JP5968622B2 - マイコプラズマ感染症用ワクチン - Google Patents

Description

マイコプラズマなどの各細菌における特異的な脂質抗原を利用した擬似細菌粒子、及びそれを用いた、高性能で安全性の高いマイコプラズマ感染症用ワクチン及び当該ワクチンを用いたマイコプラズマ感染症の予防又は治療方法に関する。

マイコプラズマはヒト、家畜さらにペットなどの動物に感染し様々な疾病を引き起こすことが知られている。特にヒトにおいては、肺炎のみでなく、慢性化や繰り返し感染により、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)などの呼吸器疾患、関節リウマチなどのリウマチ性疾患（非特許文献１）、多発性硬化症などの神経疾患との強い関連性が疑われてきており、いまやこれら難病といわれる慢性疾患の原因微生物の最有力候補であるといわれている(図１、非特許文献３１、３２)。
マイコプラズマ感染は、発熱・咳・肺炎などの風邪症状から発症し、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、多発性硬化症、リウマチ性疾患へ移行する症例が知られており、その際、症状の再燃・増悪を繰り返し次第に慢性疾患に移行していくことも知られているため、早期診断 早期治療とともに増悪（症状が次第に悪化すること）や、再燃（一旦症状が軽快したのちに再び悪化すること）を予防・治療することがとりわけ重要である。
しかし、従来の検査法ではマイコプラズマ感染の診断や治療経過を把握することがむずかしかったために詳細が明らかにされず、そのために適切な予防・治療を受けられない患者が多いのが現状である。マイコプラズマ感染の診断法として、現在、最も汎用されているのは、血清診断法であるが、従来の診断法は、マイコプラズマ・ニューモニエを大量培養し、その菌体からの粗抽出物を用いた抗体測定法であるために特異性、検出感度、定量性に問題があり、マイコプラズマ感染の早期診断は困難である。
本発明者らは、従来から、マイコプラズマ属に属する各種細菌の表面の脂質抗原に着目し、それぞれの細菌特異的な脂質抗原を複数種発見した。これらの特異的な脂質抗原を単離精製して構造決定し、そのうちのいくつかは化学合成にも成功している(特許文献１〜８）。
マイコプラズマ感染症についてのこれらの特異的な脂質抗原を用いた診断薬は、既存の診断薬に比べて、特異性・感度とも高く、抗体価の変動を定量的に測定する方法の確立につながるものであり、これまで問題点の一つであったマイコプラズマ感染の早期診断は一応解決ができたともいえる。

しかしながら、マイコプラズマ感染症に対する治療薬として、現在最も治療効果が期待できる治療薬として実用化されているのは、マクロライド系・ニューキノロン系・テトラサイクリン系などの一部の抗生物質であるが、副作用が大きいことのみならず、耐性菌の出現という大きな問題を抱えており、マイコプラズマ感染症が、十分な治療効果が望めないうちに重症化し、慢性疾患に移行してしまう原因ともなっている。
一方、ヒトにおいては、マイコプラズマのワクチン療法は開発されていない。その理由として、生ワクチン、弱毒化ワクチンなどは安全性に問題があり実用化が難しいこと、死菌ワクチンなどは培養液の馬血清の混入などによるアレルギー反応の問題がある。また、ワクチン誘導につながる特異的な抗原蛋白を特定するために、ペプチドあるいはDNA解析が進められているが、未だ有効な特異的抗原蛋白の特定ができていないことなどが挙げられる。豚やウシなどの家畜用には従来から用いられていた生ワクチンや弱毒ワクチンなどにさらに改良が加えられている（特許文献９〜１２）。蛋白抗原を用いたワクチンも開発されており（特許文献１３〜１５）、最近、マイコプラズマ感染症による組織損傷に関連した酵素をターゲットとしたワクチンが開発された（特許文献１６）が、これらはいずれも肺炎の抑制効果または炎症抑制効果程度にとどまっており、家畜用ワクチンにも、未だ毒性が少なく効果的なワクチンといえるものはない。
このように、従来、マイコプラズマ感染症に対する効果的な予防・治療方法はなかなか見つけられないでいたため、マイコプラズマ感染症用に効果的な予防・治療薬、特にマイコプラズマ感染症用のワクチンの開発は急務であった。

ところで、各種病原性ウイルスにおけるワクチンの製造においては、対象の病原性ウイルスの擬似粒子を作成し、当該擬似ウイルス粒子を用いて免疫することで、高い免疫応答が得られることが知られており、当該擬似ウイルス粒子を用いた、高活性でかつ安全性の高いワクチン製剤の開発も進んでいる（非特許文献２）。ウイルスの抗原ペプチドにおいては、リポソームなどに組み込んだワクチンも実用化される方向にある（非特許文献３）。
ウイルスは、細胞の仕組みを利用して構造蛋白や酵素などを自己複製し細胞の膜を被覆し細胞外へ出ることで増殖していく。したがって、細胞膜脂質抗原は存在せず、ワクチンもウイルス粒子や蛋白抗原がほとんどである。サイズが極端に小さいばかりか、その表面の構成成分も少ないため、ウイルス粒子を模すこと、すなわち、生物体の免疫系に対して、あたかもウイルス自体の侵入と錯覚させられるような擬似ウイルス粒子を提供することは比較的簡単であるといえる。

一方、マイコプラズマを含めて細菌類の場合は、DNA により自己複製可能で、脂質膜構成成分も基本的には独自に産生するため、膜脂質成分はそれぞれの細菌に特異的で複雑である。したがって、細胞膜構成成分や膜脂質の解析も困難である上、細胞成分や膜蛋白などまで考慮すると、多岐に亘っており、単純にそのうちの１成分だけでマイコプラズマ自体を模すことは考えにくいため、擬似マイコプラズマ粒子、擬似細菌粒子という概念はなじまなかった。通常、これらの多くの成分の中でどの成分を必須として残し、かつどのような粒子化技術を用いれば、擬似マイコプラズマ粒子を提供できるかは不明であり、このような擬似マイコプラズマ粒子が生物免疫系に対してマイコプラズマ感染と錯覚させられるほどの免疫応答を引き起こせるのかは不明である。

特許第3735388号 特許第3551525号 特許第3717962号 国際公開2007/023583（WO2007/023583) 特開2007-238470号公報 国際公開2007/145361（WO2007/145361） 国際公開2007/145362（WO2007/145362） 特開2009-7279号公報 特開2009-73855号公報 特表2004-537543号公報 特表2004-518655号公報 特表2004-536106号公報 特開2006-311824号公報 特表2005-515162号公報 特表2003-513935号公報 特表2009-500007号公報 特表2006-503830号公報 特開2005-145959号公報 特表2002-526436号公報 国際公開2002/098465（WO2002/098465） 特開2008-37831号公報 特開2001-69977号公報 特開2002-241313号公報 特許第2828391号 特開2004-010481号公報 特願2007-288728号公報 特許第2828391号

松田和洋 特集マイコプラズマ感染症の基礎と臨床 慢性関節リウマチの関節破壊原因物質としてのMycoplasma fermentans 特異コリン含有糖リン脂質 微生物と臨床 30:75-79 (2003) Influenza virus-like particle vaccines.Haynes JR.Expert Rev Vaccines. 2009 Apr;8(4):435-45. Review Immunobiology of human papillomavirus infection and vaccination implications for second generation vaccines.Stanley M, Gissmann L, Nardelli-Haefliger D.Vaccine. 2008 Aug 19;26 Suppl 10:K62-7. Review. Mol.Immunol.25:10,1025-1031,1988 Matsuda K, Saito M, Yamamoto N Encyclopedia of Life Science. Vol. 1 p748-755, Nature publishing group,(2001) M. Kraft, Q. & Hamid, J Allergy Clin Immunol 117, 1197-1198. (2006), M. Kraft, G.H. Cassell, J.E. Henson, H. Watson, J. Williamson, B.P. Marmion, C.A. Gaydos, & R.J. Martin, Am J Respir Crit Care Med 158, 998-1001. (1998) F. Meloni, E. Paschetto, P. Mangiarotti, M. Crepaldi, M. Morosini, A. Bulgheroni, & A. Fietta, J Chemother 16, 70-76. (2004) J. Haier, M. Nasralla, A.R. Franco, & G.L. Nicolson, Rheumatology (Oxford) 38, 504-509. (1999) H.W. Clark, M.R. Coker-Vann, J.S. Bailey, & T.M. Brown, Ann Allergy 60, 394-398. (1988) E. Maida, J Neurol 229, 103-111. (1983) G.L. Nicolson, M.Y. Nasralla, J. Haier, & J. Pomfret, J Clin Neurosci 9, 525-529. (2002) F. Daxbock, K. Zedtwitz-Liebenstein, H. Burgmann, & W. Graninger, Ann Hematol 80 , 180-182. (2001) C. Leen, S. & Ling, Arch Dis Child 75, 266-267. (1996) J. Nijs, G.L. Nicolson, P. De Becker, D. Coomans, & K. De Meirleir, FEMS Immunol Med Microbiol 34, 209-214. (2002) G.K. Endresen, Rheumatol Int 23, 211-215. (2003) 松田和洋、只野―有富桂子、飯田―田中直子、新宮佑子、富山哲雄、原澤 亮、森田大児、楠 進、日本マイコプラズマ学会雑誌 第34号 45-46 (2007) Matsuda, K.ら, 日本マイコプラズマ学会雑誌 第31号 35-36 (2004） 松田和洋 日本マイコプラズマ学会雑誌 第35号 41-43 (2008) Miyachi, A., Miyazaki, A., Shingu, Y., Matsuda, K., Dohi, H., Nishida, Y., Carbohydrate Research 344 : 36-43 (2009) Nishida, Y., Takamori, Y., Ohrui, H., Ishizuka, I., Matsuda, K., Kobayashi, K., Tetrahedron lett. 40:2371-2374 (1999) Nishida, Y., Takamori, Y., Matsuda, K., Ohrui, H., Yamada, T., Kobayashi, K., J. Carbohydr. Chem. 18:65-72 (1999) Matsuda, K., Ishizuka, I., Kasama, T., Handa, S., Yamamoto, T., Biochim. Biophys. Acta 1349:1-12 (1997) Matsuda, K., Li, J-L., Harasawa, R., Yamamoto N. Biochem. Biophys. Res. Com. 233: 644-649 (1997) Matsuda, K. , Harasawa, R. , Li, J. L. , Kasama, T. , Taki, T. , Handa, S. , Yamamoto, N., Microbiolo. Immunol. 39: 307-313 (1995) Matsuda, K. , Kasama, T. , Ishizuka, I. , Handa, S. , Yamamoto, N. , Taki, T. J. Biol. Chem. 269:33123-33128 (1994) Nishida, Y. , Ohrui, H. , Meguro, H. , Ishizawa, M. , Matsuda, K. , Taki, T. , Handa, S. , Yamamoto, N., Tetrahedron Lett. 35: 5465-5468 (1994) Ishida, N., Irikura, D., Matsuda, K., Sato, S.,Sone, T., Tanaka, M., Asano, K, Molecular Cloning ans Expression of a Novel Cholonephosphotransferase Involved in Glycerophospholipid Biosynthesus of Mycoplasma fermentans. Curr Microbiol (2009 in press) Matsuda, K., Li, J-L., Harasawa, R., Yamamoto N. Phosphocholine-containing glycoglycerolipids (GGPL-I and GGPL-III) are species-specific major immunodeterminants of Mycoplasma fermentans. Biochem. Biophys. Res. Com. 233: 644-649 (1997) C. Leen, S. & Ling, Arch Dis Child 75, 266-267. (1996) Kawahito, Y., Ichinose, S., Sano, H., Tsubouchi, Y., Kohno, M., Yoswhikawa, T., Tokunaga, D., Hojo, T., Harawsawa, R., Nakano, T., Matsuda K. Mycoplasma fermentans glycolipid-antigen as a pathogen of rheumatoid arthritis. Biochem. Biophys. Res. Com. 369 : 561-566 (2008) M.F. Barile, Mycoplasma and leukemia, Ann N Y Acad Sci 143： 557-572 (1967) Sato, N., Oizumi, T., Kinbara, M., Funayama, H., Sato, S., Matsuda, K., Endo, Y.FEMS Immunology and Microbiology 59 : 33-41(2010)

マイコプラズマ感染症に対する治療効果が高く安全なワクチンを提供し、効果的なマイコプラズマ感染症の予防・治療方法の開発を目的とする。そして、そのマイコプラズマ感染症用ワクチンとして有効な擬似マイコプラズマ粒子、さらには一般的な細菌も含めた擬似細菌粒子を提供することも目的とする。

本発明者らは、従来からヒトやブタなどの各種病原性マイコプラズマのそれぞれの種に特異的な脂質抗原を単離精製しており、特にヒト病原性のマイコプラズマ・ニューモニエ特異的な脂質抗原であるGGL Glc-type、GGL Gal-type及びマイコプラズマ・ファーメンタンス特異的な脂質抗原であるGGPL-I、 GGPL-IIIについては、それぞれ構造決定後、化学合成にも成功している(特許文献１〜８）（非特許文献５）。そして、本発明者らはこれら特異的な脂質抗原を用いて、血清中の抗体を高感度で特異的に検出できるマイコプラズマ感染症の診断法を開発し、確立してきたが、さらにこれらの脂質抗原のそれぞれが各マイコプラズマ種に特異的であることに着目し、これらの脂質抗原を用いた有効なワクチン製剤の製造を目指して鋭意研究を続けていた。
ところで、従来から、安定なワクチン製剤用の担体の研究開発は盛んであり、免疫原を粒子表面にコーティングしたワクチン組成物など（特許文献１７）と共に、リポソームを担体として利用し、抗原蛋白や各種アレルゲンなどを、疎水性ペプチドなどを介してリポソーム膜表面に結合させたリポソーム製剤を、診断用やワクチン用製剤として用いる技術の開発も進んでいる（特許文献１８〜２０）。また、抗原が結合したリン脂質を用いて作成したリポソームに、Ｔ細胞活性化剤としての作用が確認された例も知られている（特許文献２１）。反対に、抗原がリン脂質抗原である場合には、リポソーム膜構成成分として取り込ませ、抗体と反応すると補体作用によりリポソームが破壊される性質を利用した抗体検出法（補体依存性リポソーム溶解検定）に用いられていたが、あくまでリン脂質抗原の抗体スクリーニングや診断のために用途が限られていた（特許文献２２、非特許文献４）。
しかし、本発明者らは、マイコプラズマの場合、細菌の中で最もサイズが小さく、細胞壁がほとんどなく細胞膜構造が単純であり、しかも、細胞膜の主要な成分が脂質膜であることに着目し、本発明者らが精製した特異的脂質抗原を安定で均一なリポソーム粒子化することを思いついた。当該リポソーム粒子であれば、擬似マイコプラズマ粒子として、生体の免疫系に作用させた場合に、マイコプラズマ感染と同様の免疫反応を引き起こす可能性があると発想したわけである。
そこで、本発明者らは、マイコプラズマ・ニューモニエおよびマイコプラズマ・ファーメンタンスそれぞれ２種類の脂質抗原の化学合成品を精製して、種々のリポソーム成形法を検討した上で、安定なリポソーム粒子化に成功した。また、ブタのマイコプラズマ症の原因であるマイコプラズマ・ハイオリニスとマイコプラズマ・ハイオニューモニエの特異的脂質抗原も単離、精製後同様の方法でリポソーム粒子化させることができた。さらに、マイコプラズマ細胞膜脂質構成成分の解析結果をもとに、特異的脂質抗原と共に擬似粒子を構成する脂質成分の脂肪酸組成までも擬似させた、最も単純で機能的な粒子を作成した。
そして、このように作製した擬似マイコプラズマ粒子を用いて各種モデル実験動物を免疫することで、いずれの粒子でも強い免疫反応を誘導できるワクチン効果を確認することができた。特に、脂質成分をマイコプラズマ細胞膜構成成分にそろえ、かつ粒径を均一に調整した擬似マイコプラズマ粒子の免疫誘導活性は高かった。
マイコプラズマ擬似粒子により活性の解析を進めた結果、極めて単純な構成成分でありながらマイコプラズマの免疫学的な活性をよく反映し、安定であることがわかった。脂質抗原以外のリン脂質やコレステロールなど脂肪酸部分までマイコプラズマの成分分析に基づいた構成成分により、よりマイコプラズマに対する生体内の免疫応答を的確に反映する。
従来のリポソームを利用したワクチンは、リポソームを構成する脂質に、蛋白、ペプチド、糖質などを結合させたりリポソーム内に入れ込んだりしたものであるが、本発明の脂質抗原擬似細菌粒子は、脂質抗原そのものがリポソームの構成成分であるので、すべてが極めて単純化された粒子であり、安定であり、毒性が少なく安全性も高い。
また、アジュバントとしての作用効果を呈することを確認することができた(非特許文献３３)。また、本発明の特異的脂質抗原に基づく免疫誘導活性は、IgG及びIgMのみならず、粘膜性のIgAを誘導するものであることが確認できたため、粘膜性免疫用のアジュバントとしての利用可能性が強く示された。
そして、本発明者らは、マイコプラズマ以外の各種病原性細菌に対しても、マイコプラズマでの特異的脂質抗原の探索手法を適用し、それぞれに特異的な脂質抗原が存在することを確認した。これら特異的な脂質抗原を用いることで、各細菌の種に特異的な活性を誘導する擬似細菌粒子を作成できる。しかも、これら細菌類は、それぞれの細胞膜構成脂質成分の脂肪酸組成が異なっていることから、各細菌での脂質成分分析結果も踏まえ、マイコプラズマでの最適化手法を適用することで最適なリポソームの組成と粒径を設定することで、各細菌における擬似細菌粒子、及びそれを用いたワクチンの製造が可能である。
以上の知見を得たことで、本発明を完成することができた。

すなわち、本発明は、具体的には以下の通りのものである。
〔１〕 病原性細菌に特異的な脂質抗原の１種又はそれ以上をリポソーム構成脂質成分として含むリポソーム粒子からなることを特徴とする、擬似細菌粒子。
〔２〕 マイコプラズマに特異的な脂質抗原の１種又はそれ以上をリポソーム構成脂質成分として含むリポソーム粒子からなることを特徴とする、擬似マイコプラズマ粒子。
〔３〕 前記マイコプラズマに特異的な脂質抗原の少なくとも１種が、マイコプラズマ菌体調製物から抽出後、単離精製されたマイコプラズマ特異的糖脂質である、前記〔２〕に記載の擬似マイコプラズマ粒子。
〔４〕 前記マイコプラズマに特異的な脂質抗原の少なくとも１種が、化学的又は酵素的に合成された後に、単離精製された特異的糖脂質である、前記〔２〕に記載の擬似マイコプラズマ粒子。
〔５〕 前記マイコプラズマ特異的脂質抗原の少なくとも１種が、マイコプラズマ・ニューモニエ特異的脂質抗原、又はマイコプラズマ・ファーメンタンス特異的脂質抗原である、前記〔２〕〜〔４〕のいずれかに記載の擬似マイコプラズマ粒子。
〔６〕 前記リポソーム構成脂質成分として、さらにフォスファチジルコリン、フォスフォグリセロール及び／又はコレステロールを含むことを特徴とする、前記〔２〕〜〔５〕のいずれかに記載の擬似マイコプラズマ粒子。
〔７〕 前記マイコプラズマ特異的脂質抗原を含むリポソーム構成脂質成分を溶媒中で混合後、超音波処理により、粒子径が30〜300nmの範囲内で、かつその80％以上が40〜200nmの範囲内になる条件で粒子化した、前記〔２〕〜〔６〕のいずれかに記載の擬似マイコプラズマ粒子。
〔８〕 前記リポソーム粒子表面に、他の抗原性物質を存在させた擬似マイコプラズマ粒子であって、前記マイコプラズマ特異的脂質抗原のアジュバント効果により、当該他の抗原性物質の抗原性が高められていることを特徴とする、前記〔２〕〜〔７〕のいずれかに記載の擬似マイコプラズマ粒子。
〔９〕 前記他の抗原性物質がウイルス由来の抗原ペプチドである、前記〔８〕に記載の擬似マイコプラズマ粒子。
〔１０〕 前記〔２〕〜〔７〕のいずれかに記載の擬似マイコプラズマ粒子を有効成分として含む、マイコプラズマ感染症の予防又は治療用ワクチン。
〔１１〕 前記マイコプラズマ感染症が、肺炎、喘息、又はリウマチ性疾患である、前記〔１０〕に記載のマイコプラズマ感染症の予防又は治療用ワクチン。
〔１２〕 マイコプラズマ感染症に罹患した、又は罹患の疑いのあるヒト又は動物に対し、前記〔１０〕又は〔１１〕に記載のマイコプラズマ感染症の予防又は治療用ワクチンを少なくとも１回投与する工程を含むことを特徴とする、マイコプラズマ感染症の予防又は治療方法。
〔１３〕 前記ワクチンを用いたマイコプラズマ感染症の治療方法において、前記ワクチンを投与する前に、及び／又は投与した後で、マイコプラズマ種特異的脂質抗原量もしくは当該脂質抗原特異的抗体量を測定する工程を設け、当該測定値の程度により、次のワクチン投与時期及び投与量を決定する工程を含むことを特徴とする、前記〔１２〕に記載のマイコプラズマ感染症の治療方法。
〔１４〕 前記〔９〕に記載の、粒子表面にウイルス由来抗原ペプチドが存在する擬似マイコプラズマ粒子を有効成分とすることを特徴とする、当該ウイルス感染症に対する予防又は治療用ワクチン。
〔１５〕 前記ウイルスがインフルエンザウイルスであり、前記ウイルス感染症がインフルエンザである、前記〔１４〕に記載のワクチン。
〔１６〕 ウイルス感染症に罹患した、又は罹患の疑いのあるヒト又は動物に対し、前記〔１４〕又は〔１５〕に記載のウイルス感染症の予防又は治療用ワクチンを投与する工程を含むことを特徴とする、ウイルス感染症の予防又は治療方法。
〔１７〕 前記ウイルスがインフルエンザウイルスであり、前記ウイルス感染症がインフルエンザウイルス感染症である、前記〔１６〕に記載の予防又は治療方法。
病原性細菌に特異的な脂質抗原をリポソーム構成脂質成分として含むリポソーム粒子からなることを特徴とする、擬似細菌粒子。

本発明の擬似マイコプラズマ粒子など、擬似細菌粒子は、均一な粒子径の安定なリポソーム製剤として提供することができる。これらの擬似細菌粒子は、ヒト又はブタなどの哺乳動物に投与することで、強い液性および細胞性免疫を効率よく誘導することができ、粘膜性免疫であるIgA誘導活性も高いので、マイコプラズマ感染症用のワクチン製剤のみならず、ウイルスや他の病原微生物感染症用ワクチンのためのアジュバント、IgA誘導性アジュバントとして用いることができる。そして、これらのワクチン製剤、アジュバント製剤は毒性もなく、安全でかつ安定な製剤として提供可能なため、きわめて有用である。また、特にIgA誘導性アジュバントの場合は、従来有効性の高いものとしては金属アルミニウムのような毒性の高いアジュバントしかなかったことから、極めて画期的である。
特にヒトのマイコプラズマ感染症については、本発明者らの以前の研究により、すでにその原因となるマイコプラズマ・ファーメンタンス及びマイコプラズマ・ニューモニエの診断方法も確立していることから、本発明によるワクチン製剤の提供により、マイコプラズマ感染症の病態分子機構に基づいた診断・予防・治療システムの確立が可能となる。

マイコプラズマ感染と疾病との関連の概念図 マイコプラズマ感染症の急性症状と慢性化 擬似細菌粒子（擬似マイコプラズマ粒子）の概念図 リポソーム粒径の品質管理 （Ｃ）は、ゼータサイザーによるリポソーム粒径の測定値を示す。 精製されたマイコプラズマ・ファーメンタンス由来抗原脂質GGPL-I 及びGGPL-IIIの定量分析。 各種細菌の脂質画分の比較：大腸菌、緑膿菌、肺炎球菌、肺炎桿菌、インフルエンザ菌およびレジオネラ菌において、特異的な脂質の存在が確認できた。 擬似マイコプラズマ・ニューモニエ粒子を用いたIgG およびIgM抗体の誘導 擬似マイコプラズマ・ファーメンタンス粒子（合成GGPL-III)を用いたSKG系統マウス（自己免疫疾患モデル）の腹腔内免疫によるIgG およびIgM抗体の誘導 マイコプラズマ・ファーメンタンス生菌を用いた動物モデルの作製。経気道モデル及び経膝関節モデルのウサギへの投与実験により、血中のIgG抗体価上昇（ワクチン活性）を観察した。 擬似マイコプラズマ・ファーメンタンス粒子を用いた動物モデルでの合成脂質抗原免疫機能プライミング効果。マイコプラズマ・ファーメンタンス感染関節リウマチモデルのラビットに対して、腹腔内に擬似マイコプラズマ・ファーメンタンス粒子を複数回免疫することで、関節病変を抑制することができた。 関節リウマチ患者由来滑膜細胞内のマイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質抗原（GGPL-III）の分布 ヘリコバクター・ピロリの脂質抗原およびインターフェロンγ誘導活性 動物由来のマイコプラズマ（マイコプラズマ・ハイオリニス およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の特異的な脂質抗原の検出。 マイコプラズマ・ファーメンタンス特異的な脂質抗原（GGPL-III）のアジュバント効果。 左図は、金属ニッケル（抗原）と同時にマイコプラズマ・ファーメンタンス擬似粒子（GGPL-III）をマウスの耳に投与しておくことで、用量依存的（0.2mg/mlと1mg/mlの投与）に抗体産生能を高める効果を確認した。 マイコプラズマ肺炎を含む呼吸器疾患の患者血清中の血清抗体価：マイコプラズマ・ニューモニエ特異抗原GGL Glc-type を用いたELISA 法による IgA の測定結果を示す。ヒト血清中でIgA 抗体が誘導されていることが確認でき、粘膜免疫アジュバントとなりうることが確認された。 擬似マイコプラズマ粒子の細胞免疫活性ヒトの末梢血単核球を用い、インターロイキン２単独投与の場合よりも、擬似マイコプラズマ粒子（GGPL-I、GGPL-III）を加えた場合が、インターフェロンγの産生量を２倍以上に増加させることを確認した。健常人の末梢血から単核球を分離しそこにインターロイキン2と脂質抗原を加えたサンプルと加えないサンプルを培養しその上清を回収、その上清中のインターフェロンγ量を酵素抗体免疫法(ELISA法）で測定した。 若年性関節リウマチ患者のマイコプラズマ・ニューモニエとマイコプラズマ・ファーメンタンスの抗体価の測定結果（ELISA 法） サルコイドーシス患者のマイコプラズマ・ニューモニエとマイコプラズマ・ファーメンタンスの抗体価の測定結果（ELISA 法） 多発性硬化症患者の血清抗体の変動。 小児肺炎マイコプラズマの診断-予防-治療プロトコール 成人肺炎マイコプラズマの診断-予防-治療プロトコール 自己免疫疾患など慢性マイコプラズマ感染症の診断-予防-治療プロトコール マイコプラズマ擬似リポソーム粒子組成の検討 マイコプラズマ擬似リポソーム粒子の投与法の最適化 マイコプラズマ特異的脂質抗原（ＧＧＬ）の定量化（質量分析法） 関節リウマチ患者の関節組織に沈着しているマイコプラズマ・ファーメンタンス特異的脂質抗原ＧＧＰＬ−ＩＩＩの検出（質量分析装置による） 被検患者の咽頭ぬぐい液からのマイコプラズマ・ニューモニエ特異的脂質抗原ピークの同定

１．マイコプラズマ感染症について
マイコプラズマはヒト、家畜さらにペットなどの動物に感染し様々な疾病が知られている。特にヒトにおいては肺炎のみでなく喘息（非特許文献６、７）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）（非特許文献８）などの呼吸器疾患、関節リウマチなどのリウマチ性疾患（非特許文献９、１０）、多発性硬化症（非特許文献１１）や筋萎縮性側索硬化症（ALS）（非特許文献１２）・ギランバレー症候群などの神経疾患、溶血性貧血（非特許文献１３）などの血液疾患、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患、動脈炎・動脈硬化・川崎病（非特許文献１４）などの心血管系疾患や慢性疲労性症候群（CFS）（非特許文献１５）・線維筋痛症（FMS）（非特許文献１６）などの精神疾患、湾岸戦争病などの原因となることがわかっている。
マイコプラズマ感染は、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、多発性硬化症、リウマチ性疾患などの慢性難治性疾患の原因の最有力候補であると言われている。しかし、慢性疾患の経過を追える特異的で定量性のある診断法と治療法が確立していなかったため、病態との関連が十分に解明されず適切な治療が行われていない。（図１）

マイコプラズマ感染は、発熱・咳・肺炎などの風邪症状から発症し、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、多発性硬化症、リウマチ性疾患へ移行する症例がある（非特許文献１７，１８）。その際、症状の再燃・増悪を繰り返し次第に慢性疾患に移行していくことも知られている。しかしながら、従来の検査法ではマイコプラズマ感染の診断や治療経過を把握することがむずかしかったために詳細が明らかにされず、そのために適切な治療を受けられない患者が多いのが現状である。（非特許文献１９）（図２）
ブタ、ウシなど家畜へのマイコプラズマ感染症も深刻な疾患を引き起こすことが知られている。例えば、マイコプラズマ・ハイオリニスやマイコプラズマ・ハイオニューモニエはブタの呼吸器感染症の原因菌のひとつであり、マイコプラズマ・ボビスはウシの呼吸器感染症のひとつである。

２．マイコプラズマ特異的抗原脂質について
（２−１）病原性マイコプラズマの特異的脂質抗原の種類
ヒト病原性マイコプラズマとしては、現在マイコプラズマ・ニューモニエおよびマイコプラズマ・ファーメンタンスが知られており、本発明者らが、各マイコプラズマの特異的脂質抗原を２種類ずつ単離精製し、構造決定後、化学合成をした（特許文献１〜８）、非特許文献２０〜２７）。具体的には、マイコプラズマ・ニューモニエについては、GGL Glc-type及び GGL Gal-typeの２種類であり、マイコプラズマ・ファーメンタンスについては、GGPL-I 及びGGPL-IIIの２種類である。
また、ブタ、ウシなど家畜へのマイコプラズマ感染症も深刻な疾患を引き起こすことが知られている。例えば、豚ではマイコプラズマ・ハイオリニスやマイコプラズマ・ハイオニューモニエは豚マイコプラズマ肺炎などの呼吸器感染症、牛ではマイコプラズマ・ボビスによる牛マイコプラズマ肺炎などの呼吸器感染症やマイコプラズマ乳房炎症などの疾患である。今回、マイコプラズマ・ハイオリニスやマイコプラズマ・ハイオニューモニエそれぞれの特異的脂質抗原も、単離精製してリポソーム粒子化を行い（図４）、得られた擬似マイコプラズマ粒子について免疫活性評価実験に供し、その免疫活性効果を確認した（図１３）。

（２−２）マイコプラズマの特異的脂質抗原の製造方法
本発明において、マイコプラズマの特異的脂質抗原というときは、対象マイコプラズマの膜から単離精製された当該マイコプラズマ特異的な脂質抗原でもよいが、当該脂質の化学構造式が既知の場合（GGPL-I、GGPL-III、GGL Glc-typeあるいは GGL Gal-typeなど）、又は下記（２−３）の手法により構造決定して、化学的に合成し、精製した脂質化合物(特許文献１〜８）を用いることが好ましい。例えば、また、対象マイコプラズマの特異的脂質合成酵素を特定し、当該酵素自体を用いるか、もしくは当該酵素遺伝子をクローニングし、形質転換細胞を用いることで、その酵素合成品として特異的脂質抗原を大量に得ることができる（非特許文献２８）。
以下、典型的なマイコプラズマ・ファーメンタンス特異的脂質抗原であるGGPL-IIIについての抽出、単離精製、構造決定など製造方法について詳細に述べる。これらの手法は、他のマイコプラズマの特異的脂質抗原のみならず、クラミジア、リケッチア、結核菌、肺炎球菌などの他の病原性細菌の特異的脂質抗原の抽出、単離精製、構造決定法微生物に適応することができる。

（２−３）マイコプラズマ特異的脂質抗原の分離・精製・構造決定
以下、マイコプラズマ・ファーメンタンス由来特異的脂質抗原（GGPL-III）についての例を典型例として説明する（特許文献３などの方法による。）。
(1) 糖脂質の分離・精製
マイコプラズマはＰＰＬＯ培地での培養を以下のとおり行った。ＰＰＬＯ液体基礎培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に１０％牛血清、１０％ペニシリン、０．０００２％フェノールレッド及び１％グルコースを加えた液体培地にて３７℃で培養した。培地のｐＨ変化により微生物の増殖を確認した後、１６，０００×ｇで１時間遠心分離した。この操作をもう一度繰り返し脂質抽出用の試料とした。２００Ｌ（湿潤状態の容量）の微生物試料に対し、クロロホルムとメタノールの混合溶媒で脂質画分を抽出した。
(2) 脂質の抽出（GGPL-III）
試料をメタノールに浮遊させて４時間なじませた。そこに倍量のクロロホルムを加え、超音波で菌体を破砕し、さらに４時間放置した。３０００ｒｐｍで遠心し、上清を回収して濃縮し、脂質画分試料とした。
この脂質試料をシリカゲルを充填したカラムクロマトグラフィーにより、クロロホルムとメタノールを使用して分離・精製した。薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により脂質試料を展開し、オルシノール試薬にて染色、精製を行って目的糖脂質画分を得る。
(3) ＮＭＲ分析
得られた脂質画分をＤＭＳＯ−ｄ６：Ｄ２Ｏ＝９８：２溶液に溶解して、６０℃にて１Ｈ−ＮＭＲを測定。ＤＭＳＯ−ｄ６１００％中で測定したＤＱＦ−ＣＯＳＹスペクトル帰属のデータをとる。
(4) 質量分析
得られた脂質画分に対し、ＥＳＩ−ＭＳ測定による分析を行う。
(5) 構造決定及び化学的合成
上記(3)、(4)のデータをもとに、糖脂質の一応の構造決定を行い、構造を確定するため、化学合成により立体選択的かつ位置選択的にそれぞれの骨格を合成する。
(6) 化学合成品とのデータ比較による構造の確定
得られた化学合成品を、１Ｈ−ＮＭＲ測定を天然物と同様のＤＭＳＯ−ｄ６：Ｄ２Ｏ＝９８：２、６０℃の条件において行い、そのスペクトルを解析し比較した。その結果、合成品のスペクトルは天然物のそれと一致したことから、絶対構造を確定した。

（２−４）酵素合成法（非特許文献２８の方法による）
対象のマイコプラズマのデータベースを検索し、候補となる脂質合成酵素遺伝子を用いて形質転換大腸菌により大量合成し、対象の特異的脂質の合成酵素を特定する。当該合成酵素自体を用いて酵素合成品を得てもよく、または当該合成酵素遺伝子を用いて形質転換した形質転換細胞内において酵素合成させることで、培地内に特異的脂質抗原を大量に得ることができる。

３．本発明における擬似細菌粒子が対象とする細菌について
本明細書において「擬似マイコプラズマ粒子」というとき、マイコプラズマそれぞれの種に特異的な脂質抗原を精製し、精製脂質抗原単独で、または他のリン脂質やコレステロールなどの脂質と混合した脂質をリポソーム粒子としたものであって、かつ当該マイコプラズマが感染する生物体内の免疫系において、免疫応答を引き起こすことができるリポソーム粒子をいう。
同様に、病原性細菌それぞれの種に特異的な脂質抗原を精製し、精製脂質抗原単独で、または他のリン脂質やコレステロールなどの脂質と混合した脂質をリポソーム粒子としたものであって、かつ当該病原性細菌種が感染する生物体内の免疫系において、免疫応答を引き起こすことができるリポソーム粒子を「擬似細菌粒子」という。
本発明の擬似細菌粒子に用いる細菌としては、典型的には実施の態様で用いたマイコプラズマであるが、マイコプラズマに限らず、同様に細胞表面に特異的な抗原脂質を有している細菌類であれば、当該特異的抗原脂質を単離精製して、リポソーム表面に提示させてやることで、擬似細菌粒子を製造することができる。これら細菌類のうちでも、特にサイズや細胞表面構造がマイコプラズマと類似した、レジオネラ菌などのリケッチアやクラミジアなどが適している。なお、当該特異的抗原脂質は、単離精製して構造決定することができれば、化学合成も可能であり、また当該抗原脂質合成酵素の遺伝子をクローニングして酵素合成することも可能である。
この方法をほかのヘリコバクター・ピロリ菌、クラミジア、リケッチア、結核菌、肺炎球菌などの病原性細菌に適応し、同様な、脂質抗原粒子を作成して利用することができる。図６は各種細菌の脂質画分の比較、大腸菌、緑膿菌、肺炎球菌、肺炎桿菌、インフルエンザ桿菌およびレジオネラ菌においてそれぞれの菌で特異的な脂質が認められた。具体的には、それぞれの菌を大量培養しクロロホルム-メタノールで分画し、それらを薄層クロマトグラフィーで展開する。展開後オルシノール硫酸で染色し検出した。
また、ヘリコバクター・ピロリ菌においても、特異的な脂質抗原の存在が明らかとなり、マイコプラズマでの上記単離精製方法を適用して精製特異脂質抗原を取得し、擬似マイコプラズマ粒子作製手法と同様の手法で擬似ヘリコバクター・ピロリ粒子を作製した。そして、当該粒子にC57BL/6マウスの骨髄細胞でのインターフェロンγの誘導活性を確認することができた（実施例１３、図１２）。このことは、本発明の擬似マイコプラズマ粒子に関する知見が、ヘリコバクター・ピロリ菌等他の細菌にも適用できることを立証するものである。

４．擬似細菌リポソーム粒子の作製法
（４−１）リポソームについて
「リポソーム」は、内部に水相を含むリン脂質二重層の微小ベシクルで、脂質を相転移温度以上で、十分な量の水で水和することにより形成され、その脂質二重層の数に基づいて分類した場合、複数の脂質二重層からなる多重膜リポソーム（ＭＬＶ）と単一の脂質二重層からなる一枚膜リポソームに分けられ、後者は、さらに大きさに基づいて、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）、大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ、ＲＥＶ）および巨大リポソーム（ＧＵＶ）に分けられるが、本明細書でリポソーム又はリポソーム粒子というときは、単一の脂質二重層からなる小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）であり、直径が、数100nm以下のものをいう。本明細書での最適なリポソームの粒子径は、対象の細菌により異なるが、数10〜数100nmの範囲内で、できるだけ均一の粒子径であることが好ましい。例えばマイコプラズマの場合は、約40〜200nmの範囲にそろえることが最も好ましい。
リポソームを構成するリン脂質は、生体膜の主要構成成分であるため毒性が低いうえ、投与の目的、方法に合わせて粒子サイズをコントロールすることができ、更には、リポソーム粒子表面に官能基を導入することによって抗原、抗体、糖鎖などをリポソームに導入することができ、標的部位に対するターゲティング（標的指向化）が可能となるという利点があり、これらの利点を生かした製剤学的研究が広く行われている（特許文献２３〜２６）。これらの手法は、本発明においてリポソーム粒子化された擬似細菌粒子をアジュバントとして用いる際に利用可能な技術である。

（４−２）脂質抗原含有リポソーム粒子の分析法（図５）
本発明の擬似マイコプラズマ粒子など擬似細菌粒子をワクチンとして投与するためには、粒径及び組成において、常に一定の安定した品質で提供される必要がある。そのためにも、リポソーム粒子の粒径の測定及び組成分析法の確立は重要である。
本明細書では、リポソーム粒子の組成分析を行うにあたり、ＨＰＬＣを利用する。このＨＰＬＣによる分析に際して、用いる検出器は特に制限されず、紫外線吸光検出器や蒸発光散乱検出器（以下、ＥＬＳＤということがある）などを用いることができる。中でも、脂質のような非揮発性成分を高感度に検出でき、高精度な定量が可能になる点から蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を用いるのが望ましい。
ＨＰＬＣを用いて、リポソームの組成分析を行うと、用いるカラムの種類、使用する溶媒の種類と流速に応じて、リポソーム中の成分が固有のｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ（試料がカラム内に滞留する時間）を示す。このことから、各成分の組成を調べることができる。ＨＰＬＣで溶出された各成分を定量することができる。特に検出器としてＥＬＳＤや質量分析機を有するＨＰＬＣを用いることで、リポソーム成分を、高感度、高精度、かつ簡略に組成分析ができ、さらに正確な定量も同時に行うことができる（図５）。従って、実際の生産工程において品質管理にＨＰＬＣによる分析を行うことで、安定した品質が確保できる。

（４−３）本発明の特異的脂質抗原のリポソーム化方法
リポソームの作製自身は多数の手法が公知である［D.W.Deeamer,P.S.Uster,"Liposome"ed.by M.J.Ostro, Marcel Dekker Inc.,N.Y. Basel, 1983, p27 ］。ボルテックス法および超音波法が一般的であるが、そのほかにエタノール注入法、エーテル法および逆相蒸発法などが適用でき、これらを組合せて使用される。
例えば、ボルテックス法および超音波法においては、所定の脂質を有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、クロロホルム又はこれらの混合物、例えばメタノールとクロロホルムとの混合物に溶解した後、該有機溶剤を蒸発除去することにより脂質の薄層を得る。次に、この脂質の薄層に水性媒体を加えてボルテックス処理又は超音波処理することによりリポソームが形成される。この際に、上記水性媒体にワクチン等の活性成分である所望 の抗原又は免疫原を混入、例えば溶解又は懸濁させておくことにより、該抗原又は免疫原をリポソームに封入することができる。
脂質抗原が有機溶剤に溶解する場合には、合成脂質抗原を、リポソーム構成用脂質と共に、リポソーム製造過程において前記のごとき有機溶剤に溶解し、以後、常法に従ってリポソームを形成すればよい。リポソームの量に対する脂質抗原の量は脂質抗原の種類、封入しようとする脂質抗原以外の抗原の種類、リポソームの組合せ構造等により異なるが、一般に、リポソームを構成する他の脂質１mgに対して５μｇ〜５００μｇである。
本発明の擬似マイコプラズマ粒子など擬似細菌粒子のためのリポソーム作製法としては、これらのリポソーム作製法のうちでも、超音波法が好ましい。さらに、本発明者らは、まずエタノール注入法を適用した上で、超音波法を組み合わせることでさらに均一性が高く安定なリポソーム粒子が製造できることを見出した。加えて、所望の孔サイズのフィルターにより濾過することにより、粒径を整えることができ、一定の粒径の安定な高品質のリポソーム粒子を提供できる。

（４−４）本発明の脂質抗原含有リポソーム粒子の最適化
マイコプラズマに特異的な脂質抗原は、単独でリポソーム粒子形成が可能であるため、リポソーム粒子の脂質成分として、マイコプラズマ特異的な脂質抗原のみで形成した擬似マイコプラズマ粒子も、粒子化してすぐに生体に投与すれば強い免疫応答を引き起こし、ワクチン活性は十分に期待できるが、粒径もまちまちで不安定であるため、ワクチン・アジュバント・免疫調節剤あるいは診断用製剤としては不適切である。そこで、ワクチン製剤などとして用いる際には、リポソームを構成する脂質の構成比やリポソームの大きさを変えることにより、合成脂質抗原の安定化、より天然に近い効果、安全性の高さを最適化することが必要となる。リポソームの最適な形は、そのリポソームに期待する効果によって異なり、その効果とは、Drug Delivery System (DDS)としての効果・抗原提示・抗体誘導・アジュバント効果などである。
マイコプラズマに特異的な脂質抗原の物理化学的解析の基礎データに基づいて、最適化処理条件を検討したところ、粒子径としては、100nm 前後の粒子径のものが最も安定であり、長期保存が可能で、製剤の効果が安定な製剤として最適であることがわかってきた。つまり、擬似マイコプラズマ粒子において、最適なリポソーム製剤粒子の最適化というとき、その粒子径は、30〜300nmの範囲内に粒子径をそろえることをいい、同時に、全粒子の80％が40〜200nmの範囲内になる条件にそろえることが好ましい。
また、リポソーム組成としては、マイコプラズマの増殖に必須なコレステロールや基本構成成分であるフォスファチジルコリンなどのリン脂質を用いる（図２３）。天然のマイコプラズマの脂肪酸の長さは炭素数１６で飽和型が最も多く次いで炭素数１８および炭素数１４なので、これにあわせた炭素数１６合成抗原を用いた結果を示してある。合成脂質抗原のみで粒子を作製すると大きさや分布が均一でないため、さらに、コレステロールと炭素数１６で飽和型のフォスファチジルコリンの比を変えて、粒子系と分布を測定した。これらの結果から、モル比として脂質抗原10-50％、フォスファチジルコリン20-50％、コレステロール10-50％が好ましいことがわかった。これは、マイコプラズマ脂質の解析データに近い結果であった（非特許文献２９）。
したがって、擬似マイコプラズマ粒子における最適化というとき、そのリポソーム組成を、脂質抗原：フォスファチジルコリン：コレステロールの配合割合を、モル比率で、10〜50：20〜50：10〜50の範囲内にすることをいう。そして、同時に用いるフォスファチジルコリンの炭素数が１４〜１８、好ましくは１６であって、飽和型のフォスファチジルコリンであることが最適である。
マイコプラズマの脂質抗原の同定・精製過程において、膜脂質構成成分が複雑でなく、フォスファチジルコリンとコレステロールおよび脂質抗原を中心とした構成であること、また、脂肪酸部分の組成も極めてシンプルであることなどがわかり、これらの結果を考慮し、安定で効果的なマイコプラズマ擬似粒子を作製した。

５．本発明の擬似細菌粒子の特徴
実際のマイコプラズマ感染では、溶菌、細胞への取り込み、（脂質）抗原提示、抗体の産生、T 細胞やNKT細胞などの細胞免疫反応が引き起こされるが、マイコプラズマに特異的な脂質抗原を含む擬似マイコプラズマ合成リポソーム粒子は、同様の反応が誘導される。
また、この擬似細菌リポゾーム粒子については、それぞれ目的とする機能により最適化した構成成分や大きさを変えることができる。
特に、精製合成脂質抗原を用いることによりマイコプラズマのほかの成分の影響を完全になくしたきわめて特異的な免疫活性化製剤となる。脂肪酸の長さなど最適化したものは、さらに好ましい。構成成分がシンプルなため、抗体誘導、ワクチン、アジュバント、細胞免疫療法など、それぞれの用途に合わせた製剤に最適化していける。合成脂質抗原の特異的なワクチン効果をみるため、精製および合成脂質抗原をもちい、複数のマイコプラズマ種や複数の脂質抗原合成品をもちいて、活性を検討できる。
リポソームの作成法として、合成した脂質抗原およびマイコプラズマ脂質解析に基づいた構成成分に近いものを中心に検討した。それぞれの細菌の特異脂質抗原を中心とした構成成分で作成するリポソームでそれぞれの細菌の特徴を持った免疫粒子が作成できた。合成脂質抗原および抗体の上昇など製剤の効果を的確に評価する方法により、製剤の検討、実用化が可能となった。マイコプラズマの免疫活性に極めて近く、しかも、生ワクチンのような病原性回帰や不活化ワクチンのような不純物やロット差がなく、毒性が低い。

６．合成脂質抗原粒子の免疫活性の評価法
（６−１）脂質抗原粒子の腹腔内投与による抗体誘導活性の定量
C57BL/6Jマウス（8 weeks female）腹腔内にマイコプラズマ脂質抗原粒子を４回腹腔内投与する。抗原投与１回目から３回目までは投与直前に毎回、部分採血を行う。抗原４回目投与から４日経過後に部分採血(血清)を行う。特異脂質抗原をコーティングしたELISAにより、抗体の測定を行う。２次抗体により、IgM、IgGの測定が可能。さらに、IgAに対する２次抗体を用いることで、IgA の産生、つまり粘膜免疫誘導活性を測定することができる。測定結果をマーカーにして、脂質抗原の量、組成、形状、溶剤などについての最適化を行うことができる。

（６−２）脂質抗原粒子の鼻腔内投与による抗体誘導活性の定量
C57BL/6Jマウス（8 weeks female）鼻腔内にマイコプラズマ脂質抗原粒子を４回鼻腔内投与する。抗原投与１回目から３回目までは投与直前に毎回、部分採血を行う。抗原４回目投与から４日経過後に部分採血(血清)を行う。特異脂質抗原をコーティングしたELISAにより、抗体の測定を行う。２次抗体により、IgM、IgGの測定が可能。さらに、IgAに対する２次抗体を用いることで、IgA の産生、つまり粘膜免疫誘導活性を測定することができる。測定結果をマーカーに、脂質抗原の量、組成、形状、溶剤などについての最適化を行うことができる。

（６−３）ヒトでの脂質抗原粒子による抗体誘導の評価法
マイコプラズマ感染患者の血清中の抗体測定や抗体の変動による経過の観察ができることがわかってきており（図１７・１８）、この方法をそのまま適応できる。また、採取した血液でマイコプラズマ増殖阻止活性を測定できる。

（６−４）マススペクトルによる脂質抗原の検出・定量化
本発明者らが開発した、マススペクトロメーター（質量分析機）を用いる脂質抗原の検出法（特許文献６）を利用することで、マイコプラズマの種特異的な糖脂質抗原自体を検出し、定量化することができる。具体的には、任意のイオン化（ＥＩ法、ＥＳＩ法、ＬＳＩ法，ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法など）を用いてイオン化し、通常の質量分析法の手順に従ってマススペクトルを取得することで、マイコプラズマの種特異的糖脂質抗原の検出ができ、定量化スタンダードを用いることで、定量化することも可能である。
例えば、マイコプラズマ・ファーメンタンスの特異的糖脂質抗原ＧＧＰＬ−Ｉの場合、ポジティブモードで、質量電荷比９２４、８９６、６５８、６４０、４２０、４０２、３２８、３１０、１８４、または１０４ｍ／ｚの特有のイオンピークが検出され、ネガティブモードで、質量電荷比が９０８、８８０、８０９、６４２、６２４、４０４、３８６、３１２、２９４、および１６８ｍ／ｚの特有のイオンピークが検出される。とりわけ、このピークの中で８９６ｍ／ｚのピークがＧＧＰＬ−Ｉに特徴的なピークなので、８９６ｍ／ｚのピークの存在を確認することでＧＧＰＬ−Ｉの存在を確認することができる。より正確に同定しようという場合は、上記複数の上記ピークが存在することを確認する。マイコプラズマ・ファーメンタンスの特異的糖脂質抗原ＧＧＰＬ−ＩＩＩの場合は、ポジティブモードで、質量電荷比１８４、２３９、１０４９、または１０７７ｍ／ｚに、あるいは、ネガティブモードで、質量電荷比が８０９、８２３、８６４、９８８、１０４７、または１０７５ｍ／ｚに特有のイオンピークが検出される。とりわけ、このピークの中で１０４９ｍ／ｚのピークがＧＧＰＬ−ＩＩＩに特徴的なピークなので、１０４９ｍ／ｚのピークの存在を確認することでＧＧＰＬ−ＩＩＩの存在を確認することができる。一方、マイコプラズマ・ニューモニエの特異的糖脂質抗原ＧＧＬのポジティブモードは、ナトリウムを添加することで明瞭に観察でき、その特有のピークは、質量電荷比１８５、２０２、３４７、３６３、４０５、４９７、５２５、６５９、６８７、９１５、もしくは９４３ｍ／ｚの位置に顕れ、ネガティブモードでは、質量電荷比３７９、６３５、６６３、８９１、もしくは９１９ｍ／ｚの位置に顕れる。とりわけ、このピークの中で９１５ｍ／ｚのピークがＧＧＬに特徴的なピークなので、９１５ｍ／ｚのピークの存在を確認することでＧＧＬの存在を確認することができる。（なお、ここで、ポジティブモードとは、質量分析器において、正イオンで被検対象分子をイオン化する場合をいい、ネガティブモードとは、負イオンでイオン化する場合をいう。）
そして、これら特異的糖脂質抗原量を定量化しようとする場合には、これらGGPL-I、GGPL-III及びGGL Glc-type, GGL gal-typeなど特異的糖脂質抗原の少なくとも１つに対応する重水素化した糖脂質を合成して、段階的な濃度の糖脂質スタンダードを調整しておく。そして、被検サンプルに対して、各濃度の脂質スタンダードを加えてマススペクトル測定を行い、被検サンプルの特徴的なピークの山の高さを、糖脂質スタンダード特有のピークの山の高さと比較して、両者が同程度の高さの山の高さであるときの糖脂質スタンダード濃度を、サンプル中の特異的糖脂質抗原量として採用する。例えば、実施例１５では、10⁷ cfu の培養マイコプラズマ・ニューモニエ菌から抽出した特異的脂質抗原GGL量が、その特徴的なピークの山の高さを定量化スタンダードの濃度と比較することで、50 pmolより少なく、5 pmolより多いことが確定される。
実際の被検血液などからのサンプルは、脂質成分以上にきわめて大量のタンパク質のみならず、血球や他の細菌類なども含むものであるため、前処理が必要になる。具体的には、メタノール、クロロホルムなどの有機溶媒に水を加えた溶媒系を用い、遠心分離することで、サンプル中に大量に含まれるタンパク質を除去して脂質抗原を含む脂質画分を下層として抽出する。さらに、シリカゲルなどの吸着担体を用いるクロマトグラフィーや、標的とする特異的脂質抗原に対する抗体を用いたアフィニティーカラムなどを用いて分離精製することもできる。
なお、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）機能を持つマススペクトロメーターであるＬＣ−ＭＳを利用することで、脂質抗原の分離とマス測定を同時に行うこともできる。

（６−５）マススペクトルによる脂質抗原量変化による経過観察と、投与量の最適化
本発明の脂質抗原粒子をワクチンとしてマイコプラズマ感染患者又は感染動物に投与後、一定時間経過後に、あるいは経時的に、患者又は動物由来試料中の特異的脂質抗原量を上記（６−４）の方法で測定する。なお、本発明において、「試料」というとき、被検者又は動物から採取された体液、例えば全血、血漿、血清、関節液、髄液、唾液、羊水、腹水、胸水、尿、汗、膵液、滑液など、及び組織、細胞などを含むものとする。このような簡便な測定法で、血清などの試料中に生き残っているマイコプラズマ脂質抗原を直接的に検出及び定量することができるため、患者に対するワクチンの効き目が迅速にわかる利点がある。そして、経時的に脂質抗原量の変動を経過観察することで、投与量、投与時期に応じたマイコプラズマ増殖阻止活性が正確に評価できるので、その後の最適な治療計画を決定することができる。
すなわち、本発明の脂質抗原粒子を含むワクチン製剤の投与を、マススペクトルなどによる脂質抗原量変化を経過観察しながら行う治療方法は、個々のマイコプラズマ感染患者に対する個別治療方法として威力を発揮する。

７．擬似細菌粒子を含むワクチン活性又はアジュバント活性について
（７−１）ワクチンについて
本明細書において、「ワクチン」という用語は免疫応答を生じ得る物質を意味し、マイコプラズマ感染によるマイコプラズマ感染症の予防ワクチン、並びにマイコプラズマ感染症の治療ワクチンを含む広い意味で用いられる。ワクチンは、製剤化してヒト、家畜、ペット類などの動物に投与するものであり、製剤化、又は投与に際しては、従来のワクチン製剤と同様に薬理学的に許容される各種賦形剤を適宜用いる。

（７−２）擬似マイコプラズマ粒子のワクチン機能
従来、マイコプラズマ類などの病原性細菌用のワクチンは、菌体抽出成分や不活化ワクチンなどが主に用いられており、最近では、DNAワクチンや合成ペプチドワクチンなども用いられてきている。本発明で用いる擬似マイコプラズマ粒子からなるワクチンは、各マイコプラズマ種特異的な脂質抗原を単離精製して用いる。特に化学的な手法などで天然と同じものを合成したものを用いる場合には、不純物の制御や安全性が高いので好ましい。
このような擬似マイコプラズマ粒子をモデル動物に投与した結果、極めて高い免疫応答を引き起こすワクチン機能が確認できた。特に、実施例５では、関節リウマチモデルラビットに対して、予防的にあらかじめ投与した場合に関節病変を抑制するという画期的な結果を得ている（図１０）。
また、その特異的脂質抗原そのものに、下記（７−３）で述べるようなアジュバント活性があるため、副作用などの問題の多いアジュバントを必要としないメリットがある。

（７−３）擬似マイコプラズマ粒子のアジュバント機能
「アジュバント」機能としては、樹状細胞への抗原取り込みを高めるものと樹状細胞を活性させるものの２つの役割がある。
コンポーネントワクチン用アジュバントとしては、たとえば、結核菌の死菌菌体と鉱物油を混合してあるフロインド・コンプリート・アジュバントや、フロインド・インコンプリート・アジュバントなどの鉱物油を用いるアジュバント、リン酸化アルミニウムアジュバント、あるいは、水酸化アルミニウムを主成分とするアラムアジュバントのような無機アジュバントなどが知られている。
現在アジュバント機能効果が高く、有効なアジュバントとして多くのワクチンに認可されているのは、 Alumと呼ばれる水酸化アルミニュウムゲルのみであるが、副作用の点で問題が多い。新たな有効性が高く副反応の少ないアジュバントが求められている。
本発明の擬似マイコプラズマ粒子にはこの２種類のアジュバント機能が確認されており（図１４、１６）、有効性が高く副反応の少ないアジュバントとしての期待が大きい。
アジュバントは接種する人あるいは動物に対してより毒性の低いものであることが望まれ、新たに毒性のないコンポーネントワクチン用のアジュバントとして、マイコプラズマ合成抗原脂質を用いることができる。本発明の脂質抗原含有擬似微生物リポソームは免疫の誘導のためのアジュバント活性を有し、且つ毒性及びそれ自体の抗原性が低いので、ヒトに対して、ワクチン等の抗原のアジュバントとして使用することができる。特に該リポソームに目的とする抗原又は免疫原を封入した場合、強力なワクチンが得られる。合成脂質抗原が効率的に免疫を誘導することがわかり、リポソーム製剤のアジュバントを活性アジュバントとして使用できる。
また、細胞性免疫アジュバントに関し、細胞性免疫の指標として、マウスでの遅延型アレルギー（ＤＴＨ）反応（TH1細胞が担当）を採用することができる。目的とするアジュバントは、ＤＴＨ反応を誘導することができる。したがって、TH1細胞が関与するような病原体の感染防御ワクチン、その免疫療法剤、あるいは癌免疫療法剤のアジュバントとして使用できる。本発明では、マイコプラズマ感染症患者の血清中にIgAが誘導されていることを確認して粘膜免疫に対してその抗原が作用していることが判明しており（図１５）、特に、インフルエンザなど粘膜免疫を特異的に活性化させるアジュバントになり得る。
免疫は液性免疫と細胞性免疫以外にも、その中間に位置するナチュラルキラーT細胞に代表される脂質抗原免疫がある。Alumは液性免疫が比較的良く誘導するが、細胞性免疫に関してはあまり有効ではないとされている（特許文献２７）。持続性のウイルスや感染症において細胞性免疫や自然免疫が重要とされてきているが、それらに有効なアジュバントは出ていない。本発明のマイコプラズマ合成脂質抗原粒子はこのアジュバント活性を有する。

８．マイコプラズマ感染症用の予防又は治療用のワクチン製剤、及び治療用のプロトコル
（８−１）マイコプラズマ感染症用の予防又は治療用のワクチン
マイコプラズマ(微生物）の膜表面に存在し免疫システムに作用する形態を模擬して作成した脂質抗原含有擬似マイコプラズマ粒子により特異抗体の誘導やワクチン活性が得られた。
マイコプラズマ・ニューモニエに特異的な脂質抗原２つとマイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的な脂質抗原２つに対する抗体測定法を用いて、慢性難治性疾患（喘息、ＣＯＰＤ、多発性硬化症、リウマチ性疾患など）についてマイコプラズマ感染と病状経過の関連性を検討し、マイコプラズマ感染が原因となっている患者を選択する。選択した患者について、抗マイコプラズマ薬の効果も含めたマイコプラズマ感染治療を行える。治療法とは、脂質抗原ワクチン、脂質抗原抗体療法、脂質抗原に関連する免疫療法、脂質抗原を減量する抗菌剤や漢方薬、脂質抗原の作用を軽減する抗アレルギー剤やステロイド剤など、あるいはそれらの組み合わせの総称である。ここに、ELISA法を用いた診断−治療システムを提供する。

（８−２）投与形態、投与方法
投与方法については、マイコプラズマ感染症の病状に応じて対応できるように、ELISA法やマイコプラズマ脂質抗原を基盤とした経過観察マーカーや診断法を用いて病状を把握し、選択できる。
擬似マイコプラズマ粒子ワクチンの投与経路としては、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は経口的のいずれであってもよい。その際には、従来からワクチン製剤に用いられている、薬理学的に許容されている安定剤、抗酸化剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、着色剤、アルコール、緩衝剤などの賦形剤を併用することができる。また、本発明のワクチンは、他の抗原成分と混合して用いてもよく、公知のマイコプラズマ用抗生物質などの抗菌剤、抗炎症剤などの薬剤と併用してもよい。
また、本発明のワクチンは、治療効果のみならず予防効果が期待できるため、マイコプラズマ感染が危ぶまれる場合に、あらかじめ投与しておく、予防用ワクチンとしても有効である。

（８−３）投与量
本発明の脂質抗原含有擬似細菌粒子は、マイコプラズマ感染の防御に有効な量、すなわち、該感染に対してヒトおよび動物において免疫を誘導する量を、単回又は反復投与により投与することができる。
マイコプラズマ感染症の予防及び／又は治療用に用いる場合、対象の動物によって異なるが、１回あたり特異的脂質抗原量が1μg〜1000mgの範囲内になるように投与する。マウスのような小動物では、1μg〜200μg／1回で十分に有効であるが、ヒトに投与する場合は、100μg〜100mg／1回となるように投与することが好ましい。さらに、投与量、投与時期、投与回数、投与場所など投与方法など、それぞれの用途によって上記評価法などを用いて最適化することができる。（例えば、図２４）

（８−４）評価方法
図１７・１８に示したように、マイコプラズマ感染症が関連した患者さんに用いたのと同じELISA法を使うことにより、合成脂質抗原粒子をワクチンとして投与した後、血清のマイコプラズマに特異的な抗体の価を測定し、その価が上昇することにより、ワクチン効果があると判断できる。また、ワクチン投与による治療効果は、マススペクトルで直接マイコプラズマ種特異的糖脂質抗原量を定量的に測定することで評価することもできる。
特に、マイコプラズマ感染患者又は動物にワクチン及び／又は他のマイコプラズマ用薬剤を投与後の一定時間経過後に、あるいは複数回投与を繰り返しながら経時的に、患者又は動物由来試料（血清など）中の特異的脂質抗原を、上記（６−４）の質量分析法で検出及び／又は定量し、経時的に脂質抗原量の変動を経過観察する方法は、治療対象のマイコプラズマ感染患者又は動物に対する、投与ワクチン及び／又は治療薬剤の投与量、投与時期など治療方法自体の効果が簡便、迅速にかつ正確に評価できるので、治療計画を見直しながら個々の患者、動物に見合った最適な治療計画を決定することに適している。
マイコプラズマ感染症では、慢性化し、かつ重症化している患者が多く、しかも合併症を併発してマイコプラズマ感染が原因であるか否かも不明な場合が多いため、実際にはワクチン投与の効果を評価しながら、次の投与計画を立てていくことになろう。以下、具体的な診断・予防・治療プロトコールの例を示す。

（８−５）小児肺炎マイコプラズマの診断-予防-治療プロトコール（図２０）
小児科マイコプラズマ肺炎領域では、もちろん、早期特異的定量的な診断により、早期の抗菌剤の選択が必須の局面で的確な治療方針をたて、診断法により抗菌剤の適切な切り替えができることが期待される。
擬似マイコプラズマ粒子であるリポソームを予防ワクチンとして投与することにより、マイコプラズマ感染を阻止する。マイコプラズマは小児の髄膜炎など重篤な疾患の原因であるのでこれらが予防できる。また、川崎病（非特許文献３０）など急激な経過をたどる疾患の原因とも考えられているが、このような場合は抗体医薬が効果的と考えられる。

（８−６）成人肺炎マイコプラズマの診断予防-治療プロトコール（図２１）
マイコプラズマ肺炎の原因についても複数のマイコプラズマ種が関与していることがわかってきているが、すでにマイコプラズマ・ニューモニエおよびマイコプラズマ・ファーメンタンスの種特異的脂質抗原を用いた抗体測定法により、慢性難治性疾患（喘息、ＣＯＰＤ、多発性硬化症、リウマチ性疾患、癌など）についてマイコプラズマ感染と病状経過の関連性を検討し、マイコプラズマ感染が原因となっている患者を選択する(図１７・１８）。選択した患者について、抗マイコプラズマ薬の効果も含めたマイコプラズマ感染治療を行える。ELISA法を用いてマイコプラズマの種特異的な抗体価を測定するか、又はマススペクトロメーターなどによりマイコプラズマの種特異的糖脂質抗原量を測定し、その価による診断−治療システムを提案し、さらに糖脂質抗原を抗体医薬あるいはワクチンとしての応用する製剤を提供できる。

（８−７）自己免疫疾患など慢性マイコプラズマ感染症の診断-予防-治療プロトコール（図２２）
マイコプラズマ・ニューモニエとマイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質抗原を用いた抗脂質抗原抗体測定法（ELISA法）又はマイコプラズマ種特異的脂質抗原量測定法（質量分析法など）により、慢性疾患の経過観察（診断）を行いながら、本発明の擬似マイコプラズマ粒子からなるワクチン製剤を投与する。

（８−８）豚など家畜マイコプラズマ感染症の診断-予防-治療（図１３）
肺炎の予防につながり、収益効率の向上につながる。アジュバント効果があり、ミネラルオイルなどのアジュバントの使用量を軽減あるいはなしにできる可能性がある。対象は、ぶた、にわとり、うし、植物など、種を問わない。微生物とは、マイコプラズマ、結核菌、クラミジアなど脂質抗原症候群としての病原性などを持つものなども同様の方法が考えられる。
現在市販されている豚マイコプラズマ肺炎に対するマイコプラズマ・ハイオニューモニエのワクチンに関してもその副作用としてアレルギー様反応のショックや発熱による元気消失が報告されている。これらのワクチンは、様々なコンポーネントを含む菌体を使用している限り、原因物質を同定するのは困難である。また、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ菌体を培養する際に用いられる培養液は価格が高い馬血清や豚血清、および高蛋白な成分を含むことが多いので、製造コストが高くなる上、このような蛋白含有量の高いワクチンの頻回接種はアレルギー等の副作用の発現率を高めることになる。したがって、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ菌体構成成分の中で肺病変形成に関わる成分のみを特定し、その成分のみからなるワクチン（コンポーネントワクチン）を提供することが望まれていた。マイコプラズマ・ハイオニューモニエに特異的な擬似細菌粒子は、抗原を人工合成すれば、蛋白を含んでいないため、安価で安全なワクチンが開発できる。

９．擬似細菌粒子のその他の用途
本発明の擬似マイコプラズマ粒子の免疫学的な機能としては,ワクチン活性、抗体誘導活性、細胞性免疫誘導活性、アジュバント活性、マクロファージへの貪食活性、抗原提示細胞へのとりこみや抗原提示粒子としての機能、NKT 細胞・T 細胞・B 細胞の活性化など免疫の機能制御にかかわるメカニズムに作用させることができ、安全・安定、効果的な本製剤により用途が広がる。
特に、肺炎や下痢などを引き起こすウイルス（インフルエンザやロタウイルスなど）や細菌は、呼吸器感や消化器などの粘膜から生体内へ進入することが多い。この進入経路である粘膜の免疫反応を高めることができればこれらの微生物を有効に撃退することができる。粘膜免疫つまりIgA を誘導できるアジュバント効果が期待できる本発明の擬似マイコプラズマ粒子はこれらの微生物の抗原を組み込んで免疫することより、このような微生物抗原に対する免疫を効果的に高めることができる。しかも同時に、マイコプラズマ感染に対するワクチン効果が期待できる。インフルエンザ感染や肺炎球菌などとマイコプラズマが同時に感染して病状が増悪することが知られており、安全性の高い混合ワクチンとしての利用が可能となる。
また、抗菌剤、抗ウイルス剤などを生体内に投与するための「DDS」用リポソーム製剤として用いることもできる。

１０．その他
本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA技術）」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種蛋白質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース（URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等）から入手することができる。

以下、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。

（実施例１） 病原性マイコプラズマ擬似粒子作製のための予備実験：
（１−１）リポソーム粒子の粒径の最適化
大量培養したマイコプラズマ・ハイオニューモニエから抽出精製した脂質15.46 mg と市販品の高純度コレステロール 3.31 mg (日油株式会社製)をエタノール 600μlで溶解し、その溶液を60℃の恒温槽中で8.5%ショ糖溶液3 mlに加え3分超音波処理し(株式会社エスエヌディ社製超音波洗浄器 US-104)でリポソ−ム粒子を作製した。粒子径はゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（MALVERN社製 ZETASIZER nano series,)で測定し約100nmに揃っていた（図４）。

（１−２）マイコプラズマ擬似リポソーム粒子組成の検討
合成GGPL-IIIの一定量に比率を変えたジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC)(日油株式会社製)およびコレステロール(日油株式会社製)を加えたものをクロロフォルム−メタノール溶液で溶解しそれを濃縮乾燥させた。乾燥させたサンプルに 細胞培養用培地RPMI-1640(SIGMA製)を加え25℃で40分間超音波処理した。そのサンプルの粒子径をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（MALVERN製 ZETASIZER nano series,)で測定した(図２３)。
なお、用いたフォスファチジルコリンの脂肪酸は、天然のマイコプラズマの最も典型的な脂肪酸の炭素数１６で飽和型のものを用い、コレステロールとの比を変えて、マイコプラズマ脂質抗原と共にリポソーム粒子とし、粒子径とその分布を測定した。これらの結果から、モル比として脂質抗原10-50％、フォスファチジルコリン20-50％、コレステロール10-50％が好ましいことを導いた。これは、マイコプラズマ脂質の解析データに近い結果であった（非特許文献２９）。

（１−３）脂質抗原の品質管理
HPLCの測定はカラム：Waters C4 1.0 X 150 mm、移動層：100% メタノール、注入量：5μl流量：0.05 ml/min、温度：40℃（内部、外部）、検出器：蒸発散乱検出(ELSD)、UV（215nm）の条件で行った (すべてWaters社製)。
各GGPL-III濃度とそのピーク面積の関係をグラフにプロットした結果、GGPL-III濃度依存的にピーク面積が増大した。各標準曲線を図に示した。以上の結果より、ELSDにおいて、そのピーク面積のダイナミックレンジが広いことから、GGPL-IIIをHPLC分析で検出するには、蒸発散乱検出(ELSD)が適当であると考えられる(図５)。
質量分析は各サンプルをクロロフォルム:メタノール(2:1)溶液 500μlに溶解し、1μlをメタノールで10000倍に希釈した。希釈されたサンプル 1μlをターゲットにアプライする。さらにマトリックス溶液(2,5-hydroxybenzonic acid and sodium trifluoroacetate ) 1μlをターゲットにアップライし、質量分析装置(BRUKER 社製 autoflex II TOF/TOF,)で測定した。質量分析の結果より脂質抗原の純度が高いことが解かった(図５)。

（実施例２） マイコプラズマ・ニューモニエ 合成脂質抗原の抗体誘導
マイコプラズマ・ニューモニエ合成脂質抗原（GGL Glc-type）を用いて、実施例１（１−２）と同様の方法で、マイコプラズマ・ニューモニエ擬似粒子を調製した。なお、合成GGL Glc-typeは、特許文献８などに記載の方法で合成できる。
当該擬似粒子を用いて2匹のC57BL/6マウスを免疫した。具体的には、当該粒子を含有する溶液100μlを、マウス腹腔内に3度（0、14日目, 35日目）接種し、そのマウスから採血しそれぞれのサンプルのIgGおよびIgM抗体価を酵素抗体免疫法（ELISA法）で測定した。その結果、図７に示すように、IgG およびIgM抗体を2匹のマウスで誘導することが出来た。
この結果は、GGL Glc-typeリポソーム粒子が擬似マイコプラズマ粒子として働き、in vivoで特異的な抗体を誘導できたことを示している。

（実施例３） マイコプラズマ・ファーメンタンス擬似粒子（合成GGPL-III）による特異的抗体誘導
マイコプラズマ・ファーメンタンスの合成GGPL-III 500μgに1mlの生理食塩水を加え、30分間超音波処理して、リポソーム粒子を形成させ、当該粒子を、慢性関節リウマチを自然発症するマウスモデルSKGマウスの腹腔内に接種した。接種後４日目に採血し、その血液のマイコプラズマ・ファーメンタンスの発育阻止活性を代謝阻止試験で測定した。
その結果、マウス血清中でマイコプラズマ脂質抗原に対する抗体を特異的に誘導することができ、特にIgGの場合は、希釈度に応じた抗体価を示している。また、マイコプラズマの増殖を抑制したことも確認された。（図８）
この結果は、GGPL-IIIリポソーム粒子が擬似マイコプラズマ粒子として働き、in vivoで特異的な抗体を誘導できたことを示している。

（実施例４）マイコプラズマ・ファーメンタンス感染症動物モデルの作製
マイコプラズマ・ファーメンタンス生菌を、ウサギ（Newzealand White、雌、約2kg）の経気道に接種して、肺炎モデルラビットを、また同様に経膝関節に接種して関節リウマチモデルラビットを作製した。実験1では、0日に単回10⁹CFU/rabbit量接種し、肺炎モデルラビットを２羽、関節炎ラビットを３羽作製した。実験２では、0日、7日、21日に109CFU/rabbit量ずつ計3回接種し、肺炎モデルラビットを３羽、関節炎ラビットを３羽作製した。これらのモデルラビットのうち、４／６例で血中のGGPL-IIIのIgG抗体価が急激に上昇しているのが観察できた。（図９）
この結果は、マイコプラズマが、肺炎のみでなく関節炎を引き起こす多くの慢性の炎症性疾患（図１）を起こすことが証明された。また、実施例５では、同様に製造したモデルラビットをワクチン活性の評価に用いる。

（実施例５）マイコプラズマ・ファーメンタンス感染症動物モデルでのワクチン効果
上記実施例１（１−２）と同様の手法で、合成マイコプラズマ・ファーメンタンス脂質抗原（GGPL-III）を用いて、マイコプラズマ・ファーメンタンス擬似粒子を調製した。
上記実施例４と同様にマイコプラズマ・ファーメンタンス感染関節リウマチモデルを作製するが、それに先立ち、ラビット腹腔内に４回のマイコプラズマ・ファーメンタンス擬似粒子による免疫を行った場合は、マイコプラズマ・ファーメンタンス感染関節リウマチモデルの関節病変を抑制した。このことから合成 GGPL-III マイコプラズマ・ファーメンタンス脂質抗原粒子がワクチンなどの免疫治療薬になることが証明された。これは、合成脂質抗原免疫機能プライミング効果に相当する。（図１０）
この結果は、本願の擬似マイコプラズマ粒子（GGPL-III）が、マイコプラズマ感染によって引き起こされる関節リウマチ疾患にたいする予防ワクチンになりうることを示している。

（実施例６）関節リウマチ患者由来滑膜細胞内のマイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質抗原（GGPL-III）の分布：（図１１）
方法１：免疫染色 関節リウマチの患者より滑膜細胞を分離し、抗GGPL-III抗体および陰性コントロール マウスIgMで染色した。
方法２：免疫電顕 関節リウマチの患者より滑膜細胞を分離し、1次抗体に抗GGPL-III抗体 2次抗体に金コロイドがついたIgGおよびIgMでGGPL-IIIの検出を行った。
（非特許文献３１の方法による。）
免疫染色法での結果（A〜D）も、免疫電顕での結果（E)も、関節リウマチ患者の滑膜細胞内では、マイコプラズマ・ファーメンタンス特異的な脂質抗原（GGPL-III）が著量に増加していることが観察された。
この結果は、マイコプラズマ感染症において、脂質抗原が免疫細胞に取り込まれ、粗面小胞体に運ばれたのち抗原提示される（非特許文献３１）経路に関与していることを示す。抗原提示細胞からさらに特異的B 細胞が誘導され抗体が産生される。また、T 細胞や脂質抗原に特異的に反応する NKT 細胞が誘導される。

（実施例７）マイコプラズマ呼吸器疾患者の血清中マイコプラズマ・ニューモニエ特異抗原GGL Glc-typeを用いたIgA の測定
マイコプラズマ・ニューモニエ合成GGL Glc-type を抗原としたELISA を用いてマイコプラズマ呼吸器疾患者の血清中のIgAを測定した。マイコプラズマ呼吸器疾患者の血清中にはマイコプラズマ・ニューモニエGGL Glc-typeに対するIgA抗体が認められた。この事より、マイコプラズマ・ニューモニエGGL Glc-typeは粘膜免疫アジュバントとなりうることが示唆された。
免疫応答において IgA は粘膜の免疫系から産生される抗体のサブクラスである。したがって、その抗原に対するIgA が誘導されていることは、粘膜免疫にたいしてその抗原が作用していることを示している。したがって、ヒトでマイコプラズマ特異的脂質抗原に対する IgA 抗体が誘導されていることを示したこの結果は、本発明の擬似マイコプラズマ粒子が粘膜免疫に強く作用することを示している。擬似マイコプラズマ粒子の免疫機能としてアジュバント作用があること（実施例１０）を考えると、インフルエンザ感染などに効果的な粘膜免疫を特異的に活性化させるアジュバントになりうる。

（実施例８）擬似マイコプラズマ粒子の細胞免疫活性
健常人の末梢血から単核球を分離しそこにインターロイキン2と擬似マイコプラズマ粒子（GGPL-I、又はGGPL-III）を加えたサンプルと加えないサンプルを培養しその上清を回収、その上清中のインターフェロンγ量を酵素抗体免疫法(ELISA法）で測定した。
その結果、インターロイキン2単独投与の場合よりも、擬似マイコプラズマ粒子（GGPL-I、GGPL-III）を加えた場合が、インターフェロンγの産生量を2倍以上に増加させることを確認した（図１６）。
この結果は、本発明の擬似マイコプラズマ粒子（GGPL-I and/or GGPL-III））が、細胞免疫誘導活性を持つことを示している。

（実施例９）擬似マイコプラズマ粒子ワクチンが有効な疾病の検討
（９−１） 若年性関節リウマチ患者のマイコプラズマ・ニューモニエとマイコプラズマ・ファーメンタンスの抗体価のELISA 法による測定（図１７）
この患者は、風邪症状あり。１〜２ヵ月後から手指関節の痛みと変形が出現し、３ヵ月後から病院に通院し、若年性関節リウマチと診断された。内服薬による治療を受け、しだいに手指関節の痛みは軽快してきた。当該若年性関節リウマチの初期の患者の約半年間のマイコプラズマ・ニューモニエとマイコプラズマ・ファーメンタンスの抗体価をELISA法により測定した。その結果、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的なGGPL-IIIのIgM抗体が明らかに上昇しており、マイコプラズマ・ファーメンタンスの感染が関連していいたことが証明された。また、他の検査結果では、従来からあるマイコプラズマCF法での結果は、8倍でありマイコプラズマ感染症は否定的であったが、血液中からPCRにてマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出されており、マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染して血液中に存在することが確認された。
以上の結果から、若年性関節リウマチ患者の発症初期において、実際にマイコプラズマ・ファーメンタンス感染が原因である患者が存在していることが立証できた。これら患者に対しては、GGPL-III抗体価を測定して、感染を確認し、本願の擬似マイコプラズマ粒子（GGPL-III）ワクチンを、できるだけ早い時期で投与することが効果的である。つまり、従来、原因不明であった若年性関節リウマチの患者に一部に原因特異的な治療が可能になり、画期的で根治につながる治療法になる。

（９−２） サルコイドーシス患者のELISA 法による マイコプラズマ・ニューモニエとマイコプラズマ・ファーメンタンスの抗体価の測定結果
同様の手法で、マイコプラズマ・ニューモニエとマイコプラズマ・ファーメンタンスの抗体価を測定した。（図１８）
この患者は、膝に痛みがあり病院を受診。両側性の肺門リンパ節の腫脹を認めサルコイドーシスと診断された。その際、従来からある検査法のマイコプラズマPA法で160倍であり、マイコプラズマ感染症が関連している可能性が考えられた。マイコプラズマ感染症に効果がある抗生物質を含む治療により膝関節痛がない状態が続いたが、平成18年5月より膝の関節痛が再燃。マイコプラズマPA法で80倍であり、価が前回より低下していたが、前回と同じマイコプラズマ感染症に効果がある抗生物質を含む治療により膝関節の痛みが軽快。症状の再燃時に、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的なGGPL-IIIのIgG抗体が明らかに上昇しており、治療により症状が軽快するとともにその抗体価が減少していることより、マイコプラズマ・ファーメンタンスの感染症が関連していたことが証明された。
同様に、上記結果からみて、この再燃時のサルコイドーシス患者においても実際にマイコプラズマ・ファーメンタンス感染が原因であったことが立証できた。この患者に対しては、本願の擬似マイコプラズマ粒子（GGPL-III）ワクチン投与が効果的であると期待できる。

（９−３） 複数の多発性硬化症患者の血清中のマイコプラズマ・ニューモニエ（GGL Gal-type)のIgG及びIgMの抗体価の変動（図１９）
多発性硬化症患者血清中のGGL Gal-type抗体（IgG及びIgM）の抗体価を測定した。この結果から見て、多発性硬化症患者においても実際にマイコプラズマ・ニューモニエ感染が原因であったことが立証できた。マイコプラズマ・ニューモニエ特異的脂質抗原に対する抗体が誘導されていることから、この脂質抗原にワクチン活性があることが証明された。多発性硬化症は、症状の悪化と軽快を年に数回の繰り返しながら年単位で増悪していく難病であるが、この患者に対しては、本願の脂質抗原擬似細菌粒子により、擬似マイコプラズマ粒子（GGL Gal-type）ワクチン投与などの治療効果が効果的であることが期待できる。

（実施例１０）マイコプラズマ合成脂質抗原によるインターフェロンγの産生
健常人の末梢血から単核球を分離しそこにインターロイキン２とマイコプラズマ・ファーメンタンス合成脂質抗原GGPL-IIIを加えたサンプルと加えないないサンプルを培養しその上清を回収、その上清中のインターフェロンγの量を酵素抗体免疫法(ELISA法）で測定し比較した。ヒトの末梢血単核球にインターロイキン２に脂質抗原を加えたらインターフェロンγの産生量が脂質抗原を加えないものと比較して顕著に増加した(図１６)。この結果は、本願の擬似マイコプラズマ粒子（GGPL-III）が、細胞免疫誘導活性を持つことを示している。

（実施例１１）マイコプラズマ・ファーメンタンス特異的な脂質抗原（GGPL-III）のアジュバント効果（図１４）
図１４（Ａ）に示すように、金属ニッケル（抗原）と同時にマイコプラズマ・ファーメンタンス擬似粒子（GGPL-III）をマウスの耳に投与しておくことで、用量依存的（0.2mg/mlと1mg/mlの投与）に抗体産生能を高める効果を確認した。図１４（Ｂ）は、マイコプラズマ・ファーメンタンス擬似粒子（GGPL-III）がLPS と同等の細胞免疫活性を持つことを示している。また、抗原の活性を増強するアジュバント活性を持っている。LPS から開発された LipidA は、アジュバントとして使用され始めているが、マイコプラズマ脂質抗原もアジュバンドとしての期待が持てる。

（実施例１２）豚マイコプラズマ・ハイオニューモニエの特異的な精製脂質抗原を用いたマイコプラズマ擬似粒子のワクチン効果
マイコプラズマ・ハイオリニスおよびマイコプラズマ・ハイオニューモニエを大量培養しクロロフォルム-メタノールで分画し、それらを薄層クロマトグラフィー（クロロフォルム：メタノール：0.2% 塩化カルシュウム＝55：45：10）で展開した。展開後、オルシノール硫酸を用い、免疫染色法により染色し検出した（図１３）。
図４に示されるように、精製脂質抗原を用いた擬似マイコプラズマ・ハイオニューモニエ粒子を作成し、マウスの腹腔内に3回免疫した。最終接種後4日目に採血し、その血液のマイコプラズマの発育阻止活性を代謝阻止試験で測定した。その結果、マイコプラズマの増殖を抑制したことが確認された。

（実施例１３）ヘリコバクター・ピロリの特異脂質抗原およびその検出（図１２）
ヘリコバクター・ピロリを大量培養しクロロフォルム−メタノールで分画し、それらを薄層クロマトグラフィーで展開した。（クロロフォルム：メタノール：0.2% 塩化カルシュウム＝60：28：3）。
展開後、リン酸モリブデン染色およびオルシノール硫酸を用いた免疫染色で特異脂質抗原を検出し、ヘリコバクター・ピロリの特異な脂質抗原が認められた。
ヘリコバクター・ピロリの精製特異脂質抗原を用いて、実施例１（１−２）と同様の手法で擬似ヘリコバクター・ピロリ粒子を作製した。この擬似ヘリコバクター・ピロリ粒子を用いて、C57BL/6マウスの骨髄細胞からのインターフェロンγの産生を、上清中のインターフェロンγの量を酵素抗体免疫法(ELISA法）で測定した。この結果は、本願の擬似ヘリコバクター・ピロリ粒子が、インターフェロンγの誘導活性を持つことがわかった。

（実施例１４）マイコプラズマ擬似リポソーム粒子の投与法の最適化
実施例１（１−２）と同様の方法で調製したマイコプラズマ・ニューモニエ擬似粒子（GGL Glc-type）を、４つの群に分けた月齢２か月のマウス（体重約30g)の腹腔内に、それぞれ200μg、50μg、20μg注入して４回免疫した。コントロール群には抗原を投与しない。図２４の下部に示すように、4回に分けて採血し、ELISAによりそれぞれのIgM抗体価を測定した（値は各群毎の平均値）。50μg、20μg投与群はカットオフ値を超える高い抗体価を示したが、200μgという高濃度で投与した場合にはむしろ、抗体価が上がらない。この実施例で用いたマイコプラズマ・ニューモニエ擬似粒子（GGL Glc-type）の場合の最適投与量は、10〜100μg／1回程度で十分に有効であることが確かめられた。ヒトに投与する場合を想定すると、100μg〜10mg／1回程度となる。これは、当初の想定の範囲内（マウスなど小動物で約1μg〜200μg／1回）であり、実際のワクチン接種に際しては、この様な手法により簡便に投与量の最適化を図ることができる。

（実施例１５）マイコプラズマ種特異的糖脂質抗原の検出と定量化
この実験では、マイコプラズマ種特異的糖脂質抗原のうちで、典型的なマイコプラズマ・ニューモニエ特異的糖脂質抗原ＧＧＬについて、患者血清などサンプル中に含有されるＧＧＬ量の定量化が可能かどうかを調べるモデル実験を行った。なお、基本的な手順は特許文献６の手法に従った。
つまり、あらかじめＧＧＬに対応する合成標準品として、ＧＧＬを合成し、さらに定量化スタンダードとして、重水素化した［H3］を6個導入した、［H3］−GGL（d6−GGL）を合成しておく。
一方、マイコプラズマ・ニューモニエを培養液で培養し、菌体量を従来法であるコロニー数で定量化し、10⁷ cfuの菌体から、脂質抗原GGLを抽出・分離精製した。当該10⁷ cfu培養マイコプラズマ・ニューモニエ含有試料を、メタノール：クロロホルム＝１：１などの有機溶媒(0.8ml)をよく混合させ、水(0.2ml)を添加して2500〜3000g程度の遠心操作により層分離を起こさせることで、下層のクロロホルム層に目的のGGL（C16：0）を含有する脂質画分が、タンパクや血球と分離されて得られる。それを、さらにDIAION（三菱化学）社製のイアトロビーズ（シリカからの水酸基がキャップされたもの）を用いて精製した。
この脂質抗原の量を測定するために、［H3］−GGL（C16：0）の濃度が段階的になるように上記脂質画分に添加し、それぞれのマススペクトルを質量分析機（ブルカーダルトニクス社製）により、ナトリウムを添加してイオン化し、ポジティブモードで測定した。（図２５）
その結果、目的のGGL（C16：0）の特徴的ピーク（915m/z）のピークと、同時に［H3］−GGL（C16：0）の特徴的ピーク（921m/z）のピークの山の高さを比較すると、［H3］−GGL（C16：0）を50pmol添加した場合及び5pmol添加した場合の中間的な高さになることが確認できたので、GGL（C16：0）の存在量は、50pmolから5pmolの間である、と決定することができた。すなわち、モデルサンプル中の培養マイコプラズマ菌体10⁷ cfuに、50pmolから5pmolのマイコプラズマ特異的脂質抗原GGL（C16：0）が存在することがわかった。また、この結果は、10⁵ cfu程度の菌体量が存在すれば十分に検出可能であることも示している。
したがって、実際のマイコプラズマ感染患者由来の組織や血液を用いて測定した場合に、直ちに感染マイコプラズマ種を決定し、その感染の程度を的確に判定することが可能なばかりでなく、ワクチン治療又は化学療法剤治療を行った後の、若しくは途中経過過程での治療効果を判定するためにきわめて有効に利用できる技術であることが立証できた。

（実施例１６）関節リウマチ患者の関節組織中のマイコプラズマ・ファーメンタンス特異的脂質抗原 GGPL-IIIの検出
図１１として、関節リウマチ患者の関節組織中のマイコプラズマ・ファーメンタンス特異的脂質抗原 GGPL-IIIを特異抗体で染色した図を示しているが、今回は、関節リウマチ患者の関節組織のGGPL-IIIの存在を実施例１５に記載の質量分析機を用いる手法でも検出できることを示すものである。
関節リウマチ患者の関節組織からイアトロビーズ（DIAION、三菱化学社製）を用いて分離精製した脂質成分を得た。
当該画分を、質量分析機（ブルカーダルトニクス社製）で解析したところ、GGPL-IIIの存在を示す1049m/zの位置のピークを確認できた（図２６）。

（実施例１７）マイコプラズマ感染が疑われる患者の臨床サンプルの解析
マイコプラズマ感染が疑われる肺炎患者複数人から、咽頭ぬぐい液を採取し、実施例１６と同様の方法で、得られた溶出画分を、イオン化して質量分析機（ブルカーダルトニクス社製）で解析したところ、図２７に示すように、マイコプラズマ・ニューモニエ特異的糖脂質抗原GGLに特異的なピークが複数のサンプルで検出できた。

Claims (14)

1. マイコプラズマに特異的な脂質抗原の１種又はそれ以上をリポソーム構成脂質成分として含むリポソーム粒子からなる擬似マイコプラズマ粒子であって、前記リポソーム粒子表面に、他の抗原性物質を存在させた擬似マイコプラズマ粒子であり、前記マイコプラズマ特異的脂質抗原のアジュバント効果により、当該他の抗原性物質の抗原性が高められていることを特徴とする、前記擬似マイコプラズマ粒子。
2. 前記他の抗原性物質がウイルス由来の抗原ペプチドである、請求項１に記載の擬似マイコプラズマ粒子。
3. マイコプラズマに特異的な脂質抗原の１種又はそれ以上をリポソーム構成脂質成分として含む、単一の脂質二重層からなる一枚膜リポソーム粒子からなる擬似マイコプラズマ粒子であって、
   前記リポソーム構成脂質成分である前記脂質抗原は特異的糖脂質であり、かつ化学的又は酵素的に合成された後に、単離精製されたものであることを特徴とし、
   前記リポソーム粒子は前記マイコプラズマに特異的な精製脂質抗原単独で、または前記精製脂質抗原と他のリン脂質やコレステロールとを混合した脂質をリポソーム粒子としたものである擬似マイコプラズマ粒子を有効成分として含む、マイコプラズマ感染症の予防又は治療用ワクチン。
4. 前記マイコプラズマ特異的脂質抗原の少なくとも１種が、マイコプラズマ・ニューモニエ特異的脂質抗原、又はマイコプラズマ・ファーメンタンス特異的脂質抗原である、請求項３に記載のマイコプラズマ感染症の予防又は治療用ワクチン。
5. 前記マイコプラズマ特異的脂質抗原の少なくとも１種が、ＧＧＰＬ−Ｉ、ＧＧＰＬ−ＩＩＩ、ＧＧＬ Ｇｌｃ−ｔｙｐｅ又はＧＧＬ Ｇａｌ−ｔｙｐｅである、請求項３に記載のマイコプラズマ感染症の予防又は治療用ワクチン。
6. 前記リポソーム構成脂質成分として、さらにフォスファチジルコリン及びコレステロールを含むことを特徴とする、請求項３〜５のいずれかに記載のマイコプラズマ感染症の予防又は治療用ワクチン。
7. 前記マイコプラズマ特異的脂質抗原を含むリポソーム構成脂質成分を、溶媒中で超音波処理により、粒子径が30〜300nmの範囲内で、かつその80％以上が40〜200nmの範囲内になる条件で粒子化した擬似マイコプラズマ粒子を含む、請求項３〜６のいずれかに記載のマイコプラズマ感染症の予防又は治療用ワクチン。
8. 前記マイコプラズマ感染症が、肺炎、喘息、又はリウマチ性疾患である、請求項３から７のいずれかに記載のマイコプラズマ感染症の予防又は治療用ワクチン。
9. マイコプラズマ感染症用ワクチンとして有効な擬似マイコプラズマ粒子の製造方法であって、
   ＧＧＰＬ−Ｉ、ＧＧＰＬ−ＩＩＩ、ＧＧＬ Ｇｌｃ−ｔｙｐｅ及びＧＧＬ Ｇａｌ−ｔｙｐｅから選択される少なくとも１種のマイコプラズマ特異的脂質抗原を酵素的又は化学的に合成する工程、
   合成された特異的脂質抗原を精製する工程、及び
   リポソームを調製する工程を含む、
   方法。
10. リポソームを調製する工程において、さらにフォスファチジルコリン及びコレステロールを包含させることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. リポソームを調製する工程において、モル比としてマイコプラズマ特異的精製脂質抗原１０−５０％、フォスファチジルコリン２０−５０％、及びコレステロール１０−５０％との組成とすることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. フォスファチジルコリンが炭素数１４〜１８の飽和型フォスファチジルコリンである、請求項１１に記載の方法。
13. 請求項２に記載の、粒子表面にウイルス由来抗原ペプチドが存在する擬似マイコプラズマ粒子を有効成分とすることを特徴とする、当該ウイルス感染症に対する予防又は治療用ワクチン。
14. 前記ウイルスがインフルエンザウイルスであり、前記ウイルス感染症がインフルエンザである、請求項１３に記載のワクチン。