JP3943845B2 - リポソームベクター - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子治療用リポソームベクターに関し、更に詳細には、肝実質細胞における高い遺伝子発現率を示す遺伝子治療用ベクター及びその研究用試薬として有用なリポソームベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
リポソームとは、内部に水相を含むリン脂質二重層の微小ベシクルで、脂質を相転移温度以上で、十分な量の水で水和することにより形成される。リポソームは、その脂質二重層の数に基づいて分類した場合、複数の脂質二重層からなる多重膜リポソーム（ＭＬＶ）と単一の脂質二重層からなる一枚膜リポソームに分けられ、後者は、さらに大きさに基づいて、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）、大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ、ＲＥＶ）および巨大リポソーム（ＧＵＶ）に分けられる。
【０００３】
一般に、ＳＵＶは、直径が、数１００nm以下、ＬＵＶ（ＲＥＶ）は、直径が、１００〜１０００nm、ＧＵＶは、直径が、１０００nm以上のリポソームを指す。ＭＬＶのサイズは不均一で、その直径の分布は数百から数千nmにまで及ぶ。
【０００４】
このように、種々のタイプのリポソームが知られているが、水溶性薬物はその内水相に、油溶性のものは膜の脂質二重層の部分に取り込むことができる。リポソームに内包された薬物、例えば、抗悪性腫瘍剤であるドキソルビシンは、心臓への集積が見られるが、リポソーム化することによって心臓への集積が見られなくなり、また体内からの薬物の消失も遅くなるという遊離の薬物とはまったく異なる体内動態を示すので、薬物による副作用の軽減、徐放化などの効果がある。また、遊離の薬物は、これを導入できるように操作することが困難である。
【０００５】
さらに、リポソームを構成するリン脂質は、生体膜の主要構成成分であるため毒性が低いうえ、投与の目的、方法に合わせて粒子サイズをコントロールすることができ、更には、リポソーム粒子表面に官能基を導入することによって抗原、抗体、糖鎖などをリポソームに導入することができ、標的部位に対するターゲティング（標的指向化）が可能となるという利点があり、これらの利点を生かした製剤学的研究が広く行われている
【０００６】
一方、近年、がん等の遺伝子の異常が原因となって起こる病気を、人体に遺伝子を導入することによって、正常な遺伝子と入れ換えたり、正常な作用を有する遺伝子を補って治療する方法、すなわち遺伝子治療法が開発されてきている。遺伝子治療法には、患者の細胞を取り出して、生体外でこれらの細胞に治療遺伝子を導入した後に、生体内に戻すエクソビボ（ex vivo）法と、直接体内に治療遺伝子を投与して、標的細胞（治療を目的とする細胞）に取り込ませるインビボ（in vivo）法の２種類がある。エクソビボ法は、遺伝子の導入効率は高いものの、導入遺伝子の発現効率が低く、治療に利用するのには十分な遺伝子導入効率を達成することはできない。また、インビボ法では、生体内に投与した治療遺伝子が、標的細胞に選択的に導入されるように操作することが困難であるという欠点がある。
【０００７】
また、遺伝子治療法においては、治療遺伝子を効率よく標的細胞へ導入するために、アデノウイルスのようなウイルスベクターが用いられるのが一般的である。しかし、ウイルスベクターは、低い遺伝子導入効率、大量生産が困難、抗原性、宿主に対する毒性等が問題となり、実用化されているものはない。一方、遺伝子をそのまま生体に投与すると、生体内の分解酵素により分解され、標的細胞に到達することができない。そこで、ウイルスを使用しない遺伝子導入法として、リポソームを用いた遺伝子治療用ベクターが開発されつつある。
【０００８】
遺伝子治療用リポソームベクターとしては、膜中にＮ−アシル化アシアロフェツインを含有するリポソームが知られている（特願平６−６９９３３）。
しかし、リポソームにＮ−アシル化アシアロフェツインを含有させるためには、ミセルを調製する必要が、またリポソームをＤＮＡに封入するのに凍結融解が必要であり、更には血清存在下では遺伝子導入率が低くなるため、血清不在下で処置する必要があるという欠点がある。
【０００９】
先に、本発明者らは、肝臓、脾臓などの細網内皮系組織に取り込まれることなく、肝細胞に多く取り込まれる大豆由来ステロールグルコシドで被覆したリポソーム（ＳＧリポソーム）を発明した（特開平６−２９８６３８）。
このとき用いたリポソームは、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であったが、ＤＮＡは水溶性であるので、内水相の小さい多重膜リポソームでは、遺伝子導入に十分な量のＤＮＡの封入は困難であった。またＤＮＡとリポソーム複合体の粒子径が大きくなり、動物に注射することが困難であった。
【００１０】
また、ベクターとしてカチオン性リポソームを用いる遺伝子治療も知られている（特表平１０−５１２８８２）。
しかし、リポソームとＤＮＡの複合体の精製には、密度勾配遠心による精製が必要であり、肝臓への標的化も達成されていない。また、カチオン性リポソームは、中性リポソームと比べて、より強い毒性を示し、また、血漿タンパクとの相互作用が高いので、動物の血中での安定性も低い。
【００１１】
上述のように、リポソームを遺伝子導入用の遺伝子ベクターとして用いる方法は、いくつか開発されているが、一般に、血清存在下では遺伝子発現効率が低くなることが知られており、インビボ（in vivo）においても高い遺伝子発現効率を示すベクター及びその簡便かつ迅速な調製方法の開発が望まれている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高い肝実質細胞への移行性、高い遺伝子導入率、及び高い遺伝子発現効率を示す、肝疾患の遺伝子治療に有用な肝細胞をターゲットとする遺伝子治療用リポソームベクター、及びその新規調製方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、先に特開平６−２９８６３８で示したように、大豆由来ステロールグルコシドを有するリポソーム（以下、ＳＧリポソームという）が、肝臓、脾臓などの細網内皮系組織に取り込まれることなく、肝細胞に多く取り込まれることを見出した。更に、本発明者らは、ＳＧリポソームに遺伝子を封入させたＳＧリポソーム（以下、遺伝子封入ＳＧリポソームという）が、肝実質細胞への移行性が高く、高い遺伝子導入率を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明で遺伝子を封入するとは、遺伝子をリポソームの内水相に取り込んでいる場合のみならず、遺伝子とリポソームとの単純な複合体の形成をも含む。したがって、リポソーム表面上に遺伝子が付着しているものを含む。
【００１４】
すなわち本発明は、ステロールグルコシドを有する肝細胞をターゲットとする（肝細胞を標的とする）遺伝子治療用リポソームベクターに関する。
【００１５】
本発明の大豆由来ステロールグリコシドは、例えば、植物油精製工程で生じるソーダ油滓から得られるステロールグルコシド（以下ＳＧという）の未精製物であり、シトステリル−Ｄ−グルコシド、カンペステリル−Ｄ−グルコシド、スチグマステリル−Ｄ−グルコシド及びブラシカステリル−Ｄ−グルコシドからなる群より選ばれる混合物である。この混合物も使用することができるが、その混合物を構成する単独成分であるシトステリル−Ｄ−グルコシドの使用が最も有効である。
【００１６】
本発明のリポソームベクターとしては、中性リポソームベクター若しくはカチオン性リポソームベクター又はその組合わせを用いることができる。本発明のＳＧを有する中性リポソーム（以下、ＳＧ中性リポソームという）は、好ましくは、ジバルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール（Ｃｈ）及びステロールグルコシド（ＳＧ）を用いて調製することができる。好ましくは、ジバルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール（Ｃｈ）及びステロールグルコシド（ＳＧ）のモル比は、６:３:１である。
【００１７】
本発明のＳＧを有するカチオン性リポソーム（以下、ＳＧカチオン性リポソームという）は、好ましくは、Ｔｆｘ−２０、ＤＣ−Ｃｈｏｌ及びＳＧの主成分であるβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシド（Ｓｉｔ−Ｇ）を用いて調製することができる。Ｔｆｘ−２０、ＤＣ−Ｃｈｏｌ及びβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシド（Ｓｉｔ−Ｇ）のモル比は、好ましくは、１．３:２:１，すなわち、重量比でＴｆｘ−２０（合成カチオン脂質である〔Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジ（オレオイル−オキシ）−１，４−ブタンジアンモニウム ヨウ化物〕とＬ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の重量比が１：３のもの、プロメガ（株））／ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｓｉｔ−Ｇ＝０．３２５：０．９７５：２：１である。より好ましくは、Ｔｆｘ−２０はなくてもよいので、重量比でＤＯＰＥ／ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｓｉｔ−Ｇ＝０．２〜１０：０．１〜１０：１〜１０、最も好ましくは重量比で、Ｔｆｘ／ＤＯＰＥ／ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｓｉｔ−Ｇ＝０．３：１：２：１です。Ｔｆｘ−２０は、米国プロメガ社製のもので、カチオニック脂質とジオレオイルホスファチジルエタノールアミンの混合物である。ＤＣ−Ｃｈｏｌは、相対的に毒性が低いカチオン性脂質である３−β−Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイルコレステロールである。
【００１８】
ＳＧ中性リポソームでは、遺伝子との静電的相互作用が期待できず、静電的力でリポソームとＤＮＡの複合体を形成することができないということから、逆相蒸発法（ＲＥＶ法、ＲＥＶリポソームができる）を用いて、遺伝子封入リポソームを調製することができる。
【００１９】
ＳＧカチオン性リポソームでは、負電荷である遺伝子との静電的相互作用が期待できることから、新規調製法であるエタノールインジェクション法により空のリポソームを調製し、次いで遺伝子とインキュベーションし、遺伝子とリポソームとの複合体を調製する。
【００２０】
本発明の遺伝子導入に用いられる遺伝子は、ＤＮＡもしくはＲＮＡであることができる。ＤＮＡもしくはＲＮＡは、一本鎖もしくは二本鎖であってよく、その形態は線状、環状等であることができ、１種類以上のＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡを同時に用いることもできる。
【００２１】
ＳＧリポソームに封入されたＤＮＡは、ヒト肝芽細胞癌由来のＨｅｐＧ２細胞に対して、高い遺伝子導入効率を示し、かつ、ＨｅｐＧ２細胞に選択性があることから、ＤＮＡの肝実質細胞へのターゲティングには、本発明のＳＧリポソームが有効である。また、通常、リポソームベクターは血清存在下で不安定となり、遺伝子導入率が低くなることが知られている。しかし、ＳＧの主成分であるβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシド（Ｓｉｔ-Ｇ）を有するリポソームを用いた遺伝子導入においては、インビトロで、１０％血清存在下においても、血清不在の場合に比べて増加した遺伝子発現が認められた（図２）。更に、マウスへの静脈内注射後の各臓器における遺伝子発現性を評価した結果、肝臓に特異的な遺伝子発現が認められた（図３）。したがって、本発明のＳＧリポソームベクターを用いると、肝実質細胞に高い効率で遺伝子を導入することができ、その遺伝子を高い効率で発現させることができる。
【００２２】
本発明のリポソームベクター中に封入することができる肝疾患治療用遺伝子としては、例えば、自殺遺伝子、α−インターフェロン遺伝子、β−インターフェロン遺伝子、γ−インターフェロン遺伝子、Ｂ型又はＣ型肝炎ウイルスのアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ、α1−アンチトリプシン遺伝子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子、低比重リポプロテイン（ＬＤＬ）遺伝子等が挙げられる。プラスミドＤＮＡ封入リポソームのＤＮＡ／脂質重量比は、好ましくは１／１０〜１／５００である。
【００２３】
本発明によって得られたＳＧリポソームベクターは、そのまま懸濁させるか、又は凍結乾燥若しくはスプレードライによって粉末化したものを水、生理食塩液等で再懸濁させて静脈内投与することができる。こうして、本発明のリポソームベクターは、肝実質細胞に選択的に到達し、そこで遺伝子が発現することによって肝疾患の遺伝子治療が可能となる。したがって、本発明は、上記リポソームベクターを含む遺伝子治療剤にも関する。
【００２４】
本発明の遺伝子治療剤の投与経路は、非経口、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻または経肺を用いることができる。投与量は、患者の健康状態、症状の重篤度に依存するが、一日用量０．０１〜１０mg／kg、好ましくは０．０１〜１mg／kgであり、毎日又は１〜７回／週で投与することができる。剤形は、好ましくは、水若しくは生理食塩液の懸濁液、又はその凍結乾燥もしくはスプレードライの粉末製剤である。
【００２５】
また、本発明のＳＧリポソームベクターは、培養細胞及び動物を用いる遺伝子導入、遺伝子発現等の研究用試薬としても使用することができる。したがって、本発明は、上記リポソームベクターを含む遺伝子導入キットにも関する。
【００２６】
本発明のリポソームベクターを含む遺伝子導入キットは、リポソームベクター、懸濁用媒体、導入用遺伝子及び容器を含む。好ましくは、リポソームベクターは、リポソーム懸濁液又は粉末、懸濁用媒体は、水又は５％グルコース溶液、導入用遺伝子は、通常用いられる形態で、そして容器は、バイアル瓶を用いることができる。また上記遺伝子導入キットは、１．バイアル瓶のリポソームベクター懸濁液または、リポソームベクター粉末に懸濁用媒体を入れて再懸濁液にしてから一定量をとって、必要時に遺伝子と混ぜて使う、２．リポソームベクターと遺伝子の複合体懸濁液または、その粉末に懸濁用媒体を入れて再懸濁液にしてから、必要時に一定量をとって使うことができる。
【００２７】
また、本発明は、Ｔｆｘ−２０、ＤＣ−Ｃｈｏｌ及びβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシドをエタノールに溶かし、エタノールが少量になるまで減圧除去し、この脂質のエタノール溶液に水を加え直ちに混和した後、残留のエタノールを減圧除去する。これを次に、クリーンベンチ内に、１日置いた後、孔径０．２２μmの滅菌フィルターに通し、粒子径を揃え、このリポソームをプラスミドＤＮＡと混合し、室温で１０〜１５分間インキュベートすることによって、プラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体を調製する、新規カチオン性リポソームの調製及びカチオン性リポソームとＤＮＡの混合方法にも関する。
【００２８】
【実施例】
以下の実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらに何ら限定されるものではない。
【００２９】
実施例１ 本発明で用いるステロールグルコシド（ＳＧ）の製造方法
植物油精製工程で生じるソーダ油宰の乾燥粉末１００ｇにピリジン１，０００mlを加え、加熱溶解した。この溶液に活性炭を加えて攪判した後に濾過し、濾液を得た。濾液１，０００mlに対しアセトン１，５００mlを添加した後、冷却し結晶を析出させた。析出した結晶（ステロールグルコシド未精製物）を再びピリジンに加熱溶解し、上記と同様に活性炭を加えて脱色処理を行った後、アセトンを加えて結晶を析出させた。得られた結晶を減圧乾燥し、精製ＳＧ３０ｇを得た。このステロールグルコシドは、β−シトステリルβ−Ｄ−グルコシド（４９．９％）、カンペステリルβ−Ｄ−グルコシド（２９．１％）、スチグマステリルβ−Ｄ−グルコシド（１３．４％）、ブラシカステリルβ−Ｄ−グルコシド（７．２％）の混合物であった。各成分の単離は、カラムで分離した。
【００３０】
実施例２ プラスミドＤＮＡ封入ＳＧ中性リポソームの調製法
リポソームの脂質組成としては、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）／コレステロール（Ｃｈ）／ＳＧ（モル比６：３：１）を用い、プラスミドＤＮＡ（ｐＡＡＶ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ、ルシフェラーゼ遺伝子含有プラスミド）を封入させた。プラスミドＤＮＡ封入ＳＧ中性リポソームは、逆相蒸発法（ＲＥＶ法）により調製した。
【００３１】
まず、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）／コレステロール（Ｃｈ）／ＳＧをナス型フラスコに入れて、クロロホルムとメタノールを適量加え溶解し、室温でロータリーエバポレーターによって有機溶媒を減圧除去し、脂質薄膜を作った。この薄膜にクロロホルム及びイソプロピルエーテルを加え再溶解させてから、プラスミド含有１０倍希釈のリン酸緩衝生理食塩液 （１／１０ＰＢＳ） を加えた後、１分間ボルテックスミキサーにかけ、４５℃の水浴中で２分間超音波処理し、水和させた。このＷ／Ｏエマルションを、５０〜５５℃の水浴中で窒素（流量４５０〜５００ml／min）を通しながら、ロータリーエバポレーターで有機溶媒を減圧除去し、リポソームを調製した。このリポソームを、エクストルーダーを用いて約６０℃で孔径０．４μmのポリカーボネイトメンブランフィルター（Costar Scientific Corporation 製）に１回通し、次いで０．２μmポリカーボネートメンブランフィルターに２回通し、０．２μm以下に粒子径を揃えた。プラスミドＤＮＡ封入リポソームのＤＮＡ／脂質重量比は、１／２００であった。
【００３２】
試験例１ 肝細胞におけるＳＧ中性リポソームの遺伝子発現
ヒト肝芽細胞癌由来のＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所の細胞開発銀行より入手）を用いて、実施例２で調製したＳＧ中性リポソームの遺伝子発現を調べた。ＨｅｐＧ２細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬）（０.３mg／mlグルタミン、１０nmol／lのＨＥＰＥＳ緩衝液を添加）１mlに播種し（細胞密度：３×１０5 cells／well、容器：FALCON MULTIEWELL 12WELL）、３７℃で１日培養した。培養プレートの培養液を取り除き、ＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、次いでＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０培地０．８ml／wellを加えた。ＤＮＡ封入リポソームをＤＮＡ２μg／２００μlになるように１／１０ＰＢＳで希釈し、３７℃で１０分間インキュベートし、培地に加え、そのＤＮＡ封入リポソーム懸濁液を培養プレート内の細胞上に分散させた。ＰＢＳの組成は、塩化ナトリウム８．０００ｇ、塩化カリウム０．１９４ｇ、リン酸二ナトリウム２．２９０ｇ、リン酸一カリウム０．１９６ｇ、精製水１０００mlである。培養プレートを３７℃で６時間培養後、培養液を除去し、１０％ＦＢＳ含有培地１ml／wellを加え、さらに、３７℃で２４時間培養した。その後、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、細胞溶解液（ピッカジーン培養細胞溶解液Ｌｕｃ．東洋インキ株式会社）を１２５μl／well加え、１５分間振盪混和した後、−８０℃の冷凍庫で凍結させた。凍結後、室温で解凍し、遠心分離（１３０００rpm×２分間）し、上澄みを回収した。その後、ケモルミノメーター（chemoluminometer）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。標準タンパク質測定（ＢＣＡ試薬、Pierce, Rockford, IL, USA）で得た結果をもとに、ルシフェラーゼ活性を補正した。
その結果、図１に示すように、ＳＧ不含中性リポソームでは、ＨｅｐＧ２細胞において、遺伝子発現がほとんど見られなかったのに対し、プラスミドＤＮＡ封入ＳＧ中性リポソームでは、高い効率の遺伝子発現が見られた。したがって、ＳＧ中性リポソームが、肝細胞に高い効率で遺伝子を導入し、その遺伝子が発現することが明らかとなった。
対照としてプラスミドＤＮＡが封入されたＳＧ不含中性リポソームを調製した。プラスミドＤＮＡとしては、ｐＡＡＶ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ、ルシフェラーゼ遺伝子含有プラスミドを用いた。リポソームの脂質材料としては、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）：コレステロール（Ｃｈ）＝６：４（モル比）を用いた。対照リポソームは、逆相蒸発法（ＲＥＶ法）によって調製した。
【００３３】
実施例３ プラスミドＤＮＡとＳＧカチオン性リポソームとの複合体の調製
Ｔｆｘ−２０、ＤＣ−Ｃｈｏｌ及びＳＧの主成分であるβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシド（Ｓｉｔ−Ｇ）〔（重量比１．３:２:１）〕をエタノールに溶かし、エタノールが少量になるまで減圧除去した。この脂質のエタノール溶液に水を加え直ちに混和した後、残留のエタノールを減圧除去した。これを、クリーンベンチ内に、１日置いた後、孔径０．２２μmの滅菌フィルターに通し、粒子径を揃えた。このリポソームをプラスミドＤＮＡと混合し、室温で１０〜１５分間インキュベートすることによって、プラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体を調製した。
【００３４】
試験例２ 肝細胞におけるプラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体の遺伝子発現
ヒト肝芽細胞癌由来のＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所 細胞開発銀行）を用いて、実施例２で調製したＳＧ中性リポソームによる遺伝子発現効率を調べた。ＨｅｐＧ２細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬）（０.３mg／mlグルタミン、１０nmol／lのＨＥＰＥＳ緩衝液を添加）１mlに播種し（３×１０5cells／well）、３７℃で１日培養した。細胞プレートの培養液を取り除き、ＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。ＤＮＡが２μg／mlになるように１０％ＦＢＳ含有または不含のＲＰＭＩ１６４０培地で希釈した。実施例３で調製したプラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体の懸濁液１ml／wellを細胞に分散させた。ＦＢＳ不含の場合は、３７℃で２時間培養後、１０％ＦＢＳ含有培地１ml／wellを加え、さらに、３７℃で２４時間培養した。ＦＢＳ含有の場合は、そのまま３７℃で２４時間培養した。その後、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、セルライシスを１２５μl／well加え、１５分間振盪混和した後、−８０℃の冷凍庫で凍結させた。凍結後、室温で解凍し、遠心分離（１３０００rpm×２分間）し、上澄みを回収した。その後、ケモルミノメーター（chemoluminometer）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。標準タンパク質測定（ＢＣＡ試薬、Pierce, Rockford, IL, USA）で得た結果をもとに、ルシフェラーゼ活性を補正した。
その結果、図２に示すように、ＨｅｐＧ２細胞において、ＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体では、ＳＧを含まないカチオン性リポソームに比べ、高い遺伝子発現が見られた。また、通常、リポソームベクターは血清存在下で不安定となり、遺伝子導入率が低くなるが、ＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体は、血清（ＦＢＳ）含有の場合でも、高い遺伝子発現率を示した。したがって、ＳＧカチオン性リポソームが、肝細胞に高い効率で遺伝子を導入し、その遺伝子が発現することが明らかとなった。
【００３５】
試験例３ マウスへの静脈投与によるＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体の遺伝子発現
実施例３で調製したプラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体の懸濁液をマウスに尾静脈内注射し、２４時間後の各臓器における遺伝子発現を調べた。その結果、図３に示すように、市販品のＴｆｘ−２０ベクター及びＳＧを有しないカチオン性リポソームでは、肝臓においての遺伝子発現が低かったが、プラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体によっては、肝臓における高い遺伝子発現が見られた。このことから、ＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソームの静脈内注射により、肝細胞に選択的に遺伝子を導入し、高い効率で発現させることができることが明らかとなった。
対照とした、ＳＧ不含カチオン性リポソームとプラスミドＤＮＡとの複合体の調製は、空のＳＧ不含カチオン性リポソームを、Ｔｆｘ−２０とＤＣ−Ｃｈｏｌ（重量比１．３：２）をエタノールに溶かし、エタノールを少量になるまで留去した。この脂質のエタノール溶液に水を加え直ちに混和した後、残留のエタノールを減圧除去した。これを、クリーンベンチで、１日置いた後、孔径０．２２μmの滅菌フィルターに通し、粒子径を揃えた。このリポソームをプラスミドＤＮＡと混合し、室温で１０〜１５分間インキュベーションすることによって、プラスミドＤＮＡを封入したＳＧを有しないカチオン性リポソーム複合体を調製した。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドＤＮＡ封入ＳＧ中性リポソームによって導入された遺伝子の肝細胞における高い遺伝子発現を示す図である。***の表示は、ｐ＜０．００１で有意差があることを示す。ＲＬＵは、相対光単位（relative light unit）を表す。４℃は、吸着による対照を示す。
【図２】プラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソームによって導入された遺伝子の肝細胞における高い遺伝子発現を示す図である。***の表示は、ｐ＜０．００１で有意差があることを示す。ＲＬＵは、相対光単位（relative light unit）を表す。
【図３】ＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソームによって導入された遺伝子のマウス肝臓における高い遺伝子発現を示す図である。*の表示は、ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。ＲＬＵは、相対光単位（relative light unit）を表す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子治療用リポソームベクターに関し、更に詳細には、肝実質細胞における高い遺伝子発現率を示す遺伝子治療用ベクター及びその研究用試薬として有用なリポソームベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
リポソームとは、内部に水相を含むリン脂質二重層の微小ベシクルで、脂質を相転移温度以上で、十分な量の水で水和することにより形成される。リポソームは、その脂質二重層の数に基づいて分類した場合、複数の脂質二重層からなる多重膜リポソーム（ＭＬＶ）と単一の脂質二重層からなる一枚膜リポソームに分けられ、後者は、さらに大きさに基づいて、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）、大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ、ＲＥＶ）および巨大リポソーム（ＧＵＶ）に分けられる。
【０００３】
一般に、ＳＵＶは、直径が、数１００nm以下、ＬＵＶ（ＲＥＶ）は、直径が、１００〜１０００nm、ＧＵＶは、直径が、１０００nm以上のリポソームを指す。ＭＬＶのサイズは不均一で、その直径の分布は数百から数千nmにまで及ぶ。
【０００４】
このように、種々のタイプのリポソームが知られているが、水溶性薬物はその内水相に、油溶性のものは膜の脂質二重層の部分に取り込むことができる。リポソームに内包された薬物、例えば、抗悪性腫瘍剤であるドキソルビシンは、心臓への集積が見られるが、リポソーム化することによって心臓への集積が見られなくなり、また体内からの薬物の消失も遅くなるという遊離の薬物とはまったく異なる体内動態を示すので、薬物による副作用の軽減、徐放化などの効果がある。また、遊離の薬物は、これを導入できるように操作することが困難である。
【０００５】
さらに、リポソームを構成するリン脂質は、生体膜の主要構成成分であるため毒性が低いうえ、投与の目的、方法に合わせて粒子サイズをコントロールすることができ、更には、リポソーム粒子表面に官能基を導入することによって抗原、抗体、糖鎖などをリポソームに導入することができ、標的部位に対するターゲティング（標的指向化）が可能となるという利点があり、これらの利点を生かした製剤学的研究が広く行われている
【０００６】
一方、近年、がん等の遺伝子の異常が原因となって起こる病気を、人体に遺伝子を導入することによって、正常な遺伝子と入れ換えたり、正常な作用を有する遺伝子を補って治療する方法、すなわち遺伝子治療法が開発されてきている。遺伝子治療法には、患者の細胞を取り出して、生体外でこれらの細胞に治療遺伝子を導入した後に、生体内に戻すエクソビボ（ex vivo）法と、直接体内に治療遺伝子を投与して、標的細胞（治療を目的とする細胞）に取り込ませるインビボ（in vivo）法の２種類がある。エクソビボ法は、遺伝子の導入効率は高いものの、導入遺伝子の発現効率が低く、治療に利用するのには十分な遺伝子導入効率を達成することはできない。また、インビボ法では、生体内に投与した治療遺伝子が、標的細胞に選択的に導入されるように操作することが困難であるという欠点がある。
【０００７】
また、遺伝子治療法においては、治療遺伝子を効率よく標的細胞へ導入するために、アデノウイルスのようなウイルスベクターが用いられるのが一般的である。しかし、ウイルスベクターは、低い遺伝子導入効率、大量生産が困難、抗原性、宿主に対する毒性等が問題となり、実用化されているものはない。一方、遺伝子をそのまま生体に投与すると、生体内の分解酵素により分解され、標的細胞に到達することができない。そこで、ウイルスを使用しない遺伝子導入法として、リポソームを用いた遺伝子治療用ベクターが開発されつつある。
【０００８】
遺伝子治療用リポソームベクターとしては、膜中にＮ−アシル化アシアロフェツインを含有するリポソームが知られている（特願平６−６９９３３）。
しかし、リポソームにＮ−アシル化アシアロフェツインを含有させるためには、ミセルを調製する必要が、またリポソームをＤＮＡに封入するのに凍結融解が必要であり、更には血清存在下では遺伝子導入率が低くなるため、血清不在下で処置する必要があるという欠点がある。
【０００９】
先に、本発明者らは、肝臓、脾臓などの細網内皮系組織に取り込まれることなく、肝細胞に多く取り込まれる大豆由来ステロールグルコシドで被覆したリポソーム（ＳＧリポソーム）を発明した（特開平６−２９８６３８）。
このとき用いたリポソームは、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であったが、ＤＮＡは水溶性であるので、内水相の小さい多重膜リポソームでは、遺伝子導入に十分な量のＤＮＡの封入は困難であった。またＤＮＡとリポソーム複合体の粒子径が大きくなり、動物に注射することが困難であった。
【００１０】
また、ベクターとしてカチオン性リポソームを用いる遺伝子治療も知られている（特表平１０−５１２８８２）。
しかし、リポソームとＤＮＡの複合体の精製には、密度勾配遠心による精製が必要であり、肝臓への標的化も達成されていない。また、カチオン性リポソームは、中性リポソームと比べて、より強い毒性を示し、また、血漿タンパクとの相互作用が高いので、動物の血中での安定性も低い。
【００１１】
上述のように、リポソームを遺伝子導入用の遺伝子ベクターとして用いる方法は、いくつか開発されているが、一般に、血清存在下では遺伝子発現効率が低くなることが知られており、インビボ（in vivo）においても高い遺伝子発現効率を示すベクター及びその簡便かつ迅速な調製方法の開発が望まれている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高い肝実質細胞への移行性、高い遺伝子導入率、及び高い遺伝子発現効率を示す、肝疾患の遺伝子治療に有用な肝細胞をターゲットとする遺伝子治療用リポソームベクター、及びその新規調製方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、先に特開平６−２９８６３８で示したように、大豆由来ステロールグルコシドを有するリポソーム（以下、ＳＧリポソームという）が、肝臓、脾臓などの細網内皮系組織に取り込まれることなく、肝細胞に多く取り込まれることを見出した。更に、本発明者らは、ＳＧリポソームに遺伝子を封入させたＳＧリポソーム（以下、遺伝子封入ＳＧリポソームという）が、肝実質細胞への移行性が高く、高い遺伝子導入率を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明で遺伝子を封入するとは、遺伝子をリポソームの内水相に取り込んでいる場合のみならず、遺伝子とリポソームとの単純な複合体の形成をも含む。したがって、リポソーム表面上に遺伝子が付着しているものを含む。
【００１４】
すなわち本発明は、ステロールグルコシドを有する肝細胞をターゲットとする（肝細胞を標的とする）遺伝子治療用リポソームベクターに関する。
【００１５】
本発明の大豆由来ステロールグリコシドは、例えば、植物油精製工程で生じるソーダ油滓から得られるステロールグルコシド（以下ＳＧという）の未精製物であり、シトステリル−Ｄ−グルコシド、カンペステリル−Ｄ−グルコシド、スチグマステリル−Ｄ−グルコシド及びブラシカステリル−Ｄ−グルコシドからなる群より選ばれる混合物である。この混合物も使用することができるが、その混合物を構成する単独成分であるシトステリル−Ｄ−グルコシドの使用が最も有効である。
【００１６】
本発明のリポソームベクターとしては、中性リポソームベクター若しくはカチオン性リポソームベクター又はその組合わせを用いることができる。本発明のＳＧを有する中性リポソーム（以下、ＳＧ中性リポソームという）は、好ましくは、ジバルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール（Ｃｈ）及びステロールグルコシド（ＳＧ）を用いて調製することができる。好ましくは、ジバルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール（Ｃｈ）及びステロールグルコシド（ＳＧ）のモル比は、６:３:１である。
【００１７】
本発明のＳＧを有するカチオン性リポソーム（以下、ＳＧカチオン性リポソームという）は、好ましくは、Ｔｆｘ−２０、ＤＣ−Ｃｈｏｌ及びＳＧの主成分であるβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシド（Ｓｉｔ−Ｇ）を用いて調製することができる。Ｔｆｘ−２０、ＤＣ−Ｃｈｏｌ及びβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシド（Ｓｉｔ−Ｇ）のモル比は、好ましくは、１．３:２:１，すなわち、重量比でＴｆｘ−２０（合成カチオン脂質である〔Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジ（オレオイル−オキシ）−１，４−ブタンジアンモニウム ヨウ化物〕とＬ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の重量比が１：３のもの、プロメガ（株））／ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｓｉｔ−Ｇ＝０．３２５：０．９７５：２：１である。より好ましくは、Ｔｆｘ−２０はなくてもよいので、重量比でＤＯＰＥ／ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｓｉｔ−Ｇ＝０．２〜１０：０．１〜１０：１〜１０、最も好ましくは重量比で、Ｔｆｘ／ＤＯＰＥ／ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｓｉｔ−Ｇ＝０．３：１：２：１です。Ｔｆｘ−２０は、米国プロメガ社製のもので、カチオニック脂質とジオレオイルホスファチジルエタノールアミンの混合物である。ＤＣ−Ｃｈｏｌは、相対的に毒性が低いカチオン性脂質である３−β−Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイルコレステロールである。
【００１８】
ＳＧ中性リポソームでは、遺伝子との静電的相互作用が期待できず、静電的力でリポソームとＤＮＡの複合体を形成することができないということから、逆相蒸発法（ＲＥＶ法、ＲＥＶリポソームができる）を用いて、遺伝子封入リポソームを調製することができる。
【００１９】
ＳＧカチオン性リポソームでは、負電荷である遺伝子との静電的相互作用が期待できることから、新規調製法であるエタノールインジェクション法により空のリポソームを調製し、次いで遺伝子とインキュベーションし、遺伝子とリポソームとの複合体を調製する。
【００２０】
本発明の遺伝子導入に用いられる遺伝子は、ＤＮＡもしくはＲＮＡであることができる。ＤＮＡもしくはＲＮＡは、一本鎖もしくは二本鎖であってよく、その形態は線状、環状等であることができ、１種類以上のＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡを同時に用いることもできる。
【００２１】
ＳＧリポソームに封入されたＤＮＡは、ヒト肝芽細胞癌由来のＨｅｐＧ２細胞に対して、高い遺伝子導入効率を示し、かつ、ＨｅｐＧ２細胞に選択性があることから、ＤＮＡの肝実質細胞へのターゲティングには、本発明のＳＧリポソームが有効である。また、通常、リポソームベクターは血清存在下で不安定となり、遺伝子導入率が低くなることが知られている。しかし、ＳＧの主成分であるβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシド（Ｓｉｔ-Ｇ）を有するリポソームを用いた遺伝子導入においては、インビトロで、１０％血清存在下においても、血清不在の場合に比べて増加した遺伝子発現が認められた（図２）。更に、マウスへの静脈内注射後の各臓器における遺伝子発現性を評価した結果、肝臓に特異的な遺伝子発現が認められた（図３）。したがって、本発明のＳＧリポソームベクターを用いると、肝実質細胞に高い効率で遺伝子を導入することができ、その遺伝子を高い効率で発現させることができる。
【００２２】
本発明のリポソームベクター中に封入することができる肝疾患治療用遺伝子としては、例えば、自殺遺伝子、α−インターフェロン遺伝子、β−インターフェロン遺伝子、γ−インターフェロン遺伝子、Ｂ型又はＣ型肝炎ウイルスのアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ、α1−アンチトリプシン遺伝子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子、低比重リポプロテイン（ＬＤＬ）遺伝子等が挙げられる。プラスミドＤＮＡ封入リポソームのＤＮＡ／脂質重量比は、好ましくは１／１０〜１／５００である。
【００２３】
本発明によって得られたＳＧリポソームベクターは、そのまま懸濁させるか、又は凍結乾燥若しくはスプレードライによって粉末化したものを水、生理食塩液等で再懸濁させて静脈内投与することができる。こうして、本発明のリポソームベクターは、肝実質細胞に選択的に到達し、そこで遺伝子が発現することによって肝疾患の遺伝子治療が可能となる。したがって、本発明は、上記リポソームベクターを含む遺伝子治療剤にも関する。
【００２４】
本発明の遺伝子治療剤の投与経路は、非経口、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻または経肺を用いることができる。投与量は、患者の健康状態、症状の重篤度に依存するが、一日用量０．０１〜１０mg／kg、好ましくは０．０１〜１mg／kgであり、毎日又は１〜７回／週で投与することができる。剤形は、好ましくは、水若しくは生理食塩液の懸濁液、又はその凍結乾燥もしくはスプレードライの粉末製剤である。
【００２５】
また、本発明のＳＧリポソームベクターは、培養細胞及び動物を用いる遺伝子導入、遺伝子発現等の研究用試薬としても使用することができる。したがって、本発明は、上記リポソームベクターを含む遺伝子導入キットにも関する。
【００２６】
本発明のリポソームベクターを含む遺伝子導入キットは、リポソームベクター、懸濁用媒体、導入用遺伝子及び容器を含む。好ましくは、リポソームベクターは、リポソーム懸濁液又は粉末、懸濁用媒体は、水又は５％グルコース溶液、導入用遺伝子は、通常用いられる形態で、そして容器は、バイアル瓶を用いることができる。また上記遺伝子導入キットは、１．バイアル瓶のリポソームベクター懸濁液または、リポソームベクター粉末に懸濁用媒体を入れて再懸濁液にしてから一定量をとって、必要時に遺伝子と混ぜて使う、２．リポソームベクターと遺伝子の複合体懸濁液または、その粉末に懸濁用媒体を入れて再懸濁液にしてから、必要時に一定量をとって使うことができる。
【００２７】
また、本発明は、Ｔｆｘ−２０、ＤＣ−Ｃｈｏｌ及びβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシドをエタノールに溶かし、エタノールが少量になるまで減圧除去し、この脂質のエタノール溶液に水を加え直ちに混和した後、残留のエタノールを減圧除去する。これを次に、クリーンベンチ内に、１日置いた後、孔径０．２２μmの滅菌フィルターに通し、粒子径を揃え、このリポソームをプラスミドＤＮＡと混合し、室温で１０〜１５分間インキュベートすることによって、プラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体を調製する、新規カチオン性リポソームの調製及びカチオン性リポソームとＤＮＡの混合方法にも関する。
【００２８】
【実施例】
以下の実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらに何ら限定されるものではない。
【００２９】
実施例１ 本発明で用いるステロールグルコシド（ＳＧ）の製造方法
植物油精製工程で生じるソーダ油宰の乾燥粉末１００ｇにピリジン１，０００mlを加え、加熱溶解した。この溶液に活性炭を加えて攪判した後に濾過し、濾液を得た。濾液１，０００mlに対しアセトン１，５００mlを添加した後、冷却し結晶を析出させた。析出した結晶（ステロールグルコシド未精製物）を再びピリジンに加熱溶解し、上記と同様に活性炭を加えて脱色処理を行った後、アセトンを加えて結晶を析出させた。得られた結晶を減圧乾燥し、精製ＳＧ３０ｇを得た。このステロールグルコシドは、β−シトステリルβ−Ｄ−グルコシド（４９．９％）、カンペステリルβ−Ｄ−グルコシド（２９．１％）、スチグマステリルβ−Ｄ−グルコシド（１３．４％）、ブラシカステリルβ−Ｄ−グルコシド（７．２％）の混合物であった。各成分の単離は、カラムで分離した。
【００３０】
実施例２ プラスミドＤＮＡ封入ＳＧ中性リポソームの調製法
リポソームの脂質組成としては、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）／コレステロール（Ｃｈ）／ＳＧ（モル比６：３：１）を用い、プラスミドＤＮＡ（ｐＡＡＶ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ、ルシフェラーゼ遺伝子含有プラスミド）を封入させた。プラスミドＤＮＡ封入ＳＧ中性リポソームは、逆相蒸発法（ＲＥＶ法）により調製した。
【００３１】
まず、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）／コレステロール（Ｃｈ）／ＳＧをナス型フラスコに入れて、クロロホルムとメタノールを適量加え溶解し、室温でロータリーエバポレーターによって有機溶媒を減圧除去し、脂質薄膜を作った。この薄膜にクロロホルム及びイソプロピルエーテルを加え再溶解させてから、プラスミド含有１０倍希釈のリン酸緩衝生理食塩液 （１／１０ＰＢＳ） を加えた後、１分間ボルテックスミキサーにかけ、４５℃の水浴中で２分間超音波処理し、水和させた。このＷ／Ｏエマルションを、５０〜５５℃の水浴中で窒素（流量４５０〜５００ml／min）を通しながら、ロータリーエバポレーターで有機溶媒を減圧除去し、リポソームを調製した。このリポソームを、エクストルーダーを用いて約６０℃で孔径０．４μmのポリカーボネイトメンブランフィルター（Costar Scientific Corporation 製）に１回通し、次いで０．２μmポリカーボネートメンブランフィルターに２回通し、０．２μm以下に粒子径を揃えた。プラスミドＤＮＡ封入リポソームのＤＮＡ／脂質重量比は、１／２００であった。
【００３２】
試験例１ 肝細胞におけるＳＧ中性リポソームの遺伝子発現
ヒト肝芽細胞癌由来のＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所の細胞開発銀行より入手）を用いて、実施例２で調製したＳＧ中性リポソームの遺伝子発現を調べた。ＨｅｐＧ２細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬）（０.３mg／mlグルタミン、１０nmol／lのＨＥＰＥＳ緩衝液を添加）１mlに播種し（細胞密度：３×１０5 cells／well、容器：FALCON MULTIEWELL 12WELL）、３７℃で１日培養した。培養プレートの培養液を取り除き、ＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、次いでＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０培地０．８ml／wellを加えた。ＤＮＡ封入リポソームをＤＮＡ２μg／２００μlになるように１／１０ＰＢＳで希釈し、３７℃で１０分間インキュベートし、培地に加え、そのＤＮＡ封入リポソーム懸濁液を培養プレート内の細胞上に分散させた。ＰＢＳの組成は、塩化ナトリウム８．０００ｇ、塩化カリウム０．１９４ｇ、リン酸二ナトリウム２．２９０ｇ、リン酸一カリウム０．１９６ｇ、精製水１０００mlである。培養プレートを３７℃で６時間培養後、培養液を除去し、１０％ＦＢＳ含有培地１ml／wellを加え、さらに、３７℃で２４時間培養した。その後、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、細胞溶解液（ピッカジーン培養細胞溶解液Ｌｕｃ．東洋インキ株式会社）を１２５μl／well加え、１５分間振盪混和した後、−８０℃の冷凍庫で凍結させた。凍結後、室温で解凍し、遠心分離（１３０００rpm×２分間）し、上澄みを回収した。その後、ケモルミノメーター（chemoluminometer）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。標準タンパク質測定（ＢＣＡ試薬、Pierce, Rockford, IL, USA）で得た結果をもとに、ルシフェラーゼ活性を補正した。
その結果、図１に示すように、ＳＧ不含中性リポソームでは、ＨｅｐＧ２細胞において、遺伝子発現がほとんど見られなかったのに対し、プラスミドＤＮＡ封入ＳＧ中性リポソームでは、高い効率の遺伝子発現が見られた。したがって、ＳＧ中性リポソームが、肝細胞に高い効率で遺伝子を導入し、その遺伝子が発現することが明らかとなった。
対照としてプラスミドＤＮＡが封入されたＳＧ不含中性リポソームを調製した。プラスミドＤＮＡとしては、ｐＡＡＶ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ、ルシフェラーゼ遺伝子含有プラスミドを用いた。リポソームの脂質材料としては、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）：コレステロール（Ｃｈ）＝６：４（モル比）を用いた。対照リポソームは、逆相蒸発法（ＲＥＶ法）によって調製した。
【００３３】
実施例３ プラスミドＤＮＡとＳＧカチオン性リポソームとの複合体の調製
Ｔｆｘ−２０、ＤＣ−Ｃｈｏｌ及びＳＧの主成分であるβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシド（Ｓｉｔ−Ｇ）〔（重量比１．３:２:１）〕をエタノールに溶かし、エタノールが少量になるまで減圧除去した。この脂質のエタノール溶液に水を加え直ちに混和した後、残留のエタノールを減圧除去した。これを、クリーンベンチ内に、１日置いた後、孔径０．２２μmの滅菌フィルターに通し、粒子径を揃えた。このリポソームをプラスミドＤＮＡと混合し、室温で１０〜１５分間インキュベートすることによって、プラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体を調製した。
【００３４】
試験例２ 肝細胞におけるプラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体の遺伝子発現
ヒト肝芽細胞癌由来のＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所 細胞開発銀行）を用いて、実施例２で調製したＳＧ中性リポソームによる遺伝子発現効率を調べた。ＨｅｐＧ２細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬）（０.３mg／mlグルタミン、１０nmol／lのＨＥＰＥＳ緩衝液を添加）１mlに播種し（３×１０5cells／well）、３７℃で１日培養した。細胞プレートの培養液を取り除き、ＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。ＤＮＡが２μg／mlになるように１０％ＦＢＳ含有または不含のＲＰＭＩ１６４０培地で希釈した。実施例３で調製したプラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体の懸濁液１ml／wellを細胞に分散させた。ＦＢＳ不含の場合は、３７℃で２時間培養後、１０％ＦＢＳ含有培地１ml／wellを加え、さらに、３７℃で２４時間培養した。ＦＢＳ含有の場合は、そのまま３７℃で２４時間培養した。その後、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、セルライシスを１２５μl／well加え、１５分間振盪混和した後、−８０℃の冷凍庫で凍結させた。凍結後、室温で解凍し、遠心分離（１３０００rpm×２分間）し、上澄みを回収した。その後、ケモルミノメーター（chemoluminometer）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。標準タンパク質測定（ＢＣＡ試薬、Pierce, Rockford, IL, USA）で得た結果をもとに、ルシフェラーゼ活性を補正した。
その結果、図２に示すように、ＨｅｐＧ２細胞において、ＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体では、ＳＧを含まないカチオン性リポソームに比べ、高い遺伝子発現が見られた。また、通常、リポソームベクターは血清存在下で不安定となり、遺伝子導入率が低くなるが、ＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体は、血清（ＦＢＳ）含有の場合でも、高い遺伝子発現率を示した。したがって、ＳＧカチオン性リポソームが、肝細胞に高い効率で遺伝子を導入し、その遺伝子が発現することが明らかとなった。
【００３５】
試験例３ マウスへの静脈投与によるＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体の遺伝子発現
実施例３で調製したプラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体の懸濁液をマウスに尾静脈内注射し、２４時間後の各臓器における遺伝子発現を調べた。その結果、図３に示すように、市販品のＴｆｘ−２０ベクター及びＳＧを有しないカチオン性リポソームでは、肝臓においての遺伝子発現が低かったが、プラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソーム複合体によっては、肝臓における高い遺伝子発現が見られた。このことから、ＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソームの静脈内注射により、肝細胞に選択的に遺伝子を導入し、高い効率で発現させることができることが明らかとなった。
対照とした、ＳＧ不含カチオン性リポソームとプラスミドＤＮＡとの複合体の調製は、空のＳＧ不含カチオン性リポソームを、Ｔｆｘ−２０とＤＣ−Ｃｈｏｌ（重量比１．３：２）をエタノールに溶かし、エタノールを少量になるまで留去した。この脂質のエタノール溶液に水を加え直ちに混和した後、残留のエタノールを減圧除去した。これを、クリーンベンチで、１日置いた後、孔径０．２２μmの滅菌フィルターに通し、粒子径を揃えた。このリポソームをプラスミドＤＮＡと混合し、室温で１０〜１５分間インキュベーションすることによって、プラスミドＤＮＡを封入したＳＧを有しないカチオン性リポソーム複合体を調製した。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドＤＮＡ封入ＳＧ中性リポソームによって導入された遺伝子の肝細胞における高い遺伝子発現を示す図である。***の表示は、ｐ＜０．００１で有意差があることを示す。ＲＬＵは、相対光単位（relative light unit）を表す。４℃は、吸着による対照を示す。
【図２】プラスミドＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソームによって導入された遺伝子の肝細胞における高い遺伝子発現を示す図である。***の表示は、ｐ＜０．００１で有意差があることを示す。ＲＬＵは、相対光単位（relative light unit）を表す。
【図３】ＤＮＡ封入ＳＧカチオン性リポソームによって導入された遺伝子のマウス肝臓における高い遺伝子発現を示す図である。*の表示は、ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。ＲＬＵは、相対光単位（relative light unit）を表す。
Claims (8)
- ステロールグルコシドを有するリポソームからなる、肝細胞をターゲットとする遺伝子治療用リポソームベクターであって、該リポソームが、エタノールインジェクション法で製造されたカチオン性リポソームである、リポソームベクター。
- ステロールグルコシドが、シトステリル−Ｄ−グルコシドである、請求項１記載のリポソームベクター。
- リポソームが、Ｔｆｘ−２０、３−β−Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイルコレステロール及びβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシド（Ｓｉｔ−Ｇ）を含む、請求項１又は２記載のリポソームベクター。
- Ｔｆｘ−２０、３−β−Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイルコレステロール及びβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシド（Ｓｉｔ−Ｇ）のモル比が、１．３:２:１である、請求項３記載のリポソームベクター。
- 請求項１〜４いずれか１項記載のリポソームベクター及び遺伝子を含む、遺伝子治療剤。
- 請求項１〜４いずれか１項記載のリポソームベクターを含む、遺伝子導入用キット。
- Ｔｆｘ−２０、３−β−Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイルコレステロール及びβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシド（Ｓｉｔ−Ｇ）をエタノールに溶解し、エタノールを減圧除去することを特徴とする、リポソームの調製方法。
- ステロールグルコシドをエタノールに溶かし、エタノールが少量になるまで減圧除去し、この脂質のエタノール溶液に水を加え直ちに混和した後、残留のエタノールを減圧除去して製造されたカチオン性リポソームとＤＮＡとを混合し、室温でインキュベートすることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のカチオン性リポソームベクターの調製方法。
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