JPH0848693A - 新規グリセロ糖リン脂質とその抗体及びマイコプラズマの検出法 - Google Patents
新規グリセロ糖リン脂質とその抗体及びマイコプラズマの検出法Info
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Abstract
に存在するグリセロ糖リン脂質、それに対する抗体、こ
の抗体を用いるグリセロ糖リン脂質の測定法及びマイコ
プラズマ・ファーメンタンスを検出する方法を提供す
る。 【構成】 マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質画
分を抗原として用いてマウスを免疫し、脾細胞とマウス
ミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを作製し、
マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的なホスホコ
リン含有グリセロ糖脂質であるGGPL−IIIに対して
反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを選択する。得られた抗体を用いてマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスを検出する。
Description
ーメンタンス由来の新規グリセロ糖リン脂質、マイコプ
ラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ
糖リン脂質に対する抗体、この抗体を用いるグリセロ糖
リン脂質の測定法及びマイコプラズマ・ファーメンタン
スを検出する方法に関する。
LV−I(ヒトTリンパ球向性レトロウイルス−タイプ
I)が感染したヒトヘルパーT細胞(Miyoshi et al. Ga
nn, 71, 155-156 (1980)))から5種のグリセロ糖リン
脂質(ホスホコリン含有グリセロ糖脂質)を見出し、こ
のうちの1種が6’−O−ホスホコリン−α−グルコピ
ラノシル−(1’−3)−1,2−ジアシル−sn−グ
リセロールであることを見出している(脂質生化学研
究、第35巻、第111〜114頁、1993年)。
(Mycoplasma fermentans)は、ヒト免疫不全症候群
(エイズ;AIDS)の増悪因子である(Lo. S., -C.
et al.1991, Science 251: 1074-1076;米国特許第5,
242,820号)、あるいはリウマチの原因である
(Williams, M. H. et al. 1970, Lancet ii: 277-28
0)という報告がある。
が知られており、臨床検査等にも使用されているが、多
くはマイコプラズマ・ニューモニエ(M. pneumoniae)
またはマイコプラズマ・ジェニタリウム(M. genitaliu
m)に対する抗体である。また、これらのマイコプラズ
マに対するモノクローナル抗体も作成されているが、こ
れらの抗体は、マイコプラズマの蛋白質または蛋白質と
脂質を同時に認識する抗体であると考えられ、いずれも
マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異性を示さない
(特開昭63−298、特開昭63−184064、特
開昭63−32496、特開平5−304990、米国
特許第5,158,870号、米国特許第4,945,
041号、米国特許第5,242,820号)。また、
マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異性を示す抗体
が米国特許第5,242,820号に開示されている
が、菌体の全抽出物を免疫原として得られた抗体であ
り、蛋白質を認識する抗体であると考えられる。よっ
て、この抗体を用いて、種々の蛋白質を含む血清などの
体液中のマイコプラズマを検出する場合、この抗体が非
特異的な結合をする可能性が高く、高い感度は期待でき
ないと考えられる。また、抗原が蛋白質の場合、蛋白質
のアミノ酸配列の変異により抗原性が消失する場合も十
分に考えられる。
ホスホコリンを含有したグリセロ糖リン脂質を持つとい
う報告はない。さらに、マイコプラズマ由来のグリセロ
糖リン脂質を免疫原とし、このグリセロ糖リン脂質に特
異性を示す抗体を得た例は知られていない。またさら
に、このグリセロ糖リン脂質に特異性を示す抗体が、マ
イコプラズマ・ファーメンタンスに高い特異性を示すこ
とも全く知られていない。
が、ヒト免疫不全ウイルス感染者のエイズへの病態の進
行を加速しているという報告があり(1991, Science 25
1: 4991)、前記の通り、マイコプラズマ・ファーメン
タンスがエイズの増悪因子であるという報告もあるが、
生体内においてこのようなマイコプラズマ・ファーメン
タンスの動態を正確に検出できる手段がなく、生体内の
マイコプラズマ・ファーメンタンスを免疫学的に検出可
能な抗体の提供が望まれていた。
り、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在
するグリセロ糖リン脂質の解明、このグリセロ糖リン脂
質に対する抗体、この抗体を用いたグリセロ糖リン脂質
の測定法及びマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出
する方法を提供することを課題とする。
イルス感染による細胞の異常増殖、細胞破壊及び免疫異
常を解明するために、これらの感染細胞の脂質解析を行
う過程でヒトヘルパーT細胞株から抽出されたグリセロ
糖リン脂質(ホスホコリン含有グリセロ糖脂質)が、意
外なことにマイコプラズマ・ファーメンタンス由来のグ
リセロ糖リン脂質(ホスホコリン含有グリセロ糖脂質:
以下、単に「グリセロ糖リン脂質」という)であること
を確認し、この脂質の構造を解明した。さらに、この脂
質に対する抗体を作成し、種々のマイコプラズマに対す
る特異性を確認したところ、この抗体がマイコプラズマ
・ファーメンタンスを特異的に認識することを見出し、
本発明を完成した。
る、マイコプラズマ・ファーメンタンスから抽出され得
るグリセロ糖リン脂質である。 (A)オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 (B)アルカリで分解される。 (C)ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体
による分画において非吸着画分として得られる。 (D)質量分析計によって測定した分子量が1048+
28n(nは、−1、0、1又は2)である。
ラノシル−(1’−3)−1,2−ジアシル−sn−グ
リセロール、ホスホコリン及びアミノプロパンジオール
のリン酸エステルを構成成分とする可能性が高い。
ン、グルコース、脂肪酸及びグリセロールを含み、ジエ
チルアミノエチル基を有する陰イオン交換体に対して非
吸着性の脂質であり、アルカリに不安定であるグリセロ
糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗グリセロ糖リ
ン脂質抗体である。このグリセロ糖リン脂質としては、
マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在する
グリセロ糖リン脂質が挙げられる。
様として本願発明は、6’−O−ホスホコリン−α−グ
ルコピラノシル−(1’−3)−1,2−ジアシル−s
n−グリセロールと、以下の性質を有する、マイコプラ
ズマ・ファーメンタンスから抽出され得るグリセロ糖リ
ン糖脂質との両方と反応する抗グリセロ糖リン脂質ポリ
クローナル抗体、及び以下の性質を有するグリセロ糖リ
ン脂質に対する反応特異性を有する抗グリセロ糖リン脂
質モノクローナル抗体を提供する。 (A)オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 (B)アルカリで分解される。 (C)ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体
による分画において非吸着画分として得られる。 (D)質量分析計によって測定した分子量が1048+
28n(nは、−1、0、1又は2)である。
するグリセロ糖リン脂質を、上記の抗グリセロ糖リン脂
質抗体を用いて免疫学的に測定することを特徴とするグ
リセロ糖リン脂質の測定法、及びこの方法により検体中
のグリセロ糖リン脂質を測定し、このグリセロ糖リン脂
質の存否またはその存在量と検体中のマイコプラズマ・
ファーメンタンスの存否またはその存在量とを関連づけ
ることを特徴とするマイコプラズマ・ファーメンタンス
の検出法を提供する。
(A)〜(D)の性質を有するグリセロ糖リン脂質及び
/又はこのグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質
を、上記の抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いて免疫学的
に測定することを特徴とするグリセロ糖リン脂質及び/
又はこのグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質の
測定法を提供する。
中のマイコプラズマ・ファーメンタンスまたはマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質を検出
するための試薬キットであって、前記抗グリセロ糖リン
脂質抗体と、標識物質で標識化したマイコプラズマ・フ
ァーメンタンスのグリセロ糖リン脂質、または前記抗体
の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前
記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質
で標識化した二次抗体とを含むことを特徴とする試薬キ
ットを提供する。
記(A)〜(D)の性質を有するグリセロ糖リン脂質も
しくはこのグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物
質、またはこれらのグリセロ糖リン脂質に対して反応特
異性を有する抗体を検出することを特徴とする、エイ
ズ、腎炎及びHTLV−I関連ミエロパチーから選ばれ
る疾病の検出法を提供する。
ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ糖リン脂
質を、単に「グリセロ糖リン脂質」ということがある。
以下、本発明を詳細に説明する。
(Mycoplasma fermentans)のグリセロ糖リン脂質に対
して反応特異性を有するものであり、このグリセロ糖リ
ン脂質を抗原として調製される。はじめに、マイコプラ
ズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質について
説明する。
質が存在することが知られており、HTLV−I感染ヒ
トヘルパーT細胞から5種のグリセロ糖リン脂質(GG
PLs:GGPL−I、GGPL−II、GGPL−II
I、GGPL−IV、GGPL−V)が見い出されてい
る。そのうちGGPL−Iの構造が本発明者らによって
決定されている(西田ら、日本農芸化学会誌 第68巻
第3号(1994)「1994年度大会講演要旨集」第
39頁)。GGPL−I以外のGGPLsは存在が認め
られているのみであり、その物性、構造などは知られて
いなかった。
TLV−I感染ヒトヘルパーT細胞(MT−4(GGP
L+))と、これを抗マイコプラズマ剤(MC201
(大日本製薬(株)製))で処理したMT−4(GGP
L−)から調製した脂質画分をHPTLC(高速薄層ク
ロマトグラフィー)で分離し、オルシノール(orcino
l)試薬で糖脂質を、ディットマー(Dittmer)試薬でリ
ン脂質を染色したところ、MT−4(GGPL+)にみ
られ、MT−4(GGPL−)ではみられない2本のバ
ンドが検出された(図4)。この2本のバンドは、ポア
サイズ0.22μmのフィルターを通過させたMT−4
(GGPL+)細胞の培養上清を加えて培養したMT−
4(GGPL−)細胞からも検出された。後記実施例に
示すように、これらのうち一方はGGPL−Iであり、
他方はGGPL−IIIであることがわかった。
含有したグリセロ糖リン脂質を細胞の構成成分として有
するという報告はなく、GGPLsはヒト細胞由来であ
ると考えられていたが、上記結果から、マイコプラズマ
・ファーメンタンスに由来することが明らかとなった。
したがって、上記グリセロ糖リン脂質に対して反応特異
性を有する抗体が得られれば、マイコプラズマ・ファー
メンタンスを検出することが可能となると考えた。
セロ糖リン脂質は、マイコプラズマ・ファーメンタンス
の培養物から調製することができる。マイコプラズマ・
ファーメンタンスは、例えば以下のようにして得られ
る。GGPLsの存在が認められる(「GGPL陽
性」)培養細胞、例えばMT−4細胞(HTLV−I
(ヒトTリンパ球向性レトロウイルス−タイプI)が感
染したヒトヘルパーT細胞)の培養上清を、ポアサイズ
0.22μmのフィルターで濾過することによって、濾液中
にマイコプラズマ・ファーメンタンスが得られる。ま
た、マイコプラズマ・ファーメンタンス PG18株等
のタイプストレイン等を用いてもよい。
スを、PPLO broth(デイフコ・ラボラトリーズ製)寒天
培地等を用いて培養し、コロニーを単離した後、10%(v
/v)ウシ胎仔血清(FBS)、5%(w/v)酵母抽出物(フロー
・ラボラトリーズ製)、1000単位/mlペニシリン、1
%(w/v)デキストロース、0.002%(w/v)フェノール
レッドを含むPPLO broth(ディフコ・ラボラトリーズ
製)等の液体培地中で培養すれば、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンスの培養菌体が得られる。次に、マイコプ
ラズマ・ファーメンタンスの菌体にメタノールを加え数
時間放置した後、クロロホルムを加えて超音波処理し、
さらに数時間放置した後に、菌体をポーター型テフロン
ホモジナイザー等を用いてホモジナイズして上清を回収
し、この上清を蒸発させることにより、脂質抽出物が得
られる。こうして得られる脂質抽出物はグリセロ糖リン
脂質を含有する。
TLC(高速薄層クロマトグラフィー)プレートにアプ
ライし、クロロホルム:メタノール:0.2%(w/v)塩化カ
ルシウム水溶液=50:45:10(v/v/v)の混合溶媒で展開
し、リン脂質の分析を行ったところ、6本のバンド(Li
pid i、Lipid ii、Lipid iii、Lipid iv、Lipid v、及
びLipid vi)が検出された(図3)。TLC上の挙動か
ら、これらのうち、Lipid v及びLipid viは、各々GG
PL−I及びGGPL−IIIに相当することがわかっ
た。また、FABマススペクトルの結果から、GGPL
−IはLipid vと同一であり、GGPL−IIIはLipid vi
と同一であることが確認された。
セロ糖リン脂質は、マイコプラズマ・ファーメンタンス
が感染したMT−4細胞からも得られる。例えば、MT
−4細胞を10%(v/v)FCS(仔ウシ胎仔血清)添加
RPMI−1640培地で培養し、PBS(リン酸緩衝
生理食塩水)で洗浄した細胞に対し、クロロホルム:メ
タノール(=2:1、1:1、あるいは1:2)の混合
液400mlを用いて脂質を抽出する。
・ファーメンタンスまたはMT−4細胞の脂質抽出物
を、ジエチルアミノエチル(DEAE)基を有する陰イ
オン交換樹脂、例えばDEAE−セファデックス A2
5(ファルマシア社製)等を用いて非吸着画分(中性画
分)と吸着画分(酸性画分)に分け、非吸着画分を得
る。この非吸着画分をシリカビーズカラムにかけ、クロ
ロホルム/メタノール/水(83:16:0.5〜2
0:80:8 (v/v))による濃度勾配で分画することに
より、GGPL−IIIを他のリン脂質から分離すること
ができる。さらに、1−プロパノール/アンモニア水/
水(80:5:15〜75:5:20)の濃度勾配で溶
出することにより、GGPL−Iが単離される。
れもオルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲンド
ルフ(Dragendorff)試薬(コリンを染色する)に陽性
を示し、また、緩和なアルカリ処理で分解した。さら
に、GGPL−Iはニンヒドリン反応(アミノ基を染色
する)に陰性を示したが、GGPL−IIIは陽性であっ
た。
理化学的分析の結果を以下に示す。 赤外線吸収スペクトル -CH2および-CH3基、水酸基、エステルカルボニル基、リ
ン酸基、コリン基及び一級アミン基にそれぞれ対応する
吸収が検出された。
た。また、GGPL−IIIには少なくとも4種類の分子
が存在し、そのうち主要成分の分子量については104
8であると結論された。さらに、分子量1020、10
76及び1104のGGPL−IIIも存在することが示
された。
/MS) 分子中にホスホコリンの存在が示唆された。また、GG
PL−IIIの分子量は、主要成分については1048で
あると結論された。
ースのシグナルが検出された。さらに、アミノプロパン
ジオールの存在が予測されたので、3−アミノプロパン
−1,2−ジオール(1−アミノプロパン−2,3−ジ
オール)および2−アミノプロパン−1,3−ジオール
の標準標品を用いて得られた一次元1HNMRスペクト
ルとGGPL−IIIのスペクトルとを比較した結果、G
GPL−IIIは2−アミノプロパン−1,3−ジオール
を構成成分として含有している可能性が示唆された。
QF−COSY法) ジアシルグリセロールに由来するプロトンのシグナルが
認められた。またコリンのプロトンのシグナルが認めら
れた。
ていることが示された。また、リンを含有する化合物は
グルコース残基の1位または6位に結合していると推定
された。この位置は6位である可能性がより高い。
ホコリンの構造が示唆され、グルコース残基の6位には
まずアミノプロパンジオールのリン酸エステルが結合し
ており、さらにこのアミノプロパンジオールのリン酸エ
ステルにホスホコリンが結合した構造が推定された。
性質を有する新規グリセロ糖リン脂質であることがわか
った。 (A)オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 (B)アルカリで分解される。 (C)DEAE基を有する陰イオン交換体による分画に
おいて非吸着画分として得られる。 (D)質量分析計によって測定した分子量が1048+
28n(nは、−1、0、1又は2)である。
α−グルコピラノシル−(1’−3)−1,2−ジアシ
ル−sn−グリセロール、ホスホコリン及びアミノプロ
パンジオールのリン酸エステルを構成成分とすることが
示された。このアミノプロパンジオールのリン酸エステ
ルは、2−アミノプロパン−1,3−ジオールのリン酸
エステルであり、その結合部位は、α−グルコピラノシ
ル−(1’−3)−1,2−ジアシル−sn−グリセロ
ールのグルコース残基の6’位であると推定された。さ
らに、この2−アミノプロパン−1,3−ジオールのリ
ン酸エステルにホスホコリンが結合していることが示唆
された。また、GGPL−IIIの主要成分は、アシル基
として2個のパルミトイル基を有し、その推定構造は下
記式の通りであり、GGPL−I(6’−O−ホスホコ
リン−α−グルコピラノシル−(1’−3)−1,2−
ジパルミトイル−sn−グリセロール)のグルコース残
基とホスホコリンとの間に2−アミノプロパン−1,3
−ジオールのリン酸エステルが挿入された構造を有して
いると推定される。
グルコピラノシル−(1’−3)−1,2−ジアシル−
sn−グリセロール中のアシル基の種類が異なるもので
あり、分子量1020のものではミリストイル基とパル
ミトイル基、1076のものではパルミトイル基とステ
アロイル基、1104のものでは2つのステアロイル
基、またはパルミトイル基とエイコサノイル基を有して
いると推定されるが、詳細は明らかではない。
来のグリセロ糖リン脂質を抗原として動物を免疫し、そ
の動物から血清を分離するか、あるいはその動物の抗体
産生細胞を採取し、永続的に培養可能とし、その培養物
から回収することによって得られる。以下に、本発明の
抗体の調製法を例示するが、これに限定されるものでは
なく、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖
リン脂質を抗原に用いるならば、その他の方法によって
調製してもよい。
タンスの脂質抽出物に、モノフォスフェートリピド、フ
ロイント完全アジュバント、及びミネラルオイルを加え
て混合し、さらに0.1%(v/v)Tween 80を含むPBS
(リン酸緩衝生理食塩水)を加えて乳化する。
ウサギ、モルモット、ヒツジ等の動物の皮下または腹腔
内に投与する。初回免疫後、2〜3週間目に常法によっ
て追加免疫を行うと、力価の高い抗血清が得られる。最
終免疫から1週間後に血液を採取し、血清を分離する。
この血清を熱処理して補体を失活させた後、硫酸アンモ
ニウムによる塩析、イオン交換クロマトグラフィー等の
通常の抗体の精製と同様の方法によってイムノグロブリ
ン画分を取得する。尚、最終免疫の後に、酵素免疫測定
法等により血中抗体価の上昇を確認しておくことが望ま
しい。
プラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質に対
して反応特異性を有し、マイコプラズマ・アルソリティ
ディス及びマイコプラズマ・ホミニスなど他のマイコプ
ラズマのグリセロ糖リン脂質には反応しない。
抽出物の代わりに、精製したGGPL−IIIを用いれ
ば、GGPL−IIIに対して反応特異性を有するポリク
ローナル抗体が得られる。
(Nature,495〜492頁、1975年)によ
って得られる。すなわち、グリセロ糖リン脂質に対する
抗体を産生する哺乳動物の抗体産生細胞と骨髄腫(ミエ
ローマ)細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、目
的の抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、
このハイブリドーマを培養することによって培養液中に
モノクローナル抗体が得られる。以下、工程ごとに分説
する。
リセロ糖リン脂質でマウス、ラット、ウサギ、モルモッ
ト、ヒツジなどの動物を免疫し、その動物から脾臓細
胞、リンパ節細胞、末梢血液等を調製することにより得
られる。上記動物をグリセロ糖リン脂質で免疫するに
は、(1)と同様に行えばよい。
るモノクローナル抗体を得るには、精製したGGPL−
IIIで動物を免疫してもよいが、グリセロ糖リン脂質混
合物で免疫した動物の抗体産生細胞を用いてハイブリド
ーマを調製し、得られたハイブリドーマからGGPL−
IIIに対して反応特異性を有するモノクローナル抗体を
産生する株を選択してもよい。この方法によれば、動物
の免疫に必要な量のGGPL−IIIを得る必要がなく、
酵素免疫法による検出が可能な程度の微量のGGPL−
IIIがあればよい。
採取し、骨髄腫細胞との細胞融合を行う。細胞融合に使
用する骨髄腫細胞には種々の哺乳動物の細胞株を利用す
ることができるが、抗体産生細胞の調製に用いた動物と
同種の動物の細胞株を使用するのが好ましい。また、骨
髄腫細胞株は、細胞融合の後に未融合細胞と融合細胞と
を区別できるようにするために、未融合の骨髄腫細胞が
生存できずハイブリドーマだけが増殖できるように、マ
ーカーを有するものを用いることが好ましい。例えば、
8−アザグアニン耐性株は、ヒポキサンチン−グアニン
−ホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)を
欠損しており、核酸合成はde novo合成経路に依
存している。このような骨髄腫細胞と正常抗体産生細胞
との融合細胞(ハイブリドーマ)では、ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジンを含む培地(HAT培
地)中で、アミノプテリンによりde novo合成経
路が阻害されても、チミジン、ヒポキサンチンが存在し
ているので、リンパ球由来のサルベージ回路により核酸
合成できるので、増殖が可能である。これに対し、8−
アザグアニン耐性の骨髄腫細胞は、アミノプテリンによ
りde novo合成経路も阻害されるため、核酸合成
できずに死滅し、また正常細胞である抗体産生細胞も長
期培養はできない。したがって、抗体産生細胞と骨髄腫
細胞との融合によって生成したハイブリドーマのみがH
AT培地で増殖できるので、非融合細胞から融合細胞を
選択することができる(サイエンス 第145巻709
頁、1964年)。また、骨髄腫細胞として、固有のイ
ムノグロブリンを分泌しない株を使用することが、ハイ
ブリドーマの培養上清から目的の抗体を取得することが
容易となる点で好ましい。
例えば以下のようにして行う。免疫動物から脾臓を摘出
し、RPMI1640培地に懸濁して細胞浮遊液を調製する。こ
の脾細胞と、対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞、
例えばSP2/O細胞(アザグアニン耐性、IgG非分泌:A
TCC CRL-1581)とを、脾細胞とミエローマ細胞が10:
1〜1:1程度となるように混合し、遠沈後、沈渣に平
均分子量1,000〜6,000のポリエチレングリコ
ールを、最終濃度が30〜50%となるように加えて細
胞を融合させる。ポリエチレングリコールを加える代わ
りに、細胞混合液に電気パルスを印加することによって
融合させてもよい。
/v)仔ウシ胎仔血清(FCS)を含むRPMI1640培地などで培養
後、HAT培地などの選択培地に浮遊させ、96ウェル
のマイクロタイタープレートなどに分注して培養を行い
ハイブリドーマのみを生育させる。
異性を有する抗体を産生するハイブリドーマの検索 上記のようにして得られたハイブリドーマは、複数の抗
原あるいは抗原決定部位に対する各々のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマの混合物であるので、こ
れらの中からグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を
有するモノクローナル抗体、特にGGPL−IIIに対し
て反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生する株
を選択する。また、GGPL−IIIに結合するモノクロ
ーナル抗体のうち、抗原性の強い抗原決定部位に対する
モノクローナル抗体を産生する株を選択することが好ま
しい。
ル抗体を産生する株は、これらを抗原として用いる酵素
免疫法によって選択できる。このような方法としてEL
ISA法、すなわち、抗原をマイクロタイタープレート
等に固相化しておき、これにハイブリドーマ培養液を加
え、さらに酵素、ケイ光物質、発光物質などで標識した
第2抗体を加えてインキュベートし、結合した標識物質
によって抗体を検出する方法が挙げられる。その際、抗
体を固相化し、これに抗原、標識第2抗体を順次加えて
インキュベートしてもよい。尚、ELISA法について
は後に詳述する。
い場合には、マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質
画分を高速薄層クロマトグラフィー(HPTLC)プレ
ートを用いて分離し、このプレートにハイブリドーマの
培養液、標識2次抗体を順次加えてインキュベートし、
標識物質が結合する位置を検出する。この位置がGGP
L−IIIがHPTLCによって展開される位置と同じで
あれば、そのハイブリドーマはGGPL−IIIに対する
モノクローナル抗体を産生すると認められる。GGPL
−IIIに対するモノクローナル抗体が得られれば、これ
を用いたアフィニティークロマトグラフィー等によっ
て、脂質画分からGGPL−IIIを精製することもでき
る。
ハイブリドーマを含むことが確認されたら、そのハイブ
リドーマが含まれていたウェルの細胞から限界希釈法な
どによりクローニングを行う。
得られたGGPL−IIIに対して反応特異性を有するモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株は、通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、FERM
P−14324の受託番号で寄託されている。
中で培養すれば、その培養上清中に本発明のモノクロー
ナル抗体が得られる。さらに常法により、硫安塩析、イ
オン交換クロマトグラフィー、プロテインAまたはプロ
テインGを用いたアフィニティクロマトグラフィー、あ
るいは抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィーな
どによってモノクローナル抗体を精製することができ
る。
マイコプラズマ・ファーメンタンスに感染していない健
常人の血清中に存在するシアル酸含有糖脂質(ガングリ
オシド)、血小板活性化因子(1−アルキル−2−アセ
チルグリセロ−3−ホスホコリン)もしくはその部分脱
アシル化物、ホスファチジルコリンもしくはその部分脱
アシル化物、またはスフィンゴミエリン等の糖脂質及び
リン脂質とは交差反応を示さない。
使用することもできるが、フラグメント化したものを使
用することもできる。抗体のフラグメント化の際、抗体
の抗原結合部位(Fab)が保存されていることが抗原
と抗体との結合に必須であるので、抗原結合部位を分解
しないプロテアーゼ(例えばプラスミン、ペプシン、パ
パイン)で抗体を処理して得られる抗原結合部位(Fa
b)を含むフラグメントは使用することができる。
ドする遺伝子の塩基配列もしくは抗体のアミノ酸配列が
決定されれば、遺伝子工学的に抗原結合部位(Fab)
を含むフラグメントを作製することが可能である。
れに対する抗体の利用法 本発明の抗体は、マイコプラズマ・ファーメンタンス固
有のグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有するの
で、これを用いて検体中のグリセロ糖リン脂質を免疫学
的に測定することができる。この際、GGPL−I及び
GGPL−IIIの両方に対して反応特異性を有する抗体
を用いれば、GGPL−I及びGGPL−IIIを測定す
ることができ、GGPL−IIIに対して反応特異性を有
する抗体を用いれば、GGPL−IIIを選択的に測定す
ることができる。GGPL−IIIの測定に際しては、前
記のようにして得られるGGPL−IIIを標準物質とし
て使用することができる。また、前記検体中のグリセロ
糖リン脂質としては、生体由来の検体から抽出した脂質
画分が挙げられる。
法、免疫染色法等、抗体を用いる通常の免疫学的方法を
適用することができる。例えば、抗グリセロ糖リン脂質
抗体が結合した固相に検体液を接触させて検体液中に含
まれるグリセロ糖リン脂質を前記抗体に結合させ、非吸
着成分を固相から分離除去し、次いで、標識物質で標識
化したマイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖
リン脂質を前記固相に接触させ、前記検体液中に含まれ
るグリセロ糖リン脂質と標識化したグリセロ糖リン脂質
とを競合反応させ、固相に結合した標識物質または固相
に結合しない標識物質のいずれかを検出することによ
り、検体液中のグリセロ糖リン脂質を測定することがで
きる。
た固相に、検体液と、標識物質で標識化したグリセロ糖
リン脂質とを接触させ、前記検体液中に含まれるグリセ
ロ糖リン脂質と標識化したグリセロ糖リン脂質とを前記
抗体に対して競合反応させ、固相に結合した標識物質ま
たは固相に結合しない標識物質のいずれかを検出するこ
とにより検体中のグリセロ糖リン脂質を測定することが
できる。この際、標識化したグリセロ糖リン脂質の代わ
りに無標識の標準グリセロ糖リン脂質を用い、検体中の
グリセロ糖リン脂質と標準グリセロ糖リン脂質との競合
反応を行った後、さらに標識物質で標識化した抗グリセ
ロ糖リン脂質抗体を固相に接触させ、固相に結合した標
識物質または固相に結合しない標識物質のいずれかを検
出してもよい。この場合も、さらに標識化した二次抗体
を用いてもよい。
固相に結合し、これに標識化した抗グリセロ糖リン脂質
抗体を接触させ、固相に結合した標識物質または固相に
結合しない標識物質のいずれかを検出してもよい。
合させ、これに検体液及び標識化した抗グリセロ糖リン
脂質抗体を接触させ、固相に結合した標識物質または固
相に結合しない標識物質のいずれかを検出してもよい。
この場合においても、標識二次抗体を使用することもで
きる。標準グリセロ糖リン脂質として精製したGGPL
−IIIを用いれば、検体中のGGPL−IIIを測定するこ
とができる。
た固相に検体液を接触させて検体液中に含まれる抗グリ
セロ糖リン脂質抗体を前記抗体に結合させ、非吸着成分
を固相から分離除去し、次いで、抗ヒトイムノグロブリ
ン抗体を標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、標
識物質を検出することにより、検体中の抗グリセロ糖リ
ン脂質抗体を測定することができる。本発明のグリセロ
糖リン脂質は、マイコプラズマ・ファーメンタンスに固
有であるので、検体中の抗グリセロ糖リン脂質抗体の有
無を調べることによって、マイコプラズマ・ファーメン
タンスの感染の有無を知ることができる。
知られているが、いずれの方法も本発明に適用すること
ができる。また、上記のような固相を用いる方法以外
に、ハプテン、抗原の免疫測定に使用される方法、例え
ば、前記抗体に対して検体中のグリセロ糖リン脂質と標
識化したグリセロ糖リン脂質を競合反応させ、抗体と結
合した抗原と遊離の抗原を、例えばポリエチレングリコ
ール、デキストラン、二次抗体等を用いて分離し、遊離
の標識抗原の標識物質を検出する液相法を採用してもよ
い。
テックス粒子、ポリスチレン、ナイロン等のマイクロタ
イタープレートのウェル等の通常の材料及び形態(粒
子、微粒子、試験管、マイクロタイタープレート、スト
リップ等)のものが挙げられる。固相に抗体またはグリ
セロ糖リン脂質を結合させた後に、BSA(ウシ血清ア
ルブミン)やゼラチンなどを用いてブロッキングを行う
ことが好ましい。また、標識物質としては、ペルオキシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ等、酵素反応により
色素の発色が可能な酵素;放射性同位元素;フルオレセ
インイソチオシアネート等の蛍光色素などが挙げられ
る。
クロロ−1−ナフトール、O−フェニレンジアミン(O
PD)もしくは3,3’−ジアミノベンチジン等、アル
カリフォスファターゼに対してはp−ニトロフェニルフ
ォスフェート等を使用する。
明に係るグリセロ糖リン脂質を有しているので、本発明
の抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いてマイコプラズマ・
ファーメンタンスを検出することができる。例えば、検
体から脂質画分を抽出し、該脂質抽出物を固相と接触さ
せて脂質を吸着させ、脂質が吸着した固相と本発明の抗
体を反応させ、同時またはその後に、標識物質で標識化
された該抗体と反応する抗免疫グロブリン抗体を反応さ
せ、標識物質を検出することにより、検体中のマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスを検出することができる。
は、マイコプラズマ・ファーメンタンスに固有であるの
で、前記の方法により検体中のグリセロ糖リン脂質を測
定し、グリセロ糖リン脂質の存否またはその存在量と検
体中のマイコプラズマ・ファーメンタンスの存否または
その存在量とを関連づけることによって、マイコプラズ
マ・ファーメンタンスを検出することもできる。
イコプラズマ・ファーメンタンスの検出法において、検
体としては、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、関節液
または細胞培養液(上清)等が挙げられる。
そのまま又はグリセロ糖リン脂質の固定処理を施した
後、標識物質で標識化した抗グリセロ糖リン脂質抗体と
反応させ、マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染し
た生体組織または細胞に標識化抗体を結合させ、標識物
質を測定することにより、マイコプラズマ・ファーメン
タンスを検出することもできる。固定処理の方法として
は、例えばホルマリン、グルタルアルデヒド、パラホル
ムアルデヒド等を用いる方法が挙げられる。また、標識
物質で標識化した抗グリセロ糖リン脂質抗体の代わり
に、無標識の抗グリセロ糖リン脂質抗体を固定処理した
生体組織または細胞と反応させ、同時またはその後に、
前記抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調
製した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を
標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、マイコプラ
ズマ・ファーメンタンスが感染した生体組織または細胞
に標識化二次抗体を結合させ、標識物質を測定してもよ
い。
リン脂質またはマイコプラズマ・ファーメンタンスを検
出する際に、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリ
セロ糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗体と、こ
の抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製
した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標
識物質で標識化した二次抗体とを含む試薬キットを予め
用意しておくと、検出を簡便に行うことができる。
イタープレート、BSA(ウシ血清アルブミン)等のブ
ロッキング試薬、マイコプラズマ・ファーメンタンスの
グリセロ糖リン脂質(標準物質)、本発明の抗体、ペル
オキシダーゼ標識した抗マウスIgG抗体、過酸化水素
水、OPD、洗浄用緩衝液からなるキットが挙げられ
る。抗体類、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリ
セロ糖リン脂質等は、凍結乾燥品として、またはこれら
を安定して保存できる溶媒に溶解しておくことが好まし
い。
は、以下に示すような診断法に利用することができる。
免疫不全症候群)の増悪因子であるという報告がある
(Lo, S.-C. et al. 1993. Res.Microbiol. 144,489-49
3)。エイズは、HIV(ヒト免疫不全ウイルス)が感
染していても必ずしも発症するものではなく、通常潜伏
期間が長く、発症にはマイコプラズマ・ファーメンタン
スの複合感染が関与している。同様に、他のレトロウイ
ルス感染症の発症にもマイコプラズマ・ファーメンタン
スが関与しているものがあると考えられる。
種マイコプラズマから抽出した脂質を表1に示した脂質
濃度(終濃度)で加えて培養し、光学顕微鏡を用いて破
壊された細胞数を調べることにより、HIVの発現誘導
頻度の指標とした。結果を表1に示す。
ズマ・ファーメンタンスはレトロウイルスの増殖を誘導
する活性を有することがわかる。したがって、レトロウ
イルス感染者の血液等でマイコプラズマ・ファーメンタ
ンスの複合感染の有無を調べることによって、発症の予
測が可能となり、適切な処置を行うことができる。
あるという報告がある(Williams, M. H. et al. Lance
t ii: 277-280(1970))。したがって、本発明の抗体を
用いてマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出するこ
とにより、リウマチ罹患の診断が可能となることが期待
される。
たは/及び抗マイコプラズマ剤を結合させた本発明の抗
体をレトロウイルス感染者やリウマチ患者に投与し、レ
トロウイルス発症の予防あるいはリウマチの治療に利用
する等の応用が期待される。
合してそれによる感染を阻止するための中和抗体として
の活性が期待され、この抗体を生体に投与してマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスが複合感染する可能性の高い
ウイルスによる感染症の治療または予防に使用すること
ができる。
の抗グリセロ糖リン脂質抗体が結合する脂質が高率で認
められ、この脂質を検出することによって腎炎の診断を
行うことができることが示唆された。この脂質は、HP
TLC上の位置からはGGPL−IIIとは区別される
が、GGPL−IIIを認識するモノクローナル抗体が結
合したことから、GGPL−IIIと抗原性が類似した脂
質であると考えられる。このGGPL−IIIに抗原性が
類似した物質は、本発明の抗グリセロ糖リン脂質抗体を
用いて免疫学的に測定することができる。
説明する。
構造解析 <1>マイコプラズマ・ファーメンタンスの培養及び脂
質の調製 GGPLsを含むMT−4細胞(ヒトTリンパ球向性レ
トロウィルス−タイプI(HTLV−I)が感染したヒ
トヘルパーT細胞株)の培養上清を、ポアサイズ0.22μ
mのフィルターで濾過して、その濾液をPPLO broth(デ
ィフコ・ラボラトリーズ製)寒天培地に接種して培養
し、コロニーを単離した後、10%(v/v)ウシ胎仔血清(FB
S)、5%(w/v)酵母抽出物(フロー・ラボラトリーズ
製)、1000単位/mlペニシリン、1%(w/v)デキスト
ロース、0.002%(w/v)フェノールレッドを含むPPL
O broth(ディフコ・ラボラトリーズ製)の液体培地中
で培養した。形成されたコロニーはフライドエッグ状を
呈し、マイコプラズマであることが確認された。
コプラズマの種によって異なる16S−23Sリボゾー
ムRNA遺伝子間スペーサ領域の二段階PCR(Harasa
wa,R. et al. 1993. Res. Microbiol. 144: 489-493)
による解析を、MT−4細胞から分離したマイコプラズ
マ・ファーメンタンス、マイコプラズマ・ファーメンタ
ンス タイプストレインPG18、マイコプラズマ・ヒ
オリニス(M. hyorhinis)DBS1050(ATCC 1798
1)、マイコプラズマ・アルギニニ(M. arginini)G2
30(ATCC 23838)、マイコプラズマ・オラレ(M. oral
e)CH19299、マイコプラズマ・サリバリウム
(M. salivarium)PG20(ATCC 23064)、マイコプラ
ズマ・ペネトランス(M. penetrans)GTU−54−6
A1の各菌種について行った。その結果、一段階PCR
産物は、マイコプラズマ・ファーメンタンスのタイプス
トレインであるPG18株と一致した(図1)。さら
に、このPCR産物を用いて第2段階のPCRを行って
得られた増幅産物は、VspI及びHindIIIで切断され、Cla
I、HincII及びHaeIIIでは切断されなかった(図2)こ
とから、本微生物はマイコプラズマ・ファーメンタンス
と同定され、GGPL株(M. fermentans GGPL strai
n)と命名された。
ァーメンタンスの菌体1gにメタノールを100ml加
え数時間放置した後、クロロホルムを200ml加えて
超音波処理し、さらに数時間放置した。これを、ポータ
ー型テフロンホモジナイザーでホモジナイズして得られ
たホモジネートを10,000rpmで遠心し、その上
清を回収した。この上清を蒸発させることにより、脂質
抽出物50mgを得た。
脂質画分の分析 上記で得られたマイコプラズマ・ファーメンタンスの脂
質画分をHPTLC(高速薄層クロマトグラフィー)プ
レート(メルク社製)にアプライし、クロロホルム:メ
タノール:0.2%(w/v)塩化カルシウム水溶液=50:45:
10(v/v/v)の混合溶媒で展開し、ディットマー試薬を用
いてリン脂質を染色した。リン脂質のパターンを、TL
Cデンシトメータ(島津製作所製CS910)を用いて
580nmでの吸収により測定した。その結果、6本の
バンド(Lipid i、Lipid ii、Lipid iii、Lipid iv、Li
pid v、及びLipid vi)が検出された(図3)一方、マ
イコプラズマ・ファーメンタンスが感染したMT−4細
胞及びこの細胞を抗マイコプラズマ剤(MC201(大
日本製薬(株)製))で処理して得られたMT−4細胞
から脂質画分を既知の方法(Bligh and Dyer, Can. J. B
iochem. Physiol. 37,911-917(1959))により抽出した。
各々の脂質画分抽出物を、HPTLC(高速薄層クロマ
トグラフィー)プレート(メルク社製)にアプライし、
クロロホルム:メタノール:0.2%(v/v)塩化カルシウム
水溶液=50:45:10(v/v/v)の混合溶媒で展開し、オル
シノール(orcinol)試薬を用いて糖脂質を染色し、デ
ィットマー(Dittmer)試薬を用いてリン脂質を染色し
たところ、MT−4(GGPL+)にみられ、MT−4
(GGPL−)ではみられない2本のバンドが検出され
た(図4)。これらのバンドのうち一方は、すでに構造
が知られているGGPL−Iであり、他方はGGPL−
IIIであると同定された。尚、その他のディットマー試
薬陽性のバンドはGM2、GM1a、GD1a、オルシ
ノール試薬陽性のバンドはホスファチジルコリン及びス
フィンゴミエリンと同定されている(Matsuda , K. et
al. Biochem. Biophys. Acta, 1168, 123-129 (199
3))。
ーを通過させたMT−4細胞(マイコプラズマ・ファー
メンタンスが感染したもの)の培養上清を加えて培養し
たMT−4(抗マイコプラズマ剤PC201で処理した
もの)細胞から抽出した脂質画分を上記と同様にしてH
PTLCにより分析したところ、上記の2本のバンドが
検出された。したがって、これらのバンド、すなわちG
GPL−I及びGGPL−IIIは、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンスに由来することが明らかである。
は、TLC上の挙動から、前記マイコプラズマ・ファー
メンタンス由来のLipid v及びLipid viに各々相当する
ことがわかった。また、FABマススペクトルの結果か
ら、GGPL−IはLipid vと同一であり、GGPL−I
IIはLipid viと同一であることが確認された。
したMT−4細胞60ml(湿体積)に対し400mlのク
ロロホルム:メタノール=2:1,1:1および1:2
を用いて抽出し993mgの総脂質を得た。総脂質は、
DEAE Sephadex A-25カラムにより非吸着画分
(中性画分)と吸着画分(酸性画分)に分け、非吸着画
分775mgが得られた。この非吸着画分をイアトロビー
ズカラム(イアトロン社製)にかけ、クロロホルム/メ
タノール/水(83:16:0.5〜20:80:8,
v/v/v)の濃度勾配で3回分画し、最後に1-プロパノー
ル/アンモニア水/水(80:5:15〜75:5:2
0, v/v/v)による濃度勾配で溶出してGGPL−III
3mgを単離した。
薬、ドラゲンドルフ試薬に陽性を示し、また、緩和なア
ルカリ処理で分解した。さらに、GGPL−Iはニンヒ
ドリン反応に陰性を示したが、GGPL−IIIは陽性を
示した。これらの結果から、GGPL−IIIはコリンを
含む糖リン脂質であることがわかった。
−IIIの構造解析を行った。
鏡(IMS−8000、島津製作所製)を装着した赤外
分光光度計(FTIR−8100M:島津製作所製)を
用いて測定した。結果を図5に示す。
2920,2852,1467,1419,1378c
m-1)、水酸基(3271cm-1)、エステルカルボニ
ル基(1740,1165cm-1)、リン酸基(109
1cm-1)、コリン基(970cm-1)、及び一級アミ
ン基(1560−1670cm-1)にそれぞれ対応する
吸収が検出された。
S) 前記のようにして精製したGGPL−III 約1μgをク
ロロホルム:メタノール(1体積:1体積)の混合溶液
1μLに溶解し、この溶液に、(+)法の場合は3−ニ
トロベンジルアルコールを、(−)法の場合はトリエタ
ノールアミンをマトリクスとして0.5mL加えて混合
した。これらの混合溶液を試料とし、TSQ70三連四
重極型質量分析計(Finnegan MAT製)を使用して液体2
次イオン質量分析を行った。、一次イオン流として、2
0keVに加速したセシウムイオン(Cs+)を用い
た。スペクトルは、250原子質量単位(amu)/secの速度で
得た。(+)法によるスペクトルを図6に、(−)法に
よるスペクトルを図7に示す。
/z1049およびm/z1077イオンが認められ
た。このことから、脂肪酸組成が異なるGGPL−III
分子が少なくとも3種類存在することが示唆された。ま
た、GGPL−IIIの主要成分はm/z1049のピー
クであり、その分子量は、1049からプロトンの質量
1を差し引いた1048であると結論された。他の成分
の分子量も同様に、1020及び1076であると結論
された。
/z1076およびm/z1103イオンが認められ
た。(+)法によるスペクトル解析と併せると、GGP
L−III分子は、脂肪酸組成が異なる分子が少なくとも
4種類存在することが示唆された。(−)法におけるG
GPL−IIIの主要成分はm/z1047のピークであ
り、その分子量は、1047にプロトンの質量1を加え
た1048であると結論された。他の成分の分子量も、
同様に1104であると結論された。m/z1076イ
オンから推定される分子量は1077であるが、(+)
法の結果から推定される分子量は1076であり、他の
成分の分子量との差がメチレン基2個分に相当すること
から、1076であると結論された。
(MS/MS) LSIMSに用いた試料と同様に調製した試料((+)
法用の試料および(−)法の試料)を用い、TSQ70
三連四重極型質量分析計(Finnegan MAT製)を使用して
タンデムマススペクトルの測定を行った。一次イオン流
として、20keVに加速したセシウムイオン(C
s+)を用い、CAD(低エネルギー衝突活性化開裂)
気体として、0.26パスカル(2.0mTorr)に
維持したアルゴンを用いた。スペクトルは、250原子質
量単位(amu)/secの速度で得た。(+)法によるスペク
トルを図8に、(−)法によるスペクトルを図9に示
す。
ンおよびm/z1049イオンが認められた。m/z1
84イオンから、GGPL−IIIの分子中にホスホコリ
ンの存在が示唆された。また、GGPL−IIIの分子量
は、1049からプロトンの質量1を差し引いた104
8であると結論された。(−)法では、m/z1047
イオンが認められた。このことから、GGPL−IIIの
分子量は1047にプロトンの質量1を加えた1048
であると結論された。また、LSIMSにより示唆され
た複数種類のGGPL−IIIのうち、分子量1048の
分子が主要成分であることが支持された。
g)、ホスファチジルコリン(2mg)、D−グルコー
ス 6−リン酸・2ナトリウム塩(オリエンタル酵母
製)(約200μg)を、各々0.5mLの[2H]ジメ
チルスルホキシド((C2H3)2SO):2H2O(98体積:2体
積)に溶解し、GX−400スペクトロメーター(日本
電子製)を使用して、60℃下、400MHzにおける
1H−NMRスペクトルを得た。スタンダードとしては
テトラメチルシランを用いた。
1.00として標準化し、他のシグナルの強度を定量化し
た。結果を図10に示す。その結果、グリセロール(Gr
o)のシグナルが4.319ppm(GroH1b)、4.1
45ppm(GroH1a)、5.118ppm(GroH2)、
3.677ppm(GroH3b)、3.562ppm(GroH
3a)に検出された。また、コリンのシグナルが4.07
4ppm(-POCH2-)、3.529ppm(-CH2N≡)、
3.139ppm(-N(CH3)3)に検出された。また、3
−アミノプロパン−1,2−ジオール(1−アミノプロ
パン−2,3−ジオール)および2−アミノプロパン−
1,3−ジオールの標準標品を用いて、それぞれ上述の
方法により得られた一次元1H NMRスペクトル(それ
ぞれ図11A,図11B)とGGPL−IIIのスペクト
ルとを比較した結果、GGPL−IIIには2−アミノプ
ロパン−1,3−ジオールが含有されている可能性が高
い。さらに、グルコース(Glc)のシグナルとして4.
647ppm(GlcH1)が顕著に検出された。
400スペクトロメーター(日本電子製)を使用して、
60℃下、400MHzで、各次元2000Hz幅でP
H−DQF−COSY法による二次元の1H−NMR分
析を行った。結果を図12に示す。
るプロトンのシグナル(図12中、GroH2/H1b,GroH2/H
1a,GroH2/H3b,GroH2/H3a)が認められた。またコリン
(図中、-CH2-N-/-CH2OP-)のプロトンのシグナルが認
められた。
スペクトロメーター(日本電子製)を使用して、60℃
下400MHzで二次元の1H−31P HMQCスペクト
ルを得た。結果を図13に示す。
の1H NMRと同様のスペクトルが得られ、二次元目(
31P NMR)からは、2本のシグナルが得られた。こ
れは、1分子のGGPL−III中に2個のP(リン)が
含まれていることを示している。
3位,4位,5位のプロトンのシグナルが出ている位置
(2.9〜3.0ppm付近)と、二次元目のリンのシ
グナルが出ている位置(−0.9ppmおよび1.1p
pm)にクロスするピークが検出されなかったことか
ら、リンを含有する化合物はグルコース残基の1位また
は6位に結合していると推定された。さらに、グルコー
ス残基の6a位のプロトンのシグナル(一次元目の4.
0ppm付近)と二次元目のリンのシグナル(−0.9
ppm)およびグルコース残基の6b位のプロトンのシ
グナル(一次元目の3.6ppm付近)と二次元目のリ
ンのシグナル(−0.9ppmおよび1.1ppm)の
シグナルとクロスするピークがそれぞれ検出された。
4.05〜約4.1ppm)と二次元目のリンのシグナ
ル(−0.9ppm)とのクロスピークが検出されたこ
とから、コリンにリン酸基が結合したホスホコリンの構
造をたどることができる。さらに、このホスホコリンの
クロスピークは、グルコース残基の6a位のプロトンシ
グナル(一次元目の4.0ppm付近)とずれているこ
とから、グルコース残基の6位にはまずアミノプロパン
ジオールのリン酸エステルが結合しており、さらにこの
アミノプロパンジオールのリン酸エステルにホスホコリ
ンが結合する構造が推定された。
は、下記性質を有する新規グリセロ糖リン脂質である。 (A)オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 (B)アルカリで分解される。 (C)DEAE基を有する陰イオン交換体による分画に
おいて非吸着画分として得られる。 (D)質量分析計によって測定した分子量が1048+
28n(nは、−1、0、1又は2)である。
α−グルコピラノシル−(1’−3)−1,2−ジアシ
ル−sn−グリセロール、ホスホコリン及びアミノプロ
パンジオールのリン酸エステルを構成成分とすることが
示された。このアミノプロパンジオールのリン酸エステ
ルは、2−アミノプロパン−1,3−ジオールのリン酸
エステルであり、その結合部位は、α−グルコピラノシ
ル−(1’−3)−1,2−ジアシル−sn−グリセロ
ールのグルコース残基の6’位であると推定された。さ
らに、この2−アミノプロパン−1,3−ジオールのリ
ン酸エステルにホスホコリンが結合していることが示唆
された。
分子は、α−グルコピラノシル−(1’−3)−1,2
−ジアシル−sn−グリセロール中のアシル基の種類が
異なるものであり、主要成分(分子量1048)におけ
るアシル基はいずれもパルミトイル基であると推定さ
れ、全体の推定構造は、前記化1式に示した通りであ
る。尚、他の分子量を有するGGPL−III分子はアシ
ル基の長さが異なり、分子量1020のものではミリス
トイル基とパルミトイル基、1076のものではパルミ
トイル基とステアロイル基、1104のものでは2つの
ステアロイル基、またはパルミトイル基とエイコサノイ
ル基を有していると推定されるが、詳細は明らかではな
い。
析 各種マイコプラズマ(マイコプラズマ・ファーメンタン
ス GGPL株、マイコプラズマ・ファーメンタンス
インコグニタス(incognitus)(ATCC 53949)、マイコプ
ラズマ・ファーメンタンス PG18株、マイコプラズ
マ・ファーメンタンス F17株、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンス F1株、マイコプラズマ・ファーメン
タンスF7株、マイコプラズマ・アルスリティディス
(M. arthritidis)、マイコプラズマ・ホミニス(M. homi
nis)(ATCC 15488))を、10%(v/v)FBS(ウシ胎仔
血清)、5%(w/v)酵母抽出物(フロー・ラボラトリー
ズ製)、1000単位/mlペニシリン、1%(w/v)デキス
トロース、0.002%(w/v)フェノールレッドを含むP
PLO broth(ディフコ・ラボラトリーズ製)の液体培地
中で培養した。これらの培養液から既知の方法(Bligh a
nd Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37,911-917(195
9))により脂質を抽出し、この脂質抽出物をHPTLC
プレート(メルク社製)にアプライし、クロロホルム:
メタノール:0.2%(w/v)塩化カルシウム水溶液=50:4
5:10(v/v/v)の混合溶媒で展開した。このプレートをヘ
キサンに溶解した0.4%ポリイソブチルメタクリル酸塩
に30秒間浸した。このプレートを常法に従い、ディッ
トマー試薬による染色を行った。結果を図14に示す。
この結果より、GGPL−I及びGGPL−IIIに相当
するバンドは、各種マイコプラズマ・ファーメンタンス
にのみ見られ、他のマイコプラズマ菌種には見られなか
った。このことから、GGPL−I及びGGPL−III
は、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特徴的なグリ
セロ糖リン脂質であると結論された。
抗体の作製 前記のようにして得たマイコプラズマ・ファーメンタン
スの脂質抽出物50mgに、モノフォスフェートリピド
A(リビ・イムノケム・リサーチ社)50μgと、完全
アジュバント(ナカライテスク(株))50μgとを加
え、さらにミネラルオイル250μl加えて400rp
mで2分間グラインドした。さらに0.1%(v/v)Tween
80を含むPBSを250μl加えて400rpmで2
分間グラインドして、脂質抽出物を含むエマルジョン
0.5mlを得た。
週齢のメスBALB/cマウスの皮下に1匹あたり0.5ml
注射した。初回免疫後2週間目と3週間目に、上記の方
法で調製した脂質抽出物を含むエマルジョンを1匹あた
り0.5ml腹腔内に注射した。
ら、常法によって血清を分離した。この血清を用いて以
下のように免疫染色を行った。GGPL陽性のMT−4
細胞から、脂質画分を既知の方法(Bligh and Dyer, Ca
n. J. Biochem. Physiol. 37,911-917(1959))で抽出
し、高速薄層クロマトグラフィー(HPTLC)プレー
ト(メルク社製)に脂質画分抽出物をアプライし、クロ
ロホルム:メタノール:0.2%(w/v)塩化カルシウム水溶
液=50:45:10(v/v/v)の混合溶媒で展開した。このプ
レートを、ヘキサンに溶解した0.4%ポリイソブチルメ
タクリル酸塩に30秒間浸した後、風乾した。
てないマウスの血清をHPTLCプレートに添加して、
4℃下で一晩インキュベートした。PBSでHPTLC
プレートを洗った後、2次抗体としてペルオキシダーゼ
標識抗ウサギIgG抗体(カペル社製)をHPTLCプ
レートに添加して、室温で4時間インキュベートした。
HPTLCプレートを純水で洗った後、抗原のバンドを
ペルオキシダーゼ発色キット(KONICA Immunostaining
HRPKit:コニカ社製)を用いて検出した。結果を図15
に示す。この結果から上記の血清はGGPL−Iおよび
GGPL−IIIに対するポリクローナル抗体を含むこと
が確認された。
製 (1)ハイブリドーマの調製 実施例2と同様に、マイコプラズマ・ファーメンタンス
の脂質抽出物を含むエマルジョンを、7週齢のメスBALB
/cマウスの皮下に1匹あたり0.5ml注射した。初回
免疫後2週間目と3週間目に、上記の方法で調製した脂
質抽出物を含むエマルジョンを1匹あたり0.5ml腹
腔内に注射した。
し、RPMI1640培地を用いて細胞浮遊液を調製した。この
2×108個の脾細胞と、対数増殖期にあるマウスミエロ
ーマSP2/O細胞〔アザグアニン耐性、IgG非分泌;ATC
C CRL-1581〕(2×107 個)とを混合し、遠沈後、沈渣
に45%ポリエチレングリコール(PEG4000(和光純薬
(株)製)1mlを1分間かけてゆるやかに振盪しなが
ら加え、その後37℃下でゆるやかに振盪しながら2分
間インキュベーションした。これに、RPMI1640培地1m
lを1分間かけて加えてゆるやかに振盪し、同じく1m
lを1分間かけて加えてゆるやかに振盪した後、更に8
mlを3分間かけて加えた。
牛胎仔血清(FCS)を含むRPMI1640培地50mlに浮遊さ
せ、96穴マイクロプレート4枚に、1ウェルあたり1
00μlずつ分注し、炭酸ガスインキュベーター(5%
炭酸ガス、37℃)中で培養した。24時間後、培地を
HAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン含有、10%(v/v)FCS培地)に交換し、ひきつづき炭
酸ガスインキュベーター(5%炭酸ガス、37℃)で培
養した。HAT培地での培養開始後4日目に、新しいH
AT培地を1ウェルあたり100μl追加した。HAT
培地での培養開始後7日目にHT培地(HAT培地から
アミノプテリンを除いたもの)に交換し、その翌日に1
0%(v/v)FCSを含むRPMI1640培地に交換した後、コ
ロニー形成の有無をチェックした。
を10mlのエタノールに溶解した溶液を、96穴マイ
クロプレートの1ウェルあたり50μl加えた後、ドラ
イヤーで30分間乾燥させた。1%(w/v)ウシ血清アル
ブミン(BSA)を含むPBSを1ウェルあたり100
μl加え、室温で1時間静置した。1ウェルあたり10
0μlの0.3Mショ糖溶液で5回洗った後、前記の培
養上清を100μlずつ各ウェルに加え、室温で60分
間振盪した。0.05%Tween 20溶液で各ウェルを洗っ
た後、PBSで500倍希釈したペルオキシダーゼ標識
抗マウスIgG抗体(カペル社製製)を1ウェルあたり
50μl加え、室温で60分間振盪した。
た後、10mgオルトフェニレンジアミンおよび50μ
lの30%(v/v)過酸化水素水を含む10mlのクエン
酸緩衝液を1ウェルあたり100μl加えて室温で15
分間インキュベートした。1ウェルあたり100μlの
0.5M硫酸を加えてペルオキシダーゼの酵素反応を停
止させた後、マイクロプレートリーダーで490nmの
吸光度を測定した。抗体を産生するハイブリドーマにつ
いて限界希釈法によってクローニングを繰り返し、マイ
コプラズマ・ファーメンタンスの脂質画分を抗原に用い
たELISAにより第一次スクリーニングを行い、EL
ISA陽性のコロニーについては、さらにマイコプラズ
マ・ファーメンタンスの脂質画分のHPTLCの免疫染
色により二次スクリーングを行い、GGPL−IIIに対
して反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ株MF−III−1株を得た。この株は、
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、FE
RM P−14324の受託番号で寄託されている。
I1640培地中で培養し、その培養上清を回収することに
より、GGPL−IIIに対するモノクローナル抗体を得
た。
て、以下のように免疫染色を行った。各種マイコプラズ
マ(マイコプラズマ・ファーメンタンス GGPL株、
マイコプラズマ・ファーメンタンス インコグニタス(i
ncognitus)(ATCC53949)、マイコプラズマ・ファーメ
ンタンス PG18株、マイコプラズマ・ファーメンタ
ンス F17株、マイコプラズマ・ファーメンタンス F
1株、マイコプラズマ・ファーメンタンスF7株、マイ
コプラズマ・アルスリティディス(M. arthritidis)、マ
イコプラズマ・ホミニス(M. hominis)(ATCC 15488))の
脂質画分を、既知の方法(Bligh and Dyer, Can. J. Bio
chem. Physiol. 37,911-917(1959))で抽出し、高速薄層
クロマトグラフィー(HPTLC)プレート(メルク社
製)に脂質画分抽出物をアプライし、クロロホルム:メ
タノール:0.2%(w/v)塩化カルシウム水溶液=5
0:45:10(v/v/v)の混合溶媒で展開した。
4%(w/v)ポリイソブチルメタクリル酸塩に30秒間浸
した後、風乾した。1次抗体として、上記の抗GGPL
−IIIモノクローナル抗体をHPTLCプレートに添加
して、4℃下で一晩インキュベートした。PBSでHP
TLCプレートを洗った後、2次抗体としてペルオキシ
ダーゼ標識抗マウスIgG抗体(カペル社製)をHPT
LCプレートに添加して、室温で4時間インキュベート
した。HPTLCプレートを純水で洗った後、抗原のバ
ンドをペルオキシダーゼ発色キット(KONICA Immunosta
ining HRPKit:コニカ社製)で検出した。結果を図16
に示す。
体は、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖
リン脂質に特異的に結合し、マイコプラズマ・アルソリ
ティディス及びマイコプラズマ・ホミニスのリン脂質及
び糖脂質には結合しないことが明らかである。さらに、
HPTLC上でディットマー試薬及びオルシノール試薬
で染色されたバンドのうち、GM2、GM1a、GD1
a、ホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンと同
定されているバンド及びGGPL−Iのバンドは、免疫
染色においては認められず、本発明のモノクローナル抗
体はGGPL−IIIのみに特異的に結合した。
が感染したMT−4細胞を、1次抗体として抗GGPL
−IIIモノクローナル抗体、2次抗体としてフルオロセ
インイソチオシアネート(FITC)標識抗マウスIg
G抗体で免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を図1
7に示す。
体を用いてマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出す
ることができることが明らかである。
GGPL−IIIに抗原性が類似した物質の検出 腎炎患者の血液および正常人の血液から、常法により調
製した血清それぞれ100μlに対し、既知の方法(Bl
igh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911-9
17 (1959))に従い、それぞれ100μlのクロロホル
ム:メタノール(2:1、1:1及び1:2(V/V))の
混合溶媒を用いて血清中の総脂質を抽出した。抽出溶媒
は3層に分かれ、そのうちの最下層を回収し、これを水
に対して透析し、凍結乾燥させた。このようにして得ら
れた試料を高速薄層クロマトグラフィー(HPTLC)
プレート(メルク社製)にアプライし、クロロホルム:
メタノール:0.2%(W/V)塩化カルシウム水溶液の
混合溶媒(50:45:10(V/V/V))で展開した。ま
た、標準物質として、精製したGGPL−IIIを用いて
同様にHPTLCプレートにアプライして展開した。
4%(w/v)ポリイソブチルメタクリル酸塩に30秒間浸
した後、風乾した。1次抗体として、上記の抗GGPL
−IIIモノクローナル抗体をHPTLCプレートに添加
して、4℃下で一晩インキュベートした。PBSでHP
TLCプレートを洗った後、2次抗体としてペルオキシ
ダーゼ標識抗マウスIgG抗体(カペル社製)をHPT
LCプレートに添加して、室温で4時間インキュベート
した。HPTLCプレートを純水で洗った後、抗原のバ
ンドをペルオキシダーゼ発色キット(KONICA Immunosta
ining HRPKit:コニカ社製)で検出した。
び正常人の血清9検体について行ったところ、腎炎患者
9検体のうち6検体についてはGGPL−IIIの付近に
シグナルが認められた(図18)。このシグナルは、正
常人の検体には検出されなかった(図18)。腎炎患者
に高率に見られるこのシグナルは、HPTLC上の位置
からはGGPL−IIIとは異なっているが、抗原性が類
似した脂質であると考えられる。
それぞれの凍結乾燥試料を、クロロホルム:メタノー
ル:水(83:16:0.5(V/V/V))の混合溶媒に溶
解し、イアトロビーズ 6RS−8060(イアトロン
社製)をつめたイアトロビーズカラム(クロロホルム:
メタノール:水(83:16:0.5(V/V/V))の混合
溶媒で平衡化したもの)にアプライし、クロロホルム:
メタノール:水の組成を変えて段階的に溶出させたもの
をHPTLCにかけてもよい。
A法による、血清中の抗GGPL−III抗体の検出 実施例1で精製されたGGPL−III 40μgを10m
lのエタノールに溶解した溶液を、96穴マイクロプレ
ートの1ウェルあたり50μl加えた後、ドライヤーで
30分間乾燥させた。1%(w/v)ウシ血清アルブミン
(BSA)を含むPBSを1ウェルあたり100μl加
え、室温で1時間静置した。1ウェルあたり100μl
の0.3Mショ糖溶液で5回洗った後、正常人、エイズ
(AIDS)患者、腎炎(nephritis)患者、HTLV
−I関連ミエロパチー(HAM;HTLV-1 associated my
elopathy)患者それぞれの血液から常法によって調製し
た血清を100μlずつ各ウェルに加え、室温で60分
間振盪した。0.05%Tween 20溶液で各ウェルを洗っ
た後、PBSで2000倍希釈したペルオキシダーゼ標
識抗ヒトIgG抗体(カペル社製)を1ウェルあたり5
0μl加え、室温で60分間振盪した。
た後、10mgオルトフェニレンジアミンおよび50μ
lの30%(v/v)過酸化水素水を含む10mlのクエン
酸緩衝液を1ウェルあたり100μl加えて室温で15
分間インキュベートした。1ウェルあたり100μlの
0.5M硫酸を加えてペルオキシダーゼの酵素反応を停
止させた後、マイクロプレートリーダーで450nmの
吸光度を測定した。
患者血清10検体、腎炎(nephritis)患者血清22検
体、HTLV−I関連ミエロパチー(HAM;HTLV-1 a
ssociated myelopathy)患者血清9検体について上述の
方法で450nmの吸光度を測定し、正常人をコントロ
ールとして、正常人よりも450nmの吸光度が大きい
血清検体を、抗GGPL−III抗体陽性とした。結果を
表2に示す。
体中1検体(2.2%)、エイズ患者では10検体中8
検体(80.0%)、腎炎患者では22検体中3検体
(13.8%)、HTLV−I関連ミエロパチー患者で
は9検体中2検体(22.2%)が、それぞれ血清中の
抗GGPL−III抗体陽性であった。また、前述の2次
抗体(ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体)のかわ
りにペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgM抗体(カペル社
製)を用いて同様に調べた場合、腎炎患者の血清中の抗
GGPL−III抗体陽性率はさらに増加した。
メンタンス由来の新規グリセロ糖リン脂質、GGPL−
IIIが得られた。また、マイコプラズマ・ファーメンタ
ンス由来のグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有
する抗体、特に、GGPL−I及びGGPL−IIIに対
して反応特異性を有するポリクローナル抗体、及びGG
PL−IIIのみに対して反応特異性を有するモノクロー
ナル抗体が得られた。
プラズマ・ファーメンタンスの特異的な検出が可能とな
り、エイズ等のレトロウイルス感染症の発症の予測、及
びリウマチの診断、腎炎の診断等への応用が期待され
る。
スが複合感染する可能性の高いウイルスによる感染症の
治療または予防に使用できる可能性がある。
ームRNA遺伝子間スペーサ領域の第一段階PCRによ
る増幅産物の電気泳動の結果を示す図。 1:MT−4細胞から分離したマイコプラズマ・ファー
メンタンス GGPL株 2:マイコプラズマ・ファーメンタンス PG18 3:マイコプラズマ・ヒオリニス DBS1050 4:マイコプラズマ・アルギニニ G230 5:マイコプラズマ・オラレ CH19299 6:マイコプラズマ・サリバリウム PG20 7:マイコプラズマ・ペネトランス GTU−54−6
A1 8:ネガティブコントロール
−23SリボゾームRNA遺伝子間スペーサ領域の第二
段階PCRによる増幅産物を各種制限酵素で消化した断
片の電気泳動の結果を示す図。1.VspI,2.HindII
I,3.ClaI,4.HincII,5.HaeIII,6.無処理
分に含まれるリン脂質のTLCパターン(デンシトメト
リー)を示す図。
た又は非感染のMT−4細胞の脂質画分に含まれるリン
脂質及び糖脂質のTLCパターンを示す図。PCはホス
ファチジルコリンを、SPMはスフィンゴミエリンを各
々表す。
す図。
オン質量スペクトルを示す図。
オン質量スペクトルを示す図。
ススペクトルを示す図。
ススペクトルを示す図。
(1−アミノプロパン−2,3−ジオール)(A)およ
び2−アミノプロパン−1,3−ジオールの一次元1H
NMRスペクトル(B)を示す図。
法による二次元の1HNMRスペクトルを示す図。
スペクトルを示す図。
リン脂質のTLCの結果(ディットマー試薬で染色)を
示す図。 1.マイコプラズマ・ファーメンタンス GGPL株 2.マイコプラズマ・ファーメンタンス インコグニタ
ス 3.マイコプラズマ・ファーメンタンス PG18株 4.マイコプラズマ・ファーメンタンス F17株 5.マイコプラズマ・ファーメンタンス F1株 6.マイコプラズマ・ファーメンタンスF7株 7.マイコプラズマ・アルスリティディス 8.マイコプラズマ・ホミニス
画分を実施例2のポリクローナル抗体を用いて免疫染色
した結果を示す図。
の脂質画分を実施例3のモノクローナル抗体を用いて免
疫染色した結果を示す図。(数字は図14と同じ。)
したMT−4細胞を本発明のモノクローナル抗体を用い
て免疫染色した結果を示す写真(生物の形態)。
人の血液から抽出した脂質を実施例3のモノクローナル
抗体を用いて免疫染色した結果を示す図(クロマトグラ
フ)。nephritis patientsは腎炎患者の血液から抽出し
た脂質、normal individualsは正常人の血液から抽出し
た脂質についての結果を示す。
工業技術研究所
4324
工業技術研究所
Claims (25)
- 【請求項1】 以下の性質を有する、マイコプラズマ・
ファーメンタンスから抽出され得るグリセロ糖リン脂
質。 (A)オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 (B)アルカリで分解される。 (C)ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体
による分画において非吸着画分として得られる。 (D)質量分析計によって測定した分子量が1048+
28n(nは、−1、0、1又は2)である。 - 【請求項2】 α−グルコピラノシル−(1’−3)−
1,2−ジアシル−sn−グリセロール、ホスホコリン
及びアミノプロパンジオールのリン酸エステルを構成成
分とする請求項1記載のグリセロ糖リン脂質。 - 【請求項3】 少なくともホスホコリン、グルコース、
脂肪酸及びグリセロールを含み、ジエチルアミノエチル
基を有する陰イオン交換体に対して非吸着性の脂質であ
り、アルカリに不安定であるグリセロ糖リン脂質に対し
て反応特異性を有する抗グリセロ糖リン脂質抗体。 - 【請求項4】 前記グリセロ糖リン脂質が、マイコプラ
ズマ・ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ糖
リン脂質である請求項3記載の抗グリセロ糖リン脂質抗
体。 - 【請求項5】 6’−O−ホスホコリン−α−グルコピ
ラノシル−(1’−3)−1,2−ジアシル−sn−グ
リセロールと、請求項1記載のグリセロ糖リン脂質との
両方と反応する請求項3または4に記載の抗グリセロ糖
リン脂質抗体。 - 【請求項6】 ポリクローナル抗体である請求項3〜5
のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。 - 【請求項7】 請求項1記載のグリセロ糖リン脂質のみ
に対して反応特異性を有する請求項3または4に記載の
抗グリセロ糖リン脂質抗体。 - 【請求項8】 モノクローナル抗体またはそのフラグメ
ントである請求項3、4、5または7のいずれか一項に
記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。 - 【請求項9】 マイコプラズマ・ファーメンタンスを特
異的に認識し、他種のマイコプラズマを認識しない請求
項3記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。 - 【請求項10】 前記他種のマイコプラズマが、マイコ
プラズマ・アルソリティディス及びマイコプラズマ・ホ
ミニスである請求項9記載の抗グリセロ糖リン脂質抗
体。 - 【請求項11】 シアル酸含有糖脂質(ガングリオシ
ド)、血小板活性化因子(1−アルキル−2−アセチル
グリセロ−3−ホスホコリン)もしくはその部分脱アシ
ル化物、ホスファチジルコリンもしくはその部分脱アシ
ル化物、またはスフィンゴミエリンに交差反応を示さな
い請求項4記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。 - 【請求項12】 検体中の以下の性質を有するグリセロ
糖リン脂質を、請求項3〜11のいずれか一項に記載の
抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いて免疫学的に測定する
ことを特徴とするグリセロ糖リン脂質の測定法;少なく
ともホスホコリン、グルコース、脂肪酸及びグリセロー
ルを含み、ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交
換体に対して非吸着性の脂質であり、アルカリに不安定
であるグリセロ糖リン脂質。 - 【請求項13】 検体中に含まれる請求項1記載のグリ
セロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質を、請求項3〜
11のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体
を用いて免疫学的に測定することを特徴とするグリセロ
糖リン脂質に抗原性が類似した物質の測定法。 - 【請求項14】 検体中のマイコプラズマ・ファーメン
タンスに特異的に存在するグリセロ糖リン脂質を、請求
項3〜11のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂
質抗体を用いて免疫学的に測定することを特徴とするグ
リセロ糖リン脂質の測定法。 - 【請求項15】 請求項3〜11のいずれか一項に記載
の抗グリセロ糖リン脂質抗体が結合した固相に検体液を
接触させて検体液中に含まれるグリセロ糖リン脂質を前
記抗体に結合させ、非吸着成分を固相から分離除去し、
次いで、標識物質で標識化したマイコプラズマ・ファー
メンタンスのグリセロ糖リン脂質を前記固相に接触さ
せ、前記検体液中に含まれるグリセロ糖リン脂質と標識
化したグリセロ糖リン脂質とを競合反応させ、固相に結
合した標識物質または固相に結合しない標識物質のいず
れかを検出することを特徴とする検体中のグリセロ糖リ
ン脂質の測定法。 - 【請求項16】 請求項1記載のグリセロ糖リン脂質が
結合した固相に検体液を接触させて検体液中に含まれる
抗グリセロ糖リン脂質抗体を前記グリセロ糖リン脂質に
結合させ、非吸着成分を固相から分離除去し、次いで、
抗ヒトイムノグロブリン抗体を標識物質で標識化した二
次抗体を反応させ、標識物質を検出することを特徴とす
る検体中の抗グリセロ糖リン脂質抗体の測定法。 - 【請求項17】 検体中のグリセロ糖リン脂質を、請求
項14または15記載の測定法によって測定し、このグ
リセロ糖リン脂質の存否またはその存在量と検体中のマ
イコプラズマ・ファーメンタンスの存否またはその存在
量とを関連づけることを特徴とするマイコプラズマ・フ
ァーメンタンスの検出法。 - 【請求項18】 前記検体中のグリセロ糖リン脂質が、
生体由来の検体から抽出した脂質画分である請求項17
記載のマイコプラズマ・ファーメンタンスの検出法。 - 【請求項19】 生体由来の検体が、血液、血清、血
漿、脳脊髄液、尿、関節液または細胞培養液である請求
項18記載のマイコプラズマ・ファーメンタンスの検出
法。 - 【請求項20】 検体から脂質画分を抽出し、該脂質抽
出物を固相と接触させて脂質を吸着させ、脂質が吸着し
た固相と請求項3〜11のいずれか一項に記載の抗グリ
セロ糖リン脂質抗体を反応させ、同時またはその後に、
前記抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調
製した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を
標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、標識物質を
検出することを特徴とする検体中のマイコプラズマ・フ
ァーメンタンスの検出法。 - 【請求項21】 生体組織または細胞を、そのまま又は
グリセロ糖リン脂質の固定処理を施した後、標識物質で
標識化した請求項3〜11のいずれか一項に記載の抗グ
リセロ糖リン脂質抗体と反応させ、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンスが感染した生体組織または細胞に標識化
抗体を結合させ、標識物質を測定することを特徴とする
マイコプラズマ・ファーメンタンスの検出法。 - 【請求項22】 生体組織または細胞を、そのまま又は
グリセロ糖リン脂質の固定処理を施した後、請求項3〜
11のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体
を反応させ、同時またはその後に、前記抗体の調製に用
いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前記免疫動物
のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化し
た二次抗体を反応させ、マイコプラズマ・ファーメンタ
ンスが感染した生体組織または細胞に標識化二次抗体を
結合させ、標識物質を測定することを特徴とするマイコ
プラズマ・ファーメンタンスの検出法。 - 【請求項23】 免疫学的方法により検体中のマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスまたはマイコプラズマ・ファ
ーメンタンスのグリセロ糖リン脂質を検出するための試
薬キットであって、請求項3〜11のいずれか一項に記
載の抗グリセロ糖リン脂質抗体と、標識物質で標識化し
たマイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン
脂質とを含むことを特徴とする試薬キット。 - 【請求項24】 免疫学的方法により検体中のマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスまたはマイコプラズマ・ファ
ーメンタンスのグリセロ糖リン脂質を検出するための試
薬キットであって、請求項3〜11のいずれか一項に記
載の抗グリセロ糖リン脂質抗体と、前記抗体の調製に用
いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前記免疫動物
のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化し
た二次抗体とを含むことを特徴とする試薬キット。 - 【請求項25】 血液中に含まれる、請求項1記載のグ
リセロ糖リン脂質もしくはこのグリセロ糖リン脂質に抗
原性が類似した物質、またはこれらのグリセロ糖リン脂
質に対して反応特異性を有する抗体を検出することを特
徴とする、エイズ、腎炎及びHTLV−I関連ミエロパ
チーから選ばれる疾病の検出法。
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WO2010126146A1 (ja) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Tanaka Noriaki | 腎疾患重篤度を判定する方法又は装置若しくはその作動方法 |
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Cited By (7)
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