FI117668B - Menetelmä gangliosidi-KLH-konjugaattia ja QS-21-ainetta sisältävän koostumuksen valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä gangliosidi-KLH-konjugaattia ja QS-21-ainetta sisältävän koostumuksen valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI117668B FI117668B FI953529A FI953529A FI117668B FI 117668 B FI117668 B FI 117668B FI 953529 A FI953529 A FI 953529A FI 953529 A FI953529 A FI 953529A FI 117668 B FI117668 B FI 117668B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- patients
- ganglioside
- klh
- conjugate
- vaccine
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 37
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 claims abstract description 169
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 67
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 48
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 35
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 claims description 26
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims description 25
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims description 24
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 18
- -1 ε-aminolysyl group Chemical group 0.000 claims description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 claims description 11
- 241001092142 Molina Species 0.000 claims description 10
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 claims description 10
- 241001454523 Quillaja saponaria Species 0.000 claims description 9
- 125000001549 ceramide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 7
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 7
- WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N (-)-D-erythro-Sphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCC=CC(O)C(N)CO WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 claims description 6
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 claims description 6
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N sphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)CO WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N 0.000 claims description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 claims description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 4
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 claims description 3
- 241000219287 Saponaria Species 0.000 claims description 2
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 167
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 52
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 abstract description 44
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 25
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 abstract description 7
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 110
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 106
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 104
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 99
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 99
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 98
- 230000004044 response Effects 0.000 description 86
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 59
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 59
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 57
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 43
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 42
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 42
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 41
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 40
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 37
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 36
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 35
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 35
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 34
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 33
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 32
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 32
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 30
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 30
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 29
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 29
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 27
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 24
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 23
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 22
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 22
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 description 20
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N DDT Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(C(Cl)(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 19
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 19
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 18
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 16
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 16
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 16
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 16
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 15
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 15
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 15
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 14
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 14
- GIVLTTJNORAZON-HDBOBKCLSA-N ganglioside GM2 (18:0) Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 GIVLTTJNORAZON-HDBOBKCLSA-N 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 14
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 14
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 11
- IESOVNOGVZBLMG-BUZVEHKISA-N alpha-Neup5Ac-(2->8)-alpha-Neup5Ac-(2->3)-beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-Glcp Chemical compound O1[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(=O)C)[C@@H](O)C[C@@]1(C(O)=O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C[C@@](C(O)=O)(O[C@@H]2[C@H]([C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]3CO)O)O[C@H](CO)[C@@H]2O)O)O1 IESOVNOGVZBLMG-BUZVEHKISA-N 0.000 description 11
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 10
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 10
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 10
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 10
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 9
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 9
- 208000030247 mild fever Diseases 0.000 description 9
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 8
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 8
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 8
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 8
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 8
- VNDWQCSOSCCWIP-UHFFFAOYSA-N 2-tert-butyl-9-fluoro-1,6-dihydrobenzo[h]imidazo[4,5-f]isoquinolin-7-one Chemical compound C1=2C=CNC(=O)C=2C2=CC(F)=CC=C2C2=C1NC(C(C)(C)C)=N2 VNDWQCSOSCCWIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 7
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 7
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 7
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 7
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 7
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 6
- 241000722985 Fidia Species 0.000 description 6
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 6
- 235000015155 buttermilk Nutrition 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 6
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 6
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 6
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 5
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 5
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 5
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 5
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 5
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 5
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 5
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 5
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LLKFNPUXQZHIAE-UHFFFAOYSA-N 5-(3-aminopropyl)-8-bromo-3-methyl-2h-pyrazolo[4,3-c]quinolin-4-one Chemical compound O=C1N(CCCN)C2=CC=C(Br)C=C2C2=C1C(C)=NN2 LLKFNPUXQZHIAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 4
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 4
- 241000897276 Termes Species 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 4
- 210000004520 cell wall skeleton Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 4
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 4
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 4
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 3
- 208000006313 Delayed Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 206010022004 Influenza like illness Diseases 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- FOCMISOLVPZNSV-CANPYCKCSA-N N-[(E,2R,3S)-1-[5-[5-[3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3-hydroxyoctadec-4-en-2-yl]octadecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@H](COC1OC(CO)C(OC2OC(CO)C(OC3OC(CO)C(O)C(O)C3NC(C)=O)C(O)C2O)C(O)C1O)[C@@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC FOCMISOLVPZNSV-CANPYCKCSA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 3
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 3
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 150000002271 geminal diols Chemical class 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 3
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 3
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 229950003063 mitumomab Drugs 0.000 description 3
- 238000009448 modified atmosphere packaging Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000009021 pre-vaccination Methods 0.000 description 3
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 3
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 2
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001222774 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Minnesota Species 0.000 description 2
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- MGWWWSRHCOVLIU-UHFFFAOYSA-N benzene-1,3-diol;hydrochloride Chemical compound Cl.OC1=CC=CC(O)=C1 MGWWWSRHCOVLIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;ethanol Chemical compound CCO.O=C=O OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClC(Cl)Cl SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000012059 conventional drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- MCWXGJITAZMZEV-UHFFFAOYSA-N dimethoate Chemical compound CNC(=O)CSP(=S)(OC)OC MCWXGJITAZMZEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- VIYFPAMJCJLZKD-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 VIYFPAMJCJLZKD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000000574 ganglionic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000033687 granuloma formation Effects 0.000 description 2
- 125000001145 hydrido group Chemical group *[H] 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N keto-neuraminic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)C[C@H](O)[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N 0.000 description 2
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 2
- 238000007449 liver function test Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 2
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 210000001020 neural plate Anatomy 0.000 description 2
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 2
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- UGXDVELKRYZPDM-XLXQKPBQSA-N (4r)-4-[[(2s,3r)-2-[[(2r)-2-[(2r,3r,4r,5r)-2-acetamido-4,5,6-trihydroxy-1-oxohexan-3-yl]oxypropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-amino-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O UGXDVELKRYZPDM-XLXQKPBQSA-N 0.000 description 1
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100022548 Beta-hexosaminidase subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 241000037164 Collema parvum Species 0.000 description 1
- 238000006847 Criegee reaction Methods 0.000 description 1
- 235000016936 Dendrocalamus strictus Nutrition 0.000 description 1
- SDKQRNRRDYRQKY-UHFFFAOYSA-N Dioxacarb Chemical compound CNC(=O)OC1=CC=CC=C1C1OCCO1 SDKQRNRRDYRQKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010061819 Disease recurrence Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 1
- 101000597577 Gluconacetobacter diazotrophicus (strain ATCC 49037 / DSM 5601 / CCUG 37298 / CIP 103539 / LMG 7603 / PAl5) Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010050195 Haemophilus influenzae-type b polysaccharide-Neisseria meningitidis outer membrane protein conjugate vaccine Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010022086 Injection site pain Diseases 0.000 description 1
- 206010053425 Injection site swelling Diseases 0.000 description 1
- 206010022105 Injection site ulcer Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000542855 Megathura crenulata Species 0.000 description 1
- 102000007557 Melanoma-Specific Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010071463 Melanoma-Specific Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027459 Metastases to lymph nodes Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 1
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 208000009277 Neuroectodermal Tumors Diseases 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001092473 Quillaja Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 101150094608 SAFB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100476722 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SBA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010051837 Skin induration Diseases 0.000 description 1
- 208000033809 Suppuration Diseases 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 208000022292 Tay-Sachs disease Diseases 0.000 description 1
- 206010053614 Type III immune complex mediated reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000863480 Vinca Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 231100000230 acceptable toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 230000000719 anti-leukaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003127 anti-melanomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- CXQCLLQQYTUUKJ-ALWAHNIESA-N beta-D-GalpNAc-(1->4)-[alpha-Neup5Ac-(2->8)-alpha-Neup5Ac-(2->3)]-beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-Glcp-(1<->1')-Cer(d18:1/18:0) Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 CXQCLLQQYTUUKJ-ALWAHNIESA-N 0.000 description 1
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010277 boron hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229920005549 butyl rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N chembl1408157 Chemical compound N=1C2=CC=CC=C2C(C(=O)O)=CC=1C1=CC=C(O)C=C1 KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006757 chemical reactions by type Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- OTKJDMGTUTTYMP-UHFFFAOYSA-N dihydrosphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(N)CO OTKJDMGTUTTYMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDUPRNVPXOHWIL-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfite Chemical compound COS(=O)OC BDUPRNVPXOHWIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- YVBGRQLITPHVOP-UHFFFAOYSA-L disodium;[hydroxy-[hydroxy(oxido)phosphoryl]oxyphosphoryl] hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])(=O)OP(O)(=O)OP(O)([O-])=O YVBGRQLITPHVOP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000002745 epiphysis Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012812 general test Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910000042 hydrogen bromide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229960005375 lutein Drugs 0.000 description 1
- KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N lutein Chemical compound C([C@H](O)CC=1C)C(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\[C@H]1C(C)=C[C@H](O)CC1(C)C KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N 0.000 description 1
- ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N 0.000 description 1
- 235000012680 lutein Nutrition 0.000 description 1
- 239000001656 lutein Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000000684 melanotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- RJYJPRXPYLGEIZ-UHFFFAOYSA-N methylperoxyperoxymethane Chemical class COOOOC RJYJPRXPYLGEIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 1
- 230000003533 narcotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 238000006385 ozonation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000012746 preparative thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 208000029340 primitive neuroectodermal tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000013557 residual solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 230000018040 scab formation Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000013362 sialic acid assay Methods 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- OTKJDMGTUTTYMP-ZWKOTPCHSA-N sphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@@H](N)CO OTKJDMGTUTTYMP-ZWKOTPCHSA-N 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009121 systemic therapy Methods 0.000 description 1
- FKHIFSZMMVMEQY-UHFFFAOYSA-N talc Chemical compound [Mg+2].[O-][Si]([O-])=O FKHIFSZMMVMEQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N trans-lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N xanthophyll Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C=C(C)C(O)CC2(C)C FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/001171—Gangliosides, e.g. GM2, GD2 or GD3
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
117668
Menetelmä gangliosidi-KLH-konjugaattia ja QS-21-ainetta sisältävän koostumuksen valmistamiseksi
Keksintö on tehty Yhdysvaltain hallituksen apura-5 hän 5 nro ROI CA40532 tuella. Yhdysvaltain hallituksella on siten tiettyjä oikeuksia tämän keksinnön suhteen.
Keksinnön tausta
Gangliosidit ovat sialihappoa sisältäviä glykos-fingolipideja, jotka koostuvat hydrofobiseen keramidiosaan 10 liittyneestä monimutkaisesta hiilihydraattiosasta. Hiili- j hydraattiketju on tunkeutunut solukalvon ulkokelmuun ja se on kosketuksessa soluväliaineeseen. Gangliosidien koostu- ' \ muksessa on solujen erilaistumisen ja lisääntymisen aikana havaittu tapahtuvan kvalitatiivisia ja kvantitatiivisia 15 muutoksia ja nämä muutokset näyttävät kuvastavan sellaisten syöpien malignin transformaation astetta, joita esiintyy neuroektodermaalista alkuperää olevissa kudoksissa (Hakomori, 1985). Malignit melanoomasolut ilmentävät normaalien melanosyyttien erittämän pääasiallisen gangliosi-20 din, GM3:n, lisäksi useita erilaisia monimutkaisia gang-liosidejä (Carubia, et ai., 1984). Melanooman muuttunut :1·1; gangliosidiaineenvaihdunta saa lisäksi aikaan GD3:n, .'.j GD2:n, GM2:n, 9-0-asetyyli-GD3: n ja GT3:n ilmentymisen • · : (Hamilton, et ai., 1993; Tsushida, et ai., 1987). Kun po- • · · • · · # ··· 25 tilalta on hoidettu anti-GD3:a vastaan suunnatuilla mono- • 1 · • · I I klonaalisilla vasta-aineilla, niin tämän on johtanut tu- • ♦ 1 lehduksen muodostumiseen kasvaimen kohdalle ja metastaasi- * 1 1 ’2 1 en koon on toisinaan havaittu osittain pienentyneen, mikä viittaa siihen, että gangliosidit ovat sopivia kohteita 30 solujen tuhoamiseksi immunologisin keinoin (Houghton, et • · · ai., 1985), Melanoomapotilailta peräisin olevan GD3:n « .···. kanssa reagoivien humaani-mAb-molekyylien muodostuminen * 1 (Yamaguchi, et ai., 1987) tukee ajatusta, että myös gang- * · . liosidit ovat potentiaalisia immunogeenejä.
·· · * · 1 • · • · *·· • · · 2 * · / 2 117668
Tutkimuksissa, joissa melanoomapotilaissa pyrittiin aktiivisella immunisaatiolla saamaan aikaan humoraa-linen vaste gangliosidejä vastaan, vaikuttivat GM2/BCG-rokotteet olevan tehokkaimpia (Livingston, et ai., 1987; 5 Livingston, et ai., 1989). Satunnaistetussa tutkimuksessa 122:11a leikkauksen jälkeen oireettomaksi todetulla mela-noomapotilaalla, joista 64:aa hoidettiin pelkästään BCG:llä ja 58:aa GM2/BCG:llä, osoitettiin suurimmalle osalle (86 %:lle) GM2-rokotetta saaneista potilaista muo-10 dostuvan vasta—aineita. GM2:ta vastaan suunnattuja vasta-aineita muodostaneet potilaat pysyivät elossa oireettomina sekä yleensä elossa merkittävästi pitempään kuin vasta-aineen suhteen negatiiviset potilaat. Tämän tutkimuksen kahta osa-aluetta toisiinsa verrattaessa havaittiin 15 GM2/BCG-rokotetta saaneiden potilaiden pysyneen oireettomina 17 % pitempään ja näiden eloonjääminen oli 9 % parempaa kuin BCG-kontrolliryhmällä, vaikkakaan kumpikaan tubs ' 1 ei ollut tilastollisesti merkittävä (Livingston, at ai., 1993a). Immuunivaste oli valitettavasti ainoastaan lyhyt-20 kestoinen, koostui pääasiassa IgM:stä ja oh tiitteriltään vaatimatonta luokkaa. Tämä viittasi GM2:n tunnistamisen T-·1·1: soluista riippumattomana antigeeninä tapahtuneen siitä .‘.J syystä, että se on hiilihydraattiantigeeni (Livingston, at * · : ai., 1989) ja lisäksi siitä syystä, että gangliosidit ovat * · 1 ;1V 25 joidenkin normaalien kudosten pinnalla ilmentyviä autoan- • · | 1 tigeenejä (Hamilton, et ai., 1993). Samanlaisissa poti- * · · .
lailla tehdyissä tutkimuksissa, joissa käytettiin GD2- ja * · · "·1 1 9-0-asetyyli-GD3-rokotteita, saatiin tulokseksi joissakin tapauksissa matalia tiittereitä eikä minkäänlaista GD3:a 30 vastaan suunnattua vasta-ainevastetta pystytty havaitse- • · · :..,ί maan (Livingston, 1991) .
···'.
• · • · ··· *·2 * · • · · * · · • · * · t • · · • ·1 2 • · 3 117668
Joissakin tapauksissa gangliosidejä vastaan suunnattuja immuunivasteita on pystytty tehostamaan uusilla tehokkaammilla adjuvanteilla mutta erityisesti autoantigeenien, kuten tuumoreihin liittyvien gangliosidien, ky-5 seessä ollessa on jouduttu käyttämään toisenlaista lähestymistapaa. Landsteinerin klassisten hapteeneja ja kantaja-aineita koskevien kokeiden (Landsteiner ja Chase, 1942) perusteella immuunivastetta on pystytty tehostamaan menes-tyksellisesti liittämällä heikosti immunogeenisiä anti-10 geenejä immunogeenisiin kantajaproteiineihin kovalentti- silla sidoksilla. Esimerkiksi reagointiherkkyys muita hiilihydraatteja kuin gangliosidejä vastaan on kyetty saamaan - aikaan suorittamalla konjugointi sopiviin kantajaproteiineihin. Bakteerien kapselipolysakkarideihin liittäminen 15 immunogeenisiin proteiineihin on osoittautunut immuunivas tetta ja immunologista suojavaikutusta merkittävästi parantavaksi (Eskola, at ah., 1990). Äskettäin on reikäkoti-lon hemosyaniiniin konjugoidulla synteettisellä Thompson Friedenreich -tuumoriantigeenillä tehdyllä rokotuksella 20 saatu munasarjasyöpäpotilaissa aikaan humoraalinen IgM- ja IgG-vaste (McLean, at ah., 1992). Yhteisenä merkittävänä :T: havaintona näissä tutkimuksissa oh isotyypin muuttuminen •\· lyhytkestoisesta IgM-vasteesta pitkäkestoiseksi suuriaffi- • * : .*. niteettiseksi IgG-vasteeksi, mikä viittaa siihen, että • * · ^ • · · 25 hiilihydraatteja vastaan suunnatut T-soluista riippuvaiset • · \ 1 reaktiotiet ovat todennäköisesti aktivoituneet. Tässä kek- • * · • · · "*.* sinnössä tätä lähestymistapaa on sovellettu GD3-melanooma- * · · *** tuumoriantigeeniin menetelmän kehittämiseksi gangliosidi- proteiinikonjugaattirokotteiden syntetoimiseksi ja eri- • ·#· W 30 laisten GD3-proteiinikonjugaattien immunogeenisyyden tut- * · · ·...· kimiseksi hiirissä.
• ♦ · • · • * • · « · '· • * • ... * ·· « • · * • · • * • · • ·· • · 4 117668
Keksinnön yhteenveto Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön menetelmä koostumuksen valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että a) muodostetaan gangliosidijohdannaisen (i), joka käsittää 5 muuttamattoman oligosakkaridiosan ja muutetun kerami-diosan, konjugaatti immunogeeniseen proteiinipohjaiseen kantajaan (ii); b) lisätään saponiinia, jota saadaan Quil-laja saponaria Molina -puun kaarnasta; ja c) lisätään farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa; jossa konjugaatin ja 10 saponiinin suhteelliset määrät ovat tehokkaita stimuloimaan tai tehostamaan vasta-aineen tuotantoa potilaassa, jossa immunogeeninen proteiinipohjainen kantaja on saatu proteiinista, joka on valittu malarian T-solu epitoopista,
Neisseria meningitidiksen uikomembräänin proteiinista, ka- , 15 tionisoidusta naudan seerumin albumiinista, reikäkotilon hemosyaniinista tai sen johdannaista, tai polylysiinista; jossa gangliosidijohdannaisen konjugaatti on konjugoitu i immunogeeniseen proteiinipohjaiseen kantajaan gangliosidi-johdannaisen keramidista peräisin olevan hiilen kautta.
20 Piirrosten lyhyt kuvaus
Kuvio 1. GD3-proteiinikonjugaattien synteesi ot-;*·*; sonilla pilkkomisen ja pelkistävän aminoinnin jälkeen.
: Upotuskuviossa on esitetty GD3:n HPTLC-analyysi ennen * · : pilkkomista (A) ja sen jälkeen (B) .
• * ' J-V 25 Kuviot 2A ja 2B. GD3-KLH-antiseenumien IgM- (a) ja • * * I IgG- (b) vasta-ainepitoisuudet ajan suhteen. Kuviossa ku- • · · ··:'* *·;,· kin symboli edustaa yhtä hiirtä. s • · * *·* ‘ Kuviot 3A ja 3B. Immunologinen ohutkerroskromato- grafia kolmen hiiren antiseerumeista GD3-KLH:lla tehdyn 30 rokotuksen jälkeen. IgG- (a) ja IgM- (b) vasta-aineiden • · · ϊ,,.ϊ reagoivuudet tutkittiin käyttäen A, ihmisen aivojen gang- ,···. liosideja, B, neuroblastoomagangliosideja, C, melanooma- • · gangliosidia ja D, GD3-antigeenia.
• · ·* · ··· • * • · • · • · · ··· • · 5 117668
Kuvio 4. Immunoblotti neljästä eri hiirestä immuunivasteen spesifisyyden osoittamiseksi. Puhtaalle gang-liosidille on tehty täpläblotit ja näitä on inkuboitu hiiristä peräisin olevien seerumien kanssa.
5 Kuvio 5. Hiiren seerumin reagoivuudesta tehty edustava FACS-analyysi ennen (piikki kohdalla 3) immunisointia GD3-KLH:lla ja QS-21:llä ja sen jälkeen (piikki kohdalla 50) melanoomasolulinjalla SK-MEL-28 tutkittuna.
Kuviot 6A ja 68. GM2-KLH-antiseerumien IgM (a) ja 10 IgG (b) -vasta-ainepitoisuudet ajan suhteen. Kuviossa kukin symboli edustaa yhtä potilasta.
Kuvio 7. GM2-vasta—aineen havaitseminen immunologisella täpläblottivärjäyksellä GM2-konjugaattirokotteella ja adjuvantilla rokotettujen potilaiden seerumeista. Gang-15 liosidistandardeja pipetoitiin täpliksi nitroselluloosa-liuskoille (merkitty pystyakselille) ja niiden annettiin reagoida ennen rokotusta eri potilailta otettujen seerumien ja rokotuksen jälkeen en potilailta tiitterin huipun kohdalta otettujen seerumien kanssa sekä peroksidaasilei-20 maila varustetun vuohessa tehdyn humaani-IgM— tai IgG—vasta-aineetta vastaan suunatun antiseerumin kanssa. Liuskat on arvioitu asteikolla 0 - 3+. GM2:n positiivisena kont-;1·,· rollina on käytetty MAb 696: ta.
: Kuviot 8A-1 ja 8A-2. GM2-KLH + QS-21 -rokotteella ♦ · · • · 1 · 25 immunisoiduista potilaista tiitterin huipun kohdalla tai- • · | ^ teen otettujen seerumien spesifisyys määritettynä immuno- • · 1 *".1 ohutkerroskromatografisesti aikaisemmin kuvatulla tavalla • 1 · *** (3, kolmannen koesarjan kirjallisuusviite). TLC-levyille pipetoitiin GM2:ta ja melanoomakudoksen gangliosidiuutet- • · # • · · • · · • · * · • · 1 * 1 1 * · * · 1 • · · 1 · • 1 ♦ 1 · • 1 · • · • · « • · · I «« • · 6 117668 ta, niitä inkuboitiin eri potilaista peräisin olevien seerumien kanssa ja värjättiin peroksidaasileimalla varustetulla vuohessa tehdyllä humaani-IgM:ää tai IgG:tä vastaan suunnatulla vasta-aineella. GM2:n positiivisena kontrolli-5 na käytettiin MAID 696:ta ja gangliosidien värjäykseen re-sorsinolivärireagenssia.
Kuvio 8B. Potilasseerumin GM2:ta ja GD2:ta vastaan suunnatun IgG-reagoivuuden inhibitio. HPTLC-levyille pipe-toitiin GM2:ta (A) ja melanoomakudoksesta tehtyä gang-10 liosidiuutetta (B), niitä inkuboitiin potilaasta nro 2 peräisin olevan seerumin kanssa ja värjättiin peroksidaasileimalla varustetulla vuohessa tehdyllä humaani-IgG:tä vastaan suunnatulla vasta-aineella. Ennen immuuni-värjäystä esi-inkuboitiin 3 ml suhteessa 1:50 laimennettua 15 potilasseerumia joko 150 pg:n suuruisen GM2-erän kanssa tai 150 pg:n suuruisen GD2—erän kanssa.
Kuviot 9A ja 9B. IgM- ja IgG-vasta-ainevasteet me- lanoomapotilailla QS-21:tä sisältävällä GM2-KLH-rokot- teella suoritetun immunisoinnin jälkeen. Kuviossa 9A on 20 esitetty peräkkäiset tulokset kuudesta potilaasta, joille oh annettu 100 pg:n suuruinen QS-21-annos, ja kuviossa 98 tulokset kuudesta potilaasta, joille oli annettu 200 pg:n ·\ϊ suuruinen annos. On otettava huomioon, että yhdelle poti- • · : .·. laalle kummassakin ryhmässä annettiin ainoastaan neljä ro- * 1 2 3 · • · · » ··,1. 25 kotusta taudin etenemisen takia. Syklofosfamidi- (Cy) ja • · ! GM2-KLH ynnä QS-21 -rokoteinjektioiden ajankohdat on mer- *“.1 kitty nuolilla.
* 1 1 ** Kuviot 10A ja 10B. GM2-vasta-aineen havaitseminen täpläblotti-immunovärjäyksellä kymmenen GM2-KLH:lla roko-30 tetun potilaan seerumista. Gangliosidistandardeja pipetoi- * 1 · tiin nitroselluloosaliuskoille (vasemmanpuolisten merkin— t *·· • · • · • 1 1 • · « · · * · · · ··· 2 • · * · 3 • 1 · * 1 7 117668 töjen mukaan) ja niitä inkuboitiin ensin seerumien kanssa, minkä jälkeen ne pestiin ja niitä inkuboitiin sitten pe-roksidaasileimalla varustetun vuohessa tehdyn humaani-IgM:ää tai -IgG:tä vastaan suunnatun vasta-aineen kanssa.
5 Kuviossa on esitetty tulokset, jotka on saatu käyttäen kuhunkin viiteen en QS-21-annoksia saavaan ryhmään kuuluneen kahden potilaan seerumia (yläpuolisten merkintöjen mukaisesti) . Kustakin potilaasta on esitetty seerumit, jotka tutkittiin ennen immunisointia (a) ja sen jälkeen (b) . 10 Hiiressä tehty monoklonaalinen vasta-aine 696 on GM2:ta vastaan suunnattu IgM-vasta-aine ja 3F8 on GD2:ta vastaan suunnattu IgG—vasta-aine. GMl:ta vastaan suunnattua IgM-vasta-ainetta havaittiin useimpien potilaiden seerumeista sekä ennen rokotusta että sen jälkeen. Ennen rokotusta yh-15 dessäkään näistä potilaista ei havaittu GM2:ta vastaan suunnattuja IgM—vasta-aineita eikä IgG-vasta-aineita. Kaikkien potilaiden seerumeista havaittiin rokotuksen jälkeen GM2:ta vastaan suunnattuja IgM-vasta-aineita ja IgG-vasta-aineita. Reaktiot luokiteltiin asteikolla 0, 1+, 2+ 20 tai 3+. Esimerkki tässä määrityksessä käytetystä reaktion luokituksesta on: Potilas 1 (100 pg QS-21) IgG (ennen ro- ;1j1. kotusta/rokotuksen jälkeen) : KLH 1+12 + , GM3 0/0, GM2 0/3+, .·. : GMl 1 + /1 + , GD3 0/0, GD2 0/1 + , GDlb 0/0.
* 1 · * 1 : Kuviot 11A ja 118. IgM—vasta-ainevasteet mela- * 1 1 ' "V 25 noomapotilailla sen jälkeen, kun näitä oli immunisoitu • · ! I GM2/BCG-rokotteella. Kuviossa on esitetty peräkkäiset tu- * 1 · ·;!/ lokset viideltä potilaalta, joita hoidettiin tutkimusjak- • · · *·1 son neljän ensimmäisen kuukauden aikana (ryhmä A) ja vii deltä potilaalta, joita hoidettiin tutkimusjakson neljän • '' 30 jälkimmäisen kuukauden aikana (ryhmä B) . Syklofosfamidi- (Cy) ja GM2-KLH- ynnä QS—21-rokotteiden injektioajankohdat .···. on merkitty nuolilla.
* · 1 ·1··1' • · ·1· * 1 · • 1 • · · • 1 1 • t 1 8 : 117668
Kuvio 12. GM2-vasta-aineen havaitseminen täplä- blotti-immunovärjäyksellä kymmenen GM2/BCG:llä rokotetun melanoomapotilaan seerumista. Gangliosidistandardeja pipe-toitiin nitroselluloosaliuskoille (vasemmanpuolisten mer-5 kintöjen mukaisesti) ja niitä inkuboitiin ensin seerumien kanssa ja sitten pesun jälkeen peroksidaasileimalla varustetun vuohessa tehdyn humaani-IgM:ää vastaan suunnatun vasta-aineen kanssa. GM2-MEL tarkoittaa melanoomakoepala-näytteistä uutettua puhdistettua GM2:ta, kaikki muut gang-10 liosidit, GM2 mukaan luettuna, olivat peräisin naudan aivoista. Kuvioon on merkitty potilaiden numerot (6 - 58) ja jokaisen potilaan kohdalla on esitetty seeruminäytteet ennen immunisointia (a) ja sen jälkeen (ID). 696 on GM2:ta ja 3G6 on GD2:ta vastaan suunnattu hiiressä tehty monoklo-15 naalinen IgM-vasta-aine. Näistä 10 potilaasta peräisin olevista seerumeista havaittiin rokotuksen jälkeen GM2-vasta-ainetta. GMl-vasta-ainetta havaittiin ennen hoitoa ja sen jälkeen potilaan 53 seerumista ja hoidon jälkeen potilaan 57 seerumista. Reaktiot luokiteltiin asteikolla 20 0, 1+, 2+ tai 3+. Esimerkkejä reaktioiden luokituksesta ovat: Potilas 8 GM2 3+, GM2-MEL 2+, potilas 54 GM2 3+, GM2-MEL 1+ ja potilas 57 GM2 3+, GM2-MEL 3+. Rokotuksen ,·. : jälkeen otetuilla seerumeilla ja hiiressä tehdyllä mono- • · · ; klonaalisella vasta-aineella 696 havaittu heikompi rea- »t· II1.’ 25 goivuus GM2-MEL:ia vastaan kuin GM2:ta vastaan johtuu sii- • · I I tä, että liuskoille lisättiin pienempi määrä GM2-MEL- t · 1 ·;;/ gangliosidia.
• · 1 *·1 ’ Kuvio 13. Kaplan-Meien-kuvaajat oireettomasta jak sosta ja eloonjääneiden kokonaismäärästä potilailta, jotka 30 rokotuksen jälkeen muodostivat GM2-vasta-ainetta. Potilaat ί luokiteltiin positiivisiksi, jos GM2-neagoivuus oli a) y—m täpläbloteissa 2+ tai 3+ ELISA-tiitterin ollessa > 1/20 • · ***, tai b) täpläbloteissa 1+ ELISA-tiitterin ollessa > 1/80.
• · • · · · ! Φ 1 · * · * 1 ...
i · **· • 1 1 * · 9 117668
Kuvio 14. Kaplan-Meier-kuvaajat oireettomasta jaksosta ja eloonjääneiden kokonaismäärästä 59 potilailta, joille oh annettu satunnaistetusti BCG:tä ja 57 potilaalta, joille oli annettu satunnaistetusti GM2/BCG:tä, lukuun 5 ottamatta kuutta potilasta, jotka tuottivat GM2-vasta-ai-netta ennen immunisointia (viisi BCG-ryhmässä ja yksi GM2/BCG-ryhmässä).
Kuvio 15. Kaplan-Meier-kuvaajat oireettomasta jaksosta ja eloonjääneiden kokonaismäärästä 64 potilaalta, 10 joille oli annettu satunnaistetusti BCG:tä ja 58 potilaalta, joille oli annettu satunnaistetusti GM2/BCG:tä.
Kuvio 16. Kaplan-Meier-kuvaajat oireettomasta jaksosta ja eloonjääneiden kokonaismäärästä 59 GM2-vasta-ainenegatiiviselta potilaalta, joille oli annettu satun-15 naistetusti BCG:tä (Δ tai A ), verrattuna 57 potilaaseen, joille oli annettu satunnaistetusti GM2/BCG:tä (□ tai ) .
Potilaat on ositettu kahteen ryhmään, potilaisiin, joilla on yksi positiivinen imusolmuke (Δ tai □), ja potilaisiin, jouhia on kaksi tai useampia positiivisia imusolmukkeita 20 (A tai ) . .
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Kaikkialla tässä patenttihakemus julkaisussa viita- : taan moniin erilaisiin kirjallisuusviitteisiin, jotka on • · : .·. esitetty suluissa. Näiden julkaisujen sisältö on liitetty i « « !1V 25 kokonaisuudessaan tähän patenttihakemusjulkaisuun siihen * · .'· \ I oikeuttavien säädösten nojalla, minkä tarkoituksena on ku- • · · ***.· vata tarkemmin sen tekniikan tasoa, jota tämä keksintö * 1 1 *** 1 koskee. Näiden kirjallisuusviitteiden täydelliset biblio grafiset tiedot on esitetty tämän patenttihakemusjulkaisun 30 lopussa ennen patenttivaatimuksia.
• · · • · ♦ · * · · * • 1 · * · • · * 1 » • · · · · • · ···' • · · • 1 • · · • · · • · 1 • · 117668 ιο Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettava koostumus on käyttökelpoinen rokotteessa gangliosidin tunnistavan vasta-aineen muodostumisen stimuloimiseksi tai tehostamiseksi potilaassa, jolle rokotetta annetaan, ja 5 rokote sisältää sellaisen määrän immunogeeniseen proteiiniin konjugoitua gangliosidia tai sen oligosakkaridiosaa, jonka vaikutuksesta vasta-aineen muodostuminen potilaassa stimuloituu tai tehostuu, ja rokote sisältää myös tehokkaan määrän adjuvanttia sekä farmaseuttisesti hyväksyttä-10 vää kantaja-ainetta.
Gangliosidin oligosakkaridiosa voidaan saada aikaan jotakin gangliosidia pilkkomalla tai se voidaan syn-tetoida suoraan. Tässä keksinnössä immunogeeninen proteiini on proteiini, joka gangliosidiin tai sen oligosakkari-15 diosaan konjugoituna stimuloi tai tehostaa vasta-aineen muodostumista potilaassa.
Tämän keksinnön yhdessä sovellutusmuodossa potilas on ihminen.
Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistet-20 tava koostumus on käyttökelpoinen rokotteessa, jossa gang- liosidi tai sen oligosakkaridiosa on konjugoitu reikäkoti- lon hemosyaniiniin tai reikäkotilon hemosyaniinijohdannai- * ...
.*. : seen.
* 1 .* / Reikäkotilon hemosyaniini on tunnettu proteiini.
• · · "V 25 Reikäkotilon hemosyaniinijohdannainen voidaan valmistaa • · * j ; kytkemällä reikäkotilon hemosyaniiniin suoraan vähintään • * * · yksi immunologinen adjuvantti, kuten monofosfolipidi A tai * · · *.* * jokin ionittumaton lohkokopolymeeri tai sytokiini. Syto- kiinit ovat tämän alan ammattikokemuksen perusteella tun-ί,ί,ί 30 nettuja. Esimerkkinä sytokiinista on interleukiini 2. Täl-lä alalla tunnetaan myös muita interleukiineja, joita voi-daan liittää reikäkotilon hemosyaniiniin, mistä muodostuu * · **’. reikäkotilon hemosyaniini johdannainen.
• Φ · • · · * · • * • * • · « * · * * * 117668 n
Edellä kuvatun rokotteen yhdessä sovellutusmuodos- sa adjuvanttina on QS-21.
Tunnetaan myös muita adjuvantteja, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä. On mahdollista, 5 että on olemassa muita QS-21-kemikaaliryhmiä tai QS-21:tä muistuttavia kemikaalien ryhmiä, joita voidaan samalla tavoin käyttää tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä.
Tämä keksintö koskee lisäksi menetelmää, jossa gangliosidi on GM2, GM3, GD2, GD3, GD3-laktoni, O-ase-10 tyyli-GD3 tai GT3.
Yhdessä tämän keksinnön mukaisista edullisista so-vellutusmuodoista gangliosidi on GM2. Toisessa sovellutus-muodossa gangliosidi on GD3. Toisessa sovellutusmuodossa gangliosidi on GD2.
15 Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää erisuuruisia tehokkaita määriä konjugoitua gang-liosidia tai sen oligosakkaridiosaa. Tehokkaaseen immunisointiin tarvittavan tehokkaan määrän määrittämiseksi voidaan tämän alan tavanomaisen ammattikokemuksen perus-20 teella tehdä yksinkertaisia titrauskokeita. Esimerkkinä tällaisesta titrauskokeesta on, että eri määriä konjugoi-·*·'; tua gangliosidia tai sen konjugoitua oligosakkaridiosaa : injektoidaan potilaaseen, minkä jälkeen tutkitaan synty- • ♦ : nyttä immuunivastetta.
• · · ••V 25 Yhdessä sovellutusmuodossa konjugoidun gangliosi- • · ‘, ί din tai sen konjugoidun oligosakkaridiosan tehokas määrä • * * on noin 1 - noin 200 pg.
* * * *·* * Toisessa sovellutusmuodossa konjugoidun gangliosi- din tai sen konjugoidun oligosakkaridiosan tehokas määrä 30 on noin 50 - 90 pg. Yhdessä sovellutusmuodossa konjugoidun • · · ·.„· gangliosidin tai sen konjugoidun oligosakkaridiosan teho- .···. kas määrä on noin 70 pg.
• · • · · • · ··.· • · * • · • · • · • · * * M • · 117668 12
Vielä yhdessä sovellutusmuodossa konjugoidun gang-liosidin tai sen konjugoidun oligosakkaridiosan tehokas määrä on noin 1-10 μg. Vielä spesifisemmässa sovellutus-muodossa konjugoidun gangliosidin tai sen konjugoidun oli-5 gosakkaridiosan tehokas määrä on noin 7 - 10 pg. Yhdessä sovellutusmuodossa konjugoidun gangliosidin tai sen konjugoidun oligosakkaridiosan tehokas määrä on noin 7 pg.
Adjuvantin tehokas määrä voidaan samalla tavoin määrittää esimerkiksi antamalla konjugaattien kanssa eri 10 määriä adjuvanttia ja tutkimalla immuunivastetta, millä on tarkoitus määrittää tehokkaan annoksen suuruus. QS-21-ad-juvanttia käytettäessä voidaan sen tehokas määrä määrittää samalla tavalla.
Edullisessa sovellutusmuodossa QS-21:n tehokas 15 määrä on noin 10 - noin 200 pg. Yhdessä sovellutusmuodossa QS-21:n tehokas määrä on noin 100 pg. Toisessa sovellutus-muodossa QS-21:n tehokas määrä on noin 200 pg.
Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettava koostumus on lisäksi käyttökelpoinen rokotteessa jon-20 kin gangliosidin tunnistavan vasta-aineen muodostumisen stimuloimiseksi tai tehostamiseksi potilaassa, jolla roko-tetta annetaan, ja rokote sisältää sellaisen määrän immu- .•.tj ' nogeeniseen proteiinin konjugoitua gangliosidia tai sen * · : .·. oligosakkaridiosaa, jonka vaikutuksesta vasta-aineen muo- • · · ··,·. 25 dostuminen potilaassa stimuloituu tai tehostuu, ja rokote * · | t sisältää myös tehokkaan määrän adjuvanttia sekä farmaseut- • 1 · *".1 tisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta, ja silloin kun mai- • · · *·1 ’ nittu potilas sairastaa syöpää, niin potilaan syöpä para nee potilaassa rokotteen antamisen jälkeen muodostuneen 30 vasta—aineen vaikutuksesta.
• · 1 » · • · ··· • · • · • · 1 * · · · · • · ·1 · ··· • 1 • · • · · • ·· • · 13": 117668 Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettava koostumus on käyttökelpoinen myös rokotteessa jonkin gangliosidin tunnistavan vasta-aineen muodostumisen stimu-loimiseksi tai tehostamiseksi potilaassa, jolla rokotetta 5 annetaan, ja rokote sisältää sellaisen määrän immunogeeni-seen proteiinin konjugoitua gangliosidia tai sen oligosak-karidiosaa, jonka vaikutuksesta vasta-aineen muodostuminen potilaassa stimuloituu tai tehostuu, ja rokote sisältää myös tehokkaan määrän adjuvanttia sekä farmaseuttisesti 10 hyväksyttävää kantaja-ainetta, ja silloin kun mainittu potilas on herkkä saamaan syövän, niin syövän syntyminen potilaassa estyy rokotteen antamisen jälkeen muodostuneen vasta—aineen vaikutuksesta.
Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistet-15 tava koostumus on käyttökelpoinen lisäksi rokotteessa sellaisia syöpiä vastaan, joissa syöpäsolujen pinnalla on gangliosideja. 1 Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettava koostumus on käyttökelpoinen myös rokotteessa sellai-20 siä syöpiä vastaan, joissa syöpäkasvaimen . stroomassa esiintyy gangliosideja.
Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistet- * « ♦ .·, : tava koostumus on käyttökelpoinen myös rokotteessa sellai- * · · • siä syöpiä vastaan, jotka ovat alkuperältään epiteeliku- · * "*.* 25 dosta, mesodermikudosta tai neuroektodermikudosta. Esi- • · · • · [ merkkejä epiteelikudosperäisistä syövistä ovat rintasyövät • · ·"/ ja kohdun endometriumin syövät. Esimerkkinä mesodermiku- * · ** * dosperäisestä syövästä on sarkooma. Yhtenä esimerkkinä neuroektodermikudosperäisestä syövästä on melanooma.
30 Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön myös menetelmä, • · · ί,,.ϊ jolle on tunnusomaista, että a) muodostetaan i) gang- .···, liosidin oligosakkaridisosan ja ii) reikäkotilon hemosy- • · ']”· aniinin konjugaatti; b) lisätään saponiinia, jota saadaan · * . Quillaja saponaria Molina -puun kaarnasta; ja c) lisätään • · · : V 35 • · • · · • · · • * 117668 14 farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa; jolloin konjugaa-tin ja saponiinin suhteelliset määrät ovat tehokkaita stimuloimaan tai tehostamaan vasta-aineen tuotantoa potilaassa.
5 Edellä kuvatun menetelmän yhdessä sovellutusmuo- dossa gangliosidi on GM2.
Tässä keksinnössä "farmaseuttisesti hyväksyttävät kantaja-aineet" tarkoittaa mitä tahansa tavanomaista farmaseuttisia kantaja-aineita. Tällä alalla tunnetaan hyvin 10 monia esimerkkejä sopivista kantaja-aineista ja niitä ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, mitkä tahansa tavanomaiset farmaseuttiset kantaja-aineet, kuten jokin fosfaatilla puskuroitu fysiologinen suolaliuos, Polysorb 80:ta sisältävä fosfaatilla puskuroitu fysiologinen suola- — 15 liuos, vesi, jokin emulsio, kuten öljyn ja veden emulsio, sekä monet eri tyyppiset kostutteet.
Tämän keksinnön mukaisesti valmistettava koostumusta voidaan antaa intradermaalisesti, subkutaanisesti tai intramuskulaarisesti. Voidaan käyttää myös muita alan 20 tavanomaisen ammattikokemuksen perusteella tunnettuja menetelmiä.
Tätä keksintöä on helpompi ymmärtää seuraavaksi .·. : esitettyjen kokeellisten yksityiskohtien valossa. Alan am- • · · ; .1] mattikokemuksen perusteella on kuitenkin päivänselvää, et- • 1 · IIV 25 tä seuraavassa käsiteltyjen spesifisten menetelmien ja • 1 * ‘ koetulosten tarkoituksena on vain valaista tätä keksintöä, • 1 · .joka on täydellisemmin kuvattu jäljempänä esitetyissä pa- 1 · *·1 1 tenttivaatimuksissa.
Kokeelliset yksityiskohdat ϊ.ϊ.Ι 30 Ensimmäinen koesarja • · ·
Kokeelliset yksityiskohdat ,···. GD3-konjugaattirokotteiden immunogeenisyyden li- * ♦ sääminen: Useiden erilaisten kantajaproteiinien vertailu • · .ja GD3-KLH:n valinta lisätutkimuksiin.
·· · : 7 35 • · • · · φ 117668 15 : Kasvaimiin liittyvien gangliosidien tiedetään ole van sopivia kohteita syöpäkudoksen tuhoamiseksi immunologisin keinoin, mutta niiden immunogeenisyys on heikkoa.
Aktiivinen immunisointi johtaa lyhytkestoisen matalatiit-5 terisen IgM—vasta-ainevasteen syntymiseen. Heikosti immu-nogeenisten antigeenien liittäminen kovalenttisesti immu-nogeenisiin kantajaproteiineihin on tehokas menetelmä hu-moraalisen vasteen tehostamiseksi. Malignissa melanoomassa vallitsevana gangliosidina esiintyvä GD3 kytkettiin kanta-10 japroteiineihin kahdella menetelmällä. Tämä liitettiin GD3:n oligosakkaridiosan glukoosin välityksellä, mutta tämä johti antigeenisyyden katoamiseen ja sellaisten vasta-aineiden muodostumiseen, jotka eivät kyenneet reagoimaan GD3:n eivätkä GD3:a ilmentävien melanoomasolujen kanssa.
15 Toisessa menetelmässä GD3:a muokattiin pilkkomalla kerami-dirungon kaksoissidos otsonilla, molekyyliin liitettiin aldehydiryhmä, joka ryhmä kytkettiin pelkistävällä ami-noinnilla proteiinissa oleviin aminolysyyliryhmiin. Tätä menetelmää käyttäen konstruoitiin konjugaatteja, jotka si-20 sälsivat synteettisiä moniantigeenisiä peptidejä (MAP), jotka ilmensivät toistuvia sekvenssejä malaria—T-solun epitooppia, Neisseria meningitidiksen ulkomembraaniprote- .·. · iineja (OMP) , kationoitua naudan seerumin albumiinia • ·· (cBSA), reikäkotilon hemosyaniinia (KLH) ja polylyshiiniä.
• · · "V 25 Konjugaattien antigeenisyys varmistettiin saattamalla ne • · · * 1 reagoimaan monien erilaisten vasta—aineiden kanssa ja im- • · · ...
••j · munogeenisyys tutkittiin hiirissä. Immuuniseerumien vasta— • ♦ · *·1 1 ainepitoisuudet analysoitiin ELISA: 11a ja täpläblotti- immuunivärjäyksillä puhdistettuja gangliosideja käyttäen.
',lt1 30 Seerumien reagoivuuden spesifisyyttä tutkittiin edelleen immuno—ohutkerroskromatografisesti käyttäen kasvainkudos- ··· « · • · ··· Φ ····· • m «· · • · · • · • · · • ·· • · 117668 16 uutteita. GD3-konjugaattirokotteet saivat aikaan vasta-ainevasteiden merkittävän parantumisen erityisesti GD3-KLH-konjugaatteja käytettäessä. Tällä menetelmällä saatiin indusoitua GD3:a vastaan suunnattuja korkeatiitterisiä 5 IgM- ja IgG-vasteita. Tätä menetelmää voidaan soveltaa toisiin gangliosideihin ja se voi soveltua sellaisten gangliosidirokotteiden konstruointiin, jotka on suunnattu useita erilaisia ihmisen runsasgangliosidisia syöpiä vastaan. ; 10 Materiaalit ja menetelinat
Glykolipidit. Naudan aivoista uutetut GM3, GM2 Jo GDlb saatiin Fidia Research Laboratorysta (Abano Terme, Italia). GD2 valmistettiin GDlb:sta β-galaktosidaasikäsit-telyllä (Cahan, at ai., 1982), GD3 (mel) eristettiin ihmi-15 sen melanoomakudoksesta (Ritter, at ai., 1991), GD3 (bbm) (jota käytettiin rokotteen valmistuksessa) ja GT3 oli eristetty lehmänmaidosta valmistetusta kirnupiimästä ja ne saatiin Dr. R.K. Yulta (Medical College of Virginia, Richmond, VA) (Ritter, et ai., 1990a). Disialyylilaktoosi 20 (GD3:n oligosakkaridi) eristettiin naudan ternimaidosta aikaisemmin kuvatulla tavalla (Nicolai, et ai., 1978).
Kemikaalit. HPTLC—silikageelilevyt hankittiin E.
.·. : Merck —yhtiöstä (Darmstadt, Saksa) ; Sep-Pak C18 -patruunat • 1 · .2/ Walters Associates -yhtiöstä (Milford, MA) ; 4-kloori-l- * 1 2 "V 25 naftoli, p-nitrofenyylifosfaattidiniatrium, natriumsyaani- • · · j ;1 boorihydridi Sigma Chemical Co. -yhtiöstä (St. Louis, MO); • · · ·2: : syklofosfamidi (Cytoxan) Mead Johnson —yhtiöstä (Syracuse, : NY) ; Quil A -saponiinikomponentin sisältävä QS-21 Cambrid ge Biotech -yhtiöstä (Worcester, MA).
30 Proteiinit. Poly-L-lysiinivetybromidi (Mr (vis) ;3: 3800) hankittiin Sigmalta; reikäkotilon hemosyaniini (KLH) • 1 1
Calbiochemista (LaJolla, CA); cBSA-Imject Supercarrier Im- • · ***. munemodulator Pierce-yhtiöstä (Rockfort, IL) ; Neisseria menigitidiksen ulkomembraaniproteiinit (OMP) saatiin Dr.
·· · : 1 : 35 * · *·· 2 » · 1 3 • · 117668 17 M.S. Blakelta (Rockefeller University, New York, NY). Mo-niantigeenipeptidi (MAP) YAL-IV 294-1, joka sisälsi 4 toistuvaa malaria-T-soluepitooppia, saatiin lahjaksi Dr. J.P. Tamilta (Rockefeller University, New York, NY).
5 Monoklonaaliset vasta-aineet. ITLC:hen (Immune
Thin Layer Chromatography) käytettäväksi tarkoitetut pi-par juuriperoksidaasiin konjugoidut kaniinissa tehdyt anti-muriini-immunoglobuliinit ja ELISA:ssa käytettäväksi tarkoitetut alkaliseen fosfataasiin konjugoidut kaniinissa 10 tehdyt anti-muriini-IgM ja IgG saatiin Zymed-yhtiöstä (San Francisco, CA) ; anti-GD3-mAb-R24 oli valmistettu (Houghton, et ai., 1985).
Serologiset määritykset. Entsyymivälitteiset immu-nosorbenttimääritykset (ELISA) tehtiin aikaisemmin kuva-15 tulla tavalla (Livingston, et ai., 1989). Epäspesifisen "tarttuvuuden" huomioonottamiseksi immuuniseerumit tutkittiin myös levyillä, joita oli käsitelty samalla tavalla, mutta joihin ei oltu lisätty gangliosidia, ja saatu lukema vähennettiin gangliosidia käyttäen saadusta lukemasta. 20 Tiitteri määriteltiin suurimmaksi laimennokseksi, josta korjatun absorbanssin arvoksi saatiin 0,1 tai tätä suurem-pi arvo. Gangliosidien immunologinen värjäys monoklonaani- : silla vasta-aineilla tai hiiren seerumeilla tehtiin sen • · · * · : .1. jälkeen, kun nämä oh erotettu komponentteihinsa suuren • · · • •V 25 erotuskyvyn ohutkerroskromatografiaan (HPTLC) tarkoite- * · I I tuilla lasista valmistetuilla silikageelilevyillä aikai- semmin kuvatulla tavalla (Hamilton, et ai., 1993). Levyt • 1 · '1' 1 kehitettiin liuottimessa 1, joka on kloroformista, me- tanolista ja vedestä (0,25 % CaCl2) tilavuussuhteissa 30 50:40:10 valmistettu seos, tai liuottimessa 2, joka on * 1 1 etanolista, n-butanolista, pyridiinistä, vedestä ja etik- .···. kahaposta tilavuussuhteissa 100:10:10:30:3 valmistettu • · · · • 1 ··· * · · • 1 • · · • · 1 • · · * · 117668 18 seos, ja ne visualisoitiin myös resorsinoli/HCl-reagens-silla.
Immunisointi. Kuuden viikon ikäisille BALB/c x 20 C57BL76 Fl-hiirille (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, 5 ME) annettiin i.p.-injektioina syklofosfamidia (15 mg/kg) 3 päivää ennen ensimmäistä immunisointia ja ne jaettiin sattumanvaraisesti eri käsittelyryhmiin. Ellei toisin ole mainittu, annettiin 4 tai 5 hiirestä kootuille ryhmille s.c.-injektioina kolmea rokotetta 2 viikon välein. Kukin 10 rokote sisälsi yhtä hiirtä kohti 0,1 ml:ssa PBS-liuosta 20 pg GD3:a tai 15 pg disialyylilaktoosia ynnä 10 pg QS-21:tä. Ellei toisin ole mainittu, otettiin hiiristä verinäyte retro-orbitaalisinuksesta ennen rokotusta ja 2 viikkoa sen jälkeen.
15 GD3-konjugaatin valmistus. GD3 (2 mg) liuotettiin ultraäänikäsittelyä käyttäen 2 ml:aan metanolia ja liuos jäähdytettiin -78 °C:seen etanoli-kuivajäähauteessa. Otsonia muodostettiin otsoninkehittimessä (Del Industries, San Luis Obispo, CA) ja sitä johdettiin näytteen läpi 30 mi-20 nuutin ajan seosta samalla voimakkaasti sekoittaen (Crie-gee, 1957); Wmegandt ja Baschang, 1965). Ylimääräinen ot-soni syrjäytettiin typellä 10 minuutin aikana. Reaktio- * ; seokseen lisättiin 100 pi S(CH3)2:ta (Pappas, et ai., * 1 1 ·',·] 1966), näytettä pidettiin -78 °C:ssa 30 minuutin ajan ja • · · !“.1 25 sen jälkeen huoneenlämmössä 90 minuutin ajan seosta samal- • ♦ t ! la voimakkaasti sekoittaen. Näyte kuivattiin typpivirrassa * « · · ja se tutkittiin HPTLC:llä. Pitkäketjuinen aldehydiryhmä • φ · *·1 1 erotettiin lisäämällä kuivaan näytteeseen 2 ml n-heksaa- nia, käsittelemällä sitten ultraäänellä 5 minuutin ajan ja 30 sentrifugoimalla 2000 x g:n voimalla 15 minuutin ajan. n- heksaani imettiin varovasti pois reaktioseoksesta ja hei- : .···. tettiin pois, ja näyte kuivattiin typpivirrassa. Pilkottu « 1 • 1 · ····· • · ·· * · · • · • · · · • · 1 • · 19 1 1 7668 .
GD3 ja natiivi GD3 erotettiin toisistaan HPLC:llä (Waters, System 501, Mulford, MA) käyttäen C18-käänteisfaasiko-lonnia (10 x 250 mm, Rainin Instruments, Ridgefield, NJ) . Gangliosidit eluoitiin metanolilla, eluoitumista seurat-5 tiin 214 nm:n kohdalta ja fraktiot analysoitiin myös HPTLC:llä. Pilkottua GD3:a sisältäneet fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin 37 °C:ssa rotavapor-laitteella (Buchi, Sveitsi). Pilkottua GD3:a, PBSrään valmistettua proteiinukantaja-ainetta ja 2 mg:n suuruista natriumsyaa-10 niboorihydridierää inkuboitiin hitaasti ravistellen 37 °C:ssa 48 tunnin ajan. 16 tunnin kuluttua lisättiin vielä 1 mg NaCNBH3:a. Kytkeytymisen edistymistä seurattiin HPTLC:llä. GD3-proteiinikonjugaatit eivät liikkuneet liu-ottimessa 1 eivätkä liuottimessa 2 ja ne saatiin esiin ap-15 plikointikohdassa olevana resorsinolipositiivisena vyöhykkeenä. Seos dialysoitiin 4 °C:ssa 48 tunnin ajan dia-lyysiletkussa, jonka päästöraja oli Mr 1000:n kohdalla ja 4 l:n suuruinen PBS-liuos vaihdettiin uuteen kolme kertaa, ja seokset käsiteltiin konjugoitumattoman GD3:n lopulli-20 seksi puhdistamiseksi detergentinpoistogeelissä, Extracti- gel-geelissä (Pierce). Näytteet lyofilisoitiin ja niiden proteiini- ja gangliosidipitoisuudet määritettiin Bioradin .·. : proteiinimäärityksellä ja Svennerholmin (1957) julkaisun • · · • *t·] mukaisella neuramiinihappomäärityksellä.
* · · HV 25 Disialyylilaktoosi eristettiin naudan ternimaidos- * * * * * ta aikaisemmin kuvatulla tavalla (Nicolai, et ai., 1978).
• · · · Tämä hiilihydraatti kytkettiin proteiiniin pelkistävällä • · · *·* * aminoinnilla (Gray, 1974) . 10 mg disialyylilaktoosia ja 2 mg proteiineja inkuboitiin 37 °C:ssa PBSrssä 14 päivän 30 ajan. Reaktioseokseen lisättiin aluksi 2 mg natriumsyaani- ··· V.· boorihyrnidiä lisäten tähän uusia 1 mg:n suuruisia eriä • ·· • · ♦·· * * » * * • * ♦ ··.-• · · » · • · • · • · · ♦ · · * · 117668 20 joka 3. päivä. Kytkeytymistä seurattiin HPTLCtllä liuotti-messa 2. Disialyylilaktoosikonjugaatit puhdistettiin dia-lysoimalla dialyysimembraanin avulla, jonka päästöraja oli suhteellisen moolimassan 1000 kohdalla, ja lyofilisoimalla 5 materiaali tämän jälkeen. Proteiini- ja neuramiinihappopi-toisuus määritettiin edellä kuvatulla tavalla. Disialyyli-laktoosi konjugoitiin proteiineihin myös Royn ja Lafer-rieren (1990) kuvaamalla menetelmällä. Tätä menetelmää käytettäessä muodostettiin ensin N-akroloyyliryhmän sisäl-10 täviä oligosakkaridin glykopyranosyyliamiinijohdannaisia, jonka jälkeen ne konjugoitiin Michaelin additiolla proteiinin aminoryhmiin. Puhdistus ja proteiinien sekä neur-amiinihappojen määritys tehtiin edellä kuvatulla tavalla.
IgG-alaluokan määritys. IgG-alaluokan määritys 15 tehtiin ELISA:11a käyttäen alaluokkaspesifisiä sekundaari sia MAb-molekyylejä. Sekundaarisia MAb-molekyylejä käytettiin pienimpänä laimennoksena, jonka ei havaittu reagoivan ennen immunisointia talteen otettujen seerumien tai negatiivisten kontrolliseerumien kanssa. Kolmantena vasta-20 aineena käytettiin alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohessa tehtyä anti-hiiri-vasta-ainetta, joka oli laimen- :'·*· .. nettu suhteessa 1:200.
;\J Hiiren antiseerumien FACS-analyysi. Melanoomasolu- • · : ,·. linjasta SK-MEL-28 saatiin yksisolususpensio käsittelemäl- • · « •·φ·# 25 la materiaalia 0,l-%:isella EDTA:lla PBS:ssa ja työntämäl- • · | ^ lä se 26½ G:n neulan läpi. Soluja (3 x 105) sekä 40 μΐ seerumia, joka oli otettu talteen ennen immunisointia ja • * · *·* sen jälkeen ja joka oli laimennettu suhteessa 1:20, inku- boitiin 30 minuutin ajan jäillä. Solut pestiin kolme ker-30 taa 3-%:isella fetaalisella naudanseerumilla PBS:ssä. Re- • · · ·,„· aktioseokseen lisättiin sekundaariseksi vasta-aineeksi ··· • · • · * · · ·· · • · · • · • · « · • ♦ · ·*··., • · 117668 21 kolmekymmentä mikrolitraa laimennettua (1 : 50) fluoreske-iini-isotiosyanaattileimalla varustettua vuohessa tehtyä hiiren IgG:tä vastaan valmistettua antiseerumia (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL), jonka jäi— 5 keen seosta inkuboitiin jäillä 30 minuutin ajan. Solut pestiin kolme kertaa edellä kuvatulla tavalla ja ne sus-pendoitiin uudelleen 500 gl:aan 3—%:ista fetaalista nau-danseerumia PBS:ssä ja ne analysoitiin virtaussytometrillä (FACScan, Becton Dickinson, San Jose, CA) .
10 Tulokset GD3-rokottelden valmistus ja karakterisointi
Lehmänmaidosta valmistetusta kirnupiimästä saatu GD3 pilkottiin valikoivasti keramidiosan C4-C5-kaksoissi-doksen kohdalta otsonia käyttäen. Metoksiperoksidit vai-15 kuttavat olevan metanolissa dimetyylisulfuiitilla helposti pelkistyviä välituotteita. Pilkkomisen tulokseksi saatiin aikaan GD3-johdannainen, jossa funktionaalinen aldehydi-ryhmä on keramidiosan entisen kaksoissidoksen paikalla ja pitkäketjuinen aldehydiryhmä on poistunut (kuvio 1) . Suo-20 tuisin tuloksin pilkottu GD3 liikkui kromatografiassa na-tiivin GD3:n alapuolella ja samanaikaisesti pilkkoutunei-·'·*; den tyydyttymättömien rasvahappojen takia se näkyi : HPTLC:ssa kahdesta osasta muodostuneena vyöhykkeenä (tämä • · : .·, on esitetty kuvioon 1 upotetussa HPTLC-kuvaajassa) . Densi- • · · j**.e 25 tometrillä suoritetussa HPTLC:n analyysissa kävi ilmi, et- * · | I tä lehmänmaidosta valmistetusta kirnupiimästä eristetyn *“.* GD3:n pilkkoutuminen oli > 70 %. Tämän suhteen ei havaittu t « · '·* * muuttuneen alkuvaiheessa tehdyissä kokeissa, joissa ot~ sonikäsittelyajat olivat pitkiä, mikä osoittaa, että tästä 30 lähteestä peräisin olevasta GD3:sta -30 % koostuu sfinga- • ♦ · niini- tai fytosfingosiinianalogeista. GD3:n pilkkomiselle .···. havaittiin optimaaliseksi -78 °C:n lämpötila ja korkein- • · >>>#· taan 1 tunnin reaktioaika käytetyn GD3:n määrän mukaan.
• · . Pilkottu GD3 säilyi ainoastaan happamissa ja neutraaleissa · • V 35 fosfaattipuskureissa korkeintaan 72 tunnin ajan sivutuot-• · !.*·· teen määrän samalla lisääntyessä. B-eliminaatioreaktioiden 117668 22 vuoksi GD3:n oligosakkaridiosaa vapautui aina sitä enemmän mitä pitempi aika oli kulunut, minkä on aikaisemmin kuvattu tapahtuvan helposti emäksisessä pHrssa (Wiegandt ja Ba-schang, 1965). GD3:sta vapautunut hiilihydraattiosa ei 5 liikkunut liuottimessa 1, mutta oligosakkaridien erottamiseen käytetyssä liuottimessa 2 se liikkui yhdessä naudan ternimaidosta eristetyn disialyylilaktoosin kanssa (tuloksia ei ole esitetty). Koska pilkotun GD3:n hydrofobisuus natiivin GD3:een verrattuna oli pienempi, niin se pystytit) tiin erottamaan HPLC:llä C18-käänteisfaasikolonneja käyttäen. Pilkottu GD3, joka oli saatu käyttäen isokraattista eluointia metanolilla, muodosti proteiinien kanssa Schif-fin emäksiä muunnetun gangilosidin ja e-aminolysyyliryh-mien välille. Schiffin emäkset pelkistettiin natriumsyaa-15 niboorihydridillä pysyvien sekundaaristen amiinisidosten muodostamiseksi gangliosidin ja proteiinin välille (Borch, et ai., 1971). Pelkistin oli valikoiva eivätkä aldehydi-ryhmät pelkistyneet fosfaattipuskureissa, joiden pH-arvot olivat 6,5 - 7,5. Reaktiota seurattiin HPTLC:llä ja appli-20 kaatiokohdalla havaitun resorsinolipositiivisen vyöhykkeen ja pilkotun GD3:n välisen suhteen havaittiin muuttuvan. ;'·1· Tämä vyöhyke oli osoituksena siitä, että reaktiossa muo- : dostui neo-glykokonjugaatteja. Reaktio oh tavallisesti • ,·. mennyt loppuun, kun mkubointi 37 C:ssa oh kestänyt yli • · 1 jlV 25 48 h. Disialyylilaktoosi oli poistettavissa vaikeuksitta • · ) dialyysillä ja ylimääräinen pilkottu GD3 käsittelemällä t 1 » ’’‘t‘ detergentinpoistokolonnissa. Kytkeytymisaste määritettiin • · · *·' 1 sialihappo- ja proteiinimäärityksillä. Konjugaateissa ole vien GD3:n ja proteiinien painosuhde määräytyy eri prote- M.· 30 iineissa olevien lysiiniryhmien reagointimahdollisuuksien **· mukaan ja tämä painosuhde on esitetty taulukossa 1. Prote- .1··. iineihin kytkeytyneen GD3:n keskimääräinen saanto oli kai- • · ***. kista tuloksista laskettuna 30 %.
·····' • · ...
·1 · • · t • · • · • # • · · · 117668 23 GD3:n hiilihydraattiosa, disialyylilaktoosi, kytkettiin proteiineihin kahta eri menetelmää käyttäen. Disialyylilaktoosi konjugoitiin pelkistävällä aminoinnilla, mikä johti siihen, että proteiineihin konjugoidun glukoo-.5 sin rengasrakenne jäi avoimeksi (Gray, et ai., 1978). Oligosakkarideja ja proteiineja oli tässä menetelmässä inku- , hoitava pitkään ja saannot olivat alle 20 %. Toisen oligosakkaridien konjugointimenetelmän (Roy ja Laferniere, 1990) käyttö johti siihen, että proteiineihin kytketty 10 terminaalinen glukoosi muodosti suljetun renkaan.
··· ··· * · · .
• · t · • · • · ♦ * · • ♦ * • · · · ·· · I I » • * • « • · • · · » · · ··♦·'· • ♦ · ♦ « · • · · • · · ··*' ·#· ··♦ * · ...
• · • M * ·»· • · * * * *··!· * · 1 · • Φ f · * · • · • · · • · • · ' ' ' 24 ' 117668
Taulukko 1 GD3:a vastaan suunnatun ELlSA-tiitterin käänteisluku CD3:n ja pro-
Hiirten lu- teiinin pai- ,
Rokote ku-a>äara_ no suhde_ IgG_ IgM' 5 GD3 5 - 0(5) 20(0), 0(2) GD3-ganglios1dikonjugaatt1: GD3-KLHe 14 0,69 10240(2), 5120 (2), 2560, 1280(2). 640.
2560(3). 1280(2), 320(3), 160(2), 80, 40 (2), 0 80(3), 20. 0 GD3-CBSA 15 0,77 2560(2), 320(2), 80(2), 40(2), 20(7), 160. 80(2), 40(4), 0(4) 20(2). 0(2) CD3-OMP 15 0,93 2560. 80(4), 20(3), 1280. 320(2), 160(7), 0(7) 80(4), 40 10 GD3-MÄP 10 1 40. 0(9) 160(2), 40(4). 20(3).
0 GD3-polyly- 10 e.t.b 0(10) 320, 160(4), 80, 40, eilni 20(2), 0 GD3-öligosakkaridi-konjugaatti
Disialo-KLHc 4 0.055 0(4) 160(3), 80 15 Disialo- 4 0,16 20. 0(3) 40. 20(3) cBSAc ··· · GD3-KLHd 4 0,25 20, 0(3) 40(2), 0(2) • · *.*·· GD3-cBSÄd 4 0,34 0(4) 0(4) • · • · · : GD3-polyly~ 5 e.t. 0(5) 80(3), 40(2) f.*. 20 aiinid • « • · • ft * * · ··· * aKLH: reikäkotilon heraosyaniini, cBSA: kationoitu naudan seerumin albumiini» 0ΜΡ; meningokokin • · · J j · ulkomembraaniproteiinit, MAP: moniantigeenipeptidi, polylysiini; poly-L-lysiini ei tehty 25 cavoin rengas • ^suljettu rengas • · · • · · ··· • · • * ··· GD3:a vastaan suunnattu serologinen vaste GD3-pro- • * **·] 30 teiini-konjugaattirokotteilla tehdyn rokottamisen jälkeen ····*
Ennen immunisointia talteen otetuissa seerumeissa * 1: ei esiintynyt IgM:n eikä IgG:n reagoivuutta GD3:n kanssa.
GD3-vasta-aineita ei saatu syntymään immunisoinnilla, jos- 117668 25 sa käytettiin pelkästään 20 pg GD3:a tai GD3:a yhdistettynä 10 pg:aan QS-21-adjuvanttia (taulukko 1). GD3:a vastaan suunnatun immuunivasteen havaittiin lisääntyneen joissakin hiiristä kootuissa ryhmissä, jotka oli immunisoitu käyt-5 täen 20 pg GD3:a konjugoituna proteiineihin ynnä 10 pg QS-21:ta. Suurta GD3-epitooppitiheyttä edustava GD3-poly-L-lysiinikonjugaatti sai aikaan igM-vasteen, jonka tiitteri oli kohtalaisen suuri (vaihteluväli 1/20 - 1/320), mutta ei lainkaan IgG-vastetta. Neisseria meningltidiksen ulko-10 membraaniproteiineihin konjugoitu GD3 (GD3-0MP) sai myös aikaan kohtalaisen suuren IgM-tiitterin (vaihteluväli 1/20 - 1/320) sekä pienen IgG-tiitterin (vaihteluväli 1/20 - 1/80). GD3-0MP-rokotuksen jälkeen vain yhdessä hiiressä havaittiin suuritiitterinen IgM-vaste, joka oli 15 1/1280, ja suuri IgG-tiitteri, joka oli 1/2560. Kationoi- tuun BSA:han konjugoidulla GD3:lla tehdyn rokotuksen jälkeen (GD3-CBSA) havaittiin ELISA-määrityksellä pieni IgM-tiitteri (vaihteluväli 1/20 - 1/80) ja suuri IgG-tiitteri (vaihteluväli 1/20 - 1/2560). Malaria-T-soluepitoopin si-20 sältävässä MAP-peptidin aminoterminaalisessa päässä oli käytettävissä 8 vapaata aminoryhmää, joista neljään onnis-·1·1; tuttiin konjugoimaan GD3-molekyyli. GD3-MAP sai aikaan a ,·, : pienen IgM-tiitterin (vaihteluväli 1/20 - 1/160) ja vain • · • ,·, yhdessä hiiressä muodostui pieni IgG-vaste, jonka tiitteri • · · 25 oli 1/40. Muihin konjugaatteihin verrattuna KLHihon konju- • ·
Il goitu GD3 (GD3-KLH) sai aikaan voimakkaimman vasteen, jos- * · · ”t‘ ‘ sa esiintyi suuritiitterisin igM (vaihteluväli 1/20 - « · i *·' 1/2560), sekä suuritiitterisin IgG (vaihteluväli 1/40 - 1/10240). Kummankin tyyppisellä disialyylilaktoosiproteii-30 nikonjugaatilla tehty immunisointi sai aikaan vain pieni- ··· tiitteristä IgMrää, joka ristireagoi GD3-gangliosidin .4 ,···, kanssa (vaihteluväli 1/20 - 1/160), eikä lainkaan merkit- * · ***. tävää IgG-vastetta.
m1· ® * 1 * a 1 · * · 1 • 1 • · « « · · • ·· • · 117668 26 GD3:n kanssa reagoivien seerumien spesifisyys immu-no-ohutkerroskromatografiällä määritettynä
Immuno-ohutkerroskromatografiällä (ITLC) voidaan tutkia GD3-antiseerumin vaikutusta ihmisen kudoksista uu-5 tettuihin gangliosideihin sekä määrittää niiden spesifisyys tuumoriperäisiä gangliosideja vastaan. Kuvioissa 3a ja 3b on esitetty esimerkkejä iTLC-määrityksistä, joissa on käytetty ihmisen kudoksista tehtyjä uutteita ja seerumeja, joissa IgM:n ja IgG:n tiitterit ovat GD3-KLH-konju-10 gaatilla tehdyn immunisoinnin johdosta suuret. Tutkittiin suhteessa 1/150 laimennettujen seerumien reagoivuutta ihmisen aivoista, neuroblastoomasta tai melanoomasta peräisin olevia gangliosidiuutteita vastaan sekä lehmänmaidosta valmistetusta kirnupiimästä eristettyä GD3 (bbm) -immuno-15 geeniä vastaan. Reagoivuutta ITLC-määrityksessä verrattiin resorsinolivärjättyyn HPTLC-määritykseen, josta käy ilmi näissä kudoksissa esiintyvien gangliosidien kokonaiskoos-tumus. Normaalit aivot sisältävät pääasiassa GMl:tä, GDla:ta, GDlb:tä ja GTlb:tä, kun taas neuroblastoomauute 20 sisältää lisäksi suuren määrän gangliosideja GD2 ja GM2 ja melanoomauute sisältää pääasiassa GM3:a ja GD3:a. IgG-an-tiseerumit reagoivat spesifisesti ainoastaan kaikissa koi- .*. : messa tutkitussa kudosuutteessa olevan GD3:n kanssa (kuvio • ·· • · : 3), samoin kuin kontrollina käytetyn mAb R24:n kanssa.
» ♦ « pv 25 Toisaalta IgM-antiseerumeilla (kuvio 3b) esiintyi jonkin • ♦ t I verran ristireagointia aivokudoksessa olevien rakenteel- • « · *·*.· taan samankaltaisten gangliosidien sekä sulfatidin kanssa.
• · · *·* Muilla GD3-konjugaateilla tehdyn rokotuksen avulla aikaan saaduissa immuunivasteissa havaittiin samanlainen spesifi- * 30 nen reagoivuus, mutta nämä reaktiot olivat heikompia, jo- ten täytyi käyttää konsentroidumpia antiseerumeita (tulok- .···, siä ei ole esitetty). GD3-cBSA:lla immunisoitujen hiirten • · antiseerumeissa, jotka ELISA-määrityksellä oli tunniste- i • · . tuissa suuritiitterisiksi, havaittiin lTLC:llä voimakas ·· · • *.· 35 taustareaktio. Näillä seerumeilla käytettiin suotuisia • · • ♦ * • * · • · 117668 27 tuloksia saavuttamatta monia erilaisia taustan muodostumista estäviä aineita. Ei pystytty havaitsemaan spesifistä reagoivuutta kudosuutteen sisältämää GD3:a vastaan.
GD3:n kanssa reagoivien seerumien spesifisyys im-5 munologisella täpläblottivärjäyksellä määritettynä
Kaikkien suuritiitteristen IgM- tai IgG-antiseeru-mien (ELISA < 1/160) spesifisyys tutkittiin käyttäen naudan aivoista tai lehmänmaidosta valmistetusta kirnupiimästä eristettyjä puhdistettuja gangliosideja GM3, GD2, GDlb, 10 GD3 ja GT3 sekä ihmisen melanoomakudoksesta eristettyä GD3:a. Samansuuruiset määrät näitä rakenteeltaan toisiaan muistuttavia gangliosideja pipetoitiin täpliksi nitrosel-luloosaliuskoille ja ne saatettiin reagoimaan immuuniseerumien kanssa. Kuviossa 4 on esitetty osa täpläblotti-im-15 munovärjäystutkimuksista, joissa käytettiin hiiristä saatuja seerumeja, jotka oli otettu ennen GD3-KLH:lla ja GD3-OMPrllä tehtyä immunisointia ja sen jälkeen. Ennen immunisointia talteen otetuissa seerumeissa ei esiintynyt lainkaan reagoivuutta näiden gangliosidien kanssa. GD3-KLH:lla 20 tehdyn immunisoinnin jälkeen talteen otetuista seerumeista havaittiin spesifistä IgM- ja igG-reagoivuutta lehmänmai-.*·*. dosta valmistetusta kirnupiimästä eristetyn GM3:n (im- .·. : munogeenin) kanssa sekä ihmisen melanoomakudoksesta eris- · · • · • .·. tetyn GD3:n kanssa. Joissakin tapauksissa havaittiin ris- • · · "V 25 tireagoivuutta GT3:n kanssa, jollainen reaktio havaittiin • · * * myös positiivisena kontrollina käytetyllä mAb R24:llä • · ♦ •*j4* (Houghton, et ai., 1985). GD3-cBSA;lla immunisoiduista *·* * hiiristä saaduista suuritiitterisistä seerumeista havait tiin ainoastaan taustatasoista reagoivuutta mutta ei min-30 käänlaista spesifistä reaktiota yhtäkään gangliosidia va- ··· staan (tuloksia ei ole esitetty). Muilla GD3-konjugaateil- ,···. la aikaansaatu reagoivuus täpläblottimäärityksessä oli • · spesifistä GD3:lle (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulok- · . set viittaavat siihen, että GD3-proteiinikonjugaateilla ·· · • *.· 35 voidaan hiirissä saada aikaan spesifisiä suuritiitterisiä • Φ • e#·.·· • ·· • * 28 1 1 7668
IgM- ja IgG-vasteita ja että voimakkain reagoivuus oli GD3-KLH-konjugaattien aikaansaamaa. GD3-oligosakkaridiket-jun tärkeät epitoopit näyttävät tässä konjugointimenetel-mässä säilyvän ennallaan eivätkä GD3-konjugaatit saa ai-5 kaan ristireagoivuutta näitä rakenteeltaan muistuttavien gangliosidien kanssa.
Immuuniseerumien reagoivuus solun pintaa vastaan FACS-analyysillä määritettynä
Hiiristä otetuista seerumeista tutkittiin niiden 10 sitoutuminen SK-MEL-28-melanoomasolulinjan soluihin, joi den tiedetään ilmentävän solun pinnalla esiintyvää GD3:a.
Kuviossa 5 on esitetty edustava esimerkki FACS-analyysis-tä, jossa on käytetty fluoreskeiini-isotiosyanaattileimal- ; la varustettua sekundaarista vuohessa tehtyä anti-hiiri-15 vasta-ainetta. Tutkittiin seerumeita, jotka oli otettu ennen GD3-KLH:lla ja QS-21:llä tehtyä immunisointia ja tämän jälkeen. Ennen immunisointia otettu seerumi värjäsi 8 % kohdesoluista, immunisoinnin jälkeen otettu seerumi 92 %.
20 Pohdinta Tässä keksinnössä on kuvattu lähestymistapa gang- liosidikonjugaattirokotteiden konstruoimiseksi, minkä tar- ;*·,· koituksena on 1) saada aikaan sellainen kytkeytymisreaktio • · : .*. proteiinien kanssa, jota voidaan soveltaa erilaisiin tuu- • * · • · · * ;·.·. 25 morigangliosideihin, 2) saada lisättyä melanoomassa suuri- * * I na määrinä esiintyvän GD3-gangliosidin immunogeenisyyttä • · · .
"I.* ja 3) saada määritettyä tehokkain kantajaproteiini. Gang- ' • liosidin konjugointi on suoritettava immunodominanttia hiilihydraattiryhmää muuttamatta. Synteettisten antigee- 30 nien immunogeenisyyden on osoitettu lisääntyvän esimerkik- ·»· *...· si muokattaessa GD3:n hiilihydraattiosaa muuttamalla sen .·**. karboksyyliryhmät amidiryhmiksi, mutta merkittävää natii- • · * vin GD3: n kanssa ristireagoivaa vasta-ainevastetta ei kui- * · . tenkaan ole havaittu (Ritter, et ai., 1990b). Edellä mai- *»^· w r r ϊ .* 35 nituista syistä pyrittiin tämän keksinnön mukaisella lä- * * * · * • · · * · 117668 29 hestymistavalla kytkemään GD3 keramidiosansa kautta hiili-hydraattiosaa muuttamatta. Kaikille gangliosideille luonteenomainen keramidi pilkottiin otsonilla sfingosiiniemäk-sen C4-asemasta ja siihen liitettiin funktionaalinen alde-5 hydiryhmä. Gangliosidi kytkettiin proteiineihin pelkistävällä aminoinnilla, minkä tarkoituksena oli muodostaa pysyvä amiinisidos gangliosidin ja proteiinien e-aminolysyy-liryhmien välille. Tähän mennessä ei ole kuvattu ganglio-sidien pilkkomista otsonilla ja sen jälkeen tehtävää kon-10 jugaatiota, joten gangliosidien aldehydivälituotteen oletettiin olevan epästabiili. Fragmentoitumista on raportoitu tapahtuneen silloin, kun tämä on käynnistynyt hydroksidi-ionien hyökkäyksellä emäksisissä olosuhteissa, kaksois-sidoksen on havaittu siirtyvän ja oligosakkaridiosa loh-15 keaa p-eliminaation vaikutuksesta (Kanfer ja Hakomori, 1983; Wiegandt ja Baschang, 1965), Funktionaalisen alde-hydiryhmän on havaittu olevan riittävän stabiili neutraalissa pHrssa, jolloin proteiinien aminoryhmistä muodostuu helposti Schiffin emäksiä ja β-eliminaatiota tapahtuu vain 20 pienessä määrin. 30 %:n suuruinen kokonaissaanto oli saa-vutuksena suhteellisen hyvin vertailukelpoista siihen, ;1·2; mitä gangliosidien konversiosta lysojohdannaisiksi on ku- .\j vattu (Neuenhofer, at ai., 1985). GD3:n aldehydijohdannai- • 1 ; .·. nen ei enää reagoinut mAb R24:n kanssa immuuniohutkerros- • · 2 · ;·.·. 25 kromatografiässä (ITLC). Samanlaisia ilmiöitä on kuvattu • · J GM3:n ja mAb M2590:n reagoinnin yhteydessä ja reagoivuuden * 1 2 *".1 on havaittu olevan riippuvainen asyyliketjun pituudesta • · · ** 2 (Itonori, et ai., 1989). Toisaalta GD3-proteiinikonjugaat- tien kyseessä ollessa havaittiin ITLC:n ja western-blot- • · · 30 tien perusteella reagoivuutta mAb R24:n kanssa, mikä • · · osoittaa, että GD3-neoglykokonjugaateissa olivat immunodo- .3. minantit epitoopit palautuneet ennalleen.
* · ·
Kun konjugointimenetelmä gangliosidirokotteen vai- ·1 • mistamiseksi oli näin saatu selville, niin oli valittava ·· I 1 ♦ 1 1 ·1 35 sopivat kantajaproteiinit. Lowell, et ai. (1988) ovat ku- • · 2 • · » 3 • t · • 1 . 30 117668 vanneet suuritiitteristen vasta-aineiden aikaansaamiseen soveltuvan elegantin rokotesysteemin, joka perustui bakteerien hiilihydraatti- ja peptidiantigeenien ja Neisseria meningitidiksen ulkomembraaniproteiinin (OMP) välisen 5 kompleksin muodostamiseen synteettisen hydrofobisen varsi-osan välityksellä, joka rokote oli tehokas ilman muunlaista adjuvanttia (Donnelly, 1991). Tätä systeemiä oli mahdollista soveltaa suoraan gangliosideihin näiden amfipaat-tisten ominaisuuksien ansiosta. Tämän keksinnön tekijät 10 ovat aikaisemmissa tutkimuksissaan absorboineet gangliosi-deja näihin proteiineihin hydrofobisen vuorovaikutuksen avulla ja ovat onnistuneet saamaan aikaan suuritiitteristen igM-vasteiden muodostumisen (Livingston, et ai., 1993b). Tässä tutkimuksessa oli käytetty kovalenttista 15 liittämistä, mutta GD3-0MP-konjugaatilla saatiin IgG-vas-teita aikaan vain satunnaisesti eikä IgM-vaste ylittänyt aikaisemmin tehdyissä kokeiluissa konjugoimattomana käytetyllä GD3:lla saatua vastetta. Heikosti immunogeenisiä proteiineja vastaan suunnattua immuunivastetta pystyttiin 20 parantamaan konjugoimalla nämä proteiinit kationoituun * BSA:han, jonka on raportoitu olevan proteiiniantigeenien ·*·*: yhteydessä voimakas immunomodulaattorl (Apple, et ai., .*.tj 1988). ELISA:lla analysoituna oli GD3-cBSA-konjugaattien • * : .·. aikaansaama IgM-vaste vain kohtalainen, mutta IgG-vasta- *·· · ··.·. 25 aineiden tiitteri suuri. Näiden suuritiitteristen antisee- • · | ! rumien jatkotutkimuksissa ITLC:llä tai täpläblotti-immuno- i · · '**.* värjäyksillä havaittiin, ettei tämä vaste ollut spesifinen • * · *·* * GD3:a vastaan. Tam, J., et ai. (Tam, 1988; Tam ja Lu, 1989), ovat kuvanneet toisen houkuttelevan lähestymistavan 30 rokotteen konstruoimiseksi, jossa käytetään moniantigeeni- ··* *...· peptidijärjestelmää (MAP). Haaroittuneeseen oligomeeriseen lysiiniydinmolekyyliin perustuvat MAP:t koostuvat neljästä *m\m· tai kahdeksasta B- ja T-soluepitooppeja sisältävästä dend- • · · . riittipeptidihaarasta. Peptidejä vastaan suunnattu immuu- • · » i *.· 35 nivaste parani näitä konstruktioita käytettäessä silmiin- * · * · · • * · « · 117668 31 pistävästi verrattuna pelkästään B-solu- tai T-soluepi-tooppeja sisältäviin peptideihin. Kun GD3 liitettiin MAP-rakenteen aminoterminaaliseen päähän, joka sisälsi mala-ria-T-soluepitoopin, niin havaittiin vain kohtalaisen suu-5 ri GD3:a vastaan suunnattu IgM-vaste, mutta ei lainkaan IgG-vastetta. Vaikka tämä lähestymistapa on erittäin tehokas synteettisten peptidien yhteydessä, niin vaikuttaa siltä, että sillä on vain vähän käyttöä gangliosidirokot-teiden kyseessä ollessa, yhteydessä. Gangliosidejä vastaan 10 suunnattujen vasta-aineiden on raportoitu pystyvän erottamaan tuumoriperäisen GM3:n ja normaaleissa kudoksissa esiintyvän GM3:n toisistaan, koska näiden esiintymistiheydet solun pinnalla ovat erilaiset (Nores, et ai., 1987). GD3:n konjugoimisen polylysiiniin ajateltiin edus-15 tavan yhteen molekyyliin liittynyttä suurta GD3-epitooppi-tiheyttä. GD3-polylysiiniä vastaan suunnattu vaste oli kohtalaisen voimakas, oli havaittavissa vain tiitteriltään keskitasoa oleva IgM-vaste eikä lainkaan IgG-vastetta.
Lopulta kuitenkin reikäkotilon hemosyaniiniin konjugoidul-20 la GD3:lla, GD3-KLH:lla, immunisoiduissa hiirissä kyettiin saamaan aikaan suuritiitterisimmät IgM- ja IgG-vasteet, jotka olivat merkittävästi aikaisemmilla rokotteilla ai- • • *.^1 kaansaatuja tiittereitä suuremmat.
• * : Näiden seerumien havaittiin immuunivärjäysmääritys- · · (»t | 25 ten perusteella olevan erittäin spesifisiä ihmisen kudok- • · j sista tehdyistä uutteissa esiintyvälle GD3:lle. Tutkit- • φ · *’*.* taessa IgM-immuunivasteen kehittymistä ajan suhteen ha- ♦ · · .
* valttiin samanlaisia luonteenomaisia piirteitä kuin aikaisemmissa tutkimuksissa (kuvio 2). lgM:n tiitteri oli suu- • · · *.ϊ.* 30 rimmillaan kolmannen rokotuksen jälkeen annettaessa roko- • ♦ · tuksia kahden viikon välein. Vaste heikkeni nopeasti ei- ♦ .···. vätkä jatkuvat rokotukset tehostaneet merkittävästi vasta- „"· ainevastetta. Tämä on ensimmäinen raportti, jossa ganglio- i • · . sidirokotteilla on osoitettu saatavan aikaan suuritiitte- ·· · : *.· 35 rinen igG-vaste. Tämän vasteen kesto oli huomattavasti • · • » · • * · • · 117668 32
IgM-vasteen kestoa pitkäaikaisempi ja se tehostui jatkuvilla rokotuksilla, mutta ei ollut kuitenkaan verrattavissa proteiiniantigeenien yhteydessä usein havaittavaan vasteen eksponentiaaliseen voimistumiseen. Immunoglobuliinien 5 alaluokan määritettiin olevan IgGl eikä ollut varmaa, ak-tivoivatko gangliosidikonjugaattirokotteet T-soluista riippuvaisia reaktioteitä. Vaikka auttaja-T-solut ovat epäilemättä merkittävässä asemassa B-solujen kypsymisessä, niin niiden osuus vasta-aineluokkien säätelyssä on kiis-10 tanalainen ja on olemassa useita raportteja, joiden mukaan auttaja-T-solujen aktiivisuus voi saada aikaan isotyypin vaihtumisen (Teale ja Abraham, 1987). Pelkästään GD3:n oligosakkaridiosan sisältävien konjugaattien ei havaittu reagoivan mAb R24:n kanssa eivätkä ne pystyneet saamaan 15 aikaan merkittävää immuunivastetta GD3-gangliosidia vastaan. Oligosakkaridiketjun pelkistävässä päässä olevan glukoosin muokkaaminen konjugaation aikana tai jonkin osan puuttuminen keramidista saattaa vaikuttaa epitoopin oikeaan esittämiseen immuunijärjestelmälle tai siihen, kuin-20 ka immuunijärjestelmä havaitsee tämän. Kumpikin näistä konjugaatiomenetelmistä oli suhteellisen tehoton ja saan-not pieniä. Tuumoreihin liittyviä gangliosideja vastaan ; suunnatun spesifisen immuunivasteen syntyminen potilaissa I 1« .1 suhteellisen tehottomillakin rokotteilla sai aikaan im- • · • · · 25 muunivasteen ja siihen liittyi ennusteen paraneminen.
* · · • 1 * 1 Gangliosidikonjugaattirokotteilla osoitettiin hiirissä • · 1 pystyttävän saamaan aikaan pitkäkestoinen ja spesifinen V : IgG-vaste, mikä viittaa siihen, että erityisesti GD3-KLH- konjugaatti saattaa pian osoittautua käyttökelpoiseksi :#;t: 30 tuumorirokotteeksi melanoomapotilailla.
* · · • • · ···
• H
• · « • · • · • · · • · · · 1 • « ··· ··· • · • 1 · « · • · ' : 33 117668
Toinen koesarja I-vaiheen tutkimus, joka koskee immunologista adju-vanttia QS-21 KLH:hon kovalenttisesti liitetyllä GM2-gang-liosidilla rokotetuissa melanoomapotilaissa.
5 Tavoite: GM2:ta vastaan suunnattujen vasta-aineiden muodostumisen käynnistämiseen tarkoitetun immunologisen QS-21-adjuvantin optimaalisen turvallisen annoksen määrittäminen.
Tausta 10 Levinneisyysasteeltaan AJCC-luokan III melanoomaa sairastavien potilaiden taudin uusiutuvuus kahden vuoden kohdalla ja kuolevuus kolmen vuoden kohdalla on 60 - 70 % (Hilal, et ai., 1981; Eilber, et ai., 1976). Leikkauksen jälkeen oireettomien levinneisyysasteeltaan luokan IV me- 15 lanoomaa sairastavien potilaiden ennuste on edellistä huonompi. Näiden ennusteiden muuttamiseen ei tunneta minkäänlaista hoitoa. Leikkauksen jälkeen levinneisyysasteeltaan luokan lii melanooman tavanomaisena hoitona on tiivis seuranta .
20 Joidenkin melanoomaa sairastavien potilaiden seeru missa on osoitettu olevan vasta-aineita, jotka reagoivat :*·*: melanosyyttien hyvin rajoittuneiden differentiaatioanti- .*.#ί geenien kanssa. Joissakin tapauksissa havaittiin, että • · : näiden vasta-aineiden esiintyminen liittyi taudin odotta- • · * · ··,·. 25 mattomaan etenemiseen suotuisaan suuntaan (Livingston, et f · • I ai., 1987). Koska ainoastaan muutamilla potilailla on ve- | • · · ").* ressään näitä vasta-aineita, on vasta-aineiden muodostu- • * · *** * mistä yritetty indusoida immunisoimalla potilaita kyseessä olevia antigeenejä sisältävillä melanoomarokotteilla. Täs- *.:.* 30 sä suhteessa kokonaisista soluista valmistettu rokote on * * ϋ :.,.ϊ ollut tehoton (Livingston, et ai., 1982). On ehdotettu .·**. sitä, että rokotteet tulisi nykyisin valmistaa käyttämällä kokonaisten melanoomasolujen sijaan puhdistettuja antigee- • » . nejä. Äskettäin loppuun saatetuissa tutkimuksissa on poti- M · : 35 laita rokotettu BCG-GM2-rokotteella ja 44 potilaasta on 33 • * • * i • ·« • · 117668 34 potilaalla havaittu lyhytkestoista IgM-vasta-aineiden muodostumista (Livingston, et ai., 1989; Livingston, 1989, mutta IgG-vasta-ainevasteita todettiin vain harvoissa tapauksissa.
5 Tehokkaiden adjuvanttien tai muiden lähestymistapo jen etsintä gangliosidien, kuten GM2;n, immunogeenisyyden lisäämiseksi ja erityisesti IgG-vasteen indusoimiseksi on jatkuvaa. Suotuisimmat tulokset on gangliosideja vastaan suunnatun IgG-vasteen aikaansaamisessa hiirillä havaittu 10 saatavan käyttämällä kovalenttista liittämistä reikäkoti-lon hemosyaniiniin. Tämä perustuu jakautuneen toleranssin käsitteeseen. Immunologista toleranssia ja sen välttämis-tapoja koskevissa tutkimuksissa on osoitettu, että monissa erilaisissa kokeellisissa järjestelmissä T-soluvasteen 15 vaimentuminen syntyy helpommin kuin B-soluvasteen vaimentuminen (Romball, et ai., 1984; Weight, 1977). T-solutole-ranssin ylläpitämiseen sopivat kiertävän veren antigeenien pitoisuudet eivät yleensä riitä B-solutoleranssin ylläpitoon. Jos T-soluilta tulevien aputoimintojen käyttö teh-20 dään mahdolliseksi (voimakkaiden asiaankuulumattomien an- * tigeenien, kuten haluttuun immunogeeniin kovalenttisesti liitetyn KLH:n, avulla), niin tämän perusteella voidaan saada syntymään vasta-aineita elimistön sietämiä T-soluis- • · ; ta riippuvaisia antigeenejä vastaan. Tällä lähestymistä- • · f HV 25 valla on koe-eläimissä saatu suotuisin tuloksin muodostu- • · » II maan IgG-vasta-aineita monia erilaisia hiilihydraattianti- geenejä vastaan (Kundu, et ai., 1980; Gray, 1978; Chang ja · · *** * Rittenberg, 1981; Longenecker, et ai., 1987) ja äskettäin vastasyntyneillä lapsilla H. influenzaen polysakkaridian- 30 tigeeniä vastaan.
• · KLH:n suhteellinen moolimassa vaihtelee melko pal- .···. jon, mutta se on suunnilleen 2 x 106 Daltöniä. Monet tutki- • ·
musryhmät (Berd, et ai., 1982) ovat injektoineet sitä int- I
* · - . radermaalisesti 1 mg:n annoksena viivästyneen yliherkkyys- ? ·· 9 ! *.· 35 reaktion (dth, delayed type hypersensitivity) aikaansaami- • · • · · ·*··· • · 117668 35 seksi. Biomira Inc. (Edmonton, Kanada) on valmistanut pyrogeenitonta KLH:ta, jota on liitetty kovalenttisesti GM2:een ja saavutettu suuri epitooppitiheys (1 000/1). Immunologisiin adjuvantteihin yhdistettynä on näitä val-5 misteita käyttäen saatu hiirissä muodostumaan suuritiitte-risiä IgG-vasteita GM2:ta vastaan.
Esikliinisissä tutkimuksissa tutkituista KLH-konju-gaattirokotteiden, kuten T-antigeeni-KLH:n, yhteydessä käytetyistä immunologisista adjuvanteista on tehokkain 10 ollut QS-21. Useimmissa hiirissä on havaittu IgG-vasta-ainetiittereitä, jotka ovat yli 1/4 000, sekä voimakas DTH-reaktio. Pelkällä T-KLH:11a tiitterin mediaaniarvoksi saadaan 1/160 eikä lainkaan DTH-reaktiota. QS-21 on etelä-amerikkalaisen Quillaja saponaria Molina -puun kaarnasta 15 uutettu hiilihydraatti. Monosakkaridikoostumusta, suhteellisia moolimassoja, adjuvanttivaikutusta ja toksisuutta on kuvattu yhdestä näiden saponiinien muodostamasta ryhmästä (Kensil, et ai., 1991). QS-21 valittiin adjuvanttitehokkuutensa ja toksisten vaikutuksen puuttumisen ansiosta. 20 Sen on todistettu olevan ei-toksinen ja että se lisää erittäin tehokkaasti kissoilla FeLV-alayksikkörokotteen • m iml i immunogeenisyyttä (Marciani, et ai. ) ja reesusapinoilla :1·.· HIV-1-yhdistelmärokotteen immunogeenisyyttä.
• · : Koska lisäksi on osoitettu, että joillakin melanoo- «·1 · 25 mapotilailla on suppressorisoluja, jotka saattavat estää • i • immunisointia ja että näitä soluja voidaan inhiboida pie- • 1 · "!,1 neliä syklofosfamidiannoksella (Livingston, et ai.,
• 1 S
* 1987b), niin jokaiselle potilaalle annetaan ennen ensimmäistä rokotusta pieni syklofosfamidiannos. Tämän yhdiste- • f · *·!·1 30 tyn lähestymistavan on havaittu lisäävän glykolipidien ja
Ml • · *...1 muiden antigeenien immunogeenisyyttä koe-eläimissä ja me- ·'2; lanoomapotilaissa (Livingston, et ai., 1987a; Livingston, et ai., 1989).
• · ·· · ··· * t • 1 · • · « « ·· 2 • · • 36 117668
Tutkittava populaatio
Tutkittavaksi voidaan ottaa potilaita, joilta on kahdesta kahdeksaan kuukauden sisällä leikattu levinnei-syysasteeltaan AJCC-luokan III tai IV suuririskinen malig-5 ni melanooma, joiden patologiset mikroskopoitavat kudos-leikkeet on tarkastettu Memorial Hospital -sairaalan patologian osastolla ja jotka ovat kliinisesti oireettomia.
Potilaiden kunnon oltava > 80 (Karnofsky) ja odotettu eloonjäämisaika (melanoomaa lukuun ottamatta) vähintään 10 5 vuotta. Tutkimuksen ulkopuolelle jätetään raskaana ole vat naiset, kalaruuille allergiset potilaat ja potilaat, joiden kreatiini- tai bilirubiiniarvo on > 2,0. Potilaat ovat voineet aikaisemmin saada sädehoitoa, kemoterapiaa tai immunoterapiaa (joka on saatettu loppuun 8 viikkoa 15 ennen rokotusta).
Hoidon arviointi
Potilaille on suoritettava perusteellinen lääkärintarkastus Memorial Hospital -sairaalassa ja heistä on otettava thoraxröntgenkuvaus, täydellinen verenkuva, see-20 rumin kreatiniini ja maksan toimintakokeet 3 viikon sisäl- ^ lä hoidosta. Potilaat, joilla maksan toimintakokeet tai thoraxröntgentulokset ovat poikkeavat, hyväksytään, jos ·*·,; muilla tutkimuksilla (eli CTT:llä, tomogrammeilla jne.) ei t · : .·. havaita melanoomaa.
* · * · * · ··,·, 25 Rokotteen valmistus • · I Kemia ia valmistus * « « - Lääkeaine • · 9 *** * Nimi ja materiaali lähde
Koko nimi 30 GM2-KLH: synteettinen tuumoreihin assosioituva gly- ··· *...· kokonjugaatti (S-TAG) - tarkoitettu käytettäväksi aktiivi- .···. sessa spesifisessä immunoterapiassa • · · GM2-HSA: synteettinen tuumoreihin assosioituva gly- • · • kokonjugaatti (S-TAG) - tarkoitettu käytettäväksi GM2- e·*·'-· • · • · ··.·'· • * · • · · • · : 37 1 1 7 6 6 8 .: KLHjlla tehtävää spesifistä aktiivista immunoterapiaa saavien potilaiden ihotestaukseen.
Kemiallinen nimi: H3NeuAc-GcOse3Cer-reikäkotilohemosyaniini (KLH) 5 Laboratoriokoodit: GM2-KLH erä nro 5 GM2-HSA erä nro 1
Valmistaja: Biomira Inc. Research Centre One,
Edmonton Research and Development Park, 9411-20 Avenue 10 Edmonton, Alberta T6N 1E5, Kanada.
GM2-hapteenin valmistuksessa käytettävät materiaalit
Materiaali Valmistaja Laatuluokka
15 Asetoni BDH ACS
Ammoniakkiliuos BDH ACS
Kloroformi BDH ACS
Etanoli Commercial Alcohol -
Ltd.
Etyylieetteri BDH ACS
• ·
V*: 20 Me t anoi i BDH ACS
• · • · · Ä • · ·
jtV 2-propanoli Fisher UN1219 ACS
• · • ·
: Vesi Travanolin steriili ACS
**» * ·*!*· huuhteluvesi • · ·
Kalsiumkloridi Fisher Varmennettu t *.V (vedetön - rakei- *·· ! : 25 nen, mesh-luku M· ' 20) • · • · · "**: Dimetyylisulfidi Aldrich 99 % + ΙΌ GM2 Fidia • * • · « ··* • * 117668 38
Happi Linde UN1072 UHP
Silikageeli E. Merck Kieselgel 60H
Art 7736
Natriumsyaani- Aldrich 95-%risesti boorihydridi puhdas
5 TLC-levyt E. Merck Kieselgel 60H
F254
Konjugaatiomenetelmässä käytetyt materiaalit g Materiaali Valmistaja Laatuluokka
Reikäkotilon hemosyaniini (KLH), lyofi- Calbiochem, - -
lisoitu, 60 % proteiinia BES [N,N-bis-(2- San Diego,CA
hydroksietyyli-2-aminoetaaniaulfonihappo] •puskurissa, puhtaus 90 % 15 Deoksikolihappo, natriumsuola (DOC) (mo- Aldrich Analyyttinen nohydraatti) 98 %
Etyleenidiamiinitetraetikkahappo Aldrich ACS
Dinatriumvetyortofoafaat~ti (vedetön) SDK Analyyttinen (Na2HP04) ; : : 20 Natriumkloridi (NaCl) BDH Analyyttinen • · ! 1,J Kaliumdivetyortofoafaatti (KHjPO^) BDH Analyyttinen * 2 i · · Natriumhydroksidi (NaOH) BDH Analyyttinen • · · 1 • · · * # · * · Tris(hydroksimetyyli)aminometaanivetyklo· Sigman - : 2\ ridi • 1 2 • · · · ·3♦ 25 Natriumsyaaniboorihydridi (NaBH^CN) Aldrich -
Sepharose CL-4B Pharmacia - J J J Typpikaasu (suodatettu) Medigae - ··1 *·· • ♦ Ihmisen seerumin albumiini, 25-%:inen Miles USP, injektioon tar· * 1 1 ♦ liuos (hsa) koitettu ··· t · • · ***^ 30 GM2-aldehydi Biomlra Inc1 • « ·· · ♦ · ·· · ♦ · · • 1 ♦ · · • · .
2 • · 3 • 1 117668 39
Kemiallinen tuotekehitys GM2:ta ja GM2-aldehydiä koskevat koetulokset: GM2:n ja GM2-aldehydin rakenteet karakterisoitiin Biomira Inc. -yhtiössä XH NMR -spektroskopialla, ohutker-5 roskromatografialla (TLC), FAB-MS:llä ja FT-IR:llä.
Rakennekaava Molekyylikaava Moolimassa GM2-gangliosidi (yhdiste nro 1)
Ga 1 NAcB 1 -4GaLBl-4 C67H121026N3 M - 1 = 1328 10 GlcBl-lCer Kiinteä
Neu5Aca2 I3NeuAc-GgOSe3Cer C69H125026N3 (happo) M - 1 1 1410 TLC: Rf = 0,21 (65:35:8 CHC13-CH30H-H20)
Rf = 0,60 (5:4:1 CHC13-CH3OH-0,2-%:inen vesipi-15 toinen CaCl2)
Rf - 0,2 (7:1:1 (CH3)2CH0H-NH40H-H20)
Rakennekaava Molekyyli Suhteel- Fysikaalis- ·1!1. kaava linen moo- kemialliset .·. ϊ limassa ominaisuudet • ·· • · · GM2-aldehydi C53Hg3027N3 1204,29 Kermanvalkoi- • 1φί 20 (yhdiste nro 2) nen, hajuton, : amorfinen ·«·· :1:1· kiinteä aine .1. Rakennetta koskevat koetulokset .···. 1H(DMS0-d6:D2) 6: 9,48 (d, 1 H, J 1 2,0 Hz), 4,79 X (d, 1 H, J = 8,5 Hz, III-l), 4,26 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, 25 II-l), 4,19 (d, 1 H, J - 8,0 Hz, 1-1), 2,54 (dd, 1 H, A-3e), 1,88 (s, 3 H, Ac), 1,78 (s, 3 H, Ac), 0,85 (t, 3 H, !V; J - 6,6 Hz, CH3).
• · • 9 * ♦ 1 • ·1 • 1 40 1 1 7668 FT-IR (KBr-pelletti, CM"1): 3439, 3420, 2952, 2923, 2851, 1634, 1070 (mahdollisesti gem-dioli).
TLC: Rf = 0,5 (5:4:1 CHC13-CH3OH-0,2-%:inen vesipitoinen CaCl2) 5 klh:ta, GM2-KLH:ta, HSA:ta ja GM2-HSA:ta koskevat koetulokset
Reikäkotilon hemosyaniini (KLH) on suurikokoinen monimutkainen proteiini, joka koostuu monista pienimole-kyylipainoisista alayksiköistä. KLH uutetaan ja puhdiste-10 taan reikäkotilonilviäisestä (Megathura crenulata). KLH, HSA ja konjugaatit karakterisoitiin Biomira Inc. -yhtiössä Sepharose CL-4B -geelisuodatuskromatografialla, isoelek-tisellä fokussoinnilla (IEF) ja kolorimetrisellä resorsi-noli-suolahappo-menetelmällä (1).
15
Yhdiste Sepharose CL-4B Isoelektrinen Resorsinoli--kromatografia fokussointi geeli-HCl
Suhteellinen (isoelektrisi (moolimäärä, moolimassa nä pisteinä) hapteeni- ? (daltoneina) moolit/pro- teiinimoolit) ··· ' • ♦ · • · . KLH Koko molekyyli Useita vyö- (2):>2 x 106 hykkeitä pH-
Alayksiköt: alueella ; ί ·: 2 - 7 x 105 4,65 -6 • · · ··· ··· · GM2-KLH Koko molekyyli Useita vyö- 200 - 1400 (2):> 2 x 106 hykkeitä pn-
Alayksiköt: alueella 2 - 7 χ 105 4,65-6 • · • · • · · HSA 5 - 9 χ 104 • · e · ♦·· • · # ·· « • •e·'..· • » · • · • · · • ·· • t 117668 41 GM2-HSA 5 - 9 x 104 Leveä vyöhyke 2-12 pH-arvossa 4,65 1. Svennerholm, L., Biochimica et Biophysica Acta 24 (1957) 604 - 611.
5 2. Sepharose CL-4B -geelisuodatusmenetelmällä koko KLH-proteiinimolekyyli eluoituu kolonnin sisäisen tilavuuden kohdalla, mikä osoittaa, että KLH:n suhteellinen moolimassa on > 2 x 106. Tämä arvo on yhteensopiva tälle proteiinille kirjallisuudessa ilmoitettujen suhteellisten 10 moolimassojen kanssa.
Vuokaavio GM2-KLH:n valmistuksesta Vaihe 1 - GM2:n puhdistus GM2 (FIDIA) virustutkimukseen toimitettu materiaali 15 l
Silikageenikolonnikromatogtrafia 1. 65:35 kloroformi - metanoii 2. 65:35:4 kloroformi - metanoli - vesi
Valmistuksen sisäinen laadunvalvonta: «··
V : 20 1. TLC
• ·
2. *H NMR
• · ♦ · · * · · · ····
Vaihe 2 - KLH:n puhdistus: • · • PBS:ään, pH 7,5, liuotettu KLH ( ~ 3 mg/ml) • * · · 25 i • · ·
Sentrifugointi III Liuotetusta KLH:sta otettua näytettä käsitellään • · ”* Sepharose-kolonnissa suhteellisen moolimassaprofiilin mää- * * * ϊ.,.ί 30 rittämiseksi *
·*·* I
* * i
Diafiltraatio peräkkäisissä puskureissa, jotka • · *. ’. ovat: • · · ·♦· • · 117668 42 1. PBS, pH 7,5 2. Tris-HCl, EDTA, pH 7,5 3. Tris-HCl, EDTA, 0,5 % DOC, pH 7,5 4. Tris-HCl, EDTA, pH 7,5 5 5. PBS, pH 7,5 4 :. ^
Tilavuus säädetään steriilillä pyrogeenittomalla PBS:llä ~ 75 ml:ksi : 1 10 Sentrifugointi 4
Steriilisuodatus 4
BioRad-protelinimäärityksen suoritus 15 4 ; KLHrsta otettua näytettä käsitellään Sepharose-ko- lonnissa suhteellisen moolimassaprofiilin määrittämiseksi 4 20 Konsentraation säätö arvoon 10 mg/ml käyttäen PBS:ää, jonka pH on 7,5 4 • · · : KLH:n jako pieniin eriin seerumipulloihin ja pakas- • * · • tus -20 ± 5 °C:ssa • * * 25 Valmistuksen aikaiset tutkimukset i * · · .·>( · * ; 1. Isoelektrinen fokussointi (IEF) • · · " 2. Limuluksen amebosyyttilysaatti (LAL) -pyrogeeni- *·* * testi 30 Vaihe 3 - GM2-aldehydin (yhdiste nro 2) synteesi GM2 (yhdiste nro 1) ··. 4
(1) 03, MeOH
• * • 1 fv 35 (2) CH3SCH3 · • * · • * · • · 117668 43 l GM2-aldehydi (yhdiste nro 2, voi olla gem-dioli) i
Valmistuksen aikana tuotantotiloissa suoritettavat 5 tutkimukset: i
1. TLC
i
Vaihe 4. GM2-hapteenin konjugointi KLHzhon 10 Sulatetaan steriili pyrogeeniton KLH
i
Lisätään KLH hapteeniin suhteessa 4:1 (w/w) i
Inkuboidaan huoneenlämmössä ravistellen 3 minuutin 15 ajan
Lisätään NaBH3CN:ää hapteenin ja KLH:n seokseen käyttäen seossuhdetta 1:1 hapteenin perusteella ilmoitettuna 20 l
Reaktioseosta sekoitetaan varovasti huoneenlämmössä yön yli ja sitten 40 °C:ssa 4 päivää *
• · I
• · · ♦ ··* ·’.·] Vaihe 5 - Konjugaatin diafiltraatio • · · V 25 Konjugaatin diafiltraatio suoritetaan käyttäen * I ‘ liuoksina • t · ·*;;/ 1. PBS, pH 7,5 V : 2. Tris/EDTA, pH 7,75 3. Tris/EDTA, 0,05 % DOC, pH 7,75 30 4. Tris/EDTA, pH 7,5 5. PBS, pH 7,5 ,···. Konjugaatioseos poistetaan aseptisesti Amicon-fil- • · ***. traatiolaitteesta • * l | ",ϊ 35 Sentrifugointi • * • · · , • · i 117668 44
Konjugaatin steriilisuodatus l
Valmistuksen aikaiset laadunvalvontatutkimukset 5 1. BioRad-proteiinimääritys 2. Sepharose-geelisuodatus 3. Isoelektrinen fokussointi (IEF) i
Konjugaatin konsentraation aseptinen säätö arvoon 10 1 mg/ml l KOnjugaatin lisäys 1 ml:aan steriiliä pyrogeeniton-ta seerumia ja pakastus -20 ± 5 °C:ssa i 15 Lopullinen laadunvalvontatutkimus 1. Entsyymi-immuno- 5. Pyrogeenitesti määritys (EIA) kaniineissa 2. LAL-pyrogeeni- 6. Yleinen testi turvallisuustesti 20 3. BioRad-proteiinitesti 7. Steriilisyystesti 4. Resorsinoli-HCl-määritys 8. Epäpuhtaustesti ·**: syanidin varalta : GM2-KLH-konjugaattien valmistusmenetelmä • 4 : ASI:hin tarkoitetun puolisynteettisen GM2-KLH-gly- · 4 •IV 25 kokonjugaatin ja ihotestaukseen tarkoitetun puolisynteet- • · * ; tisen GM2-HSA-glykokonjugaatin valmistus tapahtuu viidessä * * · *·· · vaiheessa: * * * *·* * 1. Tuotantoerässä käytettävän GM2:n (nautalähtöma- teriaalln) (yhdiste nro 1) puhdistus.
30 2. Reikäkotilon hemosyaniinin (KLH) puhdistus.
• · · 3. GM2-aldehydin (yhdiste nro 2) synteesi.
.*··. 4. GM2-hapteenin konjugointi KLH:hon.
5. Konjugaatin diafiltraatio.
• · - ' . Vaihe 1: GM2:n (yhdiste nro 1) puhdistus: ·· · • *,· 35 Nimi: GM2-gangliosidi i#*.: Lyhenne: Il3NeuAc-GgOse3Cer 117668 45 Lähtömateriaalina käytettävä Fidia-yhtiön toimittaman (naudasta peräisin olevan) GM2-gangliosidinäyte toimittaminen virustutkimukseen (8CFR-menetelmä). Kaikki valmistuksessa käytettävä lasitavara pestään tislatulla ase-5 tonilla, sen jälkeen tislatulla etanolilla ja kuivataan sitten lämpökaapissa (130 °C) 18 tunnin ajan ennen käyttöä. Silikageelikolonni (Michel-Miller S 715-10) (30,5 g,
Kieselgel 60H, Art 7736, E. Merck) täytetään 517 kPa:n (75 psi) paineessa (SSI:n mallin 300 Lo -pumppu) käyttäen 10 liuottimena kloroformista ja metanolista suhteessa 65:35 valmistettua seosta. GM2 (200 mg) lisätään kolonniin väke-vöitynä kloroformista ja metanolista suhteessa 65:35 valmistetussa liuoksessa ja kolonnia eluoidaan ensin tällä liuottimena ja sitten kloroformista, metanolista ja ve-15 destä suhteessa 65:35:4 valmistetulla seoksella. Fraktiot analysoidaan TLC:llä (Rf 0,6, suhteissa 5:4:1 valmistettu kloroformin, metanolin ja 0,2-%:isen vesipitoisen CaCl2:n seos). GM2:ta sisältävät fraktiot kerätään yhteen ja haihdutetaan, mistä saadaan kermanvalkoista amorfista kiinteää 20 ainetta.
Tämän gangliosidin identiteetin ja puhtauden var- ·’·*; mistamiseksi tätä materiaalia (yhdiste 1) tutkittiin vai- j*.^ mistusmenetelmän aikana NMRilla ja ohutkerroskromatogra- * : f iällä (TLC). Näistä tutkimuksista saatujen koetulosten • t · ;·4·] 25 täytyy olla kemian alan tuotekehitystä koskevaa otsikkoa II seuraavassa kappaleessa asetettujen vaatimusten mukaisia.
• · · • » · *;),· Jos tämä materiaali havaitaan epäpuhtaaksi niin edellä • * · '·' * kuvatut puhdistusvaiheet toistetaan.
Vaihe 2: Steriilin pyrogeenittoman reikäkotilohe-30 mosyaniinin (KLH) valmistus • · :1)f! KLH:n valmistus • ··.··? ,···. Suoritusvaiheet tapahtuvat kokonaisuudessaan luokan • · 100 biologisessa turvakaapissa. Calbiochem-yhtiöstä hän- • · kittu reikäkotilon hemosyaniini (KLH) liuotetaan 100 ·· · j V 35 ml:aan steriiliä pyrogeenitonta fosfaatilla puskuroitua • • · • ·· * · ' 46 117668 fysiologista suolaliuosta (PBS, pH 7,5). Tätä liuosta in-kuboidaan 2-6 °C:ssa 18 tunnin ajan KLH:n liuottamiseksi liuokseen. Tämän jälkeen liuosta sentrifugoidaan nopeudella 200 kierrosta minuutissa 30 minuutin ajan. Supernatant-5 ti kerätään talteen ja tästä otettu näyte käsitellään Sep-harose CL-4B -geelikolonnissa käsittelemättömän KLH:n suhteellisen moolimassaprofiilin määrittämiseksi.
Ennen KLH:n dialyysiä Amiconin sekoitusmekanisrnilla varustettu ultrafiltraatiokammio steriloidaan ja siitä 10 poistetaan pyrogeenit huuhtelemalla se ensin neljä kertaa steriilillä injektiovedellä (WFI, water for injection) ja sen jälkeen täyttämällä kammio 95-%:isella etanolilla ja jättämällä se sekoittumaan kahden tunnin ajaksi. Laite huuhdellaan uudelleen injektiovedellä, jonka jälkeen se 15 autoklavoidaan.
KLH:ta sisältävä supernatantti kaadetaan steriiliin pyrogeenittomaan 400 ml:n vetoiseen Amicon-diafiltraatio-laitteeseen, joka on varustettu YM 30 -suodattimena (suodattimen päästöraja on suhteellisen moolimassan 30 000 20 kohdalla). KLH:n kokonaistilavuus säädetään 350 ml:ksi steriileillä pyrogeenittomilla tai vähäpyrogeenisilla pus-kureilla seuraavassa järjestyksessä: :*·,· 1. 1 täydellinen vaihto PBS-puskuria, jonka pH on j 7,5 (steriili, pyrogeeniton puskuri) • · · · 25 2. 3 täydellistä vaihtoa Tris-HCl, EDTA -puskuria, * · • · : jonka pH on 7,65 (steriili, vähäpyrogeeninen puskuri) • · · 3. 2 täydellistä vaihtoa Tris-HCl, EDTA -puskuria, • jonka pH on 7,75 ja joka sisältää 0,5 % deoksikolihappoa (DOC) (steriili, vähäpyrogeeninen puskuri) • · · *·!.* 30 4. 4 täydellistä vaihtoa Tris-HCl, EDTA -puskuria, · jonka pH on 7,75 (steriili, vähäpyrogeeninen puskuri) « ;***. 5. 3 täydellistä vaihtoa PBS-puskuria, jonka pH on • I» 7,5 (steriili, pyrogeeniton puskuri)
Jokainen puskurin vaihto koostuu Amicon-laitteessa • · · ‘ ·' 35 olevan tilavuuden pienentämisestä 50 ml:aan tai sitä pie- • • · · ♦ ·· • · 117668 47 nemmäksi ja sellaisen puskurimäärän lisäämisestä, että tilavuus suurenee uudelleen 350 ml:ksi.
(Steriili pyrogeeniton PBS valmistetaan kemikaaleista, joita on kuumennettu 180 - 185 °C:ssa 4,5 tunnin 5 ajan. Kemikaalit lisätään steriiliin injektioveteen (WFI) ja yhdistetään keskenään steriilissä, pyrogeenittomassa sekoitusastiassa. Toisten puskuriliuosten kemikaaleja ei voida kuumentaa niiden sisältämien pyrogeenien poistamiseksi, koska ne sulavat tällaisissa äärilämpötiloissa, 10 mistä syystä nämä puskuriliuokset valmistetaan steriiliin injektioveteen steriileissä, pyrogeenittomissa sekoitus-astioissa ja suodatetaan steriileiksi käyttäen suodatinta, jonka huokoskoko on 0,22 pm. PBS- ja Tris-HCl-puskuri-liuosten pH säädetään vaadittuun pH-arvoon käyttäen ste-15 riiliä pyrogeenitonta 2 N natriumhydroksidia.)
Tris, EDTA pH 7,75 -puskurissa olevan D0C:n tehtävänä on pilkkoa pyrogeenit suodattimen läpi kulkeviksi pienimoolimassaisiksi alayksiköiksi KLH-proteiinin jäädessä Amicon-laitteeseen. (8.9).
20 KLH-liuos poistetaan Amicon-yksiköstä aseptisesti ja se sentrifugoidaan uudelleen nopeudella 2000 kierrosta ·1·1: minuutissa 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen liuos siirre- .1. : tään steriiliin pyrogeenittomaan mittalasiin ja liuos sää- • · : detään 75 ml:n lopulliseen tilavuuteen steriilillä, pyro- • · · |1V 25 geenittomalla PBS:llä, jonka pH on 7,5.
• · \ ! Tämän jälkeen supernatantti steriillsuodatetaan • · · ··1,· käyttäen suodatinta, johon proteiinien sitoutuminen on • · · *·’ vähäistä ja jonka huokoskoko on 0,22 pm. KLH-näyte käsi tellään Sepharose CL-4B-kolonnissa sen määrittämiseksi, 30 vaikuttiko KLH:n käsittely puskuriliuoksilla (erityisesti • · · D0C:llä) KLH:n suhteellisten moolimassan jakautumaan ver- .2·. rattuna käsittelemättömästä KLH:sta ensimmäisessä vaihees- · sa saatuihin kolonnikromatografiatuloksiin. Profiili ei • · . saa muuttua merkittävästi. KLH:sta otetaan näyte ja tästä 2 · : 1.1 35 tehdään BioRad-proteiinimääritys käyttäen standardikäyrän • ♦ • · ♦ • · · . 48 117668
valmistamiseen KLH:ta. KLH-liuoksen lopputilavuus säädetään aseptisesti steriilillä, pyrogeenittomalla PBS
7,5 -puskuriliuoksella sellaiseksi, että lopulliseksi pro- > teiinikonsentraatioksi saadaan 10 mg/ml.
5 Puhdistetun KLH:n pyrogeenipitoisuuden määrittämi seksi tehdään LAL-tutkimus. Konjugaatiomenetelmässä käytettävän KLH: n pyrogeenipitoisuuden tulee olla alle 10 EU/mg.
KLH: n puhtauden ja identiteetin tarkistamiseksi 10 tehdään isoelektrinen fokussointi (IEF). Standardeina käytetään aikaisempia KLH-valmistuseriä, jotka ajetaan geelissä rinnan näytteiden kanssa.
KLH-liuos jaetaan 10 ml:n erissä steriileihin pyro-geenittomiin 30 ml:n seerumipulloihin ja pullot suljetaan 15 steriileillä, pyrogeenittomilla butyylikumitulpilla. Tämän jälkeen KLH pakastetaan -20 ± 5 °C:ssa kunnes se konjugoi-daan hapteeniin. ,¾
Vaihe 3: GM2-aldehydin (tai -gem-diolin, yhdisteen nro 2) synteesi: 20 Kaikki lasitavara huuhdellaan tislatulla metanolil- la ja kuivataan lämpökaapissa (130 °C) 18 tunnin ajan en-iT: nen käyttöä. Liuokseen, joka sisältää puhdistettua GM2- gangliosidia (yhdiste nro 1) (40 mg) tislatussa metanolis- • « : sa (10 ml), sekoitetaan -15 °C:ssa (kuivajää-etanoli-hau- • · · 25 de) ja liuoksen läpi johdetaan 7 minuutin ajan ot- • · | * sonikaasua (Orec 03V10-0 -otsoninkehitin). Tämän jälkeen · * *".* liuoksen läpi johdetaan argonvirta ja reaktioseoksen koos- # · * *·* * tumus tarkastetaan TLC:llä (seossuhteissa 5:4:1 valmistet tu kloroformin, metanolin ja 0,2-%:isen vesipitoisen :.J.· 30 CaCl2:n seos). Tämän jälkeen liuottimet poistetaan alipai- ··· neessa ja tulokseksi saatu materiaali liuotetaan tislat-.*··. tuun metanoliin. Tähän liuokseen lisätään metyylisulfidia (200 ml) ja reaktioseosta sekoitetaan huoneenlämmössä yh- • * . den tunnin ajan. Tämän jälkeen liuottimet poistetaan ja ·· · i *.· 35 jäännös trituroidaan etyylieetterillä (4 x 25 ml). Tulok- • · » * i * · · • · : 117668 49 seksi saatu valkea kiinteä materiaali (yhdiste nro 2) kuivataan vakuumissa 15 minuutin ajan kaiken jäljelle jääneen liuottimen poistamiseksi ja sitä käytetään sitten suoraan seuraavassa konjugointivaiheessa.
5 Tulokseksi saadun aldehydin epästabiilin luonteen vuoksi (B-eliminaatio) yhdiste nro 2 tunnistetaan rutiininomaisesti ainoastaan TLCrllä. Tyypillisessä TLC-ajossa havaitaan tavallisesti pieni määrä sfinganiini- tai fytosfingosiinianalogia (sama Rf-arvo kuin yhdisteellä nro 10 1) ja pieni määrä pelkistävää sokeria (Rf 0,32).
Vaihe 4: GM2-hapteenin konjugointi KLH:hon (tai HSA:han):
Kaikki käsittelyt tehdään luokan 100 biologisessa turvakaapissa.
15 Kaksi pulloa, jotka molemmat sisältävät 10 ml pa kastettua steriiliä pyrogeenitonta KLHrta (10 mg/ml) sulatetaan välittömästi ennen käyttöä huoneenlämmössä.
KLH-proteiinin määrä (16 ml) mitataan aseptisesti ja sitä lisätään pulloon, joka sisältää lyofilisoitua GM2-20 hapteenia ja magneettisekoittajan sauvan. Liuosta sekoitetaan varovasti huoneenlämmössä 3 minuutin ajan kunnes ·1·1: kaikki hapteeni on saatu liukenemaan.
.'.J Hapteeni/KLH-liuokseen lisätään natriumsyaaniboori- • · : hydridiä (NaBH3Cn) (30 mg), jonka jälkeen pullo suljetaan • · · ··,·, 25 steriilisuodattimen sisältävällä injektioneulalla varuste- • · I ! tulla tulpalla. Liuosta ravistellaan varovasti ja sitä * « · inkuboidaan sitten yön yli huoneenlämmössä. Tämän jälkeen • 1 *·1 1 liuosta inkuboidaan vielä neljän päivän ajan 40 °C:ssa.
Vaihe 5: Glykokonjugaattien (GM2-KLH) diafiltraa- \i,: 30 tio: • · · ί.,.ϊ Hapteeni/KLH-reaktiopullon sisältö siirretään asep- ,1··, tisesti steriiliin pyrogeenittomaan ja YM-30-suodattimella varustettuun Amicon-ultrafiltraatiolaitteeseen. Amicon- • · . yksikön 110 kPa:n (16 psi:n) käyttöpaineen aikaansaamisek- 1.1 35 si käytetään suodatettua typpeä. Tämän jälkeen konjugaatti • t 1 · ·· • · 117668 50 diafiltroidaan käyttäen seuraavia steriilejä, pyrogeenit-tomla tai vähäpyrogeenisia puskureita seuraavassa järjestyksessä: 1. 2 täydellistä vaihtoa PBS-puskuria, jonka pH on 5 7,5 (steriili, pyrogeeniton) 2. 2 täydellistä vaihtoa Tris-HCl, EDTA -puskuria, jonka pH on 7,75 (steriili, vähäpyrogeeninen) 3. 2 täydellistä vaihtoa Tris-HCl, EDTA -puskuria, jonka pH on 7,75 ja jossa on 0,5 % deoksikolihappoa (DOC) 10 (steriili, vähäpyrogeeninen) 4. 4 täydellistä vaihtoa Tris-HCl-puskuria, jonka pH on 7,75 (steriili, vähäpyrogeeninen) 5. 3 täydellistä vaihtoa PBS-puskuria, jonka pH on 7,5 (steriili, pyrogeeniton) 15 Tämän jälkeen glykokonjugaatti poistetaan asepti sesti suodatusyksiköstä ja se sentrifugoidaan nopeudella 2000 kierrosta minuutissa 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen supernatantti suodatetaan steriiliksi käyttäen suodatinta, johon proteiinin sitoutuminen on vähäistä ja jonka huokos- 20 koko on 0,22 pm.
Otetaan talteen glykokonjugaattinäyte ja sille teh-ϊ ί’ϊ dään seuraavat valmistuksen aikaiset laadunvalvontatutki- mukset: • * • .*. 1. Sepharose-geelisuodatus ·** · 25 2. Isoelektrinen fokussointi (IEF) • » * · • ,·, 3. BioRad-proteiinimääritys • * * "!/ Proteiinimäärityksen tulosten perusteella glykokon- • · · * jugaatin lopputilavuus säädetään steriilillä pyrogeenitto- . . maila puskurilla, jonka pH on 7,5, siten, että proteiini- * * · •h* 30 konsentraatioksi saadaan 1 mg/ml.
t ·
Valmis glykokonjugaatti jaetaan sitten luokan 100 ·*"· biologisessa turvakaapissa 0,5 ml:n erissä 0,1 ml:n yli- • · · täyttöä käyttäen 1 ml:n steriileihin pyrogeenittomiin lä-pinäkyviin boorisilikaattiseerumipulloihin, jotka on va- • · * : ·* 35 rustettu punaisilla kumitulpilla ja ne pakastetaan II* • · · • * : 51 117668 -20 eC:ssa. Täyttövaiheen aikana seurataan täyttöalueella olevaa ilmaa kuvun sisällä olevalla ja työskentelyalueelle asetetulla kahdella veriagarmaljalla, jotka on jätetty avoimiksi vähintään 30 minuutiksi. Tämän jälkeen nämä mal-5 jät siirretään inkubaattoriin 37 °C:seen ja niitä inkuboi-daan 1-2 päivän ajan. Maljoista tutkitaan sitten kaikki mahdolliset bakteeri- tai sienipesäkkeet.
Pullot asetetaan laatikkoon, jonka sisään tulee myös nimilappu, jossa on tuotteen nimi, valmistuserän nu-10 mero ja pullojen lukumäärä. Tämän jälkeen laatikko suljetaan ja suljetun laatikon ulkopuolelle kiinnitetään samat tiedot sisältävä etiketti. Tämän jälkeen laatikko viedään karanteeniin jääkaappiin 1-2 päiväksi, ennen kuin se voidaan etiketöidä. Lopullisten laadunvalvontakokeiden 15 valmistuttua tehdään etikettipyyntö. Valmistushenkilökunta varustaa tuotteet etiketeillä ja etiketöinnin varmistaa laadunvalvontaosasto tai Regulatory Affairs -osasto. Tämän jälkeen Regulatory Affairs -osaston johtaja sekä Immuno-therapeutics-osaston osastopäällikkö ja toimitusjohtaja 20 allekirjoittavat lopullisen tuoteasiakirjan. Tämän jälkeen tuote luovutetaan ja se varastoidaan "Released Product" -pakastimessa -20 °C:ssa.
.‘.J Jokainen GM2-KLH- ja GM2-HSA-erä käy läpi seuraavat ····' : .·. lopulliset laadunvalvontakokeet: ··* * ··.·. 25 1. Entsyymi-irnmuunimääritys (EIA) • · | 2. LAL-pyrogeenikoe ***,* 3. BioRad-proteiinimääritys ·*♦··· *·" 4. Resorsinoli-HCl-hiilihydraattimääritys 5. Pyrogeenikoe kaniineilla 30 6. Yleinen turvallisuuskoe »«« 7. Steriilisyyskoe ,·*·, 8. Epäpuhtauskoe syanidin paljastamiseksi ,,,,· GM2-KLH:n on valmistanut Biomira Inc. -yhtiö • · . (Edmonton, Alberta) ja sitä käytetään U.S. Food and Drug ·*·*· i *.* 35 Administration -viraston luvalla. GM2:n ja KLH:n moolisuh- • · i * ···.
» · 117668 52 de on 800:1 (todellinen * 200 - 1400) ja konjugaatti toimitetaan konsentraatiossa, jossa konjugaattia on 0,57 mg 0,5 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta (PBS). Tämä vastaa noin 70 pg GM2-gangliosidia ja 5 500 pg KLH:ta 0,5 ml:n suuruista PBS-erää kohti. Viiden ensimmäisen immunisoinnin suorituspäivinä kuhunkin ruiskuun lisätään 0,5 ml liuosta ja ruisku viedään klinikalle rokotuksen antamista varten. Tämä vastaa 70 pg:n GM2-an-nosta, minkä on aikaisemmissa GM2:lla ja erilaisilla ad-10 juvanteilla tehdyissä tutkimuksissa havaittu olevan tehokas annos. Viimeinen (kuudes) immunisointi sisältää puolet tästä annoksesta, 35 pg GM2:ta ja 250 pg KLH:ta.
Cambridge Bioscience Inc. -yhtiö (Worcester, MA) on eristänyt QS-21:n Quillaja saponaria Molina -puun kaarnas-15 ta silika- ja käänteisfaasikromatografiällä aikaisemmin kuvatulla tavalla (16). Puhdistetun GM2-KLH-konjugaatin ja QS-21:n steriilisyys tutkitaan bakteriologisessa laboratoriossa tavanomaisilla viljelymenetelmillä, pyrogeenisyys tutkitaan kaniineilla ja turvallisuus tutkitaan kaniineil-20 la ja hiirillä. Nämä materiaalit jaetaan pieniin eriin ja varastoidaan -15 - -25 eC:ssa. Rokotuspäivänä 570 pg GM2-;*·'* KLH:ta (tai kuudennessa rokotuksessa 285 pg) yhdistetään : QS-21:een, materiaalit lisätään yhteen erilliseen ruis- • · : kuun, varustetaan tarpeellisin merkinnöin ja viedään kli- • · · ··,·, 25 nikalle.
• · j I Käytetään neljää QS2l-annosta, 10, 50, 100 ja "I,* 200 pg, joista kukin on laimennettu PBS:ään 0,25 ml:n ko- • · ’·' konaistilavuuteen. Ensimmäiselle kolmen potilaan ryhmälle annetaan kuusi rokotetta, jotka sisältävät 10 pg QS21:tä, t 30 seuraaville kolmelle potilaalle annetaan 50 pg QS21:tä, • · · seuraaville 3 potilaalle 100 pg QS21:tä ja viimeisille ,···, kolmelle potilaalle 200 pg QS21:tä. Yksikään potilaista ei • · jttt. saa seuraavaksi suurempaa annosta ennen kuin kaikki kolme • · . edellisen suuruisen annoksen saanutta potilasta on saanut • » · Ϊ '.· 35 vähintään kaksi rokotusta. Jos 200 pg annoksella ei havai- • * • · · • · · • · ' 53 117668 ta toksista vaikutusta ja jos immunologinen reagoivuus GM2-antigeenia ja KLH:ta vastaan ei ole saavuttanut tasan-nevaihetta annosalueella 50 - 200 pg, niin kolmea muuta potilasta voidaan hoitaa 400 pg:n annoksella. Kun turval-5 linen ja mahdollisimman immunogeeninen annos on saatu selville, voidaan tällä annoksella immunisoida vielä kuusi potilasta, millä on tarkoituksena määrätä vasta-ainevas-teen taso paremmin.
GM2-KLH:n ja QS-21:n käyttöä koskeva IND (Investi-10 gational New Drug -asiakirja) on MSKCC:n hallussa.
Hoito
Kolmesta viiteen päivään ennen ensimmäistä immuni- = sointia annetaan syklofosfamidia i.v.-injektiona 200 mg/m2.
Tämän keksinnön tekijät ovat käyttäneet tätä annosta ja 15 aikataulua menestyksellisesti aikaisemmissa rokotekokeis- sa. Tämän jälkeen annetaan neljä rokotusta ihonalaisesti kahden viikon välein, alkaen 2-3 viikkoa sen jälkeen kun kaikki tiedossa oleva syöpäkudos on poistettu kirurgisesti. Kahden kuukauden välein annetaan vielä kaksi rokotus- ¾ 20 ta.
Arviointi iTi Serologinen vaste: Tämän kokeen ensisijainen pääte- j’·.· piste on serologinen vaste. Välittömästi kunkin rokotuksen • · : jälkeen ja kaksi viikkoa ja viisi viikkoa neljännen, vii- ··· · · :v. 25 dennen ja kuudennen rokotuksen jälkeen otetaan näyte peri- 1 • * • .·. feraalisesta verestä (30 ml). Tämän jälkeen verta voidaan • · · “I.* ottaa kolmen kuukauden välein niin kauan kuin GM2:ta vas- • · · ♦ · · * taan suunnattuja vasta-aineita pystytään havaitsemaan.
Kaikista potilaista otetuista seerumeista tutkitaan kaksi • e · 30 viikkoa neljännen, viidennen ja kuudennen rokotuksen jäi- ··· keen ELlSA-määrityksellä GM2:ta ja sitä muistuttavia gang- .*'*· liosideja vastaan suunnatut vasta-aineet. Serologisesta • · · reagoivina potilaina pidetään potilaita, joiden useita • · . erilaisia glykolipidejä vastaan spesifisesti reagoivat ·· · i : 35 vasta-ainetiitterit ELISA-määrityksellä ja immunologisella • · • t t • «Φ * 117668 54 ohutkerroskromatografiällä määritettynä ovat 1/80 tai sitä suurempia ja serologisesti reagoivilta potilailta otetut uudet seeruminäytteet voidaan tutkia rokotuksen aikaansaaman vasta-ainevasteen tarkempaa selvitystä varten. Jos 5 tämän keksinnön tekijät saavat todisteita suuritiitteris-ten GM2:ta vastaan suunnattujen IgG-vasta-aineiden muodostumisesta, niin periferaalisesta verestä voidaan ottaa 2 viikkoa neljännen rokotuksen jälkeen vielä yksi 60 ml:n suuruinen näyte GM2:ta vastaan suunnatun immuunivasteen 10 tutkimiseksi klonaalisella tasolla.
Tähän tarkoitukseen käytetään EBVrllä transformoiduista lymfoblasteista saatuja supernatantteja ja myöhemmin valmistettuja hybridoomasoluja.
Viivästynyt yliherkkyysreaktio: KLH:ta, GM2:ta ja 15 ihmisen seerumin albumiiniin kiinnitettyä GM2:ta vastaan suuntautuneen viivästyneen yliherkkyyden tutkimiseen tarkoitetut ihotestit tehdään viidennen immunisoinnin kohdalla. Positiivisena reaktiona pidetään yli 5 mm:n läpimittaista kovettumaa 48 tunnin kohdalla ja jos reaktio on 20 suuntautunut GM2:ta vastaan, niin sitä tutkitaan edelleen ihotesteillä, joissa käytetään useita erilaisia ganglio-sideja.
:*·.* Sairauden kulku: Potilaiden tila arvioidaan Memo- : .·. rial Hospital -sairaalassa näiden neljännen ja kuudennen • · · · : 25 rokotuksen yhteydessä ja kuudennen rokotuksen yhteydessä * · j tehdään rintakehän röntgentutkimus ja seulontaprofiili.
• · » **!,* Muusta seurannasta ja jälkiseurannasta huolehtivat poti- • « · *·' * laita hoitavat onkologit.
Kriteerit hoidon keskeyttämiselle * · · *.ί.· 30 Tavallisesti paikallishoidolla (kirurgisesti tai • · · ·...· leesion sisäisellä injektiolla) hoidettava taudin paikal- .·**, linen uusiutuminen ei ole esteenä hoidon jatkamiselle, jos * * · -potilas saadaan oireettomaksi. Hoito keskeytetään, jos 1 * * • potilaalle kehittyy uudelleen systeemistä hoitoa tai säde- M Φ : .* 35 hoitoa vaativa tauti.
* · # · · ··· • · · 117668
Tilastollisia näkökohtia Tämä tutkimus on I-vaiheen tutkimus, jonka pääasiallisena tavoitteena on toksisuuden ja rokotuksen jälkeen syntyneen GM2:ta ja KLH:ta vastaan suunnatun igG-vasteen 5 arviointi. Kolme potilasta rokotetaan kullakin QS-21:n neljästä asteittain suurennettavasta annoksesta. Jos IgG-vaste voimistuu annoksen kasvaessa, niin valitaan suurin annos, joka ei saa aikaan voimakkaampaa kuin 1. asteen systeemistä tai 2. asteen paikallista toksisuutta ja ellei 10 toksisuutta havaita, tutkitaan vielä viides annos. Hiirillä tehtyjen tutkimusten perusteella on odotettavissa, että IgG-vaste saavuttaa huippunsa tai tulee tasannevaiheeseen toisen tai kolmannen annoksen jälkeen. Kun turvallinen ja immunogeeninen annosalue on saatu tunnistettua immunisoi-15 daan vielä 3-6 potilasta immunogeenisimmältä vaikuttavalla annoksella sekä sitä seuraavaksi suuremmalla ja pienemmällä annoksella, jotta näillä annoksilla esiintyvä toksisuus- ja immunogeenisyysaste saadaan luotettavasti selville.
20 Riskit GM2-KLH: GM2:sta johtuvaksi katsottavaa toksisuutta :T: ei havaittu yli sadalla potilaalla, joita oli hoidettu ·*·.· 200 pg GM2:ta sisältävillä rokotteilla. 1 mg:n suuruisia t · : .·. KLH-annoksia on käytetty yli 50 potilaan immunisointiin ja *·· ♦ ··.·. 25 heidän immunologisen statuksensa tutkimiseen, eikä toksi- • · I ^ suutta ole ilmennyt (15). 18 potilasta on immunisoitu GM2- *1'.* KLH:ta sisältävillä rokotteilla. Yhdellä potilaalla on • · · ** ollut GM2-KLH-rokotteesta johtuvaksi katsottavaa kipua ja arkuutta 48 tunnin ajan rokotuskohdissa, mikä on luulta-30 vasti viivästynyt yliherkkyysreaktio KLH:ta vastaan. An- • · * :...· nosta ei ollut tarvetta pienentää. GM2-KLH:n ainoa odotet- .*··. tava sivuvaikutus on rokotuskohdissa muutamia päiviä kes- • · • * · tävä tulehdusreaktio. Jos ilmenee yli 38 °C:n kuumetta tai • ♦ . vakava normaaleja päivittäisiä toimintoja rajoittava pai- • * · : .* 35 kallinen toksinen reaktio, niin GM2-KLH:n annosta rokot- • * • * · • · · ♦ · 117668 56 teissä voidaan vastaisuudessa pienentää kolmanteen osaan nykyisestä.
Saponiineja ei ole käytetty ihmisillä. Niiden tiedetään olevan hemolyyttisiä, mutta QS-21-fraktio valit-5 tiin, koska hiirellä, kissalla ja reesusapinalla on havaittu, ettei se ole selvästi toksinen vielä 125 mikro-gramman annoksilla eläintä kohti. Neliömetreissä ilmoitetun ruumiin pinta-alan tai kilogrammoina ilmoitetun ruumiinpainon perusteella laskettuna tämä annos on tuhansia 10 kertoja suurempi kuin tässä keksinnössä esitetty maksimi-annos .
Rokotteen komponentteja tai ihotestiantigeeneja vastaan suunnatut autoimmuuni- tai yliherkkyysreaktiot ovat teoriassa mahdollisia, mutta erittäin epätodennäköi-15 siä.
Toksisuuden kriteerit: Toksisuus luokitellaan Yhdysvaltain kansallisen syöpäinstituutin (National Cancer Institute, NCI) kehittämien yleisten toksisuuskriteereiden mukaisesti. Näitä kriteereitä koskevat asiakirjat ovat 20 IRB:n (Institutional Review Board) hallussa.
Tutkimuksen merkittävyys
Syöpää vastaan suunnattua immuunivastetta voidaan yrittää tehostaa kahden peruslähestymistavan avulla - epä- • · : spesifisellä immunivasteen voimistamisella, jota on käy- »·· · 25 tetty useimmissa tehdyissä ja tekeillä olevissa syövän • · ? j immunoterapiaa koskevissa tutkimuksissa, sekä spesifisellä 4 4 · '**.* immunisoinnilla, jonka toimivuutta ei juurikaan ei ole • 4 · *’ arvioitu syövän hoidon yhteydessä mutta jolla on ollut huomattavan suuri merkitys infektiotautien leviämisen sää- • · 4 30 telyssä. Juuri mikrobiantigeenien tuntemuksen avulla on 4 4 # ollut mahdollista kehittää infektioita vastaan suunnattu 4 .**·. onnistunut spesifinen immunisointi. Toisaalta ihmisen syö- • 44.
päantigeenej ä koskevan tiedon puute on estänyt syöpää vas- * • · . taan suunnatun spesifisen immunisoinnin tutkimisen niillä • 4 4 : *.· 35 keinoilla, joilla sitä tulisi tutkia, eli käyttäen rokot- • 4 • · 4 • · 4 4 4 117668 57 teitä, jotka sisältävät tiettyjä ainoastaan syövälle ominaisia antigeenejä ja osoittamalla näiden rokotteiden im-munogeenisyys syöpäpotilailla. Melanoomasolujen pinta-antigeenien kuvaamisessa viime aikoina tapahtunut edistys 5 mahdollistaa nyt spesifisen immunisoinnin tutkimisen.
Tulokset QS-21:llä tehdyssä I-vaiheen tutkimuksessa antigeeninä käytettiin GM2-KLH:ta. Kaiken tiedossa olevan syöpä-kudoksen kirurgisen poistamisen jälkeen oireettomat levin-10 neisyysasteeltaan AJCC-luokan III ja IV melanoomapotilaat immunisoitiin kolmesta potilaasta koottuina ryhminä käyttäen 500 pg GM2-KLH:ta (GM2:n ja klh:n suhde 200 - 1400:1, GM2-annos 70 pg) + 10, 50, 100 tai 200 pg QS-21:tä. Tähän mennessä kaikille potilaille on tehty täydet kuusi immuni-15 sointia. 10 tai 50 pg:n QS-21-annoksilla ei havaittu toksisuutta. Elimistö on sietänyt myös hyvin 100 pg:n annosta mutta kullekin tällä annoksella hoidetusta kolmesta potilaasta ilmaantui vähintään yhden rokotuksen yhteydessä kuudesta annetusta rokotuksesta palpoitava paukama ja 24 -20 48 tunnin ajan kestävää aristusta ja kahdellä näistä poti laista tämä tapahtui sen jälkeen kun näistä kuudesta immu-nisoinnista oli annettu kaksi. Systeemisiä sivuvaikutuksia : ei havaittu. Niillä kolmella potilaalla, joita hoidettiin • t : 200 pg:n annoksella rokotusta kohti, esiintyi useimpien * * * ' ••V 25 rokotusten jälkeen injektiokohdissa 2-10 päivää kes- • * I tänyttä arkuutta ja kipua sekä 8-24 tuntia kestänyttä ( • · · • * · lievää kuumetta ja flunssatyyppisiä oireita, kuten lievää • t * '·* * päänsärkyä ja epämääräisiä kipuja ja särkyjä. Näiden 12 potilaan serologiset vasteet GM2:ta ja KLH:ta vastaan 30 on esitetty yhteenvetona taulukon 2 alaosassa. Vaikka * * · :,,,ί 200 pg:n annoksen yhteydessä havaittu toksisuus ei ollut » .*··, tosiasiassa suurin elimistön sietämä annos, niin se oli • · kuitenkin merkittävästi toksinen, eikä saatu todisteita • * . siitä, että tällä annoksella olisi ollut parempi adjuvant- · · : ’.· 35 tivaikutus kuin 100 pg:n suuruisella annoksella. Näiden • · • · · » M • · > 117668 58 toksisuus- ja immunogeenisyystulosten varmistamiseksi on tällä hetkellä immunisoitu vielä 9 potilasta, joista kolmelle on annettu 50 pg:n, kolmelle 100 pg:n tai kolmelle 200 pg:n annokset. Kuviossa 6 on esitetty niiden kuuden 5 potilaan IgM- ja IgG-tiitterit, joille oli annettu GM2-KLH:ta ja 100 pg tai 200 pg QS-21:tä. Vaikuttaa siltä, että GM2-KLH ·1- QS-21 (100 pg) on erittäin immunogeeninen rokote, joka on huomattavan paljon parempi kuin GM2/BCG tai GM2-KLH ynnä Detox tai BCG, kun sekä IgM- että igG-10 vasta-aineiden tiitterien suuruus ja vaikutuksen kesto otetaan huomioon.
Kun GM2-KLH ja GD3-KLH + QS-21 -rokotteiden oli osoitettu olevan merkittävästi aikaisempia ganglio-sidi/BCG-rokotteita immunogeenisempiä, niin GD2:n, GD3:n 15 ja GD3-laktonin immunogeenisyyttä kliinisessä käytössä näissä uusissa konjugaattirokotteissa tullaan tutkimaan. Perustana näiden gangliosidien valitsemiselle immunogee-neiksi melanoomassa on 20 melanoomakoepalasta tehtävä kvantitatiivisen analyysi immuuniohutkerroskromatografiaa 20 käyttäen näiden gangliosidien pitoisuuksien kvantitoimi-seksi melanoomissa ja monissa erilaisissa normaaleissa *'·1: kudoksissa.
:1·,· 6-12 melanoomapotHaalle annetaan rokotteina jo- * 1 : .1. kaista näistä gangliosidikonjugaateista, jotka on valmis- ··· · ··.·. 25 tettu ja kiinnitetty kovalenttisesti KLH:hon. Tämän jäi- • ·
Ikeen näissä pilottitutkimuksissa immunogeenisiksi osoite-• · · ; tut konjugaatit kootaan yhteen ja tutkitaan toisella • i » * 12 potilaan ryhmällä ennen laajamittaista monen keskuksen välistä tutkimusta, jonka tavoitteena on määrittää yhden- • « · *.ί.1 30 mukaisesti immunogeeni s ten polyvalenttisten melanoomagang- • · · liosidirokotteiden vaikutus taudin uusiutumiseen ja poti- .···. laiden eloonjäämiseen.
• · ·1· »···· • · ♦ · · • · • · · • · · • i 1 • · 117668 59
Taulukko 2 GM2-gangliosidia vastaan suunnattujen vasta-aineiden huipputiitteri GM2-KLH:lla plus useilla erilaisilla immunologisilla apuaineilla tehdyn immunisaation jälkeen 5 Vasta-aineiden Täpläblotti tiitterit ELISAilla immunovdrjäys
Potilaiden
Rokote lukumäärä IgM IgG_ IgM IgG
GM2/BCG 6 640(2), 160(3), 40, 0(5) 3+(4), 2+, 0 1+(3), 0 0(3) GM2-KLH 6 160(2), 80(2), 0(6) 3+(2). 2+(2), 1+(2).
40, 0 0(2) 0(4) 10 GM2-KLH 6 320, 160(4), 0 160. 0(5) 3+ (2), 2+(3), 2+. 0(5) +Detox 1+ GM2-KLH 6 1280, 320(2), 320, 20(2), 3+, 2+(3), 1+(2), 5 +BCG 80(2). 0 0(3) 0(2) 0(4) ' GM2-KLH 6 5120(2). 1280(2), 640, 3+(5), 2+ 3+(5), 2+ 15 +QS-21 1280(3), 320 320, 160, 80 10 pg 3 1280, 640, 40 160, 80, 0 3+(2). 2+ 3+(2), 2+ 50 ug 3 640, 320, 160 80(2), 40 3+. 2+(2) 3+. 2+(2) 100 pg 3 5120. 1280 (2) 1280, 640, 160 3+(3) 3+(3) 200 ug 3 5120, 1280, 320 1280. 320, 80 3+(3) 3+(2), 2+ 20
Kolmas koesarja
Malignissa melanoomassa ilmentyy usein normaalia .···. suurempi määrä solun pinnan gangliosideja GM2, GD2 ja GD3.
• · · ! . Tämän keksinnön tekijät ovat aikaisemmin osoittaneet, että • · · ' • ·· 25 melanoomapotilaiden immunisointi GM2:lla ja BCGillä sai • · ♦ |**φ· useimmissa potilaissa aikaan IgM-vasta-ainevasteen ja että • · · • ·1 niiden potilaiden, joilla esiintyi suuritiitterisiä GM2- • · * · ί.ί ϊ vasta-aineita, eloonjääminen oli parempaa. Hiilihydraatti- «·· V : antigeeneille (jotka ovat T-soluista riippumattomia) tyy- 30 pillisellä tavalla IgM-vaste oli lyhytkestoinen ja IgG- : vastetta havaittiin vain harvoin. Immunogeenisyyden lisää- ·"1· miseksi tämän keksinnön tekijät konjugoivat GM2:n kova- ·*· „1. lenttisesti reikäkotilon hemosyaniiniin (KLH). Melanooma- • · y'! *·*·] potilaille annettiin GM2-KLH-rokotetta, johon oli yhdis- 35 tetty kerrallaan yhtä kolmesta adjuvantista, jotka olivat :***· BGC, Detox tai QS-21. Tehokkain rokote oli GM2-KLH QS- • · \j 21:een yhdistettynä. Se sai aikaan suhteellisen suuren ♦ · : 60 117668 tiitterin ja pitkäkestoisen IgM-GM2-vasta-ainevasteen sekä yhdenmukaisesti syntyneen IgG-vasteen (isotyypit IgGl ja IgG3). Sen sai myös aikaan suuritiitterisimmän KLH:ta vastaan suunnatun vasteen. Nämä tulokset viittaavat siihen, 5 että GM2-KLH-konjugaattia ja QS-21:tä sisältänyt rokote sai T-solut toimimaan merkittävässä määrin apuna vasteen syntymisessä. Koska vakavaa toksisuutta ei havaittu, niin tämän rokotteen yhteydessä käytetty lähestymistapa on kiinnostava vaihtoehto toisten gangliosidien, kuten GD2:n 10 ja GD3:n immunogeenisyyden lisäämiseksi ja melanooman etenemistä koskevien gangliosidivasta-aineiden vaikutusten määrittämiseksi. Lisäksi se havainto, että QS-21 lisää f: merkittävästi GM2-KLH-konjugaattien immunogeenisyyttä, viittaa siihen, että se voi vaikuttaa samalla tavalla mui-15 hinkin konjugaattirokotteisiin, joista monia käytetään nykyisin ilman adjuvanttia.
Johdanto
Yksi maligniin transformaatioon liittyvistä muutoksista on tietyissä syöpätyypeissä, kuten malignissa mela-20 noomassa, havaittava muutos solun pinnan gangliosidien f ilmentymisessä (1). Normaaleissa melanosyyteissä vallitse-:T: vana gangliosidina on GM3. Muita gangliosideja, kuten ;\i GD3:a, GM2:ta, GDlarta ja GDlb:tä, on alle 10 % kokonais- • · ϊ määrästä (2). Malignissa melanoomassa glykosyloivien ent- 25 syymien aktivoituminen lisää GD3:n, GD2:n, GM2:n ja 9-0- • · -sf j ^ asetyyli-GD3:n ilmentymistä (3,4). Nämä normaalia runsaam- ♦ * ♦ **!.* min ilmentyvät gangliosidit ovat hyviä kohteita immunote- • i # *’ rapialle, kuten gangliosidirokotteilla tehtävälle aktiiviselle immunisoinnille. Tutkimussarjassa, joka koski GM2- ;« • ·#· *.ί.· 30 rokotteita malignia melanoomaa sairastavilla potilailla, • · ·...· ovat tämän keksinnön tekijät osoittaneet, että rokotus (pienenä annoksena annetun syklofosfamidin jälkeen käyt- ··· · täen adjuvanttina BCG:tä) saa useimmissa potilaissa aikaan • · • GM2:ta vastaan suunnattujen IgM-vasta-aineiden muodostumi- • · · 5 .* 35 sen (5) ja että oireeton jakso pitenee ja eloonjääminen ♦ · • · t • ·· · · • ♦ : 117668 61
parantuu potilailla, joilla muodostuu suuritiitterisiä GM2-vasta-aineita (6,7). GM2:ta vastaan muodostunut vasta-ainevaste muistuttaa kuitenkin tyypillistä T-soluista riippumatonta vastetta (vasta-aineet pääasiassa IgM-tyyp-5 piset, IgG-vaste lyhytkestoinen ja epäyhdenmukainen, te-hostusvaikutuksen puute), eivätkä muut melanoomaganglio-sidit, GD3 ja GD2, ole immunogeenisiä samalla tavalla annettuna (8). Koska kyseessä olevat epitoopit ovat hiilihydraatteja, niin tämän keksinnön tekijät ovat tutkineet 10 sellaisia lähestymistapoja immunogeenisyyden lisäämiseksi, joita on käytetty suotuisin tukoksin bakteeri-infektioita vastaan suunnattujen hiilihydraattirokotteiden kehittämisessä. Tämän keksinnön tekijät ovat osoittaneet hiirillä, että GD3:n immunogeenisyys lisääntyy huomattavasti kun se 15 kytketään kovalenttisesti reikäkotilon hemosyaniiniin ja että GD3-KLH-konjugaatilla ja adjuvanttina käytetyllä QS-21:llä immunisoiduissa hiirissä esiintyy suuritiitterinen igM-vaste, jota seuraa voimakas pitkäkestoinen IgG-vaste (9). Tämän keksinnön tekijät ovat ryhtyneet tässä keksin-20 nössä tutkimaan gangliosidi-konjugaattirokotteita kliini- V
sessä käytössä ja tässä keksinnössä keksijät ovat rapor- ;*·*· toineet alustavat tulokset malignia melanoomaa sairasta- » .'.tj vien potilaiden immunisoinnista GM2-KLH-konjugaattirokot- • · : .*. teella.
* · · • « * · ··,·. 25 Materiaalit ja menetelmät I ! Potilaat • ·
Levinneisyysasteeltaan luokan III malignia melanoo- • t · *·* maa sairastavien potilaiden katsottiin kelpaavan tutkimuk seen, jos taudin kaikki etäpesäkkeet oli saatu poistettua \:.J 30 viimeisen neljän kuukauden aikana. Yksikään potilaista ei • · ® *tmm· ollut saanut aikaisemmin kemoterapiaa eikä sädehoitoa.
,···. Rokotteen valmistus ja antaminen • · GM2-KLH-rokote: GM2-KLH-konjugaatin oli valmistanut • · . Biomira Inc. -yhtiö (Edmonton, Alberta), kuten aikaisemmin ·· · : V 35 GD2-KLH konjugaattirokotteen yhteydessä on kuvattu (9).
• · • · · • ·· • · · : 62 ^ 1 1 7668 ;
Yksityiskohtiin puuttumatta konjugaatiomenetelmässä GM2:n keramidikaksoissidos pilkottiin otsonilla, siihen lisättiin aldehydiryhmä ja GM2 konjugoitiin KLH:n aminolysyyli-ryhmiin pelkistävällä aminoinnilla. GM2:n ja KLH:n välinen 5 moolisuhde oli noin 800:1, ja rokote toimitettiin muodossa, jossa konjugaatin konsentraatio oli 0,57 mg 0,5 ml:ssa tavallista fysiologista suolaliuosta. Tämä määrä vastaa yhtä potilaalle annettavaa annosta ja se sisältää 70 pg GM2:ta ja 500 pg KLH:ta. Kullekin kuudesta potilaasta koo-10 tulle ryhmälle annettiin GM2-KLH-konjugaattia ilman adju-vanttia, GM2-KLH:ta Detoxiin yhdistettynä, GM2-KLH:ta BCG:hen yhdistettynä kanssa ja GM2-KLH:ta QS-21:een yhdistettynä.
Rokotetta rokotettiin neljä kertaa kahden viikon 15 välein intradermaalisesti lymfakierroltaan normaaleihin raajoihin, minkä jälkeen käytettiin vielä kahta rokotus-kertaa kahdeksan viikon välein. Kaikille potilaille annettiin 4-6 päivää ennen ensimmäistä rokotusta suonensisäisesti 200 mg/m2 syklofosfamidia (Cytoxan, Mead Johnson and 20 Co., Evansville, IN).
Immunologiset adjuvantit: Detox hankittiin sitä valmistavasta ja toimittavasta yhtiöstä Ribi Immunochem ;*.fi Research Inc. (Hamilton, MT) lyofilisoiduksi öljypisara- * · : emulsioksi formuloituna. Detox sisältää Calmette-Guorin • * · ;·,·] 25 -basillin soluseinämärakenteita (CWS, cell wall skeletons) ! • « I I ja Salmonella minnesota R595:stä peräisin olevaa monofos- foryylilipidi-A: ta (MPLA). Rokotuspäivänä GM2-KLH-valmis- • I * **’ teeseen yhdistettiin 0,25 ml Detoxia (250 pg CWS:ää ja 25 pg MPLA:ta). Rokotetta (jonka lopputilavuus oli 30 0,75 ml) sekoitettiin pyörresekoittimessa 2-3 minuutin »·« ajan ja sitä annettiin potilaille 15 minuutin kuluessa.
.···. BCG oli hankittu Bionetics Research Inc. -yhtiöstä • · (Rockville, md). Rokotuspäivänä kussakin erillisessä ruis- • * . kussa olevaan GM2-KLH-rokotteeseen lisättiin 107 elinky- ·* · ϊ ’.· 35 kyistä yksikköä BCG:tä 0,1 ml:ssa tavanomaista fysiologis- • · • · · 117668 63 ta suolaliuosta (lopputilavuus 0,6 ml). Ruiskun sisältöä sekoitettiin ja sitä annettiin potilaille 15 minuutin kuluessa. QS-21-adjuvantti (Quillaja saponaria Molina -puun kaarnasta puhdistettu homogeeninen saponiini) (10, 11) oli 5 Cambridge Biotech Inc. -yhtiön ystävällisesti toimittamaa materiaalia (Worcester, MA). 100 pg tai 200 pg QS-21:tä laimennettiin 0,25 ml:aan tavallista fysiologista suolaliuosta ja se yhdistettiin GM2-KLH-rokotteeseen. Rokotetta (jonka lopputilavuus oli 0,75 ml) sekoitettiin pyörrese-10 koittimella 2-3 minuutin ajan ja sitä annettiin 15 minuutin kuluessa.
Gangliosidit
Naudan aivoista peräisin olevat GM2 ja GDlb saatiin lahjoituksena Fidia Research Laboratorystä (Abano Terme, 15 Italia). Naudan aivoista peräisin olevat GM3, GMl ja GDla hankittiin Sigma Chemical Co. -yhtiöstä (St. Louis, MO). Asialo-GM2 valmistettiin käsittelemällä GM2:ta 0,1 M tri-fluorietikkahapolla 100 eC:ssa 1 tunnin ajan, jonka jälkeen seos erotettiin komponentteihinsa Sep-Pak C18 -kään-20 teisfaasikolonnissa (Waters, Milford, MA). GD2 valmistettiin GDlb:stä β-galaktosidaasikäsittelyllä (12). Lypsyleh-ϊ[ϊ*ϊ mien maidosta valmistetusta kirnupiimästä eristetty GD3 ·*·,· oli Dr. R.k. Yun (Medical College of Virginia, Richmond, • · ! .*. VA) ystävällisesti toimittamaa materiaalia.
··· · 25 Reagenssit ja monoklonaaliset vasta-aineet • Suuren erotuskyvyn ohutkerroskromatograf iässä • · · *V..‘ (HPTLC) käytetyt silikageelilevyt hankittiin E. Merck -yh- • » · * tiöstä (Darmstadt, Saksa). 4-kloori-l-naftoli ja p-nitro-fenyylifosfaattidinatrium hankittiin Sigmasta. ELISA-mää-
• · I
*.?.* 30 rityksissä käytettiin ensin alkaliseen fosfataasiin konju- *,„· goitua vuohessa tehtyä anti-humaani-IgMjää (Kirkegaard and .*·*. Perry Labs, Gaithersburg, MD) ja puhdistettua hiiressä ··* tehtyä anti-humaani-lgG:tä (Southern Biotech, Birmingham, • · AL) ja sitten alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohessa • .* 35 tehtyä anti-muriini-IgG:tä (Southern Biotech). Täpläblot- • ·
• · I
• ·* • · 117668 64 ti-immunovärjäyksessä ja immuno-ohutkerroskromatografiässä (ITLC) käytettiin TAGO-yhtiöstä (Burlingame, CA) hankittuja piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua vuohessa tehtyä anti-humaani-IgM:ää tai IgG:tä. ITLC:ssä käytettyä pipar-5 juuriperoksidaasiin konjugoitua kaniinissa tehtyä anti-muriini-immunoglobuliinia ja ELISA-määrityksessä käytettyä alkaliseen fosfataasiin konjugoitua kaniinissa tehtyä an-ti-muriini-IgM:ää ja -IgG:tä käytettiin yhdessä kontrollina käytettyjen hiiressä tehtyjen monoklonaalisten vasta-10 aineiden kanssa ja ne oli hankittu Zymed-yhtiöstä (San Francisco, CA). GM2:ta vastaan suunnattu mAb 696 hankittiin Kyowa Hakko Kogyo -yhtiöstä (Tokio, Japani) ja GD3:a vastaan suunnattu mAb R24 valmistettiin (13).
Serologiset määritykset 15 ELISA tehtiin aikaisemmin kuvatulla tavalla (6).
Epäspesifisen "tarttuvuuden" huomioon ottamiseksi immuuni-seerumit tutkittiin myös levyillä, jotka oli käsitelty samalla tavalla, mutta joihin ei oltu lisätty gangliosi-dia, ja saatu lukema vähennettiin gangliosidia käyttäen 20 saadusta lukemasta. Tiitteri määriteltiin suurimmaksi laimennokseksi, jolla korjatun absorbanssin arvoksi saatiin :Τϊ 0,1 tai tätä suurempi arvo. Gangliosidit värjättiin immu- ·*·,· nologisesti monoklonaalisilla vasta-aineilla tai hiiren i · j .·. seerumeilla sen jälkeen, kun ne oli pipetoitu täplinä nit- • · * · 25 roselluloosaliuskoille (14) tai kun ne oli erotettu kompo- • · • nentteihinsa lasista valmistetuilla HPTLC-silikageelile- * · · *.*1.' vyillä aikaisemmin kuvatulla tavalla (3). Levyt kehitet- * i i * tiin kloroformista, metanolista ja vedestä (0,25 % CaCl2:a) tilavuussuhteissa 50:40:10 valmistetussa seoksessa ja • · « *·ί·* 30 gangliosidit visualisoitiin värjäämällä ne resorsino- * * · li/HCl-reagenssilla tai monoklonaalisilla vasta-aineilla.
··♦ • f • · * · * ·· » • · · • * • · * · ··· • »t • · 117668
IgG-alaluokan määritys
IgG-alaluokan määritys tehtiin ELISA:11a alaluok-kaspesifisiä sekundaarisia hiiressä tehtyjä humaani-IgGl:tä, IgG2:ta, IgG3:a ja IgG4:ää vastaan suunnattuja 5 mAb-molekyylejä käyttäen. Käytettiin eri valmistajilta peräisin olevia sekundaarisia mAb-molekyylejä (taulukko 4). Kolmantena vasta-aineena käytettiin suhteessa 1:200 laimennettua alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohessa tehtyä anti-muriini-IgG:tä (Southern Biotech, Birmingham, 10 AL).
Komplementtivälitteiset sytotoksisuusmääritykset
Komplementtivälitteiset sytotoksisuusmääritykset tehtiin 4 tunnin 51Cr-vapautumismäärityksellä. Kohdesolui-na käytettiin GM2-positiivisesta melanoomasolulinjasta SK-15 MEL-173 peräsin olevia soluja. 2 x 106 solua varustettiin 100 pCi:n Na251Cr04-leimalla (New England Nuclear, Boston, MA) ja reaktio suoritettiin C02-inkubaattorissa 10 % FCS:ää sisältävässä RPMI:ssä 1 tunnin ajan 37 DC:ssa. Solut pestiin kaksi kertaa ja solut, joita pidettiin pyöreäpohjai-20 sissa 96-kuoppaisissa levyissä ja joiden määrä oli 104 solua kuoppaa kohti, varustettiin leimalla ja soluja inku- :*:*· boitiin C02-inkubaattorissa ennen rokotusta tai sen jälkeen * .*. ί otetun suhteessa 1:5 laimennetun seerumin kanssa tai pel- · Ϊ .*. kästään kasvatusliuoksen kanssa 1 tunnin ajan 37 °C:ssa.
• Φ · ··.·. 25 Solut pestiin ja niitä inkuboitiin suhteessa 1:4 laimenne- * · | I tun humaanikomplementin (Sigma) kanssa 4 tunnin ajan • · « *".* 37 °C:ssa. Levyt sentrifugoitiin 500 g:n voimalla 5 minuu- • · ♦ * tin ajan ja kustakin kuopasta otettiin 125 μ1:η superna-tanttinäyte vapautuneen 51Cr:n määrittämiseksi. Kaikki mää- * ·*· 30 ritykset tehtiin kolmena rinnakkaisena määrityksenä ja niissä oli käytetty myös kontrollikuoppia l-%:isessa NP- .···. 40:ssä (Sigma) tapahtuvan maksimaalisen vapautumisen mää- • · rittämiseksi ja ilman komplementtia tapahtuvan spontaanin • · . vapautumisen määrittämiseksi.
·*· * * « • f • · • · • · · • · 117668 66
Spesifinen hajoamisprosentti laskettiin seuraa vai la tavalla:
Sytotoksisuus_% _ kokeellinen vapautuminen - spontaani vapautuminen χ 10Q
maksimaalinen vapautuminen - spontaani vapautuminen 5 Tulokset
Rokotteen antaminen ja sivuvaikutukset GM2-KLH-rokotteella inununisoitiin 24 potilasta.
Kullekin kuudesta potilaasta kootuille ryhmille annettiin GM2-KLH:ta ilman immunologista adjuvanttia tai yhdistetty-10 nä Detoxiin, BCG:hen tai QS-21:een. Pelkkää GM2-KLH:ta annettaessa ei havaittu paikallista eikä systeemistä toksisuutta. Detoxia sisältävät rokotteet aiheuttivat neljälle kuudesta potilaasta rokotuskohtiin kyhmyjen muodostumista, joka kesti 2-10 viikkoa. Neljällä potilaalla tä-15 hän liittyi 3-10 cm:n läpimittaista punoitusta sekä kovettuma, mutta vain vähän aristusta. Yhden immunisoinnin jälkeen yhdellä potilaalla tähän liittyi 25 cm:n läpimit- i täinen punoitus ja kovettuma ja toisella potilaalla lievää kuumetta ja huonovointisuutta 72 tuntia ensimmäisen immu- • · · #*4 . 20 nisoinnin jälkeen. Detox-annos pienennettiin tällä poti- • · · .* .* laalla myöhemmissä immunisoinneissa 50 pg:aan CWS:ää ja * · · 5 pg:aan MPLA:ta. BCG aiheutti kaikille potilaille jossa- • * · ' j ·’ kin vaiheessa paikallisen tulehduksen ja ruven muodostu- • · · ϊ.ί · misen, mutta nämä paranivat 2-12 viikossa. Tämän havain- * · · * 25 non jälkeen BCG:n annos pienennettiin 1 χ 107 elinkykyises tä yksiköstä lopulliseen annokseen, joka oli neljällä po-tilaalla 3 χ 106 ja yhdellä potilaalla 1 χ 106 elinkykyistä yksikköä. Kuudennella potilaalla oli aikaisemmin ollut • · · tuberkuloosi ja hänellä oli positiivinen PPD-testitulos.
* · '·**] 30 Tästä syystä hänelle annettiin aluksi 1 χ 106 yksikköä, joka lopulta vähennettiin 1 χ 105 yksikköön. 100 pg:n an-noksella QS-21 aiheutti kaikille potilaille lievää paikal- * * * · • · · • · · • · 67 117668 lista punoitusta ja arkuutta, joka kesti 24 - 48 tuntia. 200 pg:n QS-21-annokseen liittyi kaikkien immunisointien jälkeen paikallista aristusta ja tulehdusta, joka kesti 2-10 päivää, sekä kolmessa immunisoinnissa kaikkiaan 5 18:sta suoritetusta immunisoinnista esiintyi 8-24 tuntia kestäneitä lieviä flunssaa muistuttavia oireita, kuten lievää kuumetta (< 38,5 eC), päänsärkyä ja lihassärkyä. Minkäänlaisia neurologisia poikkeavuuksia tai muita sivuvaikutuksia ei havaittu.
10 GM2-KLH-konjugaattirokotteita vastaan suunnattu vasta-ainevaste
Ennen rokotusta ei havaittu GM2:ta vastaan suunnattuja IgG-vasta-aineita ja IgM-vasta-aineita havaittiin vain kolmessa potilaassa, joista kahdella tiitteri oli 15 1:80 ja yhdellä 1:320. Muilla 21 potilaalla ei ennen roko tusta havaittu reagoivuutta GM2:ta vastaan. Ennen immunisointia ja sen jälkeen otettuja seerumeja käyttäen tehtyjen ELISA-määritysten ja täpläblotti-immunovärjäysten tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 3. GM2-20 KLH:11a tai GM2-KLH:11a sekä BCG:llä tai GM2-KLH:11a sekä Detoxilla tehtyjen immunisointien jälkeen IgM-vasta-aine-jJ*: tiitterit olivat melko samanlaisia (tiitterien mediaani ·*·.· 1:80 - 1:160). Sitä vastoin kuudesta GM2-KLH: 11a ja • * j QS21:llä immunisoidusta potilaasta oli viidellä igM-vasta- ··* · 25 ainetiitteri 1:1280 tai sitä suurempi, mikä on merkittä- • * • västi suurempi tiitteri kuin muissa ryhmissä tai potilail- • * · la, jotka oli aikaisemmin immunisoitu konjugoimattomilla • * · * GM2- ja BCG-rokotteilla (6). Lisäksi GM2-KLH:lla ja QS-21:llä tehty immunisointi indusoi ensimmäisellä kerralla *·:. 30 yhtä suuren IgG-vasteen kaikissa potilaissa; GM2-KLH-ro- • · · *...· kotteita saaneista muista 18 potilaasta vain kahdessa muo- * .**·. dostui vastaavan suuruisia IgG-tiittereitä.
• * * .
Kuviossa 6 on esitetty GM2-KLH:ta ja QS-21:tä saa- * · t·' neiden potilaiden GM2:ta vastaan suunnattujen IgM- ja igG- : .* 35 vasta-aineiden tiitterit peräkkäisillä rokotuskerroilla.
• · • · · ···' ♦ · 117668 68
Suurimmat IgM-tiitterit havaittiin kolmannen tai neljännen rokotuksen jälkeen ja tiitterit pysyivät korkeina useimmissa potilaissa vähintään 20 viikon ajan. 14. ja 22. viikolla annetut tehosteimmunisoinnit eivät enää kohottaneet 5 IgM-tiittereitä. Viidellä kuudesta potilaasta havaittiin kaksi viikkoa neljännen rokotuksen jälkeen IgG-tiitteri, jonka arvo oli 1:160 tai sitä suurempi. Tiitterit pienenivät arvoon 1:40 tai sitä pienemmäksi, mutta ne kasvoivat jälleen tehosterokotuksen jälkeen edellisille tasoille 10 (mediaani 1:160) ja pysyivät tällä tasolla yli 11 viikon ajan. Toisella tehosterokotuksella ei useimmissa tapauksissa ollut selvää vaikutusta vasta-ainetiittereihin. Tehosterokotuksesta saadulla vasteella oli siis ainoastaan toinen klassisen sekundäärisen immuunivasteen kahdesta 15 luonteenomaisesta piirteestä. Vaste ilmaantui tavanomaista nopeammin mutta vasta-ainetiitterit eivät nousseet ensimmäisten immunisointien jälkeen saatuja tiittereitä suuremmiksi.
Käsittelyä ennen otetuissa seerumeissa ei havaittu 20 KLH-vasta-aineita. Taulukon 3 mukaisesti kaikkien potilaiden seerumeissa havaittiin rokotuksen jälkeen reagoivuutta KLH:ta vastaan. Suurimmat IgG-vasta-ainetiitterit havait-tiin sen jälkeen, kun rokotetta oli annettu yhdessä QS- • « ί .*. 21 :n kanssa, ja tiitterit olivat merkittävästi korkeammat • * * ^ • · · 25 kuin yhdessäkään muussa ryhmässä, mukaan luettuna seuraa- * * • vaksi paras potilasryhmä, joka oli rokotettu käyttäen GM2- “!.* KLH:ta ja BCG:tä (p < 0,005). QS-21-ryhmässä ei havaittu • * · * korrelaatiota GM2-vasteen ja KLH-vasteen voimakkuuksien välillä.
• * · *·ϊ·* 30 GM2-vasta-aineiden spesifisyysanalyysi M· ! *...* Potilaiden seerumeissa ennen immunisointia ja sen « ·***. jälkeen havaittujen gangliosidivasta-aineiden spesifisyys • « « määritettiin täpläblotti-immunovärjäyksellä, jossa käytet- » · • tiin gangliosidistandardeja GM3, Asialo-GM2, GM2, GM1, ί .* 35 GD2, GD3, GDla ja GDlb (kuvio 7). Useimmista potilaista » · • · • · · • · 117668 69 saadut immunisointia edeltävältä ajalta olevat igM- ja IgG-vasta-aineet reagoivat heikosti asialo-GM2:n kanssa ja muutamilla potilailla oli myös GMl:tä ja GDlb:tä vastaan suunnattuja IgM-vasta-aineita. Näitä gangliosideja vastaan 5 suunnattu reagoivuus ei muuttunut immunisoinnin vaikutuksesta. Ainoat rokotteen aikaansaamat muutokset olivat voimakas reagoivuus GM2:ta vastaan ja heikko reagoivuus GD2:ta vastaan. Täpläblotti-immunovärjäykset luokiteltiin asteikolla 0, 1+, 2+ tai 3+. 3+:ksi luokiteltavaa reagoi-10 vuutta GM2:ta vastaan suunnatuilla IgM-vasta-aineilla havaittiin viiden potilaan seerumeissa niistä kuudesta potilaasta, jotka oli immunisoitu GM2-KLH:ta ja QS-21:tä käyttäen, yhden potilaan seerumissa niistä kuudesta potilaasta, jotka oli käsitelty GM2-KLH:lla sekä BCG:llä, ja kah-15 den potilaan seerumeissa niistä kuudesta potilaasta, joita oli käsitelty GM2-KLH:lla ilman adjuvanttia tai GM2:lla ΐ sekä Detoxilla. 3+:ksi luokiteltavaa igG-vasta-aineiden reagoivuutta havaittiin viidessä niistä kuudesta potilaasta, jotka oli immunisoitu GM2-KLH:11a sekä QS-21:llä eikä 20 yhdessäkään muissa käsittelyryhmissä olleessa potilaassa. .
Rokotuksen jälkeen otetuista seerumeista, jotka : olivat peräisin GM2-KLH:lla sekä QS-21:llä immunisoiduista :*·.· potilaista, tutkittiin myös immuno-ohutkerroskromatogra- • · t .*. fiaa (kuvio 8a) käyttäen reagoivuus GM2:n ja muiden mela- ·*· * 25 noomakudosuutteesta peräisin olevien gangliosidien kanssa.
• · • .·. Useimpien potilaiden seerumeista havaittiin voimakasta • · ·
IgG- ja IgM-reagoivuutta naudan aivoista tai melanoomasta • » · * eristetyn GM2:n kanssa. Reagoivuutta havaittiin myös sei- j laisen melanoomauutteesta peräisin olevan hitaasti kulke- • # · *·!·* 30 van vyöhykkeen kanssa, joka on oletettavasti GD2, kun tä- * · · *...* män vyöhykkeen Rf-arvoa verrataan puhdistetun GD2 standar- 2***2 din vastaavaan arvoon (tuloksia ei ole esitetty).
·*#
Sen varmistamiseksi, että IgG-vasta-aineet risti- • · #φ·# reagoivat GD2:n kanssa, inkuboitiin potilaasta nro 2 pe- a··-'· • ·* 35 räisin olevaa rokotuksen jälkeen otettua seerumia ensin • · • · · « * 117668 70 joko GM2:n tai GD2:n kanssa ennen immuunivärjäyksen suorittamista (kuvio 8b). Esi-inkubointi GM2:n kanssa inhiboi täydellisesti reagoivuuden GM2:ta vastaan sekä melanooma-gangliosidiuutteessa olevaa GD2:ta vastaan. Toisaalta kun 5 samaa seerumia inkuboitiin ensin GD2:n kanssa, niin ainoastaan GD2:ta vastaan suunnattu reagoivuus inhiboitu!, eikä GM2:ta vastaan suunnattu reagoivuus muuttunut lainkaan. Nämä tulokset viittaavat kahden sellaisen vasta-ai-nepopulaation olemassaoloon, joista toinen reagoi pelkäs-10 tään GM2:n kanssa ja toinen sekä GM2:n että GD2:n kanssa. igG-vasta-aineiden alaluokkien määritys
Kuudesta GM2-KLH:11a sekä QS-21:llä immunisoidusta | potilaasta peräisin olevat seerumit, joiden igG-tiitteri 4 oli suuri, tutkittiin ELiSA-määrityksellä käyttäen IgG-15 alaluokkaspesifisistä sekundäärisistä vasta-aineista koostuvaa paneelia. Tulokset on esitetty yhteenvetona taulo-kossa 4. Kaikissa kuudessa seerumissa olevat IgG-vasta-aineet kuuluvat alaluokkiin igGl ja lgG3.
Komplementtivälitteinen sytotoksisuus 20 GM2-KLH:lla sekä QS-21:llä (laimennettu suhteessa I
1:5) rokotettujen potilaiden seerumeissa olevien anti-GM2-:V: vasta-aineiden toiminta efektorina tutkittiin komplement- :1·.· tivälitteisillä sytotoksisuusmäärityksillä. Taulukon 5 • · : mukaisesti kaikista kuudesta potilaasta peräisin olevat ·»· « 25 rokotuksen jälkeen otetut seerumit hajottivat GM2-positii- • · Λ | visia SK-MEL-173-melanoomasoluja humaanikomplementin läsnä * 1 1 ollessa. Ennen rokotusta otetuilla seerumeilla ei ? * 1 1 *’ esiintynyt sytotoksisuutta komplementtia lisättäessä eivätkä rokotuksen jälkeen otetut seerumit olleet sytotoksi- 1 • tl 30 siä GM2-negatiivisia melanoomasoluja käytettäessä eivätkä • « · silloin, kun komplementti jätettiin lisäämättä. Nämä ovat .2·. selvästikin ainoastaan alustavia tuloksia ja meneillään • · • t · onkin parhaillaan yksityiskohtaisempi tutkimus rokotteen i indusoimien vasta-aineiden ja niiden alaluokkien sitoutu-
M I V
• · · ····._· • · • · · ···'·'.·· 2 • · 117668 1 ; : 71 ' misesta solun pintaan sekä niiden sytotoksisista efektori-toiminnoista.
Pohdinta
Malignia melanoomaa sairastavilla potilailla teh-5 dyssä tutkimussarjassa tavoitteena on ollut sellaisten rokotteiden konstruointi, jotka indusoivat tehokkaasti ; vasta-aineiden muodostumista kolmea melanoomassa usein normaalia runsaammin ilmentyvää gangliosidia, GM2:ta, GD2:ta ja GD3:a vastaan. Ensimmäisessä tutkimusasetelmassa 10 potilaat rokotettiin BCG-rokotteeseen adsorboiduilla kon-jugoimattomilla gangliosideilla. Tällä tavoin pystyttiin saamaan aikaan GM2:ta vastaan suunnattu vasta-aineen muodostuminen (5, 6), mutta ei GD2:ta GD3:a vastaan. GM2-BCG-rokotteiden indusoimat GM2-vasta-aineet kuuluivat pää-15 asiassa igM-luokkaan, vasta-ainevaste oli lyhytkestoinen ja tehosterokotuksilla saatiin jälleen aikaan lyhytkestoinen IgM-vasta-ainetuotanto, joka muistutti primäärivastet-ta, jotka kaikki ovat T-soluista riippumattomalle immuunivasteelle tyypillisiä piirteitä, jotka tunnetaan muilla 20 hiilihydraattiantigeeneilla tehdyistä tutkimuksista. Silti leikkauksen jälkeen rokotteella indusoituun GM2-vasta-ai-neiden tuotantoon vaiheen III melanoomaa sairastavissa ·'·,· potilaissa liittyi eloonjäämisen lisääntyminen (6, 7).
• · : .*. Tämä havainto viittasi siihen, että melanoomagangliosidit »·« · 25 ovat sopivia ehdokkaita rokotteen konstruoinnissa ja että • ,·, aikaisempaa immunogeenisemmillä melanoomagangliosidirokot- t · teillä saatettaisiin saada aikaan ylivoimaisia kliinisiä « · « • tuloksia. Koska melanoomagangliosidien asiaankuuluvat epi-toopit ovat hiilihydraatteja, niin avuksi voidaan ottaa • · · *·ϊ·* 30 sellaisten tutkimusten tarkastelu, joiden kohteena on oi- lut toisten hiilihydraattirokotteiden, varsinkin tiettyjä ·***; bakteeri-infektioita vastaan suunnattujen rokotteiden, • i* immunogeenisyyden lisääminen.
• * tt*4 Toisin kuin proteiiniantigeeneilla on hiilihydraat- • · · ί ·* 35 tiantigeenien aikaansaaman immuunivasteelle leimaa antava- · · • ·· • · 117668 72 na piirteenä se, ettei se ole kateenkorvasta riippuvaista. Ajatus siitä, että hiilihydraattiantigeenit ovat kateenkorvasta riippumattomia (TI, thymus independent) perustuu havaintoon, että hiirillä, joilta kateenkorva on syntymän 5 jälkeen poistettu, sekä hiirillä, joilla on kateenkorva, havaitaan täysin toimintakykyisiä humoraalisia immuunivasteita bakteeripolysakkarideja vastaan (15). Tl-antigeenejä vastaan reagoivilla B-soluilla on tiettyjä luonteenomaisia piirteitä. Ne ilmaantuvat myöhään yksilönkehityksessä, 10 ovat pitkäikäisiä eivätkä tarvitse T-soluja aktivoituak-seen, ainakaan in vivo -olosuhteissa. Vaikka T-soluja tarvitaan B-solujen reagointiin Tl-antigeenejä vastaan in vitro -olosuhteissa, niin T-solujen vaikutuksesta ei olla vielä kovin hyvin perillä ja se on selvästi erilainen kuin 15 proteiiniantigeenejä vastaan suunnattu T-soluista riippuvainen vasta-ainevaste, jossa tarvitaan MHC-antigeenien kanssa reagoivien T-solujen apua. Vaikka T-soluja ei välttämättä tarvita in vivo -olosuhteissa TI-antigeenejä vastaan kohdistuvassa vasta-ainevasteessa, niin vasta-aine-20 pitoisuudet ovat suuremmat T-solujen läsnä ollessa, mikä viittaa siihen, että T-soluilla on yleinen avustava vaiku- *·· : tus, jonka mekanismeja ei tässäkään tapauksessa tunneta :*·.· (16).
• · j On tutkittu monia erilaisia lähestymistapoja hiili- ·*· * 25 hydraattiantigeenien immunogeenisyyden lisäämiseksi. Näitä • * • ,·. lähestymistapoja ovat kemiallinen modifiointi (17), adju- # # · "!.* vanttien antaminen, ei-kovalenttinen kompleksinmuodostus • · « • proteiinien kanssa, kovalenttinen kiinnittäminen immuno- geenisiin kantaja-proteiineihin (18) ja hiilihydraattiepi- • · *·:·* 30 toopin korvaaminen proteiini jäljitelmällä, kuten joko täy- • *'· sin syntetisoiduilla peptideillä (niin kutsutuilla mimo- « ·"*. toopeilla, 19) tai anti-idiotyyppisillä vasta-aineilla • i · (20). Useimpien näiden lähestymistapojen tuloksena autta- • · • ja-T-solujen määrä hiilihydraattispesifisessä vasta-aine-
• I I
ί ·* 35 vasteessa lisääntyy. Vaikka kaikki nämä lähestymistavat · • · · ·*· * * 117668 73 ovat olleet tutkimusten alkuvaiheessa lupaavia, niin hii-lihydraattiantigeenien kovalenttista kiinnittämistä immu-nogeenisiin T-soluriippuvaisiin proteiinikantajamolekyy-leihin, jota ensin ehdotettiin hapteeneilla käytettäväksi · 5 (21) ja sitten disakkarideilla käytettäväksi (22), on tut kittu innokkaimmin, minkä seurauksena on saatu aikaan rokotteita, joiden viimeaikaisissa kliinisissä tutkimuksissa on joissakin tapauksissa osoitettu olevan erittäin tehokkaita.
10 Erinomaisia esimerkkejä tästä ovat H. influenzaen b-tyypin (Hib) polysakkaridikonjugaattirokotteet. Neljä viimeksi kuluneen vuosikymmenen aikana kehitettyä rokotetta eroavat toisistaan hiilihydraattikomponenttiensa, pro-teiinikantajamolekyyliensä ja hiilihydraattia ja proteii-15 nia toisiinsa liittävien kytkijämolekyyliensä suhteen (23-27). Lapsilla tehdyissä vertailututkimuksissa konju-gaattirokotteet saivat aikaan huomattavasti voimakkaamman vasta-ainevasteen kuin konjugoimaton Hib-fosforibosyyli/ ribitolifosfaattipolysakkaridi (PRP) -rokote (28). Erityi-20 sen mielenkiintoisia ovat havainnot, joiden mukaan pienis- ,'i sä lapsissa, jotka immunisoitiin ensin HbOC- (oligosakka-ί1 2": ridi - ei-toksinen difteriatoksiini) tai PRP-OMPC- (Neis- ·1·,· seria meningitidis tyyppi b:n ulkomembraaniproteiinikomp- • 1 : .1. leksi) -rokotteilla ja altistettiin myöhemmin konjugoimat- • · 1 25 tomalle PRP-rokotteelle, havaittiin anamnestinen IgG-vaste * · J \m jopa siinä tapauksessa, että immunisointi oli tehty sen • 1 · ikäisille lapsille, joilla konjugoimattomalla rokotteella t · · * tehdylle primaari-immunisoinnille ei syntynyt vastetta
(29, 30). Toistaiseksi on epäselvää millä tavoin T-solut J
*.ί.1 30 aktivoituvat ja miten ne ovat vuorovaikutuksessa Hib- ·♦· PRPrtä vastaan suunnattujen B-solujen kanssa. Se tosiseik- j φ .1··. ka, että immunogeenisyyden lisääntyminen ja T-soluriippu- ··· vaisuus edellyttävät kovalenttista sidosta PRP:n ja pro- • » teiinin välillä, viittaa siihen, että proteiinin ja PRP:n 2 · • t · : .1 35 lähekkäinoloa ei saa häiritä ainakaan antigeenien muok- • · • · · f·1·.·.··: • · 117668 74 kautumisen varhaisessa vaiheessa. Koska Hib-PRP:n ja Hib-PRP-konjugaattien indusoimien vasta-aineiden isotyypit ja biologinen aktiivisuus ovat samanlaisia, niin vaikuttaa siltä, että konjugaatin indusoimaan T-solusignaaliin rea-5 goivat B-solut ovat kvalitatiivisesti identtisiä niiden solujen suhteen, joiden toiminta lähtee käyntiin pelkän Hib-PRP:n vaikutuksesta.
Bakteeri-infektioita vastaan suunnattujen hiilihyd-raattirokotteiden kehityksestä kertyneiden varteenotetta-10 vien kokemusten perusteella tämän keksinnön tekijät ovat useina viime vuosina tutkineet samanlaisia lähestymistapoja melanoomagangliosidien immunogeenisyyden lisäämiseksi.
GD3:n kemiallisesta muokkaamisesta, jonka seurauksena muodostui amideja, laktoneja tai ganglisidoleja, saatiin joh-15 dannaisia, jotka melanoomapotilailla indusoivat erittäin tehokkaasti vasta-ainevasteen. Näiden GD3-johdannaisten indusoimat vasta-aineet eivät kuitenkaan ristireagoineet GD3:n kanssa (31, 32). Anti-idiotyyppinen vasta-aine BEC-2, joka muistuttaa GD3:a, on kehitetty immunisoimalla i 20 hiiriä monoklonaalisella GD3:n tunnistavalla vasta-aineel- la R24. BEC-2:11a immunisoiduissa kaniineissa muodostui ·*:*: anti-GD3-vasta-aineita (33) ja parhaillaan ovat käynnissä *\! alustavat tutkimukset, jotka koskevat BEC-2:n immunogeeni- • · Ϊ .·. syyttä ihmisillä.
• * · ··,·. 25 Konjugaattirokotteiden kyseessä ollessa koskivat • i | l GD3:lla tehdyt alustavat tutkimukset hiirissä kolmea kysy- • · * ‘II.* mystä - kojugaatiomenetelmän kehittäminen, kantajaproteii- • · * *·' * nin valitseminen ja adjuvantin valitseminen (7). Optimaa lisessa konjugaatiomenetelmässä GD3:n keramidirungon kak-*.:/ 30 soissidos pilkottiin otsonilla, siihen lisättiin aldehydi-
»M
ryhmä ja se liitettiin proteiinin aminolysyyliryhmiin pel- ,···. kistävällä aminoinnilla. Viidestä tutkitusta kantajamole- • · kyylistä, poly-l-lysiinistä, reikäkotilon hemosyaniinista • · . (KLH), kationoidusta naudan seerumin albumiinista, Neisse- M ♦ j *,· 35 ria meningitidiksen ulkomembraaniproteiinikompleksista • · • · · .
• «· • » 117668 75 (OMPC) ja moniantigeenipeptidikonstruktioista, jotka sisälsivät neljä peräkkäistä malaria-T-soluepitooppisekvens-siä haarautuvassa polylysiiniytimessä, havaittiin tehokkaimman olevan KLH:n. Ei-kovalenttiset GD3/KLH-kompleksit 5 eivät olleet immunogeenisiä. Paras adjuvantti oli QS-21, joka on Quillaja saponaria Molina -puun kaarnasta puhdistettu homogeeninen saponiinifraktio. GD3-KLH-konjugaatilla *; sekä QS-21:llä tehdyn immunisoinnin aikaansaamalle vasta-ainevasteelle tyypillisiä piirteitä olivat a) suuri IgM-10 vasta-aineiden tiitteri alkuvaiheessa, b) IgM-vasta-aine-tiitterien nopea sekundaarinen kohoaminen tehosteimrauni-sointien jälkeen, c) IgM-vasta-ainetiitterien säilyminen tehosteimmunisoinnin jälkeen jopa kymmenen viikon ajan ja d) yhdenmukainen suuritiitteristen igG-vasta-aineiden tuo-15 tanto yhtä aikaa IgM-vasta-aineiden muodostumisen kanssa kahden viikon alkuviivettä lukuun ottamatta. Nämä havainnot on tässä keksinnössä pystytty toistamaan immunisoimalla melanoomapotilaita toisella gangliosidikonjugaattiro-kotteella, GM2-KLH:lla, samaa konjugaatiomenetelmää käyt-20 täen. Hiirillä tehtyjen tutkimusten tavoin QS-21 osoittau- 4 tui merkittävästi tehokkaammaksi adjuvantiksi kuin Detox ·'·*; tai BCG toksisuuden ollessa hyväksyttävää luokkaa.
·*. ϊ GM2-vasta-ainevasteella oli monia T-soluista riip- • * : puvaiselle vasteelle tyypillisiä piirteitä. Vaste oli pit- f · · ··.·. 25 käkestoinen ja siinä indusoitui alaluokkiin igGl ja IgG3 * · kuuluvia vasta-aineita (näitä esiintyy tavallisesti T-so- • f * **'.* luista riippuvaisen immuunivasteen yhteydessä). Nämä iso- • · · *·* tyypit olivat samoja isotyyppejä, joita toisinaan indusoi tui pieninä tiittereinä konjugoimattomien GM2/BCG-rokot-30 teiden vaikutuksesta, mikä havaittiin myös Hib-PRP-rokot- • * · teitä käytettäessä. Selityksenä sille, ettei rokotuksilla, ,·*·, jotka annettiin kolmen ja viiden kuukauden kuluttua ensim- • · * mälsistä rokotuksista, ollut selvää tehostevaikutusta suu- ^ • · . ritiitterisinä pysyneisiin IgM- ja IgG-vasteisiin, saattaa
S
: *,· 35 olla se, että potilaat immunisoitiin aluksi kahden viikon * · Φ · · • ·· • » { 117668 76 välein. Klassisessa kokeessa, jossa havaitaan sekundaarinen proteiiniantigeenejä vastaan suunnattu vaste, annetaan toinen injektio neljä viikkoa ensimmäisen jälkeen. Ensimmäisen immunisoinnin jälkeen vasta-ainetasot ovat korkeita 5 yhdestä kahteen viikkoa injektion jälkeen, jonka jälkeen ne pienenevät erittäin matalalle tasolle ennen neljän viikon kuluttua annettavan tehosterokotteen antamista. Tämän keksinnön tekijöiden valitsemassa immunisointiaikataulussa aluksi syntynyt vasta-ainevaste ei pienentynyt vaan voi-10 mistui vaiheittain vasteena kahden viikon välein annetuille ensimmäisille neljälle rokotukselle, mitä osattiin odottaa klassisessa kokeessa silmiinpistävämmällä tavalla % havaittavan sekundaarivasteen perusteella. Useimmista pro-teiiniantigeeneja vastaan suunnatuista vasta-ainevasteista 15 poiketen hiilihydraattiantigeeneille tyypilliseen tapaan oli IgM-vaste pitkäkestoinen ja IgM-vasta-aineiden tiitte-ri pysyi IgG-tiitteriä suurempana jopa useiden tehosteim-munisointien jälkeen. Lipidirunkoon kytkeytyneen suhteellisen lyhyen oligosakkaridiketjun sisältäviä sekä autoan-20 tigeeneinä toimivia gangliosideja vastaan suunnatulla immuunivasteella on siten runsaasti yhteisiä piirteitä Hib-·*·*: PRP:tä ja muita bakteerihiilihydraatteja vastaan suunnatun ·*. i immuunivasteen kanssa.
• · · • · ϊ .·. GM2-konjugaattirokotteen kehittämisen avulla käy • * · ··,·! 25 mahdolliseksi määrittää estävätkö pitkäkestoiset GM2:ta • * II vastaan suunnattujen IgM- ja IgG-vasta-aineiden suuret • · · .· *".* pitoisuudet tehokkaammin melanooman uusiutumista kuin kon- • » · *** * jugoimattomalla GM2:lla immunisoiduilla potilailla havait tavat lyhytkestoiset edellistä pienemmät pääasiassa IgM-30 vasta-aineiden pitoisuudet. Tämän keksinnön tekijät voivat • · · näin ollen lisäksi tutkia sitä, muuttuvatko GD3 ja GD2, ,···. jotka ovat tärkeitä gangliosideja, joita vastaan ei mela- noomapotilaissa ole saatu indusoitua vasta-ainevastetta • · . konjugoimattomina rokotteina annettuna, myös immunogeeni- ** · : 35 siksi kun ne konjugoidaan immunogeenisiin kantajaproteii- • · • · · • · · • · 117668 77 neihin. Jos tämä pystytään saamaan aikaan, niin seuraavana houkuttelevana vaiheena voisi olla polyvalenttisen mela-noomagangliosidin konstruointi ja tutkiminen.
5 Taulukko 3
Niiden potilaiden serologinen vaste, jotka saavat GM2-KLH-konjugaattirokotteita apuaineiden kanssa tai ilman niitä verrattuna BGGihen liitettyä GM2:ta sisältävän rokotteen (GM2/BCG) aikaansaamaan vasteeseen 10 GM2-va»ta-ainetiitterien kSSnteisluyut
Ennen immunisointia Immunisoinnin jälkeen (huippu)
Potilaiden luku-
Rokote määrä IgH igG IgM IgG r" GM2-KLH 6 20. 0(5) 0(6) 160(2), 80(2). 40, 160, 0(5) 0, 15 Tiitterien .0 0 BO 0 .
mediaani GM2-KLH 6 20(2), 0(4) 0(6) 320, 160(4), 0 160, 0(5) +Detox
Tiitterien 10 0 160 0 20 mediaani GM2-KLH +BCG 6 80(2). 20(2), 0(6) 1280, 320(2), 320, 20(2), jj 0(2) 80(2). 0 0(3)
Tiitterien 20 0 200 10 • · · mediaani • ♦ · .1. i OK GM2-KLH +QS- 6 320 , 20(2), 0(3 ) 0(6) 5120(2), 1280(3), 1280 , 640(2), *. 11 25 21 320 320 16Q 80 • · • 1 Γ Tiitterien 10 0 1280 480 "·· 1 mediaani ·· 1 • 1 · · * 1 GM2/BCG® 58 160, 40, 20(10), 0(58) 640(11), 320(9), 640, 160, ϊ .1. 10(11), 0(35) 160(15), 80(8), 80(4), 20, Ϊ.Ι 1 40(8), 20(2), 10(3), 0(48) 10(3), 0(2) on «itterien 0 o 160 0 OU mediaani aAikaisemmin saatuja koetuloksia • 1 1 • ♦ · ··· • 1 · • · • · * « « • Oh • · • 1 · s ···1♦ • · · 1 • · · • 1 t · • · • · · ·»· * · : 78 117668
Taulukko 3 (jatkoa) GM2-vaata-alnetlitt*rien kÄMnteisluvut Vastaava KLH-vaeta-aine GM2-vasta-aineiden täpläblottl-lmmuno- Tiitterit lramunisaa-▼ärjays tion jälkeen
Potilaiden luku-
5 Rokote_ määrä _IgM_ _IgO_ IgO
GM2-KLH 6 3+(2), 2+(2), 1+(2), 0(4) 540(2), 180, 60(3) 0(2)
Tlitterien 120 mediaani 10 GM2-KLH + Detox 6 3+(2), 2+(3), 1+ 2+, 0(5) 1620, 540(2). 180(3)
Tlitterien 360 mediaani GM2-KLH +BCG 6 3+, 2+(3), 0(2) 1+(2), 0(4) 4860, 1620(2), 540(3)
Tlitterien 1080 15 mediaani GM2-KLH +QB-21 6 3+(5), 2+ 3+(5) 10240, 5120(2), 2560(3)
Tlitterien 3840 mediaani GM2/BCG® 58 3+(32), 2+(15), 3+(2), 2+(5), E.t.
1+(4), 0(7) l+(4), 0(47) 20 Tlitterien I.t.
mediaani aAikaieemmln saatuja koetuloksia • · · • · · • · ♦ • · • · • · · • * • » ··· • · · • * · • « -,τ.
• » ' • · * ··· · · • · » • I · * • · · • · · ·· ··· • « • * ♦ · · « ··· • · ···.
• « * * · ··· • · * • · * · ···.' • · · • · 117668 79
Taulukko 4 GM2-KLH ynnä QS-21 -rokotteella GM2:ta vastaan indusoitujen IgG-Ab-molekyylien IgG-alaluokkaspesifisten MoAB:iden karakterisointi 5 CM2:ta vaataan auunnatun ELISA-tiitterin käänteisluku
IgG-alaluokka-mAB:t Potilaan numero
Konsentraa- mAB:n
Spesifi syy a tlo (yig/ml) lähde 2 3 4 5 6
IgG 10 SBA1 640 640 640 640 640 640 20 BS 40 20 20 e.t. 20 20 5 ZLI 640 640 640 640 640 640 10 IgCl 10 SBA 10 10 10 10 10 10 20 BS 10 10 0 10 0 0 2 ZLI 10 0 10 0 10 0
IgG2 10 SBA 10 0 0 0 0 0 20 BS 0 0 0 0 0 0 2 ZLI 0 0 0 0 0 0
Ig03 10 SBA 20 20 20 20 20 20 20 BS 40 80 40 40 40 40 . 2 ZLI 20 40 20 10 10 20
IgG4 10 SBA 0 O O O 0 0 20 BS 0 0 O 0 0 0 2 ZLI 0 0 0 0 0 0 aSBA, Southern Blotehcnology Associates (Birmingham, AL); BS, The Binding Site Ltd.; ZLI. Zymed 15 Laboratories Inc. (San Fransisco, CA)
Taulukko 5 •fe GM2-KLH ynnä QS-21 -rokotteella immunisoiduista potilaista f 20 saadun seerumin GM2-vasta-aineiden välittämä melanoomaso- ·2 ·/· l lulinjan SK-MEL-178 solujen komplementtihajotus • 4 & • · · Hajoamisprosentti 4 · J #1φ Ennen rokotusta otettu Rokotuksen jälkeen Rokotuksen jälkeen otet- * Potilaan seerumi komplementin kana- otettu seerumi komp- tu seerumi Ilman komple- 4 · · 9 S numero sa lementin kanssa menttia * # 4 " ' - m • 4 j * | 1 1,3 38,75 3,1 • 4 1 *·· 1 2 2,2 16.9 2,72 * · · * » 1 *.1 1 3 1,1 14,0 0.9 4 1,2 26.0 2.2 • ;1; 3 0 5 2,1 34,9 1,65 4 4 f • ##\ 6 10,5 44,7 2,3 ···1 aKohdesolut varustettiin 51Cr-leim«lla ja käsiteltiin suhteessa 1:5 laimennetulla antiseerumilla.
4 4 4 1 • · 4 * 1 · • 4444· • 4 2 · • · 1 4 4 • · * · • 4 · • 14 4 4 ; 80 : 117668
Neljäs koesarja I-vaiheen tutkimuksessa immunologisena adjuvanttina annettiin suurenevia annoksia saponiinifraktiota QS-21 samalla kun reikäkotilon hemosyaniiniin (KLH) kovalentti-5 sesti kiinnitetyn melanoomagangliosidin GM2 annos pidettiin muuttumattomana. 28:aa levinneisyysasteeltaan AJCC-luokan III tai IV melanoomaa sairastavaa ja leikkauksen jälkeen oireetonta potilasta hoidettiin kuudella rokotuksella, jotka annettiin ihonalaisesti viiden kuukauden jak-10 son aikana. Paikallisilla ja systeemisillä reaktioilla oli yhteyttä QS-21:n annokseen. 100 pg tai sitä pienemmät annokset aiheuttivat rokotuskohtiin lievää 2-4 päivää kestävää paikallista aristusta ja tulehdusta ja ajoittaista lyhytkestoista lievää kuumetta ja pahoinvointia, mutta ei 15 merkittävää toimintakyvyttömyyttä. 30 %:ssa rokotuksista 200 pg:n annos aiheutti lievää kuumetta ja pahoinvointia ja kaikilla potilailla havaittiin jopa 20 cm:n läpimittaisia paikallisia reaktioita, jonka seurauksena injektoidun raajan käyttö oli hankalaa 5-10 päivän ajan. GM2:ta vas-20 taan suunnattujen IgM- ja IgG-vasta-aineiden tiitterit olivat korkeimmillaan 100 ja 200 pg:n QS-21-annoksilla. QS-21:tä vastaan suunnattuja vasta-aineita ei havaittu. Tässä tutkimuksessa 100 pg:n QS-21-annos on tunnistettu • i I optimaaliseksi elimistön hyvin sietämäksi annokseksi, joka ··· · 25 indusoi GM2:ta ja KLH:ta vastaan suunnattujen vasta-ainei- • den muodostumisen melanoomapotilaissa.
"I.1 Johdanto • · · * Tämän keksinnön tekijät sekä muut tutkijat ovat rokottaneet melanoomapotilaita käyttäen sellaisista koko- • · 1 *·ϊ·1 30 naisista melanoomasoluista tehtyä rokotesarjaa, jotka on • · · '...· valikoitu sen perustella, että ne ilmentävät useita eri- ;·1·. laisia glykoproteiini- ja gangliosidiantigeenejä (1, 2).
• · ·
Rokotuksen jälkeen otettujen seerumien sisältämien vasta- • · aineiden tunnistama antigeeni oli useimmissa tapauksissa • · a ί .1 35 gangliosidi GM2. GM2-gangliosidi on ihmisen malignien me- • · • · · » 1 1 * · 117668 81 lanoomasolujen pinnalla normaalia runsaammin ilmentyvä differentiaatioantigeeni. Yksinään injektoidun GM2:n ei havaittu olevan immunogeeninen, joten tutkittiin useita erilaisia immunologisia adjuvantteja sisältäviä GM2-rokot-5 teitä (3, 4). Immunisointi Bacillus Calmette-Guerin (BCG) -rokotteeseen kiinnitetyllä puhdistetulla GM2-gangliosi-dilla sai useimmissa melanoomapotilaissa aikaan GM2:ta ? vastaan suunnattujen IgM-vasta-aineiden muodostumisen ja vasta-ainetta tuottavien potilaiden oireeton jakso oli 10 pitempi ja eloonjääminen parempaa verrattuna potilaisiin, joissa ei muodostunut vasta-ainetta (4, 5). Satunnaistetussa tutkimuksessa 122:11a leikkauksen jälkeen oireettomaksi todetulla melanoomapotilaalla muodostui suurimmalle osalle (86 %:lle) GM2/BCG-rokotetta saaneista potilaista 15 vasta-aineita (6). GM2:ta vastaan suunnattuja vasta-aineita tuottavien potilaiden oireeton kausi oli merkittävästi pitempi ja näiden eloonjäänti kokonaisuutena merkittävästi parempi vasta-aineen suhteen negatiivisiin potilaisiin verrattuna. Tämän tutkimuksen kahta osa-aluetta toisiinsa 20 verrattaessa oli GM2/BCG-rokotetta saaneiden potilaiden oireeton kausi 18 % pitempi ja näiden eloonjääminen 11 % parempi kuin BCG-kontrolliryhmällä, vaikkakaan kumpikaan : eroista ei ollut tilastollisesti merkittävä (Livingston, * · • .·. et ai., 1993a). Immuunivaste oli lyhytkestoinen, koostui • * * JIV 25 pääasiassa IgM:stä ja oli tiitteriltään vaatimatonta luok-• · * I kaa. Samanlaisissa potilailla tehdyissä tutkimuksissa, * » · joissa käytettiin GD2-, GD3- ja 9-0-asetyyli-GD3/BCG-ro-*·* kotteita, saatiin tulokseksi joissakin tapauksissa matalia tiitterisiä vasta-ainevasteita (7). On olemassa ilmiselvä 30 tarve saada käyttöön tehokkaampi rokote.
·»·
Landsteinerin hapteeni-kantaja-aine-konjugaateilla .*··. suorittamia klassisia kokeita on sovellettu suotuisin tu- loksin useita erilaisia antigeenejä vastaan suunnattuun • · . rokottamiseen, kuten vasta-syntyneillä lapsilla bakteerien : *,· 35 kapselipolysakkarideja vastaan (8). Näiden kokemusten pe- • · * · · • * · • · 117668 82
rusteella reikäkotilon hemosyaniiniin (KLH) konjugoitiin useita erilaisia kasvainten hiilihydraattiantigeenejä ja osoitettiin, että tällä menetelmällä saadaan aikaan suu-remmat IgM- ja IgG-vasta-ainevasteiden tiitterit kuin ai-5 kaisemmin tehdyissä tutkimuksissa, joissa on käytetty kon-jugoimattomia rokotteita (9 - 11). Tämän keksinnön tekijät tutkivat useisiin erilaisiin kantajamolekyyleihin kytketyn GD3:n immunogeenisyyttä hiirillä ja tunnistivat KLH:n optimaaliseksi kantaja-aineeksi (12). GM2-KLH-konjugaatti-10 rokotetta tutkittiin yksinään tai yhdistettynä immunologisiin adjuvantteihin, BCGrhen ja Detoxiin, melanoomapoti-lailla, mutta immuunivaste ei muuttunut merkittävästi verrattuna GM2-BCG-rokotteella aikaansaatuun vasteeseen, ja saatiin yksinomaan tiittereiltään kohtalaisen suuria IgM- P
15 vasta-aineita (13). Tarvittiin voimakkaampaa immunologista adj uvanttia.
QS-21 on saponiinifraktio, joka on puhdistettu lähes homogeeniseksi Quillaja saponaria Molina -puun kaarnasta, ja se valittiin hyvän adjuvanttitehonsa ja vähäisen 20 toksisuutensa ansiosta (14, 15). Saponiineja on käytetty f immunologisina adjuvantteina useissa erilaisissa yhteyk- ··* ϊ#ί ϊ sissä (näistä on esitetty katsaus kirjallisuusviitteessä :*·.· 15). QS-21 :tä on käytetty E. colin polysakkaridia vastaan * * • ;*· suunnatun vasta-ainevasteen tehostamiseen (16) sekä Hiv- ·*» · :*.·. 25 l:n vaippaproteiinia (17), ovalbumiinia (18) ja kissan i • · ** • · • ,·. leukemiavirusta (19) vastaan suunnattujen vasta-aine- ja t II t **!.* T-soluvasteiden tehostamiseen. Proteiinin ja QS-21:n seok- • i» « ·» * • A · , silla tehdyllä immunisoinnilla on saatu käynnistettyä sy- , totoksisten T-solujen muodostuminen HIV:llä infektoitunee- • · · '···* 30 ta soluja ja ovalbumiinilla transfektoituja soluja vastaan *·..* (17, 18). Tämän keksinnön tekijät tutkivat useita erilai- siä uusia immunologisia adjuvantteja yhdessä useiden eri-....: laistenhiilihydraattiantigeeni-KLH-konjugaattirokotteiden kanssa ja nämä havaitsivat, että immunologiset adjuvantit ♦ · · • ·* 35 QS-21 ja SAFb tehostivat tehokkaimmin IgM- ja IgG-vasta- • · · • *· • · 117668 83 ainetiittereitä (9). Tutkimukset kohdistettiin QS-21:een, koska se oli näistä vähiten toksinen ja sitä oli saatavilla konjugaattirokotteilla tehtäviin tutkimuksiin. GD3-gangliosidi-KLH + QS-21 -rokotteet saivat yhdenmukaisesti 5 hiirillä aikaan suuritiitterisiä IgM- ja IgG-vasta-aine-vasteita (12), mikä on ollut perusteena tämän lähestymistavan tutkimiselle melanoomapotilailla.
Tässä keksinnössä on kuvattu sellaisesta I-vaiheen tutkimuksesta saadut tulokset, jossa käytettiin vakiona 10 pidettyä GM2-KLH-annosta ja suurentuvia QS-21-annoksia.
Koska puhdistettua QS-21:tä tai osittain puhdistettuja 3 saponiineja, kuten Quil-A:ta, ei ollut aikaisemmin käytetty ihmisillä, niin tavoitteena oli määrittää suurin elimistön yhdenmukaisesti sietämä annos toistuvassa poliklii-15 nisesti tehtävässä annostuksessa, sekä optimaalinen annos GM2:ta vastaan suuntautuvan vasta-ainevasteen tehostamiseksi.
Materiaalit ja menetelmät
Gangliosidit 20 Naudan aivoista peräisin olevat GM2 ja GDlb saatiin lahjoituksena Fidia Research Laboratorystä (Abano Terme, :T: Italia). Naudan aivoista peräisin olevat GM3, GM1 ja GDla hankittiin Sigma Chemical Co. -yhtiöstä (St. Louis, MO).
• · : GD2 valmistettiin GDlbrstä β-galaktosidaasikäsittelyllä *·· · 25 (12). GD3 oli eristetty lypsylehmien maidosta valmistetus- • · ! ta kirnupiimästä ja se saatiin Dr. R.K. Yulta (Medical * * * .
College of Virginia, Richmond, VA).
·*· ** Reagenssit ja monoklonaaliset vasta-aineet HPTLC-silikageelilevyt hankittiin E. Merck -yhtiös- * **· M·* 30 tä (Darmstadt, Saksa). 4-kloori-l-naftoli ja p-nitrofenyy- M· lifosfaattidinatrium hankittiin Sigmasta. ELISA-määrityk- .***. sissä käytettiin ensin alkaliseen fosfataasiin konjugoitua • · · vuohessa tehtyä humaani - IgM: ää vastaan suunnattua antisee- • * • rumia (Kirkegaard and Perry Labs, Gaithersburg, MD) ja • ·** : ** 35 puhdistettua hiiressä tehtyä humaani-IgG:tä vastaan suun- • · • · · • ·· • · 1 .
117668 84 nattua antiseerumia (Southern Biotech, Birmingham, AL) ja sitten alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohessa tehtyä muriini-IgG:tä vastaan suunnattua antiseerumia (Southern Biotech). Täpläblotti-immunovärjäyksessä ja immuno-ohut-5 kerroskromatografiässä käytettiin TAGO-yhtiöstä (Burlingame, CA) hankittuja piparjuuriperoksidaasiin konjugoituja vuohessa tehtyjä humaani-IgM:ää tai -IgG:tä vastaan suunnattuja antiseerumeja. ITLC:hen tarkoitettuja piparjuuriperoksidaasiin konjugoituja kaniinissa tehtyjä hiirtä vas-10 taan suunnattuja immunoglobuliineja ja ELISA-määritykseen tarkoitettuja alkaliseen fosfataasiin konjugoituja kaniinissa tehtyjä muriini-IgM:ää ja -IgG:tä vastaan suun-nattua antiseerumia käytettiin yhdessä kontrollina käytet- | tyjen hiiressä tehtyjen monoklonaalisten vasta-aineiden 15 kanssa ja ne oli hankittu Zymed-yhtiöstä (San Francisco, CA). Anti-GM2-mAb 696 hankittiin Kyowa Hakko Kogyo -yh- ~ tiöstä (Tokio, Japani) ja anti-GD3-mAb R24 oli valmistettu (13) ♦
Potilaat 20 Levinneisyysasteeltaan AJCC luokan III tai IV mela- | noomaa sairastavia potilaita pidettiin kelvollisina tutki- ·1": mukseen, jos kaikki metastaattiseen tautiin viittaavat ·1. ϊ todisteet olivat kielteisiä viimeksi kuluneiden 8 kuukau- • · · • · : den aikana. Yksikään potilaista ei ollut saanut aikaisem- • · · ·** t ··.·, 25 min kemoterapiaa eikä sädehoitoa. Potilaat arvioitiin tok- • · j ! sisuuden suhteen jokaisen rokotuksen yhteydessä. Potilaita • · · kehotettiin lisäksi mittaamaan paikallisten reaktioiden • · ·
"·1 suuruudet sekä mittaamaan ruumiinlämpönsä. Nämä tulokset S
merkittiin muistiin ja ne käytiin läpi seuraavan klinikka- *..*.1 30 käynnin yhteydessä. Neljä potilasta (yksi kultakin neljäl- ··· tä annostasolta) sai vain 4 immunisointia, koska tauti t .***. alkoi uudelleen edetä vaatien muuta hoitoa. > * · «ti ...,· Rokotteen valmistus ja antaminen j • · • GM2-KLH-konjugaatti oli Biomira Inc. -yhtiön I V 35 (Edmonton, Alberta) valmistama. GM2:n ja KLH:n moolisuhde • · t · · · 117668 85 oli noin 800:1, ja rokote toimitettiin konsentraatiossa 0,57 mg konjugaattia tavallisen fysiologisen suolaliuoksen 0,5 ml:n suuruista erää kohti. Tämä määrä vastaa yhtä potilaalle annettavaa annosta ja se sisältää 70 pg GM2:ta, 5 500 pg KLH:ta ja 0,5 ml tavallista fysiologista suola liuosta. Quillaja saponaria Molina -puun kaarnasta eristettyä saponiinikomponenttia sisältävä QS-21-adjuvantti saatiin Cambridge Biotech Corp. -yhtiöstä (Worcester, MA).
QS-21:n puhtauden määritettiin analyyttisellä käänteisfaa-10 si-HPLC:llä olevan > 98 %. 10, 50, 100 pg tai 200 pg QS-21:tä laimennettiin 0,25 ml:aan tavallista fysiologista suolaliuosta ja yhdistettiin GM2-KLH:hon. Rokotetta (jonka lopputilavuus oli 0,75 ml) sekoitettiin pyörresekoittimes-sa 2 - 3 minuutin ajan ja sitä annettiin 15 minuutin ku-15 luessa. Kahden viikon välein annettiin neljä rokotusta ja sitten vielä kaksi rokotusta kahdeksan viikon välein.
Aluksi hoidettiin 12 potilasta siten, että kullakin nel- ' jästä erisuuruisesta QS-21-annoksesta hoidettiin 3 potilasta. Myöhemmin vielä yhtä potilasta hoidettiin 10 pg:n 20 annoksella ja vielä kolmea muuta potilasta hoidettiin koi- ^ mella suurempaan luokkaan kuuluvalla annoksella. Kaikille ϊ1ϊ"; potilaille annettiin laskimonsisäisesti 200 mg/m2 syklofos- ·1·.· famidia (Cytoxan, Mead Johnson and Co., Evansville, IN) • · : 4-6 päivää ennen ensimmäistä rokotusta.
• · · 25 Serologiset määritykset ja viivästyneen yliherk- • 1 .^ kyysreaktion (DTH) määritykset i » ·
Entsyymivälitteiset immunosorbenttimääritykset • I 1 : * (ELISA) tehtiin samoin kuin mitä on kuvattu aikaisemmin gangliosidien kyseessä ollessa (5). QS-21:n ELISA-määri- 30 tyksiä varten kiinnitettiin glutaarialdehydillä käsitelty- i«a ·,,,· jen Immulon 4 -levyjen (Dynatech Labs, Chantilly, VA) pin- .1··. taan QS-21:etyleenidiamiinia (tämä oli valmistettu kytke- ···'.
...,· mällä etyleenidiamiinia QS-21:n glukuronihapon karboksyy- • ♦ • liryhmään). Epäspesifisen "tarttuvuuden" huomioonottami- • e···· • · · i .1 35 seksi immuuniseerumit tutkittiin myös levyillä, joita oli • · • · · · 117668 86 käsitelty samalla tavalla mutta joihin ei oltu lisätty KLH-gangliosidia tai QS-21:tä, ja lukema vähennettiin antigeenin läsnä ollessa saadusta arvosta. Tiitteri määriteltiin suurimpana laimennoksena, josta korjatun absor-5 banssin arvoksi saatiin 0,1 tai tätä suurempi. Gangliosi-dit värjättiin immunologisesti monoklonaalisilla vasta-aineilla tai humaaniseerumeilla sen jälkeen kun ne oli pipetoitu täpliksi nitroselluloosaliuskoille aikaisemmin kuvatulla tavalla (22). Potilaille tehtiin ihotestit 10 GM2:lla, GM2-HSA:lla ja KLH:11a viidennen rokotuksen yhteydessä. 25 pg kutakin tutkittavaa ainetta laimennettiin 0,05 ml:aan PBS:ää ja seos annettiin intradermaalisesti.
Tulokset tulkittiin aikaisemmin kuvatulla tavalla (5).
Tulokset 15 Toksisuus
Taulukossa 6 on esitetty niiden annettujen rokotus- f ten lukumäärä, jotka sisälsivät pelkästään GM2-KLH:ta tai ΐ tämän kanssa käytettyjä useita erilaisia annoksia QS-21:tä, sekä näihin rokotuksiin liittyneet paikalliset ja 20 systeemiset reaktiot. Kun GM2-KLH sellaisenaan tai yhdistettynä 10 pg:aan QS-21:tä aiheutti ajoittain lievän pai- ·*·': kallisen punoituksen ja kovettuman, niin QS-21-annoksen ·\ϊ suurentaminen johti yhä useammin esiintyviin ja yhä vai- • · : keammiksi käyviin paikallisreaktioihin. 10 ja 50 pg:n an-
··' S
25 noksilla rokotukseen liittyi 24 - 48 tunnin ajan kestänyt- « • · | t*t tä lievää arkuutta ja 2 - 4 senttimetrin läpimittainen *“.* punoitus ja kovettuma (ei kuitenkaan havaittu luokkaa 1 ♦ · · • · · * voimakkaampaa toksisuutta). Edellistä suuremmilla annoksilla nämä reaktiot muuttuivat voimakkaammiksi ja reagoiva • · * · M.* 30 alue oli useimmissa tapauksissa läpimitaltaan jopa 8 - ··· 10 cm ja joissakin tapauksissa (200 pg:n annoksilla) läpi- .·*·, mitaltaan jopa 20 cm. 100 pg:n annoksilla nämä reaktiot i kestivät yleensä 2-4 päivän ajan ja yhdessä tapauksessa • · . jopa seitsemän päivän ajan ja 200 pg:n annoksella reaktiot : V 35 kestivät seitsemän päivän ajan ja yhdessä tapauksessa jopa • · • · · • * • · 117668 87 10 päivän ajan. Yhdessäkään tapauksessa ei tarvittu Tyle-nolia voimakkaampia kipulääkkeitä ja 10, 50 ja 100 pg:n annoksia saaneet potilaat pystyivät keskeytyksettä huolehtimaan normaaleista päivittäisistä tekemisistään. Käytet-5 täessä 200 pg QS-21:tä sisältäviä rokotteita oli rokotetun raajan käyttö useimmissa tapauksissa hankalaa 5-8 päivän ajan rokotuksen antamisen jälkeen mutta mitään paikallisreaktioihin viittaavaa ei ollut todettavissa kahden viikon kuluttua potilaita seuraavan kerran tutkittaessa. Ei ollut 10 havaittavissa haavaumia, märkimistä eikä ihonalaisia paukamia (jollaisia todettiin useimmilla muilla adjuvanteil-la). Vaikka toisinaan havaittiinkin ohimeneviä lieviä kuumeita tai lihaskipuja sellaisten rokotusten jälkeen, joissa käytettiin jotakin kolmesta pienimmästä QS-21-annokses-15 ta, niin näitä oireita liittyi noin kolmasosaan rokotuksista, jotka oli tehty 200 pg QS-21:tä sisältäneillä rokotteella. Systeemiset oireet olivat yleensä voimakkaimmat toisen immunisoinnin jälkeen. Kolmannen ja neljännen immunisoinnin yhteydessä kaikkien niiden potilaiden QS-21-an-20 nos, jotka olivat saaneet 200 pg QS-21:tä, pienennettiin | 100 pg:aan tai 50 pg:aan, koska huolenaiheena oli paikal-;"ϊ*Γ listen ja systeemisten reaktioiden lisääntyminen (taulu- kossa 6 on näihin muutetuilla annoksilla tehtyihin immuni- « · j .·. sointeihin liittyneet sivuvaikutukset esitetty 100 pg:n ja ♦ ·· · 25 50 pg:n annosten kohdalla). Elimistö sieti näitä annoksia • · ! hyvin ja niinpä kaikkien viiden potilaan (yhdellä poti- • * · laalla tauti alkoi jälleen edetä ja tämä potilas suljet- • · · * tiin tutkimuksen ulkopuolelle neljän immunisoinnin jälkeen) annos nostettiin viidennen immunisoinnin yhteydessä t · · M.* 30 takaisin 200 pg:aan. Viidennellä immunisointikerralla suo- • * · \,.· ritetuista viidestä immunisoinnista oli kaksi sellaista, joihin liittyi kuumetta ja flunssaa muistuttavia oireita ja yhteen immunisointiin liittyi myös 20 cm:n läpimittai- • · • nen paikallinen punoitus ja kovettuma. Tämän potilaan saa- : 35 ma QS-21-annos pienennettiin kuudennen rokotuksen yh- • · • · * ··'.-• · 117668 88 teydessä 100 pg:aan eikä systeemisiä oireita kehittynyt ja paikallinen reaktio oli lievä (3 - 4 cm:n suuruinen punoitus j a kovettuma). Yhteenkään neljästä muusta kuudennesta immunisoinnista 200 pg:lla QS-21:tä ei liittynyt systeemi-5 siä oireita. Vaikka systeemiset oireet olivat kaiken kaikkiaan melko lieviä, niin paikallinen punoitus, kovettuma ja aristus olivat 200 pg:n annoksella niin voimakkaita, että tämän keksinnön tekijät pitivät parempana keskeyttää suurten QS-21-annosten käyttö.
10 GM2:ta vastaan suunnattu vasta-ainevaste rokotusten jälkeen (tämä on esitetty taulukossa 7)
Pelkällä GM2-KLH:lla tehdyllä immunisoinnilla aikaansaadut vasta-ainetiitterit olivat melko samanlaiset kuin sellaisissa aikaisemmissa tutkimuksissa saadut tiit-15 terit, jotka oli tehty BCGtn pintaan tarttunutta GM2:ta sisältävää rokotetta käyttäen. Kuudesta potilaasta oli viisi sellaista, joissa muodostui IgM-vasta-ainetta, ja ainoastaan yhdessä potilaassa muodostui IgG-vasta-ainetta (jonka tiitteri oli pieni). QS-21:n annoksen suurentaminen 20 kohotti IgM-vasta-ainetiittereitä. IgM-vasta-ainetiitterin käänteisluvun mediaani oli 80, kun immunisoinnissa käytet-tiin pelkästään GM2-KLH:ta, ja kun immunisoinnissa käytet- :*·.♦ tiin 10 pg QS-21 :tä, niin tämä arvo oli 480, ja käytet- • · • täessä 50 pg:n annosta tämä arvo oli 240 ja 100 tai ··· · 25 200 pg:n suuruisen QS-21-annoksen jälkeen 1280. Myöskin • * j I, IgG-vasta-ainetiitterit suurentuivat annosten suurentuessa • · · asteittain arvosta 0, joka oli saatu potilailta, joille * oli annettu pelkästään GM2-KLH:ta, arvoihin 10, 60, 200 ja 640 potilailla, joille oli annettu vastaavassa järjestyk- *·ϊ·* 30 sessä ilmoitettuna 10, 50, 100 ja 200 pg QS-21 :tä. Kaikil- ··· la GM2-KLH:ta ynnä QS-21 :tä saaneilla potilailla havait- .***. tiin huomattavia määriä IgM-vasta-aineita ja havaittavissa ·♦· · ....· olevia IgG-vasta-aineita (ELISA-määritystä ja täpläblotti- • * • immunovärj äyksiä käyttäen). Kuviossa 9 on esitetty peräk- • · i .* 35 käisten rokotusten IgM- ja IgG-vasta-ainetiitterit niistä • i • · · • «« • · 117668 89 kuudesta potilaasta kootuista ryhmistä, joille annettiin 100 ja 200 pg:n suuruisia QS-21-annoksia. Näissä kahdessa ryhmässä on vasta-ainevaste kokonaisuudessaan melko samanlainen vaikkakin ELISA-IgG-tiitterit olivat 200 pg:n an-5 noksella jonkin verran suuremmat. Varmistus vasta-aineiden spesifisyydestä GM2:ta vastaan ja reaktioiden samanlaisuudesta 100 ja 200 pg:n annoksilla saatiin GM2:ta vastaan suunnatuilla täpläblotti-immunovärjäyksillä (ks. taulukko 7 ja kuvio 10). GM2:ta vastaan suunnatun IgM-täpläblotti-10 reaktion mediaani suurentui arvosta 2+ potilailla, jotka saivat pelkästään GM2:ta, arvoon 2+ ja 3+ potilailla, jotka saivat 10 tai 50 pg QS-21:tä ja arvoon 3+ potilailla, jotka saivat 100 tai 200 pg QS-21:tä. IgG-reaktiot suurentuivat arvosta 0 potilailla, jotka eivät saaneet QS-21:tä, 15 arvoon 2+ potilailla, jotka saivat 10 tai 50 pg QS-21:tä ja arvoon 3+ potilailla, jotka saivat 100 tai 200 pg QS-21:tä.
GM2-vasta-ainevasteiden spesifisyysanalyysi
Kuviossa 10 on esitetty ennen immunisointia ja nii- 20 den jälkeen otetuilla seerumeilla tehdyt täpläblotti-immu- novärjäykset kuhunkin viiteen hoitoryhmään kuuluvasta kah- :1·1: desta edustavasta potilaasta. Kuten tämän keksinnön teki- •\J jät ovat aikaisemmin kuvanneet, kyettiin monien potilaiden • » : seerumeista, jotka oli otettu ennen immunisointia, osoit- • · · ··♦ · ♦·,·. 25 tamaan GMl:tä vastaan suunnattua IgM-reagoivuutta mutta ei • · j I havaittu minkäänlaista reagoivuutta GM2:ta tai muita gang- • · · **'.1 liosideja vastaan. Immunisointi ei vaikuttanut reagoivuu- • · ·1 teen GMl:n kanssa mutta kaikissa potilaissa havaittiin GM2:ta vastaan suunnattuja IgM- ja IgG-vasta-aineita. Ku- • ·#· 30 ten tämän keksinnön tekijät ovat aikaisemmin esittäneet ··· (13), näillä indusoituneilla GM2-vasta-aineilla esiintyi ; joskus ristireagoivuutta GD2:n kanssa (potilas 1, 100 pg:n • 4 1 annos).
• · • •« 4 • · t • · « · ··# • · · * · 117668 90 KLH:ta ja QS-21:tä vastaan suunnatut serologiset vasteet
Kuten taulukosta 7 käy ilmi, ei ennen immunisointia havaittu reagoivuutta KLH:ta vastaan ja tämä reagoivuus i 5 lisääntyi asteittain QS-21:n annoksia suurennettaessa.
Vaikka 50, 100 ja 200 pg:n QS-21-annokset saivat aikaan merkittävästi suurempia KLHrta vastaan suunnattuja IgG- -f vasta-ainetiittereitä kuin 0 tai 10 pg:n suuruinen annos, niin 50, 100 ja 200 pg:n annoksilla aikaansaaduissa sero-10 logisissa tiittereissä ei tiittereiden välillä ollut merkittävää eroa. QS-21:tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden tiitterit määritettiin ELISA-määrityksillä neljän immunisoinnin jälkeen. QS-21:tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden määrän ei havaittu merkittävästi lisääntyvän 15 verrattaessa keskenään ennen immunisointia ja sen jälkeen otettuja seeruminäytteitä (koetuloksia ei ole esitetty).
DTH-vasteet GM2:ta ja KLH:ta vastaan Ihotesteissä ei GM2:n tai GM2-HSA:n kohdilla havaittu punoitusta tai kovettumaa. Useimmissa KLH-ihotesti-20 kohdissa havaittiin 24 ja 48 tunnin kohdalla voimakkaat punoitusreaktiot ja nämä reaktiot olivat voimakkaimmat ϊ*:*ϊ 200 pg:n annoksen saaneilla potilailla (läpimittojen medi- a ·\ϊ aanit 4,0 x 6,0 cm). Näihin reaktioihin liittyi vain vä- • · ϊ .·. häistä kovettuman muodostumista, mikä viittaa siihen, että • · φ a·* · ·*.·. 25 kyseessä oli viivästyneen yliherkkyysreaktion ja vasta- • * I ; ainevälitteisen reaktion yhdistelmä, mistä syystä viiväs- • ta '**,* tyneen yliherkkyysreaktion voimakkuus oli vaikeaa kvanti- a a a *·* toida täsmällisesti (potilaiden kotonaan tekemien määri- ; tysten avulla). ' v *.:.* 30 Muut kliiniset tutkimukset • · ·
Kuutta potilasta, joilla tauti oli edennyt pitkäl- a .···, le, hoidettiin samalla rokoteannoksella (Biomira, Inc. ) a taa kuin mitä oli käytetty edellä. Kuutta muuta potilasta, • · • joilla tauti oli edennyt pitkälle, hoidettiin kymmenes- a#a# : V 35 osalla GM2-KLH-annoksesta käyttäen tässäkin tapauksessa • a a · · a aa .
aa·- 117668 91 100 pg QS-21:tä. Kummassakin ryhmässä vasta-ainetiitterit olivat pienemmät kuin mitä oli havaittu potilailla, joilla tauti on varhaisessa vaiheessa, mutta 7 pg:n GM2-annos vaikutti indusoivan yhtä tehokkaasti IgM- ja IgG-vasta-5 ainetiittereitä kuin 70 pg:n annos.
Toisessa tutkimuksessa GM2-KLH-konstruktiolla hoidettiin 6 potilasta, joilla tauti oli varhaisessa vaiheessa. IgG-vasta-ainetiitterit olivat verrattavissa Biomiran konstruktion antamisen jälkeen havaittuihin tiittereihin 10 vaikkakin IgM-vasta-ainetiitterit vaikuttivat jonkin verran tätä pienemmiltä. Kaikissa potilaissa kuitenkin muodostui immunisoinnin jälkeen vasta-aineita ja potilaiden elimistö sieti hyvin rokotetta.
Vielä yhdessä tutkimuksessa tullaan käyttämään 18 15 potilasta, joille annetaan GM2-KLH-rokotuksia aluksi viikon välein (tämä on aikataulu, jonka hiirillä suoritetuissa tutkimuksissa oli osoitettu ylivoimainen). Potilaat jaetaan ryhmiin satunnaistamalla siten, että toisia potilaita ei käsitellä alkuun pienellä syklofosfamidiannoksel- k 20 la ja toisia taas käsitellään aluksi pienellä syklofos-famidiannoksella. Tuloksia on kertynyt tähän ajankohtaan :’·1· mennessä 10 potilaasta ja vaikuttaa siltä, ettei niiden •1.j potilaiden välillä, joista toisille on annettu syklo- *···;· : .·. fosfamidia ja toisille ei, ole eroa ja tällä ajankohdalla • 1 1 * « · · 25 vaikuttaa siltä, että tätä uutta aikataulua käyttäen saa- • · I I vutetut vasta-ainetiitterit ovat ylivoimaiset samaa konju- • · · "1.1 gaattia käyttäen suoritetuissa aikaisemmissa kokeissa saa- ♦ 1 · ’·' turhin tiittereihin verrattuna.
Pohdinta 30 Tämä tutkimus oli I-vaiheen tutkimus, jonka tavoit- • · · \tt· teenä oli saada selville suurin elimistön sietämä (MTD, ,···. maximum tolerated dose) QS-21-annos avohoidossa sekä se • · QS-21:n annos, jolla saadaan suurin immuunivastetta voi- • 1 . mistava vaikutus. Todennäköiseksi MTD-annokseksi määritet- •« 1 : .1 35 tiin 200 pg:n QS-21-määrä rokotusta kohti. Vaikka 200 yg:n • φ * · · · 92 117668 annoksen aiheuttamia lieviä kuumereaktioita ja huonovointisuutta sekä laaja-alaisia paikallisia tulehdusreaktioita ei voida pitää MTD-annoksena sairaalahoitoa vaativien pitkälle edennyttä melanoomaa sairastavien potilaiden hoidos-5 sa käytettyjen suurien IL2-annosten tai yhdistelmäkemote-rapian yhteydessä (23, 24), niin ne olivat merkittäviä syöpäpotilaiden avohoidossa käytettävää adjuvanttimäärää määrättäessä eikä niitä pidettäisi hyväksyttävinä infektiotauteja vastaan suunnatun immunisoinnin yhteydessä nor-10 maaleilla rokotettavilla potilailla. 100 pg:n annos aiheutti kuitenkin vain 2 lievää kuumetapausta kaikkiaan 44 injektiossa eivätkä paikalliset tulehdusreaktiot haitanneet jokapäiväisiä toimintoja ja reaktioiden kesto ra- 4 joittui tavallisesti 2-4 päivään. Kliinisessä tutkimuk-15 sessa tämä annos oli potilaspopulaatiossa hyvin siedetty. Paikallinen ja systeeminen toksisuus lisääntyi selvästi suurennettaessa annos 100 pg:sta 200 pg:aan, minkä johdosta annoksia ei uskallettu kohottaa suuremmiksi. Vaikka suurimmalla annoksella kuume ja huonovointisuus muistutti-20 vat toisinaan muiden immunologisten adjuvanttien, kuten BCG:n ja Detoxin, yhteydessä havaittuja sivuvaikutuksia (15, 25), niin paikallisreaktiot olivat huomattavasti eri- * laisia. Ihonalaisesti injektoitu 200 pg:n QS-21-annos sai • 1 2 3 : .·. aikaan läpimitaltaan 10 - 20 cm:n punoituksen ja kovettu- • · · ··1 · ' 25 man, jota kuumotti ja joka oli kosketusarka. Tämä paikal- J ^ lisreaktio on laaja-alaisempi kuin yhtä voimakkaat systee- * » 1 "!.1 miset oireet aiheuttavilla Detox- tai BCG-annoksilla ta- * vallisesti havaittava reaktio. Näiden reaktioiden yllättävänä piirteenä oli, että muutamaa päivää myöhemmin (tai • 1 · **!·1 30 enintään 10 päivää myöhemmin) nämä reaktiot olivat koko- ® · · naan hävinneet eikä rokotteen antamiskohtaan ollut jäänyt .1·1. näkyviin minkäänlaisia jälkiä. Yhdelläkään potilaalla ei • 1 · injektiokohdassa havaittu haavaumia, märkimistä tai pauka- • · mien muodostumista.
• · 1 • · · • · * ♦ 2 * · 3 • · · • · ; 93 117668
Toinen yllättävä havainto tässä tutkimuksessa oli, että QS-21 sai kaikilla käytetyistä annoksista aikaan kvalitatiivisesti erilaisen immuunivasteen GM2-gangliosidia vastaan. Jopa 10 pg:n annoksella kaikissa potilaissa muo- Ä 5 dostui täpläblotti-immunovärjäyksillä havaittavia määriä GM2:ta vastaan suunnattuja IgG-vasta-aineita. Pelkästään KLH-rokotteilla tai optimaalisilla BCG- tai Detox-annok-silla tai BCG:n, Salmonella minnesota R595-mutantin tai proteosomien pintaan kiinnitetyllä GM2:lla saatiin vain 10 harvoin aikaan useampi kuin 1 havaittava IgG-vaste kuutta immunisoitua potilasta kohti (2, 4, 5). GM2:ta vastaan suunnatut IgM- ja IgG-vasta-ainetiitterit suurentuivat edelleen QS-21:n annoksia suurennettaessa mutta nämä näyttivät saavuttavan tasannevaiheen 100 ja 200 pg:n annosten 15 välillä. Myös KLH:ta vastaan suunnattujen IgG-vasta-ainei-den määrä suureni QS-21:n annoksia suurennettaessa. igG-tiitterien suurimmat arvot olivat merkittävästi suuremmat 50, 100 ja 200 pg:n annoksilla kuin 0 ja 10 pg:n annoksilla, mutta kolmella suurimmalla annoksella aikaansaadut 20 tiitterit eivät eronneet toisistaan merkittävästi. Nämä tulokset osoittavat, että 100 ja 200 pg:n QS-21-annokset indusoivat optimaalisen vasta-ainevasteen GM2:ta vastaan •\j ja että elimistö sietää 100 pg:n annosta 200 pg:n annosta • * J .*. paremmin. Punoituksen syntyminen pelkällä GM2-KLH:lla tai 25 GM2-KLH:lla ja useilla erilaisilla QS-21-annoksilla immu- • ♦ | nisoitujen potilaiden ihotestireaktioissa KLH: ta vastaan • · · oli yllättävää. Tämä reaktio saattaa olla vasta-ainevälit- • * * • · · • teisen Arthus-tyyppisen reaktion ja viivästyneen yliherkkyysreaktion yhdistelmä. On myös mahdollista, että muissa * • · · '·!·* 30 tutkimuksissa (26) käytettyä annosta pienempi KLH-annos • · φ *...· (25 pg 100 pg:n sijaan) ihotesteissä ei ollut riittävän ·***. suuri saamaan aikaan voimakasta havaittavaa DTH-reaktiota • · ··· tai että GM2-gangliosidien suuri epitooppitiheys rokot-teissä käytetyssä KLH:ssa ei antanut antigeenien muokkauk- • · · • ·* 35 set ja esittämisen immunologiselle järjestelmälle tapahtua • · • ♦ · ····.
117668 94 normaalilla tavalla, mikä on vaatimuksena KLH:ta vastaan suunnatun klassisen DTH-reaktion syntymiselle.
Vaikka QS-21:tä ja muita saponiineja sisältäviä adjuvantteja on käytetty laajamittaisesti koe-eläimillä ja ;i 5 eläinlääkinnässä (14 - 19), niin niiden vaikutusmekanismi on yhä tuntematon. Näiden tutkimusten perusteella voidaan * tehdä joitakin päätelmiä QS-21:n vaikutusmekanismista. Palpoitavissa olevien paukamien puuttuminen injektiokoh-dista viittaa siihen, ettei tapahdu depot-ilmiötä ja tähän 10 liittyvää granulooman muodostumista. QS-21 vaikuttaa voimakkaasta adjuvanttivaikutuksestaan huolimatta olevan huono immunogeeni. Havaittavaa vasta-ainevastetta ei syntynyt edes useiden immunisointien jälkeen. Näin ollen toisin kuin muilla adjuvanteilla, kuten C. parvumilla, BCG:llä ja 15 täydellisellä Freundin adjuvantilla, saattaa olla, ettei QS-21:n iramunogeenisyydellä ole myötävaikutusta adjuvant-tivaikutukseen. 200 pg:n annoksella havaittu lievä kuume ja huonovointisuus sekä injektiokohdissa ilmenevä diffuusi punoitus ja kovettuma viittaavat siihen, että reaktioon 20 liittyy sytokiinien vapautumista. IL-2:n intradermaalisen injektoinnin seurauksena on syntynyt hyvinkin samanlaisia I reaktioita, jotka koepalatutkimuksen perusteella ovat tyy- »*·,· pillisiä klassiselle viivästyneelle yliherkkyysreaktioille • * ί (27, 28). GM2-vasta-aineiden osittainen vaihtuminen IgG- • · · · :v. 25 vasteeksi viittaa T-solujen antamien aputoimintojen indu- * · . soitumiseen, mikä saattaa olla tämän sytokiini-induktion • · · ‘II.* seurausta.
• · φ * Tämän keksinnön tekijät ovat äskettäin osoittaneet, että tutkituista gangliosidien immunogeenisyyttä tehosta- *.i.' 30 vista kantaja-aineista tehokkain on klh (12) ja tämän kek- * * * \..* sinnän tekijät ovat osoittaneet QS-21 :n optimaalisen an- noksen immunogeenisyyden parantamiseksi tästä edelleen. έ • · ·
Koska keksijät ovat valmistautumassa gangliosidirokotetta • · • koskevaan suureen III-vaiheen tutkimukseen levinneisyys- • · · : .* 35 asteeltaan AJCC-luokan III melanoomaa sairastavilla poti- • · • · · ♦ ·· * · 117668 95 lailla, niin tutkittavaksi jää vielä useita muuttujia. Tämän keksinnön tekijät ovat parhaillaan suorittamassa esikliinisiä tutkimuksia tällä gangliosidi-KLH ynnä QS-21 -rokotteella sekä useilla muilla immunologisilla adjuvan-5 teillä. Lisäksi suunnitteilla on kliinisiä tutkimuksia, joissa käytetään erilaisia immunisointiaikatauluja ja erilaisia GM2-KLH-annoksia. Tässä keksinnössä kuvatussa I-vaiheen tutkimuksessa yllättäviä havaintoja olivat, että 1) millään QS-21:n annoksella ei havaittu granulooman muo-10 dostumista ja että 2) elimistön hyvin sietämällä 100 pg:n annoksella GM2:ta vastaan suunnattu serologinen vaste oli niin kvantitatiivisesti kuin kvalitatiivisestikin silmiinpistävän ylivoimainen kaikkiin aikaisemmin tutkituilla GM2-rokotteilla havaittuun vasteeseen verrattuna.
15
Taulukko 6
Esiintyneiden haitallisten reaktioiden lukumäärä (ja niiden vakavuus) kullakin QS-21-annoksella potilailla, jotka saivat 500 pg GM2-KLH:ta ± QS-21 sisältäviä rokotteita 20 QS-21tn anno· Ja haitalliset reaktiot 0 10 ug 50 pg 100 μg 200 ug ··· • · Rokotusten lukumäärit 35 22 34 44 23 • · • ·β2 Haitalliset reaktiot • * 2 »*· Paikalliset: • · · ·♦· * 25 Aristus ja kipu 6(1) 21(1) 34(2) 23(2) : #· 7(d* • ·
Iti Punoitus ja kovettumat 6(1) 4(1) 17(1) 24(2) 21(3) ·*· · ·*·*· Systeemiset:
Kuume 00 3(1) 2(1) 7(1) , Päänsärky 0 0 0 0 1(1) ...
··· 30 Lihaskivut 0 1(1) 2(1) 0 6(1) ·· • ·
Pahoinvointi Ja okaentelu 0 1(1) 1(1) 0 1(1) l * *7(1): Paikallinen kipua ja arkuutta tuntui 7 rokotuksen jälkeen 22 rokotuksesta. Jotka sisälslvMt ··* 10 ug QS-21:tä. Suluissa esitetty luku tarkoittaa Yhdysvaltain kansallisen syopäinstituutin (NCI) 35 yleisten toksisuuskriteerien mukaista mediaanivakavuusaatetta, joka tässä tapauksessa on lievä * * paikallinen aristus. Paikallisen toksisuuden yhteydesaä (1) vähäistä aristusta Ja punoitusta. (2) • keskivoimakasta punoitusta ja kovettumaa läpimitaltaan < 10 cm, kipua, jossa ei tarvita huimaavia }*,·, kipulääkkeitä, (3) Punoitusta ja kovettumaa läpimitaltaan a 10 cm, kipua. Jossa tarvitaan huumaa- • · via kipulääkkeitä (ei havaittu). Systeemisen toksisuuden yhteydessä (1) tarkoittaa 38,3 - 40 39,4 "C:n kuumetta, lievää päänsärkyä, lieviä lihaskipuja tai lievää pahoinvointia ilman oksente- : lua.
* * : 96 117668
Taulukko 7 GM2-KLH:ta ynnä monia eri QS-21-annoksia sisältävillä rokotteilla tehdyn rokottamisen jälkeen saatu serologinen vaste 5 GM2:ta vastaan suunnattujen vasta-aineiden huipputiitteri ELISA-määrityksessä
Rokote Ennen hoitoa Hoidon jälkeen
Potilaiden
GM2-KLH plus lukumäärä IgH IgO IgM IgG
ei adjuvanttia 6 20, 0(5)* 0(6) 160(2), 80(2), 40, 0(5) 40, 0 10 10 ug QS-21 4 0(4) 0(6) 1280, 640. 80, 20, 0(2) 320, 80 50 ug QS-21 6 20, 0(5) 0(6) 640, 320(2), 80(3), 40(2), 20 160(3) 100 ug QS-21 6 40, 0(5) 0(6) 5120, 1280(3). 2560, 640, 320, ίί 160, 80 80, 40(2) 200 U9 QS-21 6 320. 20, 0(6) 5120, 1280(3). 1280(2). 640(2).
0(4) 320(2) 320, 80 15 Taulukko 7 (jatkoa) 6M2:ta vastaan suunnattiin Imuu- KLM:ta vastaan suunnat- #··· nijärjestelnän vasteen täpläblot- tujen IgG-vasta-aineiden *·* * Rokote tihuippuarvot tiitteri ELISA-määrityksessä • · • * · ···'.
• · Potilei- • · J J · den lu- Ennen ♦ · · · «* · GM2-KLH plus kumäärä IgM IgO hoitoa Hoidon jälkeen • φ ·
• · ^—- I· I I III I
• · : ei adjuvanttia 6 3+. 2+(3), 1*. 0 l+(2). 0(4) 0(6) 360, 180(3), 20(2) • · · • · * » 20 10 ug QS-21 4 3+(2), 2+(2) 2+(3), 1+ 0(6) 810. 270(2), 90 • · · 50 ug QS-21 6 3+(3), 2+(3) 3+(2). 2+(2), 0(6) 2430(3), 810(2).
, 1*(2) 90 • * · • · · 100 ug QS-21 6 3+(5), 2+ 3+(4), 2+(2) 0(6) 21870, 2430 (3).
• · 810(2) ··* : 1 200 ug QS-21 6 3+(4), 2+(2) 3+(4), 2+(2) 0(6) 21 870, 7290(3), * · · • 2430, 810 • * ♦Yhdellä potilaalla ennen hoitoa vaateen hiupputiitteri ELISA-määrityksessä oli 1/20. Suluissa 25 oleva luku tarkoittaa sitä potilaiden lukumäärää, jollia kyseinen arvo esiintyi. Tässä tapauksessa • · * * viidellä potilaalla ei pystytty havaitsemaan GM2-vasta-aineita • · • · · • · * • · ' ' 97 117668
Viides koesarja
Johdanto
Malignin melanooman insidenssi on kasvanut nopeasti viimeksi kuluneen vuosikymmenen aikana. Vuonna 1992 Yhdys-5 valloissa melanoomaan sairastui yli 32 000 ihmistä ja melanoomasta johtuvia kuolemantapauksia rekisteröitiin 6 700 (1). Kun primaarimelanooma on poistettu leikkauksella riittävän hyvin, on viiden vuoden päästä elossa olevien potilaiden määrä yli 95 %:sta potilailla, joilla primaari-10 tuumorin paksuus on < 0,75 mm, 50 %:iin potilailla, pri-maarituumorin paksuus on > 4,0 mm (2). Potilailla, joilla syöpä on metastasoitunut paikallisiin imusolmukkeisiin (AJCC-luokka III), on elektiivisen tai terapeuttisen leikkauksen jälkeen viiden vuoden päästä elossa olevien poti-15 laiden määrä 25 - 35 % (3). Näillä potilailla minkään adjuvanttihoidon ei ole leikkauksen jälkeen osoitettu vähentävän syövän uusiutumista eikä lisäävän eloonjääneiden lukumäärää. Näissä adjuvanttitutkimuksissa on tutkittu monia erilaisia aineita (joista on esitetty katsaus viit-20 teissä 4 ja 5), mukaan luettuna kemoterapia, ei-spesifiset ? immuunivastetta stimuloivat aineet, interferonit ja monet :*·*: eri tyyppiset melanoomarokotteet. Melanoomarokotteiden ;*.tj osalta haasteena on ollut kehittää menetelmiä, joilla voi- • · ϊ .·. daan seurata rokotteiden immunogeenisyyttä immuunivasteen e · ··.·, 25 voimakkuuden ja aikaansaatavan spesifisyyden suhteen. Kos- | • · | I ka rokotteita vastaan suunnattuja humoraalisia immuuni- * » « *’*.* reaktioita voidaan kvantitoida ja analysoida sellaisella • · · ’·* tarkkuudella, jollaiseen soluvälitteisten immuunireaktioiden yhteydessä vasta parhaillaan ollaan pääsemässä, niin i J.:.: 30 tämän keksinnön tekijät ovat keskittyneet humoraalisen ·· ·...· immuniteetin aikaansaaviin melanooma-antigeeneihin. Näistä • ... .*·*♦ serologisesti määritellyistä antigeeneistä ovat gangliosi- ,..,j dit, erityisesti GM2, muodostuneet houkutteleviksi aktii- φ ♦ . visen immunisoinnin kohteiksi (5 - 8). Tämän keksinnön ·*·*· : .* 35 tekijät ovat äskettäin osoittaneet, että pientä Cy (syklo- • · • · t • · · • * 117668 98 fosfamidi) -annosta käyttäen tehdyn esikäsittelyn jälkeen tehty immunisointi BCG:hen tarttuneella puhdistetulla GM2:lla johti siihen, että IgM-vasta-aineiden muodostuminen käynnistyi suurella osalla melanoomapotilaita (8, 9).
5 GM2-vasta-ainevasteessa havaittiin T-soluista riippumatto man vasteen piirteitä, toisin sanoen lyhyt kesto, IgG-vas-teen puuttuminen ja toistuvien rokotusten aikaansaaman tehostevaikutuksen puuttuminen. Muodostuneet vasta-aineet olivat humaanikomplementin läsnä ollessa sytotoksisia 10 GM2:ta ilmentäville melanoomasoluille ja immunisoinnin jälkeen GM2-vasta-aineita muodostavien potilaiden oireeton jakso kesti merkittävästi pitempään ja nämä pysyivät elossa merkittävästi pitempään kuin oli asianlaita niiden potilaiden kohdalla, joissa näitä ei muodostunut. Tämän tut-15 kimuksen tarkoituksena oli varmistaa rokotteen indusoiman GM2-vasta-aineen muodostumisen edulliset vaikutukset satunnaistetussa kontrolloidussa tutkimuksessa.
Materiaalit ja menetelmät Potilaat 20 Tutkimukseen kelpuutettiin potilaat, joiden patolo gisesti dokumentoidut melanoomametastaasit rajoittuivat ·*;*· ihoon ja paikallisiin imusolmukkeisiin (levinneisyysaste •*.J AJCC-luokka III) ja joiden ihometastaasien ja paikallisten • · : .·, imusolmukkeiden täydellisestä poistosta leikkauksella oli • · · •V 25 kulunut 2-13 viikkoa. Muita sopivuuskriteerettä olivat: * · ' | * ikä > 15 vuotta, Karnofskyn suorituskykystatus a 90; see- • · · "*.* rumin kreatiniini < 2,5 mg/dl, seerumin bilirubiini < • · · *** * 2,5 mg/dl; ei muita syöpiä; ei kemoterapiaa tai sädehoitoa rokotusta edeltävän 8 viikon jakson aikana. Raskaana ole-30 vat naiset suljettiin tutkimuksen ulkopuolelle. Kaikki ·»· ί,.,ί potilaat tutkittiin ja heidän sopivuutensa määritettiin .···. kahden viikon sisällä ennen satunnaistamista. Myöhemmästä • · kliinisestä seurannasta huolehti potilasta hoitava onkolo- • * . gi.
·· · • · • · • · • · · • ·· • · : 99 ; 117668
Satunnaistaminen ja seuranta
Kaikilta potilailta saatiin tietoon perustuva suostumus ja potilaat luokiteltiin positiivisten imusolmukkeiden lukumäärän (1, 2 - 4, a 5), kehittymässä olleen (int-5 ransit) taudin esiintymisen ja leikkauksen ja rokotuksen välisen ajan (2-6 viikkoa, 7-13 viikkoa) mukaan. Potilaat satunnaistettiin tietokoneella ja lohkojen koot määrättiin liukuvasti sen varmistamiseksi, että kahteen hoitoryhmään tulevien potilaiden määrät vastasivat melko hy-10 vin toisiaan) rokotettavaksi joko GM2/BCG:llä tai pelkästään BCG:llä. Tietoa annetun rokotteen tyypistä ei annettu potilaille eikä lääkintähenkilökunnalle ennen kuin kahden viikon kuluttua viimeisestä rokotuksesta. Kaikista potilaista saatiin seurantatiedot yhden viikon aikana joka 15 4.-6. kuukausi puhelimitse potilaita hoitavilta lääkä reiltä. Oireettoman jakson määrittämiseen käytettiin radiografisesti tai patologisesti dokumentoituja taudin uusiutumispäivämääriä. Koska tämän rokotuslähestymistavan kahdella ei-spesifisellä komponentilla, BCG:llä ja pienenä 20 annoksena annetulla syklofosfamidilla, saattaa olla osoitettavissa olevaa tuumoreja vastaan suunnattua aktiiviini I suutta (10, 11, 12), niin näiden ottamista kontrolliryh- ·*·,· mäksi pidettiin sopivampana kuin ei mitään hoitoa saanei- • » I .*. den potilaiden ryhmää.
j\\ 25 GM2/BCG-rokote • * • .·. Rokotteen valmistukseen käytetty GM2-gangliosidi • · · “I.‘ saatiin kahdesta materiaalilähteestä, Tay-Sachsin tautia • * « * Λ • « « * sairastavien kissojen (tämä tauti periytyy näissä kissois- # sa autosomissa resessiivisesti) aivokudoksesta ja nauta- • · · ’···* 30 karjan aivoista valmistetusta GMl:stä, joka hankittiin yhtiöstä Supelco, Beliefonte, PA. Tay-Sachs-kissojen ai- • .--¾ ·***· voista tehdyt leikkeet (nämä saatiin Dr. Mario Ratazzilta -4 «·· ....I Mt. Sinai Hospital -sairaalasta New Yorkista, NY) uutet- • · tt· tiin kloroformin ja metanolin seoksella ja uute perasety- • · • ·* 35 loitiin, sille tehtiin florisil-kromatografia fosfo- • · • * · • * · • * 117668 100 lipidien poistamiseksi, deasetyloitiin, dialysoitiin ja erotettiin komponentteihinsa DEAE-Sephadex-kolonnikromato-grafiällä (13). Kun materiaali oli dialysoitu, erotettiin suurimpana fraktiona ollut GM2 preparatiivisella ohutker-5 roskromatografiällä. GM2 valmistettiin naudan aivojen GMlistä pilkkomalla terminaalinen galaktoosi β-galakto-sidaasilla aikaisemmin kuvatulla tavalla (14). Näistä kahdesta lähteestä peräisin olevia GM2-molekyylejä ei pystytty erottamaan toisistaan ohutkerroskromatografiällä (TLC) 10 eikä immuno-TLC:llä, jossa käytettiin GM2:n tunnistavia hiiren monoklonaalisia vasta-aineita (13). Ohutkerroskromatograf iällä ja densitometriskannauksen avulla määritettynä kukin GM2-erä oli yli 98-%risesti puhdas. Erien steriilisyys tutkittiin tavanomaisilla steriilisyystutki-15 muksilla ja turvallisuus tutkittiin marsuilla ja hiirillä.
Puhdistettu GM2 kuivattiin ja varastoitiin 4 "Crssa. BCG:n Tice-kantaa (University of Illinois,
Chigaco, IL), jota käytettiin 107 elinkykyistä yksikköä (tai 3 x 106 elinkykyistä yksikköä potilailla, joilla oli 20 positiivinen PPD-testitulos), sekä 200 pg kuivattua puh- § distettua GM2:ta suspendoitiin ultraäänikäsittelyn avulla ··· ϊ#:: samanaikaisesti tislattuun veteen. Suspensio lyofilisoi- :1·.· tiin ja varastoitiin -80 °C:ssa. Juuri ennen rokotteen * · • antamista jäljelle jäänyt materiaali suspendoitiin uudel-·»· · IV. 25 leen 0,5 ml:aan fosfaatilla puskuroitua fysiologista #·, suolaliuosta (PBS). Näissä olosuhteissa GM2:n on havaittu 117668 101 laille annettiin alkuvaiheessa kissan aivoista peräisin olevaa GM2:ta. Tämän jälkeen käytettiin yhä enenevässä määrin GMl:stä peräisin olevaa GM2:ta, koska kissan aivoista peräisin olevaa GM2:ta ei enää ollut saatavilla.
5 Kaikille potilaille annettiin intradermaalisia injektioita 6 - 10 kohtaan imunestekierroltaan normaalissa raajassa ja tämä toistettiin kaksi kertaa kahden viikon välein siten, että kullakin kerralla käytettiin eri raajaa. Tehosterokotukset annettiin kahden ja viiden kuukauden kuluttua en-10 simmäisen rokotesarjan jälkeen.
Syklofosfamidin antaminen
Kaikille potilaille annettiin laskimonsisäisesti yksi annos 200 mg/M2 Cy:tä (Cytoxan; Mead Johnson and Co., Evansville, IN) viidestä seitsemään päivää ennen ensim-15 mäistä ja neljättä rokoteinjektiota.
Gangliosidireagenssit GD2 valmistettiin käsittelemällä GDlbitä p-galakto- sidaasilla (G. W. Jourdian, University of Michigan, Ann
Arbor, MI) julkaistujen menetelmien mukaisesti (14). GMl 20 hankittiin Supelco-yhtiöstä (Bellefonte, PA). GD3 saatiin * lahjoituksena Fidia Research Laboratories -tutkimus- laitokselta (Abano Terme, Italia) ja GDlb hankittiin sa- :*·,· malta toimittajalta. GM3 puhdistettiin koiran punasoluista * * ! .*. (13). Täpläblotti-immunovärjäyksiin (kuvio 11) käytetty ··· · 25 GM2 valmistettiin GMl:stä β-galaktosidaasikäsittelyllä tai • · ; t·' se uutettiin ihmisen melanoomista peräisin olevista koe- • · * "*.* palanäytteistä aikaisemmin kuvatulla tavalla (13).
• · · • · · * Serologiset menetelmät
Seerumia otettiin jokaisella rokotuskerralla, 2 ja • * · *·ί·* 30 6 viikkoa 3., 4. ja 5. rokotuksen jälkeen ja 3 kuukautta * · · 5. rokotuksen jälkeen. GM2- ja BCG-vasta-aineiden tunnis- .***. tukseen käytetyssä ELISA-määrityksessä (9) käytettiin 4 ··· potilasseerumeja ja kaniinissa tehtyjä humaani-IgM-vasta- • · • aineita tai humaani-IgG-vasta-aineita vastaan suunnattua • · · Ϊ .* 35 sekundaarista vasta-ainetta tai alkaliseen fosfataasiin • · * · · • · · 117668 102
konjugoitua proteiinl-A:ta (Kirkegaard and Perry Labs, Gaithersburg, MD). GM2:n kanssa reagoimattomilta verenluovuttajilta peräisin olevia normaaliseerumeita käyttäen saadut lukemat vähennettiin potilasseerumeista saaduista J
5 lukemista. Vasta-ainetiitteri määriteltiin suurimmaksi seerumilaimennokseksi, jolla korjatun absorbanssin arvoksi saatiin > 0,10 aikaisemmin kuvatulla tavalla (8, 9).
Täpläblotti-immunovärjäykset tehtiin aikaisemmin kuvatulla tavalla (8, 9) ja ne luokiteltiin asteikolla 0, 1+, 2+ tai 10 3+, kuten kuviosta 11 käy ilmi. Seerumit luokiteltiin positiivisiksi, jos GM2:n reagoivuus oli täpläbloteissa 2+ tai 3+ silloin kun ELISA-tiitteri oli > 1/20, tai täpläbloteissa 1+ silloin kun ELISA-tiitteri oli > 1/80. Komplementista riippuvaisen sytotoksisuuden määritykset 15 tehtiin aikaisemmin kuvatulla tavalla käyttäen komplemen tin lähteenä ihmisen normaalia seerumia ja kvantitoimalla elinkykynsä menettäneiden solujen määrä visuaalisesti Giemsa-värjäyksellä (8, 15).
Viivästyneen yliherkkyysreaktion (DTH) määrittäni! -20 seen tarkoitetut ihotestit
Unilamellaarisia liposomeja valmistettiin kanan-.*!*. munan fosfatidyylikoliinista ja ne käsiteltiin suodatta- .·. : maila 10 kertaa suodattimena, jonka huokoskoko oli • · * • · ; 0,1 pm. Ihotestin suorituspäivänä (2 viikkoa neljännen • · · J*V 25 rokotuksen jälkeen) yhdistettiin toisiinsa 1,5 mg fosfati-• * dyylikoliiniliposomeja ja 25 pg GM2:ta PBS:ssä ja seosta • · * käsiteltiin ultraäänellä Branson 1200 -mallin vesihaude- • · · *·* ultraäänikäsittelylaitteessa (Shelton, CT). Ihotestit (0,1 ml:n tilavuus) tehtiin käyttäen a) 25 pg GM2:ta ja b) ·.·,· 30 25 pg GM2:ta ja 1,5 mg liposome ja ja tulokset luettiin • · · : ϊ 48 tunnin kuluttua aikaisemmin kuvatulla tavalla (16, 17).
.···, Tulokset # *
Potilaiden ominaispiirteet . Tutkimukseen otettiin 10.3.1987 ja 17.3.1989 väli- ·· · : V 35 senä aikana yhteensä 123 potilasta. Potilaiden katsastuk- * · • « · • · · • * 117668 103 sessa yhdellä potilaalla havaittiin olevan levinneisyys-asteeltaan AJCC-luokan II tauti (ei positiivisia imusolmukkeita), joten tämä potilas suljettiin tutkimuksen ulkopuolelle. Kaikki 122 kelpoisuusvaatimukset täyttävää poti-5 lasta sisältyvät saatujen rokotteiden lukumäärästä riippumatta analyysiin satunnaistettuina. Kaksi potilasta (yksi kummastakin ryhmästä) päätti jättää tutkimuksen kesken yhden immunisoinnin jälkeen, koska heillä ei ollut valmiuksia kestää kokeelliseen hoitoon ja satunnaistukseen 10 liittyvää epävarmuutta. BCG-ryhmässä yhdelle potilaalle oli annettu vain kaksi immunisointia kun taudin havaittiin päässeen etenemään ja hoito keskeytettiin. Kaikki muut potilaat saivat vähintään ensimmäisen kolmen immunisoinnin sarjan ja pysyivat tutkimusohjelmassa loppuun saakka tai 15 siihen asti, kunnes tauti lähti etenemään. Yksi BCG-ryh-mään kuulunut potilas sai viidennen rokotuksen yhteydessä vahingossa GM2/BCG:tä (tässä potilaassa muodostui GM2-vas-ta-ainetta ja hän pysyi oireettomana). Seuranta-ajan mediaani on viisi vuotta ja kolme kuukautta lyhimmän seuran-20 ta-ajan ollessa neljä vuotta ja kolme kuukautta ennen satunnaistamista tehdyn leikkauksen jälkeen. j1t1. 122 satunnaistetun potilaan ominaispiirteet on esi- .·. : tetty taulukossa 8. Levinneisyysluokan III melanoomaa sai- • · i ,·. rastavilla potilailla tärkein yksittäinen ennustetta ennä- • · · IIV 25 koiva tekijä on positiivisten imusolmukkeiden lukumäärä • · tl (3). Muita huonoon ennusteeseen liittyviä tekijöitä ovat • 1 · primaarikohdan sijainti pään ja kaulan alueella sekä • 1 · *·1 1 kehittymässä oleva (intransit) melanooma (3). Näiden en nustetta ennakoivien tekijöiden osalta GM2/BCG- ja BCG- ·.·/ 30 ryhmät olivat vertailukelpoisia.
• · * · • · · ··· • · • · ·2 ♦ *···1 * · • · · • · · • · • · · ··· ♦ ·· 2 • · 104 1 1 7 6 6 8
Taulukko 8
Potilaiden luonteenomaiset piirteet
Hoitoryhsiä 0M2-vaata-aineet g Luonteenomainen piirre BCQ GMZ/BCO Poaitiivinen Negatiivinen
Potilaiden lukumäärä 64 58 64 58
Sukupuoli (M/N) 48/16 37/21 48/16 37/21
Ikämediaani (vaihtelu- 48,5 46 49,5 44 väli) (27, 75) (16, 74) (31, 75) (16, 74) 10 Aika leikkauksesta 14 - 42 pv 21 22 20 23 43 - 91 pv 43 36 44 35
Primaarikohta Pää j a kaula 7 7 8 6 15 Vartalo 29 24 28 25
Raaja 23 27 21 19
Ei havaittu 5 10 7 8
Primaarikohdan syvyys < 2 mm 15 12 15 12 20 2 - 4 mm 20 15 19 16 > 4 mm 10 11 10 11
Ei tiedossa 19 20 20 19 ;>
Kehittyvä tauti ··· Poissa 54 52 54 52 • · 1 • · · * , 25 Läsnä 10 6 10 6 • · 1 * 1 · * 1 Metastaaseja sisältävien imusolmukkeiden lukumäärä • · • · « : i 27 24 26 25 ···' • 1.♦ 2-4 23 23 24 22 : >4 14 n 14 n ····__ ··· 30 * · · • · 1 * • · · ··· ··· • · · • · Φ · ♦2 • · · • · ··· • · • 1 · ···''' • · • · · * · · • «· 2 • · 117668 105
Sivuvaikutukset
Alkuhoitona ollut syklofosfamidi aiheutti toisinaan lievää pahoinvointia tai kuvotusta 2-24 tunnin ajan, mutta pääasiassa se oli hyvin siedetty. Intradermaalinen 5 BCG-injektio sai aikaan tulehduksen sekä märkäisen ruven muodostumisen kaikilla potilailla, jotka oli immunisoitu kolme kertaa tai tätä useammin. Kun ruven muodostusta tai märkimistä havaittiin ensimmäisen kerran, niin BCG:n annos pienennettiin kolmasosaan tulehdusreaktion pitämiseksi 10 siedettävällä tasolla. Tästä syystä viimeisen immunisoinnin aikana BCG:n mediaaniannos oli kummassakin hoito-ryhmässä 3 x 106 elinkykyistä yksikköä. 107 elinkykyisen yksikön annos pidettiin ainoastaan 10 %:lla potilaista ja joillakin potilailla annos oli pienennettävä vielä 106 yk-15 sikköön. GM2 ei vaikuttanut BCG:n aiheuttamaan tulehdusreaktioon eikä se aiheuttanut muita sivuvaikutuksia.
GM2:ta vastaan suunnattu serologinen vaste
Kuviossa 10 on esitetty peräkkäisissä immunisoinneissa saadut GM2:ta vastaan suunnattujen IgM-vasta-20 aineiden tiitterit ennen GM2/BCG-rokotusta ja sen jälkeen ja ne ovat tiittereitä sellaisilta ensimmäisiltä viideltä :1·1; (vuonna 1987) hoidetulta potilaalta ja viimeiseltä viidel- • tä (vuonna 1989) hoidetulta potilaalta, jotka olivat saa-• 1 : .·. neet kaikki GM2/BCG-immunisoinnit. Kuten oli asianlaita • t i ••V 25 aikaisemmassa tutkimuksessa (9) oli vasta-ainevaste valta- · j I osaltaan IgM-tyyppistä ja tiitterin havaittiin siinä usein • · 1 *".1 suurentuvan kunkin immunisoinnin jälkeen, mikä muistuttaa * · · • ennemminkin toistuvaa primaarivastetta kuin anamnestista sekundaarivastetta. ELISA-määrityksessä havaittujen vasta- * · · 30 aineiden spesifisyyden varmistamiseksi tutkittiin kaikkien • 1 « potilaiden seerumit, jotka oli otettu ennen immunisointia * .··1. ja tiitterin huippukodalla immunisoinnin jälkeen, myös * · · täpläblotti-immunovärjäyksellä. Kuviossa 11 on esitetty • · . kymmenestä kuviossa 10 esitetystä seerumista tehdyt ·· · i 1.· 35 immunologiset täpläblottivärjäykset. Kuten aikaisemmin on • m • · · · 117668 106
esitetty, havaittiin ennen hoitoa toisinaan matalatiitte-ristä reagoivuutta (8, 9). Rokotteen indusoima reagoivuus rajoittui ainoastaan GM2:een; GM3:n, GD2:n, GDlb:n tai GD3:n kanssa ei havaittu minkäänlaista reagoivuutta. GM2- H
5 vasta-aineet pystyivät osallistumaan komplementtiriippu-vaiseen sytotoksisuusilmiöön tutkimuksissa, joissa käytettiin GM2:ta ilmentäviä tuumorisoluja yhdessä humaanikomp-lementin kanssa (taulukko 9). Tässä vasta-ainevaste- ja vasta-ainespesifisyysmallissa ei havaittu muutoksia sen 10 kahden vuoden aikana, jolloin potilaita koottiin tutkimukseen. Taulukossa 10 on esitetty yhteenveto serologisten tutkimusten tuloksista. Seitsemällä BCG-ryhmän 64 potilaasta havaittiin esiintyvän GM2-vasta-aineita sekä ELISA-määrityksellä (mediaanitiitteri 1/40) että täpläblottiim-15 munovärjäyksellä (mediaani 2+) määritettynä. Viidessä tapauksessa vasta-aineita esiintyi ennen hoitoa ja kahdessa tapauksessa vasta-aineita havaittiin ensimmäisen kerran BCG-rokotuksen jälkeen. Kolmella niistä viidestä potilaasta, joilla GM2:ta esiintyi ennen BCG-rokotusta, suurentui-20 vat GM2-vasta-ainetiitterit BCG-immunisoinnin jälkeen nelinkertaisesti tai tätä enemmän. Tästä poiketen ainostaan :T: yhdellä niistä 58 potilaasta, joille oli annettu GM2/ ·'·, BCG:tä, havaittiin GM2-reagoivuutta kummassakin määrityk- • * j .*. sessä ennen immunisointia, ja 50 potilaalla 58 potilaasta • a · · 25 havaittiin seerumista immunisoinnin jälkeen GM2-vasta-ai- • · J neita (ELISA-tiitterin mediaani oli 1/160), mikä varmis- *”,* tettiin täpläblotti-immunovärjäyksellä (mediaanitiitteri « · * * 3+). Näissä kahdessa ryhmässä esiintyvien serologisten GM2:ta vastaan suunnattujen IgM-vasteiden (täpläblottauk- ’•i.‘ 30 sessa 2+ tai 3+ ja ELISA-tiitteri ä 1/20 tai täpläblot- • · « tauksella 1+ ja ELISA-tiitteri ä 1/80) kokonaismäärä oli .***. pelkästään BCG:llä hoidettaessa 11 % ja GM2/BCG:llä hoi- • * * dettaessa 86 %.
• « • Ennen immunisointia yhdenkään potilaan seerumissa • · · l .* 35 ei havaittu igG-vasta-aineita eikä BCG indusoinut yhdessä- • · • · · • ·· ♦ · 107 ^ 1 1 7668 kään potilaassa niiden muodostumista (taulukko 10). GM2/ BCG-rokotus indusoi kahdeksalla potilaalla positiivisen IgG-vasta-ainevasteen (ELISA-tiitterin mediaani 1/80, mediaani täpläblottauksessa 2+). Nämä vasteet olivat lyhyt- s 5 kestoisia (keston mediaani 8 viikkoa) eikä seuraavat immunisoinnit yleensä lisänneet vasteen voimakkuutta. Kaikissa tapauksissa IgG-reagoivuus oli rajoittunut GM2:een (koetuloksia ei ole esitetty). Kaikilla kahdeksalla potilaalla esiintyi myös IgM-vasta-aineita, joiden tiitteri 10 oli suurempi ja vasteen kesto pitkäaikaisempi kuin IgG-vasta-aineilla.
··· ft · · • 1 • 1 • · · • · · 1 • · f · · • · · · ·· • » · • · ·« • · · * · · it1 » • 1 · ··1 • ·· • -l • ft·..· ··· • · · • ft ft • ft • ft • ft ft • t·· ft ft ft · ft · ft ft •ft···'.' ft ft • ft ft ft ft ft ft ft ft · ft ft·· ft · 108 117668
Taulukko 9 GM2-vasta-ainetiitterien vertailu ennen GM2/BCG-immunisaa-tiota ja sen jälkeen määritettynä ELISA-määrityksellä ja sytotoksisuustutkimuksilla, joissa käytettiin humaanikomp-5 lementtia
Sytotokeisuustiitteri· OD-arvo aeerumi-
IgM-tlltteri laimennoksella PMMtepisteenH PÄMtepisteenH
Potilas ELISA:saa _1/40 20 1:n hajoaminen _50_J!^Jiajoaminen_ 6 20 0,05 20 0 160 0,412 20 0 10 7 0 0,066 5 0 80 0,134 80 5 8 0 0,017 0 0 320 0,78 80 5 10 10 0,057 0 0 160 0,455 80 20 12 0 0,011 5 0 160 0,506 320+ 20 53 0 0,004 20 0 320+ 0,896 320+ 320 15 54 0 0,000 5 0 160 0,378 20 5 56 o 0,013 20 0 320 0,418 320 20 57 o 0.028 80 20 640 0,811 320 80 58 0 0,029 5 0 • J · 320 0,718 320 20 * , ‘Kohdesolut: astrosytoomasolulinja SK-MG 6.
• · · • · · • » • · • i · • ·» · "Λ ·· · • · · • · .1 • 1 f · • « · ··· • · · ♦ · · • 1 · • f · - ·1· • · • S··'· ··1 ··· • · • · ··· • · ·· · • S··.·· · • Ö ··-._ · • · · • · · S··-'· 117668 109
D
1 t + CM N N
•H C <0 O CO to φ h c
«0 ΌΗ D
^ >rj >rj p p to o e + h in m co m j3 η ·ι-)·η es h
φ Ή H
p -μ --μ C
_ ο ad p o h & :¾ ° co ' : H M " * H C Λ >i W Φ g MO Md
Φ X3 3 H ‘O
P -H ϋ O, ^ - vD t·» O· t«» 00 Γ-* ^ P -H D mo ad ^ in in in in ® m g iS H P >
X
o U ^
O ° Ij H
υ id
“ H
•H H
Π) 'ΰ — O
P ° S OJ <* , ° 0 00 O '3 U a0 X _
B) (! D ° H in N H H
\ MO H ^ H
(N MO CO H
E E -H
O 30) „ Λί-ΡΟ CO ’# O fi DC CO w ^
H Φ H MO
C MO
O c CX o Φ 0) y H CO ^Ips X m Ό C ^
3 5 -H -H
_l W #rt ti 3 .5 HO) O O (S CO ^ .
« S -H P <N H H H
... fr» I p p : : : 2 S ‘1
• 5! 04 ‘H
. . ., S P O : H CO O H (V) S *. S ' a Cl1-1 H H «H 00 • " I · ·' . ' « φ *< : .·. :I i a Sw ... · d) 3 ^ f, m n o ό 00 00 ^ ^ ... Ό '? m ^ <0 tji <s in Ί· ie id i
• · · l-J 4-1 W
I · n • * (0
.· .*. ^ I
:.: : ΰ ο i ... +i : a m 5 7 mo 00 00 ^ 00 00 -* ra m ίο in in vo vo in in vomj S g p C p 6 ΐ
O S O O) (0 D
: ;·. g Jjj a x3 e x *·· <0 Ή
,···. H MO
·...· a)·1-» e e c c ·;· e <d a) a) ® ... ,, e p φ a) p CD 0) ;: p S Q) <0* ra a: φ β ϋ «αχ
... 0)» Φ PH ΡΗΦ PH PH
· ?) C C0M0 tOMOC C0m0 (0 MO
•ί"! Grt -H D ή D n -H D n D -o
•H -n (0 -μ p (0 P P
' <8 I OC OCi oc oc :·.·. Ifl (0 Ai Φ Ji Φ Id Ai Φ AJO) :.· « p -t-1 oto o to p oto ora .. Po ra ο μ a: ihaoioo^ao ^a:
... W H φ (0 u D D (0 U D D
• : rap p >mcp e p > ra e p cp > ra o i\<uo φοι^φο φο ra Ai emcaoocaoocncaioca:
CJM o ÖlECOUCOÖlSCOOCO
E-h oi HoraamwoSHOwramwo: o e 117668 110 GM2:ta vastaan suunnattu DTH-reaktio GM2:ta ja muita antigeenejä vastaan suunnatun DTH:n määrittämiseen tarkoitetut ihotestit tehtiin kolmen ensimmäisen rokotussarjan jälkeen. Kaikille kolme rokotusta tai 5 tätä useamman rokotuksen saaneille potilaille kehittyi voimakkaat DTH-reaktiot BCG:tä vastaan. Kahdeksalla potilaalla (neljälle BCG:llä rokotetulle ja neljälle t GM2/BCG:llä rokotetulle) esiintyi positiiviset 10 -33 mm:n kovettumina ilmenneet DTH-reaktiot GM2:ta ja GM2-10 liposomeja (joita käytettiin GM2:n pitämiseen ihotesti- kohdassa) vastaan. Lisätutkimuksissa paljastui, että nämä kahdeksan potilasta reagoivat samalla tavoin gangliosidien kanssa, joissa ei ollut liposomeja, sekä muiden gangliosidien kanssa. Ei siis saatu todisteita GM2:lle spesifi-15 sestä DTH:sta yhdelläkään potilaalla.
BCG:tä vastaan suunnattu serologinen vaste
Kaikista potilaista otetuista seerumeista tutkittiin ELISA-määrityksellä IgG-molekyylien reagoivuus käyttäen 103 ELISA-levyille kuivattua elinkykyistä BCG-organis-20 mia kuoppaa kohti menetellen gangliosidien yhteydessä kuvatulla tavalla. Ennen rokotusta ei havaittu minkäänlaista :*"· reagoivuutta. Rokotuksen jälkeen seerumien BCG-vasta-aine- .‘.J tiitterien arvot olivat kummassakin hoitoryhmässä 1/40 - • · : .·. 1/80 riippumatta siitä muodostuiko potilaissa GM2-vasta- • · · • · · « 25 aineita vai ei.
• · II Vasta-ainevasteen ja immunisoinnin korrelaatio oi- • · · reettoman jakson ja eloonjääneiden potilaiden määrään • · · *·* Kuviossa 12 on esitetty oireettoman jakson pituus ja eloonjääneiden kokonaismäärä GM2-vasta-aineita muodos- . · *.:.· 30 taneilla potilailla, joilla vasta-aineiden muodostuminen ·*· :...J oli dokumentoitu kahdella määrityksellä (ELISA-tiitteri > .···, 1/180 ja täpläblotti 1+, tai ELISA-tiitteri 2 1/20 ja täpläblotti 2 2+), GM2-vasta-aineita muodostamattomiin • * • potilaisiin verrattuna. Erojen havaittiin olevan merkittä- : .* 35 vät sekä oireettoman jakson pituuden (logaritmiarvojen • · • · · • · · • · 117668 m järjestysluokkatesti, p - 0,004) että eloonjääneiden kokonaismäärän (logaritmiarvojen järjestysluokkatesti, p = 0,02) suhteen. Kuudesta ennen immunisointia GM2-vasta-ainetta muodostavasta potilaasta (joista viidelle annettiin 5 BCGrtä ja yhdelle GM2/BCG:tä) tauti kehittyi uudelleen vain yhdelle (tämä potilas kuului BCG-ryhmään), mikä viittaa siihen, että GM2-vasta-aineiden luonnollinen muodostuminen on yhteydessä edulliseen taudin kulkuun. Päinvastoin kahdeksasta potilaasta, joissa ei muodostunut GM2/BCG-ro-10 kotuksen jälkeen GM2-vasta-aineita, kehittyi melanooma uudelleen kuudelle ja he kuolivat, mikä viittaa siihen, että GM2-vasta-aineiden muodostumiskyvyn puuttuminen merkitsee huonoa ennustetta. Kuuden luonnollisesti GM2-vasta-aineita muodostavan potilaan BCG-vasta-ainetiitterien me-15 diaani oli samansuuruinen kuin kahdeksan GM2/BCG-ryhmään kuuluneen GM2-vasta-ainenegatiivisen potilaan tiitterit, mikä viittaa siihen, että nämä potilaat eivät ole erilaisia kyvyltään muodostaa serologinen vaste muuntyyppistä antigeeniä vastaan.
20 Kun nämä kuusi ennen satunnaistusta GM2-vasta-ai- neita tuottavaa potilasta (joista viisi kuului BCG-ryhmään .*·*· ja yksi GM2/BCG-ryhmään) jätettiin pois analyysistä, niin .•.j GM2/BCG-ryhmän oireeton jakso tuli merkittävästi pidemmäk- si kuin BCG-ryhmällä (logaritmiarvojen järjesty s luokka- • « · |*V 25 testin mukainen p = 0,02) ja GM2/BCG-ryhmällä havaittiin • · * l myös suuntaus suurempaa eloonjääneiden kokonaismäärää koh- • * · •*j/ ti (kuvio 13). Kuvaajat saavuttavat tasannevaiheen 40 - • · · *·* 52 kuukauden kohdalla, jolloin oireettoman jakson pituudet eroavat toisistaan 23 % ja eloonjääneiden kokonaismäärät ·.·.· 30 14 %. Koska GM2:n kanssa reagoivia IgG-vasta-aineita tuot- tavien potilaiden lukumäärä on pieni, niin on mahdotonta ,·*·. tehdä mitään johtopäätöstä GM2:ta vastaan suunnattujen • « ***. IgM- tai IgG-vasta-aineiden suhteellisista eduista. Tällä ····· , hetkellä kahdeksasta GM2-IgG-vasta-ainepositiivisesta po- Φ · · • *#! 35 tilaasta viisi on oireettomia.
• · • ♦ · • ·· • · 117668 112 Näiden kahden hoitoryhmän välinen vertailu satunnaistettuina ryhminä on esitetty kuviossa 14. Kuvaajat saavuttavat tasannevaiheen 40 - 52 kuukauden kohdalla, jolloin oireettoman jakson pituudet eroavat 18 % ja eloon-5 jääneiden kokonaismäärät eroavat 11 % GM2/BCG-rokotuksen eduksi. Nämä erot eivät olleet tilastollisesti merkittäviä. BCG-ryhmällä ovat 51 kuukauden kohdalla (joka on lyhin seuranta-aika) oireetonta jaksoa kuvaava arvo (30 %) ja eloonjääneiden kokonaismäärää kuvaava arvo (46 %) sa-10 manlaisia verrattuina arvoihin, joita tämän keksinnön tekijät ovat aikaisemmin havainneet potilailla, jotka oli jaettu satunnaisesti joko BCG:tä tai ei lainkaan hoitoa saaviin ryhmiin (28). Kuviosta 14 käy ilmi, että immunisoinnin edullinen vaikutus oli selvempi, kun nämä kak-15 si hoitoryhmää luokiteltiin positiivisten imusolmukkeiden lukumäärän (1 verrattuna 2teen tai useampaan positiiviseen) suhteen. Immunisoinilla ei ollut yhtä suurta vaikutusta oireetonta jaksoa kuvaaviin lukuihin potilailla, joilla oli vain yksi positiivinen imusolmuke. Sitä vastoin 20 potilailla, joilla oli kaksi tai useampia positiivisia imusolmukkeita ja jotka saivat GM2/BCG-hoitoa, oli oireet-:***· toman jakson pituus merkittävästi pidempi kuin pelkästään BCG:llä immunisoiduilla potilailla (logaritmiarvojen • · : .·, järjestysluokkatestillä mukainen p * 0,02). Eloonjääneiden • · t 25 määrässä havaittiin samanlainen suuntaus (logaritmiarvojen i J järjestysluokkatestin mukainen p 0,08). - "I,· Pohdinta * · · Tämän keksinnön tekijät ovat suunnanneet suuren työpanoksen sellaisten gangliosidirokotteiden kehittämi-30 seksi, jotka saavat aikaan suurten seerumivasta-aine- *·· määrien syntymisen (18, 19), koska 1) gangliosidit ovat .**·. tärkein ryhmä melanoomasolujen solun pinnan muodostavista molekyyleistä (14, 20 - 25), 2) melanoomaa sairastavista • · . potilaista voidaan suhteellisen usein eristää ganglio- • · · : .· 35 sideille spesifisiä monoklonaalisia humaanivasta-aineita • · • ♦ · * # · ♦ # 117668 113 (14, 25 - 28) ja 3) gangliosideja vastaan suunnatut vasta-aineet voivat humaanikomplementin läsnä ollessa hajottaa gangliosidiantigeenejä ilmentäviä ihmisen tuumorisoluja (13, 29). GM2-gangliosidin on havaittu olevan ihmisillä 5 erityisen hyvin immunogeeninen ja on osoitettu, että puhdistettua GM2:ta ja adjuvanttina käytettyä BCG:tä sisältävät rokotteet saavat aikaan etukäteen pienellä syklo-fosfamidiannoksella hoidetuissa melanoomapotilaissa GM2-vasta-aineiden syntymisen (8, 9). Tässä keksinnössä rapor-10 toidun tutkimuksen oli tarkoitus vastata kahteen kysymykseen - indusoiko rokottaminen GM2/BCG-rokotteella GM2-vas-ta-aineiden muodostumista suurella osalla melanooma- : potilaista ja muuttaako GM2-vasta-aineiden indusoituminen taudin kulkua kaiken tiedetyn tuumorikudoksen poistamisen 15 jälkeen levinneisyysasteen lii melanoomaa sairastavilla potilailla.
GM2-vasta-aineiden muodostumisen aikaansaamisen kyseessä ollessa oli GM2/BCG suurimmalla osalla potilailla selvästi tehokas. 58:sta GM2/BCG-rokotetta saaneesta poti-20 laasta 50:ssä muodostui GM2-vasta-aineita, jotka havaittiin sekä ELISA-määrityksellä että täpläblotti-immuuni-iTi värjäysmäärityksillä. Aikaisempien kokemusten tavoin (9) ·**,· indusoituneet vasta-aineet kuuluivat pääasiassa IgM-luok- • » ϊ .*. kaan; IgG-vasta-aineita ei havaittu aivan niin usein. Täs- • · * * 25 sä keksinnössä varmistettiin myös korrelaatio GM2-vasta- * * * · • .*. aineiden muodostumisen ja edullisen kliinisen taudinkulun • · « ]*!.* välillä (9) ja tämä korrelaatio laajennettiin koskemaan * · * ’ oireettomista levinneisyysluokan AJCC XII melanoomaa sai rastavista potilaista koostuvaa aikaisempaa homogeeniseni- • · · **" 30 paa populaatiota. GM2-vasta-aineita (joko luonnollisesti • * · • * *·..* esiintyviä tai rokotteella indusoituja) tuottavien poti- :***· laiden oireeton jakso oli merkittävästi pidempi ja eloon- ··« ·...: jääneiden kokonaismäärä suurempi kuin potilailla, joilla ei havaittu lainkaan vasta-ainevastetta. Tässä potilas- • · · \ 35 sarjassa kuudella potilaalla havaittiin jo aikaisemmin • · f • ·* • » 117668 114 muodostunutta (ennen rokotusta muodostunutta) GM2-vasta-ainetta ja siihen vaikutti liittyvän erityisen hyvä ennuste. Koska spontaanin GM2-vasta-ainemuodostuksen insidenssi vaikuttaa melanoomapotilailla olevan samanlainen (10 %) 5 kuin populaatiossa yleensä (8, 9), niin sen suhde melanooman kehittymiseen ja kasvuun jää selvittämättä. On mainitsemisen arvoista, että ennalta olemassa olleiden GM2-vas-ta-aineiden tiitteri ei muuttunut yhdeksän kuukauden seuranta-ajan kuluessa, kun taas rokotteen indusoimien GM2-10 vasta-aineiden määrä pysyi havaittavana yleensä vain 8 -12 viikon ajan rokotuksesta. Tämän havainnon perusteella on mahdollista, että vasta-aineen tuotannon säilymisellä saattaa olla merkitystä edullisen kliinisen taudinkulun kannalta ja se osoittaa, että on olemassa tarve kehittää 15 GM2-rokotteita, jotka saavat aikaan pitkäkestoisia GM2-vasta-ainevasteita. GM2-vasta-ainetta muodostavista rokotetuista potilaista poiketen niissä 8 potilaassa, joissa ei muodostunut GM2/BCG:tä, taudin havaittiin etenevän erityisen nopeasti niin, että taudin uusiutuminen havaittiin 20 tavallisesti jo ennen kuin kaikki sarjan viisi rokotusta j oli ehditty antaa. Näiden potilaiden muut ennusteeseen :*·*· vaikuttavat tekijät eivät olleet huonompia kuin muilla .'.J potilailla eikä heidän vasta-ainevasteensa BCGrtä vastaan • · j ,·. ollut heikompi kuin GM2-vasta-ainepositiivisten potilaiden ·*« · ··,·, 25 vaste, mikä osoittaa, ettei taustalla olevana mekanismina • · j ^ ollut immuunivasteen yleinen vaimentuminen.
• · · "*,* GM2:ta vastaan suunnattujen vasta-aineiden muodos- • · · *·* * tumisen ja hyvän ennusteen välisen yhteyden olemassaoloa j on ehdotettu myös tutkimuksissa, joita on tehty 0FA-l:ksi 30 nimitetyllä antigeenillä (31), joka on monissa melanoomis- ··· sa ilmentyvä solun pinta-antigeenisysteemi. On olemassa * .···. runsaasti todisteita siitä, että vasta-aineiden reagoivuus OFArta vastaan on pääasiassa suunnattu GM2-gangliosidia • · . vastaan (30, 25). Eloonjäämisajan oli havaittu olevan pi- • •e ; .* 35 dempi potilailla, joilla 0FA-I:tä vastaan suunnatut IgM- ♦ · • » · • · · • · 117668 115 tiitterit ovat kohonneet joko ennen immunisointia tai sä-teilytetyillä melanoomasoluilla tehdyn immunisoinnin jälkeen (31).
Sen lisäksi, että tämä tutkimus vahvistaa sitä kä-5 sitystä, että GM2-vasta-aineet liittyvät melanoomapotilai-den hyvään ennusteeseen, niin tämä tutkimus valottaa myös satunnaistettujen rokotetutkimusten suunnittelussa esiin tulevia ongelmia. Näiden kahden satunnaistetun hoitoryhmän välinen ero hämärtyi siihen pisteeseen asti, ettei 10 GM2/BCG-ryhmän saama terapeuttinen hyöty ollut merkittävä, koska kontrolliryhmässä oli viisi potilasta, joilla oli jo ennalta muodostuneita GM2-vasta-aineita, kun taas GM2/BCG-ryhmässä tällaisia potilaita oli vain yksi. Selvästikin tulevissa tutkimuksissa potilaat, joilla esiintyy ennalta 15 muodostuneita GM2:ta vastaan suunnattuja vasta-aineita, on jätettävä pois tutkimuksesta tai ainakin erotettava omaksi ryhmäkseen. Yhtä tärkeää on tarve lisätä rokotteen immuno-geenisyyttä. Tältä osin ovat tämän keksinnön tekijät tutkineet lähestymistapoja, joita on suotuisin tuloksin tut-20 kittu bakteeri-infektioita vastaan suunnattujen hiilihyd-raattirokotteiden yhteydessä (näistä tutkimuksista on esi-tetty katsaus lähdeviitteessä 32), mukaan luettuna gang- :*·.· liosidin kemiallinen muokkaaminen, minkä tarkoituksena on • · J .*. saada aikaan näitä läheisesti muistuttavia yhdisteitä (33, • · · * :v. 25 34), gangliosidien konjugoiminen immunogeenisiin proteii- : .·. nikantaja-aineisiin (35) sekä tehokkaampien adjuvanttien • · * jlj/ käyttö (36). Tämän keksinnön tekijöiden tehokkaimmaksi havaitsema lähestymistapa on ollut GM2:n konjugoiminen reikäkotilon hemosyaniiniin (KLH) ja GM2-KLH-konjugaatin • · · *·ί.* 30 antaminen yhdessä adjuvanttina käytetyn QS-21:n (joka on *...· Saponaria Quillajasta peräisin oleva saponiiniuute) kans- sa. Melanoomapotilailla tehdyssä esitutkimuksessa tämän • « · ....: rokotteen antaminen sai aikaan huomattavasti suurempia GM2:ta vastaan suunnattuja IgM-vasta-ainetiittereitä kuin • · · • ·* 35 mitä oli muodostunut GM2/BCG:n antamisen jälkeen, ja tätä- • · • · · • · 117668 116 kin tärkeämpi näkökohta on, että tämä sai aikaan yhdenmukaisen IgG-luokkaan kuuluvien GM2:ta vastaan suunnattujen vasta-aineiden muodostumisen, mikä merkitsee, että T-so-luista riippumaton vasta-ainevaste muuttui T-soluista 5 riippuvaiseksi vasteeksi (37).
Vielä yhtenä lähestymistapana tässä keksinnössä kuvatun GM2/BCG-rokotteen kliinisen tehon parantamiseksi voisi olla muiden immunogeenisten melanoomagangliosidien liittäminen rokotteeseen. Hiirillä tehdyt kokeet viittaa-10 vat myös melanoomapotilailla toistaiseksi erittäin vähän immunogeeniseksi osoittautuneen GD3:n, joka on vielä edellä kuvattua suuremmassa määrin ilmentyvä melanoomagang-liosidi, immunogeenisyyden paranevan, kun se konjugoidaan KLH:hon ja sen kanssa käytetään QS-21-adjuvanttia (35).
15 Jos nämä havainnot voidaan varmistaa ihmisillä tehtävissä tutkimuksissa, niin tämän keksinnön tekijöillä voi olla hallussaan perusteet sellaisen polyvalenttisen gangliosi-dikonjugaattirokotteen konstruoimiseksi, jossa on useita tärkeitä melanoomagangliosideja, ja tällä tavoin voidaan 4 20 kiertää ihmisen melanoomissa havaittu gangliosidien ilmentymisessä vallitseva heterogeenisyys. Tämän keksinnön te-:*·*♦ kij öiden mielestä tässä keksinnössä raportoidun tutkimuk- : sen tulokset oikeuttavat tätä lähestymistapaa koskevat * · : .·. jatkotutkimukset.
·«· • · · · • · · • · · * · • · • * * * · · » ·*· • · · ··· * • · · ···.' • · · • · · • * • · · * .
**· ♦ · • · • · · Φ * * · · • · 1 2 « .. .
* 2 * · • · * · ···'' • * · • · 117668 117
Ensimmäisen ja toisen koesarjan kirjallisuusluettelo 1. Apple, R.J., Donien, P.L., Muckerheide, A. & Michael,
J.G. (1988). Cationization of Protein Antigens: IV
5 Increased Antigen uptake by_ Antigen Presenting
Cells. J. Immunol. 40: 3290.
2. Berd, D., Mastrangelo, M.J., Engström, P.F., Paul, A. and Maguire, H. (1982) Augmentation of the human 10 immune response by cyclophosphamide. Cancer Res.
42: 4862.
3. Borch, R.F., Bernstein, M.D. and Durst, H.D. (1971).
The cyanohydridobroate anion as a selective reducing 15 agent. J. American. Chem. Soc. 93:2897.
4. Cahan, L.D., Irie, R.F., Singh, R., Cassidenti, A., and Paulson, J.C. (1982) Identification of a Human Neuroectodermal Tumor Antigen (OFA-I-2) as :T: 20 ganglioside GD2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7629.
• « • e'.'·. '1 • · · 5. Carubia, J.M., Yu, R.K., Macala, L.J., Kirkwood, # · • J.M., Varga, J.M. (1984). Gangliosides of Normal and * · · *!*.* 25 Neoplastic melanocytes. Biochem. Biophs. Res. Comm.
*♦···. * '1 * 120: 500.
*·!.*’ 6. Chang, S.P. and Rittenberg, M.B. (1981).
··· i.
•,..* Immunologic memory to phosphorylcholine in vitro.
* .1·. 30 I. Asymmetric expression of clonal dominance. j.
....: Immunol. 126: 975.
* · • · · ♦ · · • ·* 7. Criegee R. (1957) The course of ozonization of • · ·*.*♦: unsaturated compounds. Record of Chemical Progress.
35 18: 111.
117668 ns 8. Donnelly, J.J., Deck, R.R., & Liu, M.A. (1991).
Adjuvant activity of the outer membrane protein complex of neisseria meningitidis sergroup B for a polysaccharide-protein conjugate. Vaccines 91. Cold 5 Spring Harbor Laboratory Press. 403.
9. Eilber, F.R., Morton, D.L., Holmes, E.C., Sparks, F.C. and Ramming, K.P. Adjuvant immunotherapy with BCG in treatment of regional-lymph-node metastases 10 from malignant melanoma. N. Engl. J. Med. 194:237- 240, 1976.
10. Eskola, J., Kayrty H., Takaia, A.K., Peltola , H., Ronneberg, P.R. Kha, E., Pekkanen, E., Mcverry, P.H.
15 and Makela, P.H. (1990). A Randomized Prospective
Field Trial of a Conjugate Vaccine in the Protection of Infants and Young Children Against Invasive Haemophilus Influenza Type b Disease. N. Engl. J. Med. 323:1381.
20 V * 11. Gray, G.R. (1974). The Direct Coupling of
Oligosaccharides to Proteins and Derivatised Gel.
• Arch. Biochem. Biophys. Acta. 163: 426.
··· · • · a • · • · • · ϊ .·. 25 12. Gray, G.R. (1978). Antibodies to Carbohydrates: • · · [···! Preparation of Antigens by Coupling Carbohydrates to • * ·
Proteins by Reductive Amination With . cyanoborohydribe. Methods Enzymol. 50: 155.
• * ··· • · · • · *...* 30 13. Hakomori, S. I. (1985). Aberrant Glycosylation in
Cancer Cell Membranes as Focused on Glycolipides: ....: Overview and Perspective. Cancer Res. 45: 2405.
a · · 14. Hamilton, W.B., Helling, F., Lloyd, K.O., 35 Livingston, P.O. (1993). Gangliosides Expression on 117668 119
Hunan Malignant Melanoma Assessed by Quantitative Immune Thin Layer Chromatography. Jnt. J. Cancer 53:1.
5 15. Hilal# E.Y., Pinsky, C.M., Hirshaut, Y., Wanebo, H.J., Hansen, J.A., Braun, D.W. Jr.,.Fortner, J.G., and oettgen, H.F. (1981). Surgical adjuvant therapy of malignant melanoma with Corynebacterium Parvum. Cancer 48:245.
1° ' 16. Houghton, A.N., Mintzer, D., Cordon-Cardo, C., Welt, S., Fliegel, B., Vadhan, S., Carswell, E., Melamed, M.R., Oettgen, H.F. & Old, L.J. (1985). Mouse Monoclonal IgG3 Antibody Detecting GD3 Ganglioside: 15 A Phase I trial in Patients with Malignant Melanoma.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1242.
17. Itonori, S., Hidari, K., Sanai, Y., Taniguchi, M. & Nagai, Y. (1989). Involvement of the Acyl Chain of 20 Ceramide in Carbohydrate Recognition by an Anti- ;*!*; glycolipid Monoclonal Antibody: The Case of an Anti- : Melanoma Antibody, M2590, to GM3-Ganglioside.
:*.·! Gly cocon jugate J. 6: 551.
I · < ····- • * · • · a \ 25 18. Kanfer, J.N. & Hakomori, S. (1983) . Sphingolipid » · ·
Biochemistry. In: Hanahan, D.J. Handbook of Lipid • · ♦ *·* Research. New York: Plenum Press.
!..V 19. Kensil, C.R., Patel, U., Lennick, M. and Marciani, 30 D. (1991) Saponin adjuvants from Quillaja saponaria .···. Molina. J. Immunol. 146:431.
• · ·* * · · • * . 20. Kundu, S.K., Marcus, D.M. and Veh, R.w. (1980).
: Preparation and properties of antibodies to GD3 and • · :.**i 35 GM1 gangliosides. J. Neurochem. 34:184.
117668 120 21. Landsteiner, K. & Chase, M.W. (1942). Experiments on Transfer of cutaneous Sensitivity to Simple Compounds. Proa. Soe. Exp. Biol. Med., 49, 688.
5 22. Livingston, P.0. (1989) The basis for ganglioside vaccines in melanoma. IN: Human Tumor Antigens and
Specific Tumor Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, R. Metzgar and M. Mitchell (eds.), Alan R. Liss, Inc., New York, N.Y. Volume 10 99: 287.
23. Livingston, P.0. (1991). Active specific immunotherapy in the treatment of cancer. In: Oettgen, H.F. (Ed.) Immunolgy and Allergy Clinics of 15 North America: Human Cancer Immunology II. London, U.K.: W.B. Saunders Co. Voi. II: 2, 402-423.
24. Livingston, P.O., Calves, M.J., Helling, F.
Zollinger, W.O., Blake, M.S. and Lowell, G.H.
20 (1993b). GD3/proteosome vaccine induce consistent
IgM antibodies against the ganglioside GD3.
: Vaccine. In Press.
• ·« • · * ···
• I I
25. Livingston, P.O., Cunningham-Rundles, S., Marfleet, * « ; 25 G. , Gnecco, C. , Wong, G.Y., Schiffman, G., Enker, *".* W.E. and Hoffmann, M.K. (1987) Inhibition of • · · : * suppressor cell activity by cyclophosphamide in patients with malignant melanoma. J. Biol. Resp.
:.:V Mod. 6:392.
··· J...: 30 Φ 26. Livingston, P.O., Natoli, E.J. Jr., Calves, M.J., ....: Stockert, E., Oettgen, H.F. and Old, L.J. (1987).
• ·
Vaccine containing purified GM2 ganglioside elicit • · · • ·* GM2 antibodies in melanoma patients. Proc. Natl.
9m· :.**i 35 Acad. Sci. USA, 84:2911.
121 ' ' 117668 27. Livingston P.O., Ritter G. and Calves M.J. (1989)
Antibody response after immunization with the ganglioside GM1, GM2, GD2 and GD3 in the mouse.
Cancer Immunol. Immunother. 29:179-184.
5... ...
28. Livingston, P.O., Ritter, G. Srivastava, P.,
Padavan, M., Calves, M.J., Oettgen, H.F. and old, L. J. (1989). Characterization of IgG and IgM antibodies induced in melanoma patients by 10 immunization with purified GM2 ganglion. Cancer
Res. 49: 7045.
29. Livingston, P.O., Watanabe, T., Shiku, H., Houghton, A.N., Albino, A., Takahashi, T., Resnick, L.A., 15 Michitsch, R., Pinsky, C.M., Oettgen, H.F. and Old, L.J. (1982) Serological response of melanoma patients receiving melanoma cell vaccines: I.
autologous cultured melanoma cells. Int. J. Cancer 30:413-422.
20 30. Livingston, P.O., Wong, G.Y., Adluri, S., Tao, Y.,
Padavan, M., Parente, R., Hanlon, C., Calves, M.J., • · : Helling, F., Ritter, G., Oettgen, H.F., & Old, L.J.
··,·! (1993a) A Randomized Trial of Adjuvant Vaccination • 1 ) I 25 with BCG Versus BCG Plus the Melanoma Ganglioside GM2 in AJCC Stage III Melanoma Patients. In • J ♦ • Preparation.
• . - • · · *·!·2 31. Longenecker, B.M., Willans, D.J., MacLean, G.D., et 30 al. (1987). Monoclonal antibodies and synthetic .3. tumor-associated glycoconjugates in the study of the ,,..: expression of Thomsen-Friedenreich-like ant Tn-like h,i antigens on human cancers. JNCI 78:489.
* · · • · • » · • · · 2 • I1 3 • · 117668 32. Lowell, G. H., Ballou, w.R., Smith, L. F. Wirtz, R.A., Zollinger, W.D. & Hockmeyer, W.T. (1988). Proteosome-Lipopeptide Vaccines: Enhancement of
Immunogenicity for malaria CS peptides. Science 5 240:800.
33. Marciani, D.J., Kensil, C.R., Beltz, G.A., Hung, C.H., Cronier, J., and Aubert, A. Genetically engineered subunit vaccine against FeLV: protective 10 immune response in cats. Vaccine 9:89.
34. MacLean, G.D., Bowen-Yacyshyn, M.B., Samuel, J.,
Meikle, A., Stuart, G., Nation, J., Poppema, S., Jerry, M., Koganty, R., Wong, T. & Longenecker, B.M.
15 (1992) . Active Immunization of Human Ovarian Cancer
Patients Against a Common Carcinoma (Thomsen-Friedenreich) determinant using a Synthetic
Carbohydrate Antigen. J. Immunotherapy 11: 292.
20 35. Neuenhofer, S., Schwarzmann, G., Egge, H. & «·· V * Sandhoff, K. (1985). Synthesis of Lysogangliosides.
Biochem. 24: 525.
• · • * ·
• I
• · · · !·.·. 36. Nores, G., Dohi, T., Taniguchi, M. & Hakomori, S.-I.
• · * 25 (1987). Density-Dependent Recognition of Cell • · a ,···] Surface GM3 by a Certain Anti-Melanoma Antibody, and * · · GM3 Lactone as a Possible Immunogen: Requirements . for Tumor Associated Antigen and Immunogen. J.
'···* Immunol., 139 IX: 3171.
*·· !·»: 30 * :**'· 37. Old, L.J. (1981). Cancer immunology: The search for I·* ....: specificity-G.H.A. Clowes Memorial Lecture. Cancer
Res., 41:361.
···· • » • · • · ··· *·· * * 117668 123 38. Pappas, J.J., Keaveneiy, W.P., Gaucher, E., and Melvin, B (1966). A new and convenient method for converting olefins to aldehyde. Tetrahedron Letters, 36:4273.
5 39. Ritter, G., Boosfeld, E., Adluri, R.., Calves, M.,
Oettgen, H.F., Old, L.J. & Livingston, P.O. (1991).
Antibody Response to Immunization with Ganglioside GD3 and GD3 Congeners (Lactones, Amide and 10 Gangliosidol) in Patients with Malignant Melanoma.
Int. J. Cancer, 48: 379.
40. Ritter, G., Boosfeld, E., Markstein, E., Yu, R.K.,
Ren, S., Oettgen, H.F., Old, L.J. and Livingston, 15 P.O. (1990a). Biochemical and serological characteristics of natural 9-O-acetyl GD3 from human melanoma and bovine buttermilk and chemically O-acetylated GD3. Cancer Res. 50: 1403.
20 41. Ritter, G., Boosfeld, E., Calves, M.J., Oettgen, :*·*. H.F., Old, L.J. and Livingston, P.O. (1990b).
•\t: Antibody response after immunization with • gangliosides GD3, GD3 lactones, GD3 amide and GD3 ··· j'V gangliosidol in the mouse. GD3 lactone I induces *, ! 25 antibodies reactive with human melanoma. '?
• · I
Immunhiology 182: 32.
• · · * · · 42. Romball, G.C. and Weigle, W.O. (1984). T cell competence to heterologous and homologous • · · ·,,,· 30 thyroglobulins during the induction of experimental ,···. autoimmune thyroiditis. Eur. J. Immunol. 14: 887.
I · • « · ····· • · . 43. Roy, R. and Lafferiere, C.A. (1990) Michael Addition ·· · ϊ ',· as the Key Step in the Syntheses of.
• · 35 Sialyloligosaccharide-Protein Conjugates from N- 117668 124
Acroloylated Glycopyranosylamines. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1709.
44. Svennerholm, L. (1957). Quantitative estimation of 5 sialic acids -II. Colorimetric resorcinol- hydrochloric acid method. Biochea. Biophys. Acta. 24: 604.
45. Tam, J.P. (1988). Synthetic Peptide Vaccine Design: 10 Synthesis and Properties of a High-Density Multiple
Antigenic Peptide System. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5409.
46. Tam, J.P. & Lu, Y. (1989). Vaccine Engineering: 15 Enhancement of Immunogenicity of Synthetic Peptide
Vaccines Related to Hepatitis in Chemically Defined Models Consisting of T-and B-Cell Epitopes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9084.
20 47. Teale J.M. and Abraham K.M. (1987) The regulation of
• M
ϊ,ϊ t antibody class expression. limun. Today 8:122.
• · • · ) • ·* * * * ·*: 48. Tsuchida, T., Saxton, R.E., Morton, D.L. & Irie, ··· » R.F, (1987). Gangliosides of Human Melanoma. J.
• .·. 25 Natl. Cancer Inst. 78 I : 45.
* · I ··« I
• · · 49. Nicolai H., Muller H.E., Zilliken F. (1978) . Substrate Specificity of Neuraminidase from • · · *;j;* Erysipelothrix rhusiopathiae. Hoppe-Seyler's Z.
'···* 30 Physiol. Chem. 359: 393.
• e· * · • · • ....: 50. Wiegandt, H. & Baschang, G. (1965) . Die Gewinnung des Zuckeranteils der Glykosphingolipde durch
I » I
^ ·* Ozonolyse und Fragmentierung. z. Naturforschung, 35 20b: 164.
. . . 125 117668 51. Weight, w.o. (1977) Autoimmunity: Genetic,
Immunologic, Virologic and Clinical Aspects. New
York, Academic: 141.
5 5 52. Yamaguchi, H., Furukawa, K., Fortunato, S.,
Livingston, P.O., Lloyd, K.O., Oettgen, H.F. & Old, L.J. (1987) Cell-surface Antigens of Melanoma Recognized by Human Monoclonal Antibodies. Proc.
10 Natl. Acad. Sci. USA 84: 2416.
10
Kolmannen koesarjan kirjallisuusluettelo 1. Hakomori, s. I. 1985. Abberant glycosylation in cancer cell membranes as focused on glycolipides; 15 Overview and perspectives. Cancer Res. 45:2405.
2. Carubia, J. M., R. K. Yu, L. J. Mascala, J. M.
Kirkwood, and J. M. Varga. 1984. Gangliosides on normal and Neoplastic melanocytes. Biochem. Biophys.
20 Res. Comm. 120:500.
*·· • · · • · · • · 3. Hamilton, W. B., F. Helling, K. 0. Lloyd, and P. O, jj : Livingston. 1993. Ganglioside expression on human j*·*: malignant melanoma assessed by quantitative immune *•25 thin layer chromatography. Int. J. cancer. 53:i.
* · · • * · 4. Tsuchida, T., R. E. Saxton, D. L. Morton, and R. F.
, ,., Irie. 1987. Gangliosides of human melanoma. J. Natl.
• · · XI Cancer Inst. 78 1:45.
so *·· Σ,,.ϊ 5. Livingston, P. 0., E. J. Jr. Natoli, M. J. Calves, *:·*: E. Stockert, H. F. Oettgen, and L. J. Old. 1987.
Vaccines containing purified GM2 ganglioside elicit \\ GM2 antibodies in melanoma patients. Proc. Natl.
** *: 35 Acad. Sci. USA 84:2911.
i : 126 117668 6. Livingston, P. 0., G. Ritter, P. Srivastava, M. J.
Calves, H. F. Oettgen, and L. J. Old. 1989. Characterisation of IgG and IgM antibodies induced in melanoma patients by immunization with purified 5 GM2 ganglioside. Cancer Res. 49:7045.
7. Livingston, P. 0., G. Y. Hong, S. Adluri, Y. Tao, M.
Padavan, R. Parente, c. Hanlon, M. J. Calves, F.
Helling, G. Ritter, H. F. Oettgen, and L. J. Old.
10 1994. Improved survival in AJCC stage III melanoma patients with GM2 antibodies: A randomized trial of adjuvant vaccination with GM2 ganglioside. J. Clin.
Oncol, in press.
15 8. Livingston, P. 0. 1989. The Basis for ganglioside vaccines in melanoma. In Human tumor antigens and specific tumor theraphy. vol. 99. R. Metzgar and M.
Mitchell, eds. Alan R. Liss. Inc., New York, NY, p. I
287.
20 ' ·*,.*: 9. Helling, F., A. Shang, M. J. Calves, S. Zhang, S.
:\j Ren, R. K. Yu, H. F. Oettgen, and P. 0. Livingston.
• ·'· 1994. GD3 vaccines for melanoma: Superior immunogenicity of KLH conjugate vaccines. Cancer • » : .·. 25 Res. in press.
• · ♦ 1 2 3 · · ··· 10. Kensil, C. R., U. Patel, M. Lennick, and D.
. Marciani. 1991. Separation and characterization of • · « 2 j*‘ saponins with adjuvant activity from Quillaja * · *··.* 30 saponaria Molina Cortex. J. Immunol. 146:431.
3 • * • · ....: 11. Newman, M. J., J.-Y. Hu, B. H. Gardner, K. J.
Murroe, D. Leombruno, J. Recchia, C. R. Kensil, and ^*1 R. T- Coughlin. 1992. Saponin Adjuvant Induction of • · · • * · • · 117668
Ovalbumin-specific CD8+ Cytotoxic T-Lymphocyte Responses. J. Immunol. 148:2357.
12. Cahan, L. D., R. F. Irie, R. Singh, A. Cassidenti, 5 and J. C. Paulson. 1982. Identification of a neuroectodermal tumor antigen (OFA-I-2) as ganglioside GD2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7629.
13. Dippold, W. G., K. 0. Lloyd, L. T. Li, H. Ikeda, H.
10 F. Oettgen, and L. J. Old. 1980. Cell surface antigens of human malignant melanoma: definition of six antigenic systems with monoclonal antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:6114.
15 14. Hawkes, R., E. Niday, and J. A. Gordon. 1982.
Dot-imunebinding assay for monoclonal and other antibodies. Anal. Biochem. 119:142.
15. Basten, A., and J. G. Howard. 1973. Thymus 20 independence. In Contemporary Topics in : Immunobiology. A. J. s. Davies, ed. Plenum Press, V1: New York, Vol. 2, p. 265.
• · • · ♦ • · · ··· 1 Γ·]: 16. Hosier, D. E., and A. J. Feeney. 1987. The • :1; 25 physiology of B Lymphocytes capable of generating • 4 · · anti-polysaccharide antibody responses. In Towards Better Carbohydrate Vaccines. R. Bell, and G.
• Torrigiani, eds. J. Wiley & Sons Ltd, London, Great • · · · .
Ill Britain, p. 243.
• · • « *:1 30 »·· ϊ.,.ϊ 17. Jennings, H. J., F. E. Ashton, A. Gamian, F. Michon,
*t2: and R. Roy. 1987. A chemically modified Group B
iv. meningococcal polysaccharide vaccine. In Towards • · ' !·/. Better Carbohydrate vaccines. R. Bell, and G.
• 1♦ • · 2 117668 128
Torrigiani, eds. J. Wiley & Sons Ltd, London, Great Britain, p. 11.
18. Schneerson, R., J. B. Robbins, S. c. szu, and Y.
5 Yang. 1987. Vaccines composed of polysaccharide-protein conjugates: current status, unanswered questions, and prospects for the future.
In Towards Better Carbohydrate Vaccines. R. Bell, and G. Torrigiani, eds. J. Wiley & Sons Ltd, London, 10 Great Britain, p. 307.
19. Gey sen, H. M., R. Macfarlan, S. J. Rodda, G.
Tribbick, T. J. Mason, and P. Schoofs. 1987.
Peptides which mimic carbohydrate antigens. In 15 Towards Better Carbohydrate Vaccines. R. Bell, and G. Torrigiani, eds. J. Wiley & Sons Ltd, London,
Great Britain, p. 103.
20. Soederstroem, T. Anti-idiotypes as surrogate 20 polysaccharide vaccines. 1987. in Towards Better ee# v1 Carbohydrate vaccines. R. Bell, and G. Torrigiani, • * \*·: eds. J. Wiley & Sons Ltd, London, Great Britain, p.
: 119.
··· · ·· · ·'-! • · · • · • · : ·*: 25 21. Landsteiner, K., and M. w. Chase. 1942. Experiments ··· ♦ .*:·. on transfer of cutaneous sensitivity to simple compounds. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 49:688.
• i * · · • · · 22. Avery, O. T., and W. F. Goebel. 1929.
• ♦ T 30 Chemo-inununological studies on conjugated ··· carbohydrate-proteins. J. Exp. Med. 50:533.
*«··! • · ··)·. 23. Schneerson R., 0. A. Barrera, and J. B. Sutton.
• ♦ *./. 1980. Preparation, characterization, and * · · ’ * 35 immunogenicity of Haemophilus influenzae type b 117668 129 polysaccharide protein conjugates. J. Exp. Med.
152:361.
24. Lepov, M. L., J. S. Samuel son, and L. K. Gordon.
5 1985. Safety and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b-polysaccharide diphtheria toxoid conjugate vaccine in infants 9 to 15 months of age.
J. Pediatr. 106:185.
10 25. Chu, C. Y., R. Schneerson, J. B. Robbins, and S. C.
Rastogi. 1983. Further studies on the immunogenicity of Haemophilus influenzae type b and pneumocococcal type 6A polysaccharide protein conjugates. Inf.
Immun. 50:245.
15 26. Marburg, S. D. Jörn, L. Tolman, B. Arison, J.
McCauley, P. J. Kniskern, A. Hagopian, and P. P.
Vella. Biomolecular chemistry of macromolecules: synthesis of bacterial polysaccharide conjugates i 20 with Neisseria meningitidis membrane protein. J. Am.
··· V : Chem. Soc. 108:5282.
• · • 1 * * ·» ** • · :#: : 27. Anderson, P. 1983. Antibody response to Haemophilus :***: influenzae type b and diphtheria toxin induced by • :1; 25 conjugates of oligosaccharides of the type b capsule *·· · .
with the nontoxic CRM 197. Inf. Immun., 39:233.
* · · r * , .·, 28. Turner, R. B., C. 0. Cimino, and B. J. Sullivan.
* 1 · 1991. Prospective comparison of the immune response * · "1 30 of infants to three Haemophilus influenzae type b ··· :...ϊ vaccines. Pediatr. Infect. Dis. J. 10:108.
*··1· • · 29. Anderson, P., M. E. Pichichero, and R. A. Insel.
• · *. 1. 1985. Immunogens consisting of oligosaccharides from • · · 35 the capsule of Haemophilus influenzae type b coupled 117668 130 to diphtheria toxoid or CRM 197. J. Clin. Invest. 76:52.
30. Weinberg, 6. A., M. S. Einhorn, A.A. Lenoir, P. D.
5 Granoff, and D. M. Granoff. 1987. Immunologic priming to capsular polysaccharide in infants immunized with Haemophilus influenzae type b polysaccharide-Neisseria meningitidis outer membrane protein conjugate vaccine. J. Pediatr. 118:22.
10 31. Ritter, G., E. Boosfeld, R. Adluri, M. Calves, H. F. Oettgen, L. J. Old, and P. 0. Livingston. 1991. Antibody response to immunization with ganglisoside GD3 and GD3 congeneres (lactones, amide and 15 gangliosidol) in patients with malignant melanoma.
Int. J. Cancer 48:379.
32. Ritter, G., E. Boosfeld, M. J. Calves, H. F. Oettgen, L. J. Old, and P. 0. Livingston. 1990.
20 Biochemical and serological characteristics of • »· *.1 ' natural 9-0-acetyl GD3 from human melanoma and * · ·.1·· bovine buttermilk and chemically 0-acetylated GD3.
::: Cancer Res. 50:1403.
• 1 · · • · · # 1 · • · • · • 25 33. Chapman, P. B., and A. N. Houghton. 1991. Induction • t · · .1:1. of IgG Antibodies against GD3 Ganglioside in Rabbits * by an Anti-idiotypic Monoclonal Antibody. J. Clin.
, Invest. 88:186.
• 1 · ···'.
* · · ' ' • · ”1 30 34. Svennerholm, L. 1963. Chromatographic separation of ·1· human brain gangliosides. J. Neurochem. 10:613.
• · *· · • · · • · • 1 • · # 117668 131
Neljännen koesarjan kirjallisuusluettelo 1. Livingston, P.O., Kaelin, X., Pinsky, C,M., oettgen, H.F. and Old, L.J. The serological response of 5 patients with stage II melanoma to allogeneic melanoma cell vaccines. Cancer 1985, 56, 2194-2200.
2. Livingston, P.0. Experimental and clinical studies with active specific immunotherapy. In: Immunity to 10 Cancer II (Ed. Mitchell, M.S.) Alan R. Liss, Inc.,
New York, 1989, pp. 309-321.
3. Livingston, P.O., Jones-Calves, M. and Natoli, E.J. Jr. Approaches to augmenting the immunogenicity of 15 the ganglioside GM2 in mice: Purified GM2 is superior to whole cells. J. Immunol. 1987, 138, 1524-1529.
4. Livingston, P.O., Natoli, E.J. Jr.f Calves, M.J., 20 Stockert, E., Oettgen, H.F. and Old, L.J. Vaccines • 1 · V : containing purified GM2 ganglioside elicit GM2 • · :.‘1i antibodies in melanoma patients. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 1987, 84, 2911-2915.
·· · • •e··'· • · • ♦ 25 5. Livingston, P.O., Ritter, G., Srivastava, P., • 1 · ·
Calves, M.J., Oettgen, H.F. and Old, L.J. Characterization of IgG and IgM antibodies induced ( a.( in melanoma patients by immunization with purified GM2 ganglioside. Cancer Res. 1989, 49, 7045-7050.
• · 30 i#1t: 6. Livingson, P.O., Wong, G.Y.C., Adluri, s., Tao, Y., ·:··· Padavan, M., Parente, R., Hanlon, C., Jones-Calves, M., Helling, F., Ritter, G., Oettgen, H.F. and Old, • · *. 1, L.J. A randomized trial of adjuvant vaccination * · · • ·· • φ : 132 117668 with GM2 ganglioside in patients with AJCC stage III melanoma. J. Clin. Oncol. 1994, In Press.
7. Livingston, P.0. Experimental and clinical studies 5, with active specific immunotherapy. In* Immunity to Cancer II (Ed. Mitchell, M.S.) Alan R. Liss Inc., New York, 1989, pp. 309-321.
8. Eskola, J., Kayrty, H., Takaia, A.K., Peltola, H., 10 Ronneberg, P.R., Kha, E., Pekkanen, E., McVerry, P.H. and Mäkelä, P.H. A randomized prospective field trial of a conjugate vaccine in the protection of infants and young children against invasive Haemophilus Influenza type b disease. N. Engl. J. 15 Med. 1990, 323, 1381-1387.
9. Livingston; P.0., Koganty, R.R., Longenecker, B.M., Lloyd, K.O. and Calves, M.J. Studies on the immunogenicity of synthetic and natural Thomsen- 20 Friedenreich (TF) antigens in mice: Augmentation of :,: : the response by Quil A and SAF-m adjuvants and analysis of the specificity of the responses.
• ;*; Vaccine Res. 1991, 1, 99-109.
·* · ··· ♦ · • · : .·. 25 10. MacLean, G.D., Bowen-Yacyshyn, M.B., Samuel, J., i * · ]··/ Meikle, A., Stuart, G., Nation, J. , Poppema, S., * · #
Jerry, M., Koganty, R., Wong, T. and Longenecker, . B.M. Active immunization of human ovarian cancer • · · **!*' patients against a common carcinoma (Thomsen- • · *·.· 30 Friedenreich) determinant using a synthetic :*"· carbohydrate antigen. J. Immunotherapy 1992, 11, ··· .....* 292-305.
• * ··· * * · ·, 11. MacLean, G.D. , Reddish, M., Koganty, R., Wong, T., • I · *· *: 35 Gandhi, S., Smolensk!, M., Samuel, J., Nabholtz, : i ' 133 117668 J.M. and Longenecker, B.M. Immunization of breast cancer patients using a synthetic sialy-Tn glycoconjugate plus DETOX adjuvant. J. Immunol. Immunother. 1993, 36, 215-222.
5 12. Helling, F., Shang, Y., Calves, M., Oettgen, H.F. and Livingston, P.o. Increased immunogenicity of GD3 conjugate vaccines: Comparison of various carrier proteins and selection of GD3-KLH for further 10 testing. Cancer Res. 1994, In Press.
13. Helling, F., Adluri, S., Calves, M., Koganty, R.R., Oettgen, H.F., and Livingston, P.O. Increased immunogenicity of GM2 conjugated with KLH and used 15 with adjuvants in patients with melanoma. Proc.
Amer. Assoc. Cancer Res. 1993, 34.
14. Kensil, C.R., Soltysik, S., Patel, u. and Marciani, D.J. Structure/function relationship in adjuvants 20 from Quillaja spaonaria Molina. In: Vaccines 92 • 1 1 V : (Eds. Brown, F., Chanock, R.M., Ginsberg, H., • 1
Lerner, R.A.). Cold spring Harbor Laboratory Press, : 1992, pp 35-40.
»II ( w ft1 « * ft ft • · • ft • •1•25 15. Kensil, C.R., Patel, U., Lennick, M. and Marciani, • 1 1 1 D. Separation and characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina 4 t·' cortex. J. Immunol. 1991, 146, 431-437.
• · · • · · ·♦· ♦ 1
’1:** 30 16. white, A.c., Cloutier, P. and Coughlin, R.T. A
· · ϊί#,ϊ purified saponin acts as an adjuvant for a T- ·;··: independent antigen. In: Immunobiology of Protein and Peptides VI (Ed. Atassi, M.Z.). Plenum Press, \ \ NY, 1991, pp. 207-210.
···: 1 35 : 134 1 1 7668 17. Wu, J—Y., Gardner, B.H., Murphy, C.X., Seals, J.R., Kensil, C.R., Recchia, J., Beltz, G.A., Newman, G.W. and Newman, M.J. Saponin adjuvant enhancement of ' antigen-specific immune responses to an experimental 5 HIV-1 vaccine. J. Immunol. 1992, 148, 1519-1525.
18. Newman, M.J., Wu, J-Y., Gardner, B.H., Munroe, K.J., Leombruno, D., Recchia, J, Kensil, C.R. and Coughlin, R.T. Saponin adjuvant induction of 10 ovalbumin-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte responses. J. Immunol. 1992, 148, 2357-2362.
19. Marciani, D.J., Kensil, C.R., Beltz, G.A., Hung, C- H., Cronier, J. and Aubert, A. Genetically- 15 engineered subunit vaccine against feline leukaemia virus: protective immune response in cats. Vaccine 1991, 9, 89-96.
20. Cahan, L.D., Irie, R.F., Singh, R., Cassidenti, A.
20 and Paulson, J.C. Identification of a :T: neuroectodermal tumor antigen (OFA-I-2) as ganglioside GD2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982, • · 79, 7629-7633.
• · · r **· 1 M · • I · • · : 25 21. Dippold, W.G., Lloyd, K.O., Li, L.T.C., Ikeda, H., • 1 [Ij.j Oettgen, H.F. and Old, L.J. Cell surface antigens • · · * of human malignant melanoma: Definition of six antigenic systems with monoclonal antibodies. Proc.
*···: Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77, 6114-6118.
··· 30 22. Hawkes, R., Niday, E. and Gordon, J.A. Dot- *·· ·;♦·· immunebinding assay for monoclonal and other ..1. antibodies. Anal. Biochem. 1982, 119, 142-147.
I ( · • · 1 · • · 1 • 1 117668 135 23. Rosenberg, 5.A., Lotze, M.T., Muul, L.M., Chang, A.E., Avis, F.P., Leitman, S., Linehan, W.M.,
Robertson, G.N., Lee, R.E., Rubin, J.T., Seipp, C.A., Simpson, C.G. and White, D.E. A progress 5 report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high-dose interleukin-2 alone. H. Engl. J. Med. 1987, 316, 789-905.
10 24. Del Prete, S.A., Maurer, L.H., O'Donnell, J.,
Forcier, R.J. and LeMarbre, P. Combination chemotherapy with cisplatin, carmustine, dacarbazine, and tamoxifen in metastatic melonama.
Cancer Treat. Rep. 1984, 68, 1403-1405.
15 25. Mitchell, M.S., Kan-Mitchell, J., Kempf, R.A.,
Harel, W., Shau, H. and Lind, S. Active specific immunotherapy for melanoma: Phase I trial of allogeneic lysates and a novel adjuvant. Cancer 20 Res. 1988, 48, 5883-5893.
See • · · • ♦ · 26. Berd, D,, Mastrangelo, M.J., Engström, P.F., Paul, • j1; A. and Maguire, H. Augmentation of the human immune response by cyclophosphamide. Cancer Res. 1982, 42, • .·. 25 4862-4866.
···' • · · ' • [ f * 27. Kaplan, G., Kiessling, R., Teklemariam, S., Hancock, G., Sheftel, G., Job, C.K., Converse, P., Ottenhoff, f · · '·ί·2 T.H.M., Becx-Bleumink, M., Dietz, M. and Cohn, Z.A.
• · · 3 0 The reconstitution of cell-mediated immunity in the :3: cutaneous lesions of lepromatous leprosy by * · · ...,: recombinant interleukin 2. J. Exp. Med. 1989, 169, 893.
··· • · # • t * · 2 • ·· • #· 3 • · ; 136 117668 28. Kaplan, G., Cohn, Z.A. and Smith, K.A. Rational immunotherapy with interleukin 2. Biotechnology 1992, 10, 157.
5
Viidennen koearjan kirjallisuusluettelo 1. Boring, C.C., Squires, T.S., Tong, T.; Cancer Statistics in Ca - A Cancer Journal for Clinicians.
New York, NY, JB Lippincott Co, 1992, Vol. 42, No, 10 1, pp 19-38.
2. Balch, C.M., Smalley, R.V., Bartolucci, A.A., et al; A randomized prospective clinical trial of adjuvant C. parvum immunotherapy in 260 patients with 15 clinically localized melanoma (Stage I): Prognostic factors analysis and preliminary results of immunotherapy. Cancer 49:1079, 1982.
3. Coit, D.G., Rogatko, A., Brennan, M.F.,: Prognostic 20 factors in patients with melanoma metastatic to ··· V : axillary or inguinal lymph nodes. Ann Surg V·: 214:627-636, 1991.
* · • · · * - -1 • · · f; ··· · 4. Steffens, T.A., Livingston, P.O.: The status of • · '5 • 25 adjuvant therapy of melanoma, in Surgical Oncology • · · ·
Clinics of North America. Philadelphia, PA, W.B.
Saunders Company, 1992, pp 307-333.
• · · * · · .W 5. Oettgen, H.F., Livingston, P.O., Old, L.J.: f *
**"* 30 Melanoma in DeVita VT Jr, Hellman S, Rosenberg SA
(eds): Biologic Therapy of Cancer. Philadelphia, ·:**: PA, JB Lippincott Company, 1991, pp 682-701.
·· e • · · \ 6. Livingston, P.O.: Construction of cancer vaccines « · · 35 with carbohydrates and protein (peptide) tumor 137 1 1 7668 antigens. Current Opinion in Immunology 4:624-629, 1992.
7. Tai, T., Cahan, L.D., Tsuchida, T., et al: 5 Immunogenicity of melanoma-associated gangliosides in cancer patients. Int J Cancer 35:607-612, 1985.
8. Livingston, P.O., Natoli, E.J. Jr, Calves, M.J., et al: Vaccines containing purified GM2 ganglioside 10 elicit GM2 antibodies in melanoma patients. Proc
Natl Acad Sci USA 84:2911-2915, 1987.
9. Livingston, P.O., Ritter, G., Srivastava, P., et al: Characterization of IgG and IgM antibodies induced 15 in melanoma patients by immunization with purified GM2 ganglioside. Cancer Res 49:7045-7050, 1989.
10. Greenspan, E.M.: Is BCG an "orphan" drug suffering from chemotherapists' overkill? Cancer Invest 20 4:81-92, 1986.
• · · . · • * * I 4 V*· 11. Awwad, M., North, R.J.: Cyclophosphamide-induced immunologically mediated regression of a
:***: cyclophosphamide-resistant murine tumor: A
* · • ·*· 25 consequence of eliminating precursor L3T4+ ····-'· suppressor T-Cells. Cancer Res 49:1649-1654, 1989.
, 12. Mokyr, M.B., Dray, S. : Some advantages of curing • · · mice bearing a large subcutaneous MOPC-315 tumor • · - 30 with a low dose rather than a high dose of ·«· {...: cyclophosphamide. Cancer Res 43:3112-3119, 1983.
•a··#.··· • · 13. Natoli, E.J. Jr., Livingston, P.O., Cordon-Cardo, • · C., et al.: A murine monoclonal antibody detecting • · · 35 N-acetyl and N-glycolyl GM2: Characterization of 117668 138 cell surface reactivity. Cancer Res 46:4116-4120, 1986.
14. Cahan, L.D., Irie, R.F., Singh, R., et al: 5 Identification of a hinnan neuroectodermal tumor antigen (OFA-I-2) as gangliside GD2. Proc Natl Acad Sci USA 79:7629, 1982.
15. Livingston, P.O., DeLeo, A.B., Jones, M., et al: 10 Comparison of approaches for augmenting the serological response to the Meth A antigen.
Pretreatment with Cyclophosphamide is most effective. J Immunol 131:2001, 1983.
15 16. Livingston, P.O., Cunningham-Rundles, S., Marfleet, G., et al: Inhibition of suppressor cell activity by^-eyclophosphamide in patients with malignafit F~ melanoma. J Biol Resp Mod 6:392-403, 1987.
20 17. Pinsky, C.M., El Domeiri, A., Caron, A.S., et al: ··· V 1 Delayed hypersensitivity reactions in patients with !.1·· cancer. Rec Results Cancer Res 47:37-41, 1974.
• · • · · • · · "** 1 ...¾ ·1·1: 18. Livingston, P.O., Oettgen, H.F., Old, L.J.: • · • ;1. 25 Specific active immunotherapy in cancer therapy, in • · 1 ·
Mihich E (ed) : Immunological Aspects of Cancer φ
Therapeutics. John Wiley and Sons Inc, 1982, pp . 363-404.
::: *·· * ♦ # • · 30 19. Livingston, P.O.: Active specific immunotherapy in ··· the treatment of cancer, in Oettgen HF (ed) : *:·1: Immunology and Allergy Clinics of North America: l1\·' Human Cancer Immunology II. London, UK, WB Saunders *. '! Co, 1991, Vol 11:2, pp 402-423.
• · 1 ' * 1 » · 35 117668 139 20. Portoukalian, J., Zwingelstein, G., Dore, J.: Lipid composition of human malignant melanoma tumors at various levels of malignant growth. Europ J Biochem 94:19-23, 1979.
5 21. Tsuchida, T., Saxton, R.E., Morton, D.L., et al: Gangliosides of human melanoma. JNCI 78:45-54, 1987.
10 22. Hamilton, W.B., Helling, F., Lloyd, K.O., et al:
Ganglioside expression on human malignant melanoma assessed by immune thin layer chromatography. Int J Cancer 53:566-573, 1992.
15 23. Watanabe, T., Pukel, C.S., Takeyama, H., et al:
Human melanoma antigen AH is an autoantigenic ganglioside related to GD2. J Exp Med 156:1884-1889, 1982.
20 24. Pukel, C.S., Lloyd, K.O., Travassos, L.R., et al: ··· V 1 GD3, a prominent ganglioside of human melanoma • ♦ Σ.’·· detection and characterization by mouse monoclonal \t:‘: antibody. J Exp Med 155:1133-1147, 1982.
• · « • · • · • 25 25. Tai, T., Paulson, J.C., Cahan, L.D., et al: ··· ·
Ganglioside GM2 as a human tumor antigen (OFA-I-1). Proc Natl Acad Sci USA 80:5392-5396, 1983.
• · ♦ • · · III 26. Furukawa, K., Yamaguchi, H., Oettgen, K.F., et al: ···1 30 Two human monoclonal antibodies reacting with the major gangliosides of human melanomas and comparison *:1·: with corresponding mouse monoclonal antibodies.
··1. Cancer Res 49:191-196, 1989.
• · · 9 • · • · · • · · « ·« • · 117668 140 27. Yamaguchi, H., Furukawa, K., Fortunato, S.R., et ai:
Cell-surface antigens of melanoma recognized by human monoclonal antibodies. Proc Natl Acad Sci USA 84:2416-2420, 1987.
S
28. Yamaguchi, H., Furukawa, K., Fortunato, S.R., et al:
Human monoclonal antibody with dual GM2/GD2 specificity derived from an immunized melanoma patient. Proc Natl Acad Sci USA 87:3333-3337, 1990.
10 29. Welt, S., Carswell, E.A., Vogel, C-W., et al:
Immune and nonimmune effector functions of IgG3 mouse monoclonal antibody R24 detecting the disialoganglioside GD3 on the surface of melanoma 15 cells. Clin Immunol Immunopath 45:214-229, 1987.
30. Irie, R.F.: Oncofetal antigen (OFA-I): A human tumor-associated fetal antigen immunogenic in man, in Rosenberg S (ed): Serological analysis of human 20 cancer. New York, NY, Academic Press, 1980, pp 493- :T·* 513.
• · • * « * ·» * · : 31. Jones, P.C., Sze, L.L., Liu, P.Y., et al: Prolonged ··· · ·*·*; survival for melanoma patients with elevated IgM ? • · : .*. 25 antibody to oncofetal antigen. JNCI 66: 249-254, • * · · .·:·. 1981.
• * · . 32. Bell, R., Torrigiani, G. (eds): Towards Better • * · HI* Carbohydrate Vaccines. New York, John Wiley & Sons * » *·;1 30 Ltd, pp 1-363, 1987.
·*· • · • · • · · ♦:··· 33. Ritter, G., Boosfeld, E., Calves, M.J., et al: ./. Antibody response after immunization with gangliosides GD3, GD3 lactones, GD3 amide and GD3 • · * 35 gangliosidol in the mouse. GD3 lactone I induces >« 1 1 7668 antibodies reactive with human melanoma.
Immunobiology 182: 32-43, 1990.
34. Ritter, G., Livingston, P.O.: Cancer associated 5 ganglioside antigens, in Longenecker M (ed) :
Seminars in Cancer Biology, London, UK, WB Saunders, 1991, Vol 2:40-409.
35. Helling, P., Shang, Y., Calves, M. , et ai: GD3 10 vaccines for melanoma: Superior immunogenicity of KLH conjugate vaccines. Cancer Res, Jan 1994, In Press.
36. Livingston, P.O., Koganty, R., Longenecker, B.M., et 15 al: Studies on the immunogenicity of synthetic and natural Thomsen-Friedenreich (TF) antigens in mice:
Augmentation of the response by Quil A and SAF-m adjuvants and analysis of the specificity of the response. Vaccine Res 1:99-109, 1992.
20 ··· v : 37. Helling, F., Adluri, S., Calves, M., et al: • ·
:.**j Increased immunogenicity of GM2 conjugated with KLH
• · : : : and used with adjuvants in patients with melanoma.
Proc Amer Assoc Cancer Res 34:491, 1993.
I 25 9**9 38. Svennerholm, L., Chromatographic separation of human brain gangliosides. J Neurochem 10:613-623, 1963.
• · · • · · • · · r • 1 · • 1 * · ··· * · · ···'" ·:.'··' • e·.1' ··"·': • 1 · • · · · · • · ·1 1 • · · • · * » · v • · · ...
·1·' • ♦
Claims (21)
1. Menetelmä koostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) muodostetaan gangliosidijohdannai- 5 sen (i), joka käsittää muuttamattoman oligosakkaridiosan ja muutetun keramidiosan, konjugaatti immunogeeniseen pro-teiinipohjaiseen kantajaan (ii); b) lisätään saponiinia, jota saadaan Quillaja saponaria Molina -puun kaarnasta; ja c) lisätään farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa; jossa 10 konjugaatin ja saponiinin suhteelliset määrät ovat tehok- .·*. kaita stimuloimaan tai tehostamaan vasta-aineen tuotantoa potilaassa, jossa immunogeeninen proteiinipohjainen kantaja on saatu proteiinista, joka on valittu malarian T-solu epitoopista, Neisseria meningitidiksen ulkomembraanin pro-15 teiinista, kationisoidusta naudan seerumin albumiinista, reikäkotilon hemosyaniinista tai sen johdannaista, tai po-lylysiinista; jossa gangliosidijohdannaisen konjugaatti on konjugoitu immunogeeniseen proteiinipohjaiseen kantajaan gangliosidijohdannaisen keramidista peräisin olevan hiilen 20 kautta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, .*!*. tunnettu siitä, että keramidiosa käsittää sfingosii- .·, ; niemäksen, ja jolloin konjugaatissa gangliosidijohdannai- nen on konjugoitu immunogeeniseen proteiinipohjaiseen kan- » · · 25 tajaan gangliosidi johdannaisen keramidiosan sfingosii- • · \ * niemäksen C-4 hiilen kautta.
• · * ··· * 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, ··· r • · · *·* * tunnettu siitä, että immunogeeninen proteiinipohj ainen kantaja käsittää ε-aminolysyyliryhmän, ja jolloin konju- 30 gaatissa gangliosidi j ohdannainen on konjugoitu immuno- • · * ϊ ϊ geeniseen proteiinipohjaiseen kantajaan immunogeenisen .···, proteiinipohjaisen kantajan ε-aminolysyyliryhmän kautta. • ·
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • t . tunnettu siitä, että keramidiosa käsittää sfingosii- ·· · • V 35 niemäksen, ja immunogeeninen proteiinipohjainen kantaja l/·· käsittää ε-aminolysyyliryhmän, ja jolloin konjugaatissa 117668 gangliosidijohdannainen on konjugoitu immunogeenisen pro-teiinipohjaisen kantajan ε-aminolysyyliryhmään ganglio-sidijohdannaisen keramidiosan sfingosiiniemäksen C-4 hiilen kautta.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että saponiini, jota saadaan Quillaja saponaria Molina -puun kaarnasta, on QS-21.
6. Menetelmä koostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) muodostetaan i) gangliosidin oli- 10 gosakkaridisosan ja ii) reikäkotilon hemosyaniinin konju-gaatti; b) lisätään saponiinia, jota saadaan Quillaja saponaria Molina -puun kaarnasta; ja c) lisätään farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa; jolloin konjugaatin ja sa-poniinin suhteelliset määrät ovat tehokkaita stimuloimaan 15 tai tehostamaan vasta-aineen tuotantoa potilaassa.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saponiini, jota saadaan Quillaja saponaria Molina -puun kaarnasta, on QS-21.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen mene-20 telmä, tunnettu siitä, että gangliosidi johdannainen on konjugoitu reikäkotilon hemosyaniiniin.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 tai 8 mukainen * : menetelmä, tunnettu siitä, että gangliosidi johdannainen i ·» • *t/ on johdannainen gangliosidista, joka on valittu ryhmästä, !!*.* 25 joka koostuu GM2:sta, GM3:sta, GD2:sta, GD3:sta, GD3 lak- * * · ) tonista, O-asetyyli CD3:sta ja GT3:sta.
• · · ··· · 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, Φ # · Φ · Φ *.'* tunnettu siitä, että gangliosidi johdannainen on johdan nainen GM2:sta tai GD2:sta.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että gangliosidi johdannainen on johdan- •I. nainen GM2:sta.
* · • · **. 12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, *,* tunnettu siitä, että gangliosidi johdannainen on johdan- • *.! 35 nainen GD2:sta. * · * » · ... • · · * φ 14 4 117668
13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konjugaatin määrä on 1 -200 ug.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että konjugaatin määrä on 50 - 90 pg.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konjugaatin määrä on 70 pg.
16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konjugaatin määrä on 1 - 10 pg.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konjugaatin määrä on 7 pg.
18.Jonkin patenttivaatimuksen 1-17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saponiinin määrä on 10 -200 pg.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saponiinin määrä on 100 pg.
20. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saponiinin määrä on 200 pg. f-
21. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että konjugaatissa gangliosidi johdannainen on konjugoitu immunogeeniseen proteiinipohjaiseen :1·1· kantajaan stabiililla amiinisidoksella, joka on gang- : liosidi johdannaisen keramidiosan sf ingosiiniemäksen C-4 • « • ,·, hiilen ja immunogeenisen proteiinipohj aisen kantajan ε- • · · jlV 25 aminolysyyliryhmän välillä. * · • · • · • I Φ ···' ···· ··· • 1 · ·1· • · • · · • · · • · · • · • · ·· t · · * · • · * 1 · * · · « φ · • · 1 ···' • 1 • · • • · « ···. • · 117668 145 . ;
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US926893 | 1992-08-07 | ||
| US926893A | 1993-01-22 | 1993-01-22 | |
| PCT/US1994/000757 WO1994016731A1 (en) | 1993-01-22 | 1994-01-21 | Ganglioside-klh conjugate vaccines with qs-21 |
| US9400757 | 1994-01-21 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI953529A0 FI953529A0 (fi) | 1995-07-21 |
| FI953529A FI953529A (fi) | 1995-09-15 |
| FI117668B true FI117668B (fi) | 2007-01-15 |
Family
ID=21736616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI953529A FI117668B (fi) | 1993-01-22 | 1995-07-21 | Menetelmä gangliosidi-KLH-konjugaattia ja QS-21-ainetta sisältävän koostumuksen valmistamiseksi |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US7014856B1 (fi) |
| EP (2) | EP0680338B1 (fi) |
| JP (1) | JP3852945B2 (fi) |
| KR (1) | KR100307289B1 (fi) |
| AT (2) | ATE237357T1 (fi) |
| AU (1) | AU685776B2 (fi) |
| CA (1) | CA2154488C (fi) |
| DE (2) | DE69432513T2 (fi) |
| DK (1) | DK0680338T3 (fi) |
| ES (1) | ES2196024T3 (fi) |
| FI (1) | FI117668B (fi) |
| HK (1) | HK1014659A1 (fi) |
| HU (1) | HU221420B1 (fi) |
| NO (1) | NO318920B1 (fi) |
| NZ (2) | NZ314058A (fi) |
| WO (1) | WO1994016731A1 (fi) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE237357T1 (de) * | 1993-01-22 | 2003-05-15 | Sloan Kettering Inst Cancer | Gangliosid-klh-konjugatimastoffe mit qs-21 |
| CU22420A1 (es) * | 1993-12-29 | 1996-01-31 | Centro Inmunologia Molecular | Composicion vacunal para el desarrollo de una respuesta contra gangliosidos n glicolilados y su uso para el tratamiento del cancer |
| US5977316A (en) * | 1995-01-17 | 1999-11-02 | The Board Of Trustees Of The University Of Kentucky | Monoclonal antibody 1A7 and related polypeptides |
| US5612030A (en) | 1995-01-17 | 1997-03-18 | University Of Kentucky Research Foundation | Anti-idiotype monoclonal antibody 1A7 and use for the treatment of melanoma and small cell carcinoma |
| US5935821A (en) | 1995-01-17 | 1999-08-10 | Board Of Trustees Of The University Of Kentucky | Polynucleotides related to monoclonal antibody 1A7 and use for the treatment of melanoma and small cell carcinoma |
| WO1997040140A1 (en) * | 1996-04-22 | 1997-10-30 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Gd2 anti-idiotypic antibodies and uses thereof |
| US6491919B2 (en) * | 1997-04-01 | 2002-12-10 | Corixa Corporation | Aqueous immunologic adjuvant compostions of monophosphoryl lipid A |
| AUPO732997A0 (en) * | 1997-06-12 | 1997-07-03 | Csl Limited | Ganglioside immunostimulating complexes and uses thereof |
| EP1017419A4 (en) * | 1997-09-25 | 2004-12-29 | Sloan Kettering Institutefor C | FUCOSYLE GM1-KLH CONJUGATE VACCINE AGAINST SMALL CELL LUNG CANCER |
| US6355244B1 (en) | 1997-11-17 | 2002-03-12 | University Of Kentucky Research Foundation | Methods and compositions for the treatment of psoriasis |
| EP1903114A3 (en) | 1997-12-01 | 2008-07-23 | Neose Technologies, Inc. | Enzymatic synthesis of gangliosides |
| US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
| US7790856B2 (en) | 1998-04-07 | 2010-09-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| TWI239847B (en) | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
| US20080050367A1 (en) | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| DE60127113T2 (de) | 2000-04-25 | 2007-06-14 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Gd3-mimetische peptide |
| EP1731161B1 (en) * | 2000-12-22 | 2014-08-06 | Lpath, Inc. | Sphingosine-1-phosphate antibodies for the treatment of diseases associated with elevated sphingolipid concentrations |
| WO2003055514A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-10 | Antigenics Inc. | Compositions comprising immunoreactive reagents and saponins, and methods of use thereof |
| MY139983A (en) | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| KR101270692B1 (ko) * | 2003-08-12 | 2013-06-03 | 리폭센 테크놀로지즈 리미티드 | 폴리시알산 유도체 |
| US7794713B2 (en) | 2004-04-07 | 2010-09-14 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases |
| US8916165B2 (en) | 2004-12-15 | 2014-12-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized Aβ antibodies for use in improving cognition |
| WO2006076508A2 (en) * | 2005-01-14 | 2006-07-20 | Avax Technologies, Inc. | Method for producing a vaccine for the treatment of cancer |
| US8784810B2 (en) | 2006-04-18 | 2014-07-22 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases |
| US20080138334A1 (en) * | 2006-05-31 | 2008-06-12 | Sabbadini Roger A | Immune-Derived Moieties Reactive Against Bioactive Lipids, and Methods of Making and Using Same |
| US8796429B2 (en) * | 2006-05-31 | 2014-08-05 | Lpath, Inc. | Bioactive lipid derivatives, and methods of making and using same |
| US9274130B2 (en) | 2006-05-31 | 2016-03-01 | Lpath, Inc. | Prevention and treatment of pain using antibodies to lysophosphatidic acid |
| US7862812B2 (en) | 2006-05-31 | 2011-01-04 | Lpath, Inc. | Methods for decreasing immune response and treating immune conditions |
| US9274129B2 (en) * | 2006-05-31 | 2016-03-01 | Lpath, Inc. | Methods and reagents for detecting bioactive lipids |
| US8003097B2 (en) | 2007-04-18 | 2011-08-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of cerebral amyloid angiopathy |
| PL2182983T3 (pl) | 2007-07-27 | 2014-10-31 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Leczenie chorób amyloidowych z wykorzystaniem humanizowanych przeciwciał specyficznych względem Abeta |
| JO3076B1 (ar) | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
| WO2009124294A2 (en) * | 2008-04-05 | 2009-10-08 | Lpath, Inc. | Pharmaceutical compositions for binding sphingosine-1-phosphate |
| WO2009132082A2 (en) * | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Immunogenic compositions containing ceramide and methods of use thereof |
| US9067981B1 (en) | 2008-10-30 | 2015-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Hybrid amyloid-beta antibodies |
| US8512939B2 (en) * | 2009-09-25 | 2013-08-20 | Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. | Photoresist stripping technique |
| WO2012081508A1 (ja) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | 日本ケミカルリサーチ株式会社 | スフィンゴ糖脂質の定量法 |
| EP3077405B1 (en) * | 2013-12-06 | 2021-11-03 | AOA Dx | Anti-ganglioside compound for targeting cancer and generating antibodies |
| KR102614642B1 (ko) | 2014-06-04 | 2023-12-19 | 바이오엔테크 리서치 앤드 디벨롭먼트 인코포레이티드 | 강글리오사이드 ｇｄ２에 대한 사람 단클론 항체 |
| US11786586B2 (en) | 2016-12-23 | 2023-10-17 | Aoa Dx | Carbohydrate structures and uses thereof |
| EP3717005A1 (en) * | 2017-12-01 | 2020-10-07 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Saponin extraction |
| EP3980044A1 (en) * | 2019-06-05 | 2022-04-13 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Saponin purification |
| WO2023212741A1 (en) * | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Seneb Biosciences, Inc. | Treatment of gm1 deficiencies |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4356170A (en) * | 1981-05-27 | 1982-10-26 | Canadian Patents & Development Ltd. | Immunogenic polysaccharide-protein conjugates |
| US4591552A (en) * | 1982-09-29 | 1986-05-27 | New York Blood Center, Inc. | Detection of hepatitis B surface antigen (or antibody to same) with labeled synthetic peptide |
| US4557931A (en) * | 1982-12-02 | 1985-12-10 | Regents Of The University Of California | Antigenic compositions and methods for using same |
| US4652629A (en) * | 1985-07-03 | 1987-03-24 | The Salk Institute For Biological Studies | Synthetic peptide-based anti-rabies compositions and methods |
| US4879213A (en) * | 1986-12-05 | 1989-11-07 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse |
| US5344870A (en) * | 1987-12-02 | 1994-09-06 | Alberta Research Council | Sialic acid glycosides, antigens, immunoadsorbents, and methods for their preparation |
| US5102663A (en) * | 1988-10-18 | 1992-04-07 | Sloan-Kettering Instutute For Cancer Research | Vaccine for stimulating or enhancing production of antibodies against 9-O-acetyl GD3 |
| DE3840044A1 (de) | 1988-11-27 | 1990-06-07 | Behringwerke Ag | Glykosphingolipide mit kopplungsfaehiger gruppe im sphingoidanteil, ihre herstellung und verwendung |
| GB9001694D0 (en) * | 1990-01-25 | 1990-03-28 | Therapeutic Antibodies Inc | Immunogenic compositions |
| ATE237357T1 (de) * | 1993-01-22 | 2003-05-15 | Sloan Kettering Inst Cancer | Gangliosid-klh-konjugatimastoffe mit qs-21 |
| WO1996001903A1 (en) | 1994-07-07 | 1996-01-25 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising gm-csf and antigens and their expression in yeast |
-
1994
- 1994-01-21 AT AT94907279T patent/ATE237357T1/de active
- 1994-01-21 DE DE69432513T patent/DE69432513T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-21 KR KR1019950703022A patent/KR100307289B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-01-21 CA CA002154488A patent/CA2154488C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-21 WO PCT/US1994/000757 patent/WO1994016731A1/en active IP Right Grant
- 1994-01-21 HU HU9502201A patent/HU221420B1/hu unknown
- 1994-01-21 NZ NZ314058A patent/NZ314058A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-01-21 EP EP94907279A patent/EP0680338B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-21 DE DE69435025T patent/DE69435025D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-21 AU AU60924/94A patent/AU685776B2/en not_active Expired
- 1994-01-21 JP JP51720394A patent/JP3852945B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-21 DK DK94907279T patent/DK0680338T3/da active
- 1994-01-21 AT AT03008652T patent/ATE372783T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-01-21 NZ NZ261744A patent/NZ261744A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-01-21 EP EP03008652A patent/EP1360963B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-21 US US08/196,154 patent/US7014856B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-21 ES ES94907279T patent/ES2196024T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/475,784 patent/US6967022B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/481,809 patent/US6916476B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/477,147 patent/US7001601B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/477,097 patent/US6936253B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-21 NO NO19952914A patent/NO318920B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-07-21 FI FI953529A patent/FI117668B/fi not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-12-28 HK HK98116010A patent/HK1014659A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-03-13 US US11/375,549 patent/US20060153859A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI117668B (fi) | Menetelmä gangliosidi-KLH-konjugaattia ja QS-21-ainetta sisältävän koostumuksen valmistamiseksi | |
| Ragupathi | Carbohydrate antigens as targets for active specific immunotherapy | |
| Helling et al. | GD3 vaccines for melanoma: superior immunogenicity of keyhole limpet hemocyanin conjugate vaccines | |
| Slovin et al. | Carbohydrate vaccines as immunotherapy for cancer | |
| Livingston et al. | Phase 1 trial of immunological adjuvant QS-21 with a GM2 ganglioside-keyhole limpet haemocyanin conjugate vaccine in patients with malignant melanoma | |
| CA2674269C (en) | Three component glycolipopeptides | |
| Ragupathi et al. | Comparison of antibody titers after immunization with monovalent or tetravalent KLH conjugate vaccines | |
| Livingston et al. | Approaches to augmenting the immunogenicity of the ganglioside GM2 in mice: purified GM2 is superior to whole cells. | |
| TW201622743A (zh) | 免疫原醣肽、包含該醣肽之組合物及其用途 | |
| Ragupathi et al. | A preclinical study comparing approaches for augmenting the immunogenicity of a heptavalent KLH-conjugate vaccine against epithelial cancers | |
| AU745555B2 (en) | Fucosyl GM1-KLH conjugate vaccine against small cell lung cancer | |
| US20030170249A1 (en) | Vaccines directed to cancer-associated carbohydrate antigens | |
| Hevey et al. | Recent advances in developing synthetic carbohydrate-based vaccines for cancer immunotherapies | |
| Zheng et al. | Improvement of the immune efficacy of carbohydrate vaccines by chemical modification on the GM3 antigen | |
| Helling et al. | Ganglioside conjugate vaccines: Immunotherapy against tumors of neuroectodermal origin | |
| Ritter et al. | Induction of antibodies reactive with GM2 ganglioside after immunization with lipopolysaccharides from Campylobacter jejuni | |
| AU725303B2 (en) | Ganglioside-KLH conjugate vaccines with QS-21 | |
| Gabri et al. | Role of cell surface GM3 ganglioside and sialic acid in the antitumor activity of a GM3-based vaccine in the murine B16 melanoma model | |
| RU2174013C2 (ru) | Композиция для стимулирования или повышения продуцирования антител, которые распознают ганглиозид | |
| JP2002525339A (ja) | ウイルス疾患のための炭水化物ワクチン | |
| CARBOHYDRATES | EFFECTOR MECHANISMS OF ANTIBODIES AGAINST CELL-SURFACE ANTIGENS |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 117668 Country of ref document: FI |
|
| MA | Patent expired |