤＰ）スクシンイ ミドエステルアナログＣＧＰ　１７１０７．ドイツ・フライブルクのＣ、汐ヒ３ ｎ　ｏ　ｓ博士から提供されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ由来のエ ンドトキシン（高純度リボボリサッｈライド）及びＨＰｌ、Ａが包含される。

（シクロホスファミドＣｙ） １５ＩＩｔｇ／Ｋｇ用量のＣｙ　（Ｃｙｔｏｘａｎ　：　Ｈｅａｄ　Ｊｏｈｎｓ ｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｅｖａｎｓｖｉｌｌｅ、　ＩＮ）を第１回ワクチン接種の３日前にｉ、Ｉ）、投 与した。

（ワクチンの投与） マウスは同−小ｇ　（ｓｈｉｐＨｅｎｔ）から無作為に選択した。マウス１匹当 り総容ｆｆｉ　０．１ｄ！のワクチンを皮下投与した。５ｏＩＪ！ｌのＧＨ２を 含有するワクチンを１力月間隔で２回以上投与した。但し、（顕著な硬化及び排 液性（ｄｒａｉｎｉｎｇ）潰瘍を生じた）完全７０インドアジユバントを含有す るワクチンは例外である。どのワクチンを投与しても中毒状Ｍ若しくは病的状態 は認められなかった。

臨床実験 （患者） 精製ＧＭ２をワクチン接種する研究の場合には、腫瘍及び局所リンパ節を４ｆＪ 月内に切除したとき及びこれらに検出され得るメラノーマがなかったときには、 ＡＪＣＣ第ｍ期メラノーマ（即ち転移が局所的に皮膚及びリンパ節に限定されて いる）患者を適確な被検体と見做した。全細胞ワクチンを用いた研究では、クラ ークレベル■又はＶの初期メラノーマ若しくは触診できる程度の局所リンパ節転 移が見られる患者を対象とし、局所リンパ節の切開を行うこととした。この場合 には、手術の少なくとも１０日前に最初のワクチンを投与した。どの患者に対し ても化学療法若しくは放射線療法を殆こさなかった。患者を６週間間隔で検査し た。胸部Ｘ線、肝機能検査及び尿検査を３力月間隔で実施した。血清学的テスト のために２週間間隔で採血した。

（ガングリオシド） 公知の方法（１４）に従ってＧＨＩをβ　−ガラクトシド（ミシガン州立大学、 　Ｇ、１４．Ｊｏｕｒｄｉａｎ）で処理してＧＨ２を作成した。ＧＤｌａ。

ＧＤｌｂ及びＧ１１は５ｕｐｅｌｃｏ（Ｂｅｌｌａｆｏｎｔｅ、　Ｐ＾）から購 入した。ＧＤ２はＨｅｒｂｅｒｔ　Ｗｉｅｇａｎｄｔ　（西ドイツのマールブル ク大学）からご厚意で提供された。ガングリオシドの抽出、同定及び定ｍは文献 （２）に記載されている如〈実施した。

（血清学的手順） 文献（２，３，５）に記載されている如くしてｍＡｂｓ　５−３．３Ｆ８及びＲ ２４を用いてｍ胞表面ガングリオシドを発現させるためにセルラインのタイピン グを実施した。家兎抗−ヒトＩｇＨ、抗−ヒト１（ＩＧ又はアルカリホスファタ ーゼ（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　Ｓａｎベントアッセイ（Ｅ ＬＩＳＡ）　（２）を、実施した。抗体価を０．１９０に等しいか又はそれ以上 の００を示すＩａ高血清希釈度として定義した。補体源として正常ヒト血？Ｆｆ （１：３希釈）を用いて補体依存性細胞毒性アッセイ（２２）を実施した。ＩＴ ＬＣ（Ｇｅｌｌａｒｌ）（２）に対する試薬は１：５００に希釈したヤギ抗−ヒ トＩｇＧ　（ｌａｇｏ、　Ｂｕｒｌｉｎ−ｇａｍｅ、　ＣＡ）及びベルオキシダ ーぜ複合ヤギ抗−ヒトＩｇＭであった。

（全細胞ワクチン） ヒト星状細胞セルラインＳに−ＮＧ−１４及びヒトメラノーマセルラインＳに− ＨＥＬ−３１を樹立させるべく使用した手順は文献（２５）に記載されている。

ＪＢ−ＲＨマウスメラノーマセルラインはＪ。

Ｂｅｒｋｅｌｈａｍｍｅｒら（２６）に従って樹立させ、高ＧＨ２発現のために 選択されたサブクローンＪＢ−ＲＨ−１６は本発明者ら（２）に従って樹立させ た。ワクチン調製のために細胞を培養・採集する方法は文献（＋’ｌ）に記載さ れている。細胞に６０コバルト源から１０，０００ラド（１ラド＝０．０１グレ ー）を照射し、ジメチルスルホキシド中で生育可能に凍結させた。ワクチン接種 口に各ラインからの細胞を迅速に融解さゼ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で３ 回洗浄し、はとんど同数をプールし、注入した。ワクチン当りの平均総細胞数は ＰＢＳ　１　ｄ中に懸濁している２、２Ｘ　１０’個であり、（トリパンブルー 排除法で判定して）約４０％の生育度であった。細菌性アジュバントは使用しな かった。リンパ節切開直前に５日間隔でワクチンを２〜３回投与し、手術後４週 間目に更に２〜３回のワクチンを接種して、全体で５回のワクチンを接種した。

ワクチン【ｔすべての実験を含めて順番に（ｒｏｔａｔｉｎｇ　ｂａｓｉｓ）皮 肉に投与した。

（精製ＧＨ２ワクチン） アジュバントを含有しないＧＨ２ワクチンをｌｌ製するために、１００ｎのＧＨ ２をＰＢＳ　ｌ　ｄ中に溶解させた。ＢＣＧ含有ワクチンの場合には、１０７生 育単位のＢＣＧ　（Ｔｉｃｅ系、イリノイ大学）又はＢＣＧに対して強い反応性 を示した患者には３Ｘ　１０６単位のＢＣＧを超音波処理により蒸留水に懸濁さ せ、１００ＩＩ９の乾燥ＧＨ２を収容した管に導入した。懸濁液を凍結乾燥させ 、ワクチン投与直前にＰＢＳに懸濁させた。ｓ、　ｍｔｎｎｅｓｏｔａ変異体Ｒ ５９５（アラバマ大学のＪａｒｒｙ　ＨｃＧｈｅｅのご厚意により提供された） を文献（２７）に記載されている如く　１％酢酸中で１時間加熱し、洗浄、乾燥 し、凍結保存した。ワクチン調製のために、ｏ、　５＃ｉ！のＲ５９５を超音波 処理によりＰＢＳ中に懸濁させ、ＢＣＧの場合と同様にしてＧＨ２に添加した。

ＧＨ２ワクチンで免疫化した患者に２週間間隔で皮肉に４回ワクチンを接種した 。更に、ＢＣＧ又はＲ５９５を含有するＧＨ２ワクチンで免疫化した数名の患者 には第４回のワクチン接種後３〜５カ月の間にブースター注射を行った。

結　果 ワクチン接種の前と接種後一定の間隔でマウスから血清を採取し、ＪＢ−ＲＨ標 的細胞に対するＩＡアッセイとＰＡアッセイによってテストした。ワクチン接種 前の血清には反応性がなかった。８回の別々の実験で二回ワクチン接種をした後 に得られた血清の反応性を表工に示す。反応はすべてＩＡアッセイ（１９Ｍを検 出する）によって検出され、１９Ｇ反応は全熱誘発されなかった。３種の広いカ テゴリーのワクチン、すなわち、照射した全細胞、ＧＭ２単独、もしくは完全フ ロインドアジュバント中に混和した０Ｍ２のような従来のワクチン、細菌に結合 もしくは混合した０Ｍ２　、およびリポソーム中に入れた０Ｍ２をテストした。

従来のワクチン。生理食塩水、完全７０インドアジユバントならびにＭＰＬＡお よびＢＣＧ　ＣＷＳと混合した１ｎｔｒａｌｉｐｉｄ（Ｃｙ金含有たは不含有の いずれか）に入れて投与した０Ｍ２では、６５匹のマウスのうちの９匹のみで血 清応答がみられた（メジアンタイター１／２０、表■参照）。照射したＪＢ−Ｒ Ｈ細胞ｓｘ　ｉｏ７個（０Ｍ２を６０４含有することが知られている）とＭＰＬ Ａとで、予めＣｙで処理したマウスを免疫すると、２０匹のマウスのうちの４匹 で血清応答が誘発された（メジアンタイター　１／２０）。

細菌アジュバント。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）はアジュバントとして効果がないこ とが判明した（　１ｏｄのうち２だけ応答するという結果になる）。サルモネラ ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ）とＢＣＧは中程度に 有効なアジュバントであり（応答はそれぞれ２５のうち１０および１５のうち８ ）、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｎ＋ｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ）の Ｒ５９５変異体はＧＭ２に対する血清応答を誘発するのに極めて有効なアジュバ ントであったく応答は３０のうち２７、メジアンタイター１／６４、タイターが １／１２８を越えるマウス９匹も含まれる）（表工参照）。これらをＧＭ２＋生 理食塩水と比較したｐ値はそれぞれ０．０３．０，０１および０．００１未満で あった。Ｒ５９５の至適用量は０．５■であり、Ｃｙで前処理するとワクチンの 免疫原性はかなり増大した。

最適の効果を得るのに０Ｍ２とアジュバントの結合が必要であるのか否かを決定 するためにＲ５９５とＢＣＧの０Ｍ２に対する結合能を測定した。０Ｍ２が５０ 埒、Ｒ５９５がＱ、３！１１ｇの用量で痕跡量の０Ｍ２が上溝中に検出された。

Ｒ５９５の用量がこれより高いとガングリオシドは全てベレット中にあり、Ｒ５ ９５の用量がこれより低いとガングリオシドはほとんどが上溝中にｔあった。し たがって、ここで最も免疫原性であることが判明したＲ５９５の用量（０，５ａ ｙ）は、５０〜の０Ｍ２を全てＲ５９５の表面に結合させることができる（　Ｒ ５９５の）最少量に一致している。

ＢＣＧの場合は、細菌Ｒ５９５の約５％が生存していた点と、マウスが許容でき る最高用ｆｆｌ　（１０７）で０Ｍ２の約６０％がＢＣＧ細菌ベレット（１５， ６００ｘ　Ｇ　、　３０分）に結合しておらず上清中に見い出された点において Ｒ５９５の場合とは相異していた。これはＢＣＧ　：　ＧＭ２比のある程度の範 囲に亘ってみられた。上清中の０Ｍ２が遊離であるのかあるいはＢＣＧの細胞下 成分に結合しているのかを決定するために、混合物を超遠心（３００，０ＯＯＸ Ｇ１１８０分）にかけ、ベレットと上清の両者からＴＬＣプレートを調製した。

５０埒　０Ｍ２：１０６生菌ＢＣＧ単位の比で０Ｍ２の９０％はベレット中にあ った。ＢＣＧの用量がこれより高いと全てのＢＣＧがベレット中にあり、これよ り用量が低いとほとんどが上清中にあった。これらのプレートを抗−ＧＭ２モノ クローナル抗体５−３で免疫染色することによって、観察されたバンドが実際に ０Ｍ２であることを確認した。これらの結果が示しているのは、はとんどの免疫 原性のＢＣＧワクチンとＲ５９５ワクチンにおいて、０Ｍ２は大部分が細菌また は細菌産物に結合しており、これらの細菌は０Ｍ２で最大限に飽和しており、か つこれらのワクチンは遊離の０Ｍ２をほとんど含有していないということである 。

リポソームワクチン。リポソーム１と２ｂはあまり免疫原性が高くない（それぞ れ１５のうち３と１５のうち５、表工参照）が、リポソーム２ａは中程度に免疫 原性である（２５のうち１６が応答、ＧＭ２＋生理食塩水と比較したｐ＝　ｏ、 ｏｏｉ）。リポソーム製剤１と２の間にある違いはその脂質含有量であるのに対 し、２ａと２ｂの間にある違いは超音波処理法であった。リポソーム２ａの方が 激しく超音波したが、この方が小さいものと仮定する。我々の結果が示している ように、免疫原性を決定するのはリポソームの組成とそれらの作り方との両方で あるリポソーム中にはＭＰＬＡが必要とされ、これはりボイジルアミンＣＰ　２ ０，９６１またはＭＤＰで置き替えることはできなかりた。エンドトキシンはが ならなかつ亡−′この用量でのＭＰＬＡもまた有効でなかった。

これらのような高めのＩｇＧ抗体タイターは以後の４回の実験では二度と検出さ れなかった。Ｃｙはリポソーム２ａ−Ｍ　Ｐ　Ｌ　Ａワクチンの免疫原性を増進 する（１０のうちの３の応答に対して２５のうちの１６の応答）ようにみえたが 、その差は統計的に有意ではなかった（フィッシャーＦｉｓｈｅｒの精密テスト によるｐ−−ＲＨ−１６に対して高いタイターの反応性をもつ選択された血清を 精製されたガングリオシドのパネルに対するＥＬＩＳＡアッセイによってテスト した。しかしこの分析は、マウスによってはワクチン接種の前後に検出されるＧ Ｍｌに対する天然の抗体のため、またマウスによって得られることがあり、いろ いろなガングリオシドを含有するウェルやガングリオシドを全く含有しないウェ ルで陽性の反応を示す「粘着血清（Ｓｔｉｃｋｙｓａｒａ）　Ｊのため複雑であ った。この後の人為構造はウシ血清アルブミンや正常マウス血清でブロックする ことができなかったので、ＪＢ−ＲＨＩｆｆｉ胞に対するタイターの高い５つの 血清の特異性を阻害テストによって分析した（表■参照）。ＪＢ−ＲＨ細胞との ＩＡ反応性は０Ｍ２によってのみ完全に阻害され、ＧＤｌａ、ＧＤｌ　、ＧＤ３ およびＧ　Ｍ　３　Ｌｔ　コ（７）　反応性ヲＩＡ　ＶＭ　Ｌ／　すいことが見 い出された。しかし、ＧＭＩはＢＣＧ　０Ｍ２で処置したマウスの２つの血清の 反応性を部分的に阻害した。

に増大したが、ＰＡも抗−１ｇＧアッセイ反応性（ＩｇＧ＞もＩＡにより反応性 の血清もまた補体依存性ｉｌｌ　Ｆ！ａ　責性（ＣＤＣＸ）を媒介する。最初に ＩＡテストで反応性の血清をｃｏｃｘについてもテストした。反応性のタイター は類似していた。そのような実験のひとつにおいて、０Ｍ２単独で免疫したマウ ス５匹から得た血清はどちらのアッセイでも反応性でなかったのに対し、ＧＭ２ ＋Ｒ５９５マウス５匹のうち４匹から得た血清はいずれのアッセイでも強い反応 性を示した。ｃｏｃｘによって５０％を殺すメジアンタイターへは１／４０であ り、ＩＡでは１／６４であった。ＣＤＣＸとＩＡで得られたタイターの間には有 意な相違は検出されていないが、ＩＡの方がより迅速であり必要とする血清が少 ないのでＩＡの方を主に使用してしいる。

ＩｇＧ応答を得る試みと遅延型過敏症（ＤＴＨ）。これらの実験でさまざまなワ クチンによって誘発された血清はＪＢ−ＲＨに対するラビット補体による強力な ｃｏｃｘを媒介することができたが、Ｔ９Ｇ応答への常に変わらぬ自発的な変換 は全く観察されなかった。そのような変換を得るために一連の実験において、１ ０匹のマウスに最後のワクチン接種の２ケ月後Ｒ５９５−ＧＭ２を皮下に再接種 した。この群におけるＪＢ−ＲＨ細胞に対するメジアンＩＡタイター（Ｉ　ｇＭ ）は１／８０からｊ／１６０ミド（ＧＶ）（２００Ｉ！ｇ／ｄ＞で患者を前以っ て処置した。この全組観察されなかった。別に一群４匹のマウス三群に対し、最 後のワクチン接種の２ケ月後５０／Ｊの０Ｍ２を単独で、またはＲ５９５もしく はＢＣＧと共に静注投与して「追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ　）　Ｊのワクチン接 種をした。ここでもメジアンＩＡタイターはやや増大した（　１／４０から１／ ８０へ）が、ＰＡも抗−ＩｇＧ反応性も検出されなかった。これらと同じ群のマ ウスのＤＴＨ反応性も、０Ｍ２を１／ｌｉ、５４および２５４足に注射してテス トした。

反応性は全く検出されなかった。

系、すなわちマウス黒色腫細胞系ならびにヒト由来の黒色腫細胞系および星細胞 腫から構成された全細胞ワクチンの特性をまとめて表３に示す。これらのｌ胞系 は、０Ｍ２を検出するマウスｍＡｂとの反応性によって示されるように、０Ｍ２ の高い表面発現に関して選択した。Ｒ製された０Ｍ２を含有する５種のワクチン （１種は０Ｍ２単独で、４種はアジュバントとしてＢＣＧかＲ５９５を含む）を テストした。これらのうちの２つの実験では最初のワクチン接種の３日前に低用 量のシクロホスファ胞ワクチンは細菌性のアジュバントを含有しないにもかかわ らず、患者６人のうち５人で硬結紅斑が（４８時間で直径８ａｇ以上）、４人の 患者で軽度の発熱（３９℃以下）がみられた。４人の患者では排液リンパ節（ｄ ｒａｉｎｉｎｇ　１ｙＢｈ　ｎｏｄｅｓ）に圧痕と腫脹がみられ、６人の患者の うちの５人では切除したリンパ節で過血漿が目立った。皮膚およびリンパ節での これらの反応はワクチン接種の度毎に増大するが、我々が以前に行なったヒト黒 色腫細胞ワクチンを用いた実験ではみられなかった。したがって、この高い炎症 性反応は抗マウス応答に帰因すると思われる。０Ｍ２単独かまたは０Ｍ２／Ｒ５ ９５によるワクチン接種に対しては充分耐性であり、副作用は検出されなかった 。０Ｍ２／ＢＣＧワクチンの場合患者１１人のうち５人で軽度の発熱（３９℃以 下）と顕著な局所潰瘍化がみられ、そのためＢＣＧ用量を減らす（３ｘ１０６生 体）か、またはブー不スターワクチン接種にＢＣＧの代わりにＲ５９５を使用す る必要があった。神経学的またはその他の検出可能な異常がＧＭ２ワクチン接種 に伴なうことはなかった。

表３ ｔｈｎｖワク手ン’ｌ　ＣｖＭ２ｒＱ９２ｋｉｘ−Ｃｒしン！ＦＥ１に’　−− ｐ’＞　７°’／’Ｉ　シト４　＊＊ＦＩＬ　Ｘｍａｙ　−ａ心上 ｃ１７ｒｙ”Ｙｔｖ　−ｔｇ−ｚｑ−１６ｓｘ−＜−１ｔ、　ｓｒ−に！し一３ ｔｓ　／Ｉ苓　イＨ不メ４ター　（−を捉）５−３　（ａＱ’２）　６５．００ ０　６！１，０００　２２，０００３ＦＢ　（ｃＧ）２）　Ｏ２５，口００　２ ．５　ｘ　１０６Ｒ２＆　（ｅＧＤ３）　ＯＯＬ、０００尼←　η゛ンク゛ソオ ンド４’　（い　ハ０７　伸し）Ｑ仁　１２−４　４．５　６．９ ＧＤ２　０　５．４　２．０゜ ＣＤ３　０　２．１　１．０ Ｑ仁　１７３．８ ＧＤ２　５４３ Ω３　−　２２．７ 健常人由来向清、ワクチンを接種してない黒色腫患者由来の血清およびワクチン を接種した黒色腫患者由来の血清中のＧＭ２抗体に関するＥＬＩＳＡの結果を第 １図と表４に示す。

健常人とワクチン未接種黒色腫患者のＧＭ２抗体タイターと頻度は類似しており 、８０％は陰性で、１人の健常人だけが１：４０を越えるタイターをもっていた 。全細胞ワクチンは、ワクチンを接種した患者６人のうちの５人で高タイター（ １：８０またはそれ以上）の０Ｍ２を誘発した。０Ｍ２単独で免疫した患者では 　ＧＭ２抗体は誘発されなかった。精製された０Ｍ２ワクチンにＢＣＧを添加す ると、特にＣｖで前以って処置した患者または最後のワクチン注射の１２〜１６ 週後にブースター免疫をした患者で、ＧＭ２抗体が産生された。Ｃｙの効果はア ジュバントとしてＲ５９５を含む０Ｍ２ワクチンの場合にも明らかであり、生さ れ、一方Ｃｙで前処置しなかった。患者ではＧＭ２抗体は検出されなかった。Ｒ ５９５はＢＣＧとは逆にブースター免疫のアジュバントとして有効ではなかった 。ＧＭ２／Ｒ５９５ワクチンを接種し、ＧＭ２／Ｒ５９５で（最後のワクチン注 射の１４′ｉｊ４後）ブースター免疫した、Ｃｙで処置した４人の患者では０Ｍ ２タイターの上昇はみられなかった。患者によってはＢＣＧによって誘発される 局所炎症性反応と全身性反応が増大するので、最初に０Ｍ２　／ＢＣＧワクチン を接種した１１人の患者のうちの６人にはＧＭ２／Ｒ５９５ワクチンをブースタ ー注射した。ＧＭ２／ＢＣＧでブースター免疫した６人の患者のうちの４人では ０Ｍ２タイターが大幅に上昇した。ＧＭ２／Ｒ５９５でブースター免疫した５人 の患者では０Ｍ２タイターの増加はみられなかった。。

ワクチンを接種した患者に由来する血清の特異性分析。抗−ＧＭ２タイターが１ ：４０以上の患者１９名の血清のＱ　［）　１ａ。

ＧＭｌ　、ＧＤ２　、ＧＤ３　お、Ｊ：（ＦＧＭ３　ｋｍ対する反応性をＥＬＩ ＳＡとＩＴＬＣによってテストした。反応性は、全ａｍワクチン実験において１ ：４０のタイターでＧＤ２が認められた１名の患者の血清を除いて、０Ｍ２に限 られていた。タイターがに８０以上の血清は全てＩＴＬＣによっても分析した。

反応性は０Ｍ２に限られていた。ＥＬＩＳＡによる抗−ＧＭ２タイターがに８０ 以上である４つの血清を用いたＩＴＬＣテストを第２図に示す。抗−ＧＭ２タイ ターがこれより低い血清は一般にＩＴＬＣで分析することはできなかった。ワク チンを接種した患者のＧＭ２抗体は１９Ｍクラスに属していた。１ｇＧインジケ ーター系を用いたテストによって１９Ｇの抗−０Ｍ２はないことが判明した。

ＧＭ２抗体の補体依存性ｗｉ胞毒性。ワクチン接種の後ＧＭ２抗体の高タイター を示している患者の血清は、補体源として健常ヒト血清が存在している場合に０ Ｍ２１性の標的細胞に対して細胞毒性であることが判明した。０Ｍ２に陰性の標 的細胞は溶菌されなかった。表５に、ＥＬＩＳＡと細胞毒性テスト（ＳＫ−ＭＧ −６星ｍｕ腫使用、参考文献２）によって検出された抗−〇Ｍ２タイター間の関 係を示す。両アッセイにおける抗体タイターの１５には正の相関がみられた。

議論 これらの研究の目的は、マウスを０Ｍ２に対して確実に免疫化する方法を見い出 すことにあった。適当なアジュバントと混合したＧＭ２発現の照射全細胞を用い る免疫化は、選択可能な方法であることが予見されている。腫瘍細胞上および精 製ガングリオシド含有ワクチン内でのガングリオシドの相対的免疫原性を比較す るその他の研究はなされていないが、究極の目的物としてＤＴＨ又はｌ瘍拒絶（ ｔＬＩＩｏｒ　ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ　）を用イル蛋白質抗原又はグリコ蛋白質抗 原を利用した研究がなされている（３９〜４１）。これらの研究においては、照 射全細胞上に発現した抗原は同じ抗原精製物よりも確実に免疫原性であった。し かしながら、本発明の実験結果によると、０Ｍ２に対する抗体産生に関し、全細 胞ワクチンはそれ程免疫原性でなく、一部のマウスにのみ免疫応答を示した。更 に、本発明の実験結果から、ＧＭ２単独又は完全フロインドアジュバント中の０ Ｍ２は免疫原性ではないが、成る種のリポソーム調製物中に組み込まれるか又は ＢＯＧ若しくは特に酸加水分解のＲ５９５のようなバクテリアと混合した０Ｍ２ がはるかに免疫原性であることが判った。

実際、このようにして出現する０Ｍ２は、全腫瘍細胞上で発現する同社の０Ｍ２ よりも顕著に免疫原性である。０Ｍ２を発現する腫瘍細胞に対する確実な細胞障 害抗体応答が誘発された。

このことは、本発明においてＧ・Ｍ２に対する一連のモノクローナル抗体を産生 ずる上での新しい発現である。これらの結果とＤＴＨ若しくは腫瘍拒絶および蛋 白質若しくはグリコ蛋白質抗原を使用する先人研究者等の結果とを比較すると、 相互に相客れないものとなっているように思われる。ＧＭ２単独又は完全フロイ ンドアジュバントとの混合ＧＭ２を含むワクチンは、照射腫瘍細胞上で０Ｍ２を 発現するものよりも免疫原性ではない。

このように相違点は抗原が存在するということであり、このことは今まで蛋白質 又はグリコ蛋白質腫瘍抗原を用いて完全に調査研究されなかったことである。

グリコ脂質の免疫原性を増加させるベヒクルとして酸加水分解変異株５ａｌｓｏ ｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｅｓｏｔａ　Ｒ５９５を使用することは、Ｇａ１ａｎＯ８ｅ ｔ　ａｌによって初めて記載されている（２７）。Ｇａ１ａｎｏｓｅｔ　ａｌは 、バクテリアのりボボリサッカライドの脂質Ａ成分の免疫原性を増加させる上で 前記酸加水分Ｎ　Ｒ５９５又は完全７０インドアジユバントを見い出したのであ る。この手法はその後ＨａｋｏｍｏｒｉおよびＹｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌによって 用いられ、アジア０ＧＭ２　（４２）およびその他のグリコ脂質血液型抗原（４ ３）の免疫原性を増加し、血液型および腫瘍グリコ脂質（４４，４５）に対する 一連のモノクローナル抗体を調製している。本発明に於いては、Ｒ５９５が０Ｍ ２のようなガングリオシドに対する抗体を誘発するのにも利用し得ることが明ら かにされる。脂質Ａを用いたＧａ１ａｎｏｓ　ｅｔ　ａｌの研究（２７）以来、 グリコ脂質の免疫原性を増加させる別個の方法を見い出す研究は殆んどなされて いない。本発明者等は本発明の研究過程において、追加的研究の２つの他の価値 あるベヒクルとしてＢＣＧ含有リポソームおよびＭＰＬＡ含有リポソームを同定 することにより、グリコ脂質の抗体を誘発させる種々の方法を研究した。　Ｇａ １ａｎｏｓ　ｅｔ　ａｌ（２７）の研究結果、および酸処理Ｒ５９５が野生型Ｓ ａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ又はＥ、ｃｏ＋＋よりも優れているこ と及びＧＭ２／Ｒ５９５比が最も高いものがまた最も免疫原性であるという本発 明者等の知見から、酸処理Ｒ５９５が果す役割が明らかにされた。リポポリサッ カライドは２つの顕著な領域からなっており、親水性のポリサッカライド部分は 〇−特異鎖と基底コアー（ｂａｓａｌ　ｃｏｒｅ）とからなり、疎水性の脂質部 分は脂質Ａからなる。本発明者等の全ｔｉＡｗｊ。

ワクチンを用いた以前の研究（２０，２２）およびここに記載するリポソームを 用いた研究の成果から、脂質Ａが単一の最も可能性の高いアジュバントであるこ とが判った。Ｒ（ｒｏｕｇｈ）変異体５９５は脂質Ａを含むが、〇−特異鎖を含 んでいない。コアーのポリサッカライドは２−ケト−３−ジオキシオクトネート のみからなり、これはＧａ１ａｎｏｓ（２７）に記載されであるように酸加水分 解によって除去される。そのため、酸処理Ｒ５９５のｍ胞表面は非常に疎水性と なっており、０Ｍ２のような追加されるグリコ脂質を結合し濃縮するのに理想的 なものとなる。０Ｍ２は当該表面で濃縮され、セラミドが埋設されポリサッカラ イド（抗原）が露出されるように且つバクテリアの脂質Ａに非常に近接するよう に配向する。

リポソームは、免疫原性を増長させる配向で膜の上にグリコ脂質を濃縮させ、且 つグリコ脂質を選択アジュバントに非常に近接させる別個の方法である。本発明 者等の研究結果によると、リポソームの組成およびサイズの両方が重要であるこ とが判った。また、１つのアジュバントであるＭＰＬＡがリポソーム調製に最も 効果的であることも判った。変化物（ｖａｒｉａｂｌｅｓ）が制限され且つ迅速 にアドレスされるＧＭ２被覆Ｒ５９５およびＢＣＧを用いた本発明者等の研究と 違って、リポソームを用いた研究は研究のための追加的領域を示唆するのに役立 つだけであった。本発明者等は現在、脂質の組成、リポソームのサイズおよび電 荷、単層構造体対多層構造体の各影響、および抗原とリンフ才力インをリポソー ム内部でもなく、またリポソームの内部と表面でもなく、リポソームの表面に導 入する効果、更には種々の軍−アジュバント若しくはアジュバントの組合せの影 響を研究中である。

本発明において免疫化したマウスの多くは、神経毒およびその他の毒性の徴候を 示すことなく６ケ月以上抗体を産生し続けた。このことはもつともなことである 。というのは、０Ｍ２がヒトの小さな亜集団および（おそらくは）Ｂ−６７スト ロサイト（１）に存在するからである。実験的アレルギー性脳を髄炎（ＥＡＥ） は一般に、完全７０インドアジユバントのような適当なアジュバント中のミニリ ンの塩基性蛋白質を用いる免疫化によって誘発されるが、Ｎａｇａｉ　ｅｔ　ａ ｔ（４６）は、完全フロインドアジュバント中のＧＤ　Ｉａ又はＧＭＩを用いて ウサギを免疫化した場合にはＥＡＥについて記載されたのと同様の症候群すなわ ち後足まひとか時には死亡に至る症例が表われたと報告している。更に、Ｒａｐ ｐｏｒｔ　ｅｔ　ａｔ（４７）は、抗ＧＭ１抗体をウサギに脳内インジェクショ ンすると脳いっ血大発作が起こるが、その他の関連のない種々の抗原に対する抗 体をインジェクションしても当該大発作は起こらないことを記載している。ＥＡ Ｅは一般に短命であり、病気の進行に継続的な免疫化を要し、更には抗ＧＭ２抗 体活性に付随する自己免疫現象は報造されていないけれども、本発明者等はほぼ 一年の長きに亘って免疫マウスを観察したところ、抗ＧＭ２抗体と自己免疫疾患 との間には何の関連性もないことを確認した。

ヒト実験 もとの宿主で免疫原性である黒色腫細胞の表面抗原を同定することが、黒色腫患 者の血清（２１）、細胞障害Ｔ１１１１胞（２８，２９）およびｍＡ　ｂｓ（１ ５，３０）についての本発明者等の分析目的であった。

同座の宿主で免疫原性若しくは潜在的に免疫原性である黒色腫細胞の表面抗原の ３つの主要なカテゴリーは次のようになっている。すなわち、同座の黒色腫細胞 にのみ検出される非常に限定された抗原（クラス１　（ユニーク）抗原）から、 黒色腫のザブセットに存在する抗原に至る範囲に加えて他の細胞タイプの限定さ れた範囲（クラス２抗原）から、黒色腫および他のｌ胞タイプに広く分布する抗 原（クラス３抗原）の範囲である（２１）。

これらの黒色腫抗原の生化学的特徴づけは限られているが、クラス１　（ユニー ク）抗原はグリコ蛋白質（３１）であり、クラス２の黒色腫抗原のうちの最も研 究されたものの１つはガングリオシドＧＤ２　（１３，１４）である。これらの 抗原に対する反応性は数パーセントの黒色腫患者にのみ見い出されているので、 本発明者等はこれらの抗原を発現する照射細胞のワクチンを用いてクラス１又は クラス２の抗原に対する抗体の誘発を試みた（１６〜２０）。これらのヒト実験 は成功的ではなかったので、０ａｔｈ　Ａ肉！！　（２２，２３）およびガング リオシドＧＭ２　（２０，２４）のクラス１抗原を含むマウスのｍｇ抗原に対す る確実なヒトの免疫応答に必要な条件を明らかにしなければならなかった。マウ ス研究においてはアジュバント並びに低投与量のＧｙを用いた前処置が重要な因 子であったが、本発明のヒト実験の結果からも黒色腫患者におけるこれらの重要 性が明らかとなった。

Ｉｒ１ｅ、Ｔａｉ、Ｈｏｒｔｏｎおよび共同研究者達はまた、彼らの黒色腫患者 の研究において０Ｍ２の免疫原性を明らかにしている（１１゜１２）。彼らは、 ０Ｍ２のｉＡｂを産生する黒色腫患者からエプスタイン−パールウィルス形質転 換Ｂ１１１胞の安定な培養物を単離している（１２）。加えて、Ｔａｉ　ｅｔ　 ａｌはガングリオシドの混合物を含む黒色Ｍ［ｌ胞ワクチンを用いて黒色腫患者 を免疫化し、２６人の患者中１０人にＧＭ２に対する反応性が認められたことを 発見している（１１）。本発明の研究においては、ＧＤ２に対する反応性はその シリーズでほんの少ししか認められず（２６人の患者中２人）　、ＧＤ３又は０ Ｍ３に対する抗体も見い出されなかった。

本発明者等およびその他の研究者等は、最大かの正常個体（１０）およびワクチ ン接種をしていない第３期黒色腫患者において低レベルのＧＭ２抗体を見い出し ている。皮膚および局所のリンパ節における黒色腫の自然成長はＧＭ２抗体の生 成に潜在的な刺激にならないようである。というのは、第３期黒色ｍ息者の抗体 レベルは正常個体に比してより高くないからである。

殆んどの黒色腫患者がワクチンの接種後＾レベルのＧＭ２抗体を産生じ得るよう になるという事実は、脳および神経外胚菓起源の他の組織中にこれらのガングリ オシドが存在することに鑑みると驚くべきことである。ＧＭ２ワクチンの他の発 見は、ＧＭ２抗体の高い力価がこれらの患者にとって明白な病因とならないとい うことである。

本発明の研究から、黒色腫の再発がＧＭ２抗体を産生ずる患者にあっては遅延さ れることが判った。本発明の研究において３１人のワクチン接種患者を１５ケ月 に亘って観察したところ、ＧＭ２力価が１：２０若しくはそれ以下の１４人の患 者のうち５人は、ＧＭ２力価が１：４０若しくはそれ以上の１７人の患者のうち の１４人に比較して病気の治癒が認められた。

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Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．当該ワクチンが投与される被検体においてＧＭ２に抗する抗体の産生を刺激 または増進するためのワクチンであって、該被検体における抗体産生を刺激また は増進するのに有効な量の精製されたＧＭ２と、有効量の微生物アジュバントと 、薬剤として許容される担体とからなる前記ワクチン。
2. ２．被検体がヒトである、請求の範囲１のワクチン。
3. ３．ＧＭ２が微生物アジュバントに結合されている、請求の範囲１のワクチン。
4. ４．ＧＭ２の脂質部分と微生物アジュバントの細胞膜との間の疎水性結合によっ てＧＭ２が微生物アジュバントに結合されている、請求の範囲３のワクチン。
5. ５．微生物アジュバントがサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｉ ｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５９５である、請求の範囲１のワクチン。
6. ６．微生物アジュバントがカルメットグラン菌（ＢＣＧ、ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃ ａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）である、請求の範囲１のワクチン。
7. ７．ＧＭ２の有効量が約５０μｇと約３００μｇの間の量である、請求の範囲１ のワクチン。
8. ８．サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５ ９５の有効量が約０．２ｍｇと約１．５ｍｇの間の量である、請求の範囲５のワ クチン。
9. ９．カルメットゲラン菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ ）の有効量が約１０５生菌単位と約３×１０７生菌単位の間の量である、請求の 範囲６のワクチン。
10. １０．被検体が癌に罹患しており、ワクチンの投与によって該被検体で産生され る抗体が該癌を有効に処置する、請求の範囲１のワクチン。
11. １１．被検体が癌に罹患しやすく、ワクチンの投与によって該被検体で産生され る抗体が該癌を有効に予防する、請求の範囲１のワクチン。
12. １２．癌が神経性外胚葉に由来する、請求の範囲１０または１１のワクチン。
13. １３．神経性外胚葉由来の癌が黒色腫（メラノーマ）である、請求の範囲１２の ワクチン。
14. １４．請求の範囲１のワクチンを有効用量で被検体に投与することからなる、被 検体においてＧＭ２に抗する抗体の産生を刺激または増進する方法。
15. １５．請求の範囲１０のワクチンを有効用量で被検体に投与することからなる、 癌に罹患した被検体において癌を処置する方法。
16. １６．請求の範囲１１のワクチンを有効用量で被検体に投与することからなる、 癌に罹患した被検体において癌を予防する方法。
17. １７．ＧＭ２が微生物アジュバントに結合されている、請求の範囲１４、１５ま たは１６のいずれかの方法。
18. １８．ＧＭ２の脂質部分と微生物アジュバントの細胞膜との間の疎水性結合によ ってＧＭ２が微生物アジュバントに結合されている、請求の範囲１４、１５また は１６のいずれかの方法。
19. １９．微生物アジュバントがサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ ｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５９５またはカルメットゲラン菌（ＢＣＧ、ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）である、請求の範囲１４、１５または １６のいずれかの方法。
20. ２０．癌が神経性外胚葉に由来する、請求の範囲１５または１６の方法。
21. ２１．神経性外胚葉由来の癌が黒色腫である、請求の範囲２０の方法。
22. ２２．ワクチンを投与する前に有効量のシクロホスフアミドを被検体に投与する 、請求の範囲１４、１５または１６の方法。
23. ２３．ワクチンを投与する前約３日〜約７日の間シクロホスフアミドを投与する 、請求の範囲２２の方法。
24. ２４．シクロホスフアミドの有効量が約１ｍｇ／ｍ２と約５００ｍｇ／ｍ２の間 である、請求の範囲２２の方法。