JPH0848693A - 新規グリセロ糖リン脂質とその抗体及びマイコプラズマの検出法 - Google Patents
新規グリセロ糖リン脂質とその抗体及びマイコプラズマの検出法Info
- Publication number
- JPH0848693A JPH0848693A JP6286038A JP28603894A JPH0848693A JP H0848693 A JPH0848693 A JP H0848693A JP 6286038 A JP6286038 A JP 6286038A JP 28603894 A JP28603894 A JP 28603894A JP H0848693 A JPH0848693 A JP H0848693A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glyceroglycophospholipid
- antibody
- mycoplasma
- mycoplasma fermentans
- ggpl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
- C07H15/06—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical being a hydroxyalkyl group esterified by a fatty acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
- C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1253—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56933—Mycoplasma
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的
に存在するグリセロ糖リン脂質、それに対する抗体、こ
の抗体を用いるグリセロ糖リン脂質の測定法及びマイコ
プラズマ・ファーメンタンスを検出する方法を提供す
る。 【構成】 マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質画
分を抗原として用いてマウスを免疫し、脾細胞とマウス
ミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを作製し、
マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的なホスホコ
リン含有グリセロ糖脂質であるＧＧＰＬ−IIIに対して
反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを選択する。得られた抗体を用いてマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスを検出する。
に存在するグリセロ糖リン脂質、それに対する抗体、こ
の抗体を用いるグリセロ糖リン脂質の測定法及びマイコ
プラズマ・ファーメンタンスを検出する方法を提供す
る。 【構成】 マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質画
分を抗原として用いてマウスを免疫し、脾細胞とマウス
ミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを作製し、
マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的なホスホコ
リン含有グリセロ糖脂質であるＧＧＰＬ−IIIに対して
反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを選択する。得られた抗体を用いてマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスを検出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、マイコプラズマ・ファ
ーメンタンス由来の新規グリセロ糖リン脂質、マイコプ
ラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ
糖リン脂質に対する抗体、この抗体を用いるグリセロ糖
リン脂質の測定法及びマイコプラズマ・ファーメンタン
スを検出する方法に関する。
ーメンタンス由来の新規グリセロ糖リン脂質、マイコプ
ラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ
糖リン脂質に対する抗体、この抗体を用いるグリセロ糖
リン脂質の測定法及びマイコプラズマ・ファーメンタン
スを検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】本発明者らは、先にＭＴ−４細胞（ＨＴ
ＬＶ−Ｉ（ヒトＴリンパ球向性レトロウイルス−タイプ
Ｉ）が感染したヒトヘルパーＴ細胞(Miyoshi et al. Ga
nn, 71, 155-156 (1980))）から５種のグリセロ糖リン
脂質（ホスホコリン含有グリセロ糖脂質）を見出し、こ
のうちの１種が６’−Ｏ−ホスホコリン−α−グルコピ
ラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グ
リセロールであることを見出している（脂質生化学研
究、第３５巻、第１１１〜１１４頁、１９９３年）。
ＬＶ−Ｉ（ヒトＴリンパ球向性レトロウイルス−タイプ
Ｉ）が感染したヒトヘルパーＴ細胞(Miyoshi et al. Ga
nn, 71, 155-156 (1980))）から５種のグリセロ糖リン
脂質（ホスホコリン含有グリセロ糖脂質）を見出し、こ
のうちの１種が６’−Ｏ−ホスホコリン−α−グルコピ
ラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グ
リセロールであることを見出している（脂質生化学研
究、第３５巻、第１１１〜１１４頁、１９９３年）。
【０００３】一方、マイコプラズマ・ファーメンタンス
（Mycoplasma fermentans）は、ヒト免疫不全症候群
（エイズ；ＡＩＤＳ）の増悪因子である（Lo. S., -C.
et al.1991, Science 251: 1074-1076；米国特許第５，
２４２，８２０号）、あるいはリウマチの原因である
（Williams, M. H. et al. 1970, Lancet ii: 277-28
0）という報告がある。
（Mycoplasma fermentans）は、ヒト免疫不全症候群
（エイズ；ＡＩＤＳ）の増悪因子である（Lo. S., -C.
et al.1991, Science 251: 1074-1076；米国特許第５，
２４２，８２０号）、あるいはリウマチの原因である
（Williams, M. H. et al. 1970, Lancet ii: 277-28
0）という報告がある。
【０００４】従来、種々のマイコプラズマに対する抗体
が知られており、臨床検査等にも使用されているが、多
くはマイコプラズマ・ニューモニエ（M. pneumoniae）
またはマイコプラズマ・ジェニタリウム（M. genitaliu
m）に対する抗体である。また、これらのマイコプラズ
マに対するモノクローナル抗体も作成されているが、こ
れらの抗体は、マイコプラズマの蛋白質または蛋白質と
脂質を同時に認識する抗体であると考えられ、いずれも
マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異性を示さない
（特開昭６３−２９８、特開昭６３−１８４０６４、特
開昭６３−３２４９６、特開平５−３０４９９０、米国
特許第５，１５８，８７０号、米国特許第４，９４５，
０４１号、米国特許第５，２４２，８２０号）。また、
マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異性を示す抗体
が米国特許第５，２４２，８２０号に開示されている
が、菌体の全抽出物を免疫原として得られた抗体であ
り、蛋白質を認識する抗体であると考えられる。よっ
て、この抗体を用いて、種々の蛋白質を含む血清などの
体液中のマイコプラズマを検出する場合、この抗体が非
特異的な結合をする可能性が高く、高い感度は期待でき
ないと考えられる。また、抗原が蛋白質の場合、蛋白質
のアミノ酸配列の変異により抗原性が消失する場合も十
分に考えられる。
が知られており、臨床検査等にも使用されているが、多
くはマイコプラズマ・ニューモニエ（M. pneumoniae）
またはマイコプラズマ・ジェニタリウム（M. genitaliu
m）に対する抗体である。また、これらのマイコプラズ
マに対するモノクローナル抗体も作成されているが、こ
れらの抗体は、マイコプラズマの蛋白質または蛋白質と
脂質を同時に認識する抗体であると考えられ、いずれも
マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異性を示さない
（特開昭６３−２９８、特開昭６３−１８４０６４、特
開昭６３−３２４９６、特開平５−３０４９９０、米国
特許第５，１５８，８７０号、米国特許第４，９４５，
０４１号、米国特許第５，２４２，８２０号）。また、
マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異性を示す抗体
が米国特許第５，２４２，８２０号に開示されている
が、菌体の全抽出物を免疫原として得られた抗体であ
り、蛋白質を認識する抗体であると考えられる。よっ
て、この抗体を用いて、種々の蛋白質を含む血清などの
体液中のマイコプラズマを検出する場合、この抗体が非
特異的な結合をする可能性が高く、高い感度は期待でき
ないと考えられる。また、抗原が蛋白質の場合、蛋白質
のアミノ酸配列の変異により抗原性が消失する場合も十
分に考えられる。
【０００５】本発明者らが知る限り、マイコプラズマが
ホスホコリンを含有したグリセロ糖リン脂質を持つとい
う報告はない。さらに、マイコプラズマ由来のグリセロ
糖リン脂質を免疫原とし、このグリセロ糖リン脂質に特
異性を示す抗体を得た例は知られていない。またさら
に、このグリセロ糖リン脂質に特異性を示す抗体が、マ
イコプラズマ・ファーメンタンスに高い特異性を示すこ
とも全く知られていない。
ホスホコリンを含有したグリセロ糖リン脂質を持つとい
う報告はない。さらに、マイコプラズマ由来のグリセロ
糖リン脂質を免疫原とし、このグリセロ糖リン脂質に特
異性を示す抗体を得た例は知られていない。またさら
に、このグリセロ糖リン脂質に特異性を示す抗体が、マ
イコプラズマ・ファーメンタンスに高い特異性を示すこ
とも全く知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】マイコプラズマの感染
が、ヒト免疫不全ウイルス感染者のエイズへの病態の進
行を加速しているという報告があり（1991, Science 25
1: 4991）、前記の通り、マイコプラズマ・ファーメン
タンスがエイズの増悪因子であるという報告もあるが、
生体内においてこのようなマイコプラズマ・ファーメン
タンスの動態を正確に検出できる手段がなく、生体内の
マイコプラズマ・ファーメンタンスを免疫学的に検出可
能な抗体の提供が望まれていた。
が、ヒト免疫不全ウイルス感染者のエイズへの病態の進
行を加速しているという報告があり（1991, Science 25
1: 4991）、前記の通り、マイコプラズマ・ファーメン
タンスがエイズの増悪因子であるという報告もあるが、
生体内においてこのようなマイコプラズマ・ファーメン
タンスの動態を正確に検出できる手段がなく、生体内の
マイコプラズマ・ファーメンタンスを免疫学的に検出可
能な抗体の提供が望まれていた。
【０００７】本発明は、上記観点からなされたものであ
り、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在
するグリセロ糖リン脂質の解明、このグリセロ糖リン脂
質に対する抗体、この抗体を用いたグリセロ糖リン脂質
の測定法及びマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出
する方法を提供することを課題とする。
り、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在
するグリセロ糖リン脂質の解明、このグリセロ糖リン脂
質に対する抗体、この抗体を用いたグリセロ糖リン脂質
の測定法及びマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出
する方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、レトロウ
イルス感染による細胞の異常増殖、細胞破壊及び免疫異
常を解明するために、これらの感染細胞の脂質解析を行
う過程でヒトヘルパーＴ細胞株から抽出されたグリセロ
糖リン脂質（ホスホコリン含有グリセロ糖脂質）が、意
外なことにマイコプラズマ・ファーメンタンス由来のグ
リセロ糖リン脂質（ホスホコリン含有グリセロ糖脂質：
以下、単に「グリセロ糖リン脂質」という）であること
を確認し、この脂質の構造を解明した。さらに、この脂
質に対する抗体を作成し、種々のマイコプラズマに対す
る特異性を確認したところ、この抗体がマイコプラズマ
・ファーメンタンスを特異的に認識することを見出し、
本発明を完成した。
イルス感染による細胞の異常増殖、細胞破壊及び免疫異
常を解明するために、これらの感染細胞の脂質解析を行
う過程でヒトヘルパーＴ細胞株から抽出されたグリセロ
糖リン脂質（ホスホコリン含有グリセロ糖脂質）が、意
外なことにマイコプラズマ・ファーメンタンス由来のグ
リセロ糖リン脂質（ホスホコリン含有グリセロ糖脂質：
以下、単に「グリセロ糖リン脂質」という）であること
を確認し、この脂質の構造を解明した。さらに、この脂
質に対する抗体を作成し、種々のマイコプラズマに対す
る特異性を確認したところ、この抗体がマイコプラズマ
・ファーメンタンスを特異的に認識することを見出し、
本発明を完成した。
【０００９】すなわち本願発明は、以下の性質を有す
る、マイコプラズマ・ファーメンタンスから抽出され得
るグリセロ糖リン脂質である。 （Ａ）オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 （Ｂ）アルカリで分解される。 （Ｃ）ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体
による分画において非吸着画分として得られる。 （Ｄ）質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋
２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である。
る、マイコプラズマ・ファーメンタンスから抽出され得
るグリセロ糖リン脂質である。 （Ａ）オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 （Ｂ）アルカリで分解される。 （Ｃ）ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体
による分画において非吸着画分として得られる。 （Ｄ）質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋
２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である。
【００１０】上記グリセロ糖リン脂質は、α−グルコピ
ラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グ
リセロール、ホスホコリン及びアミノプロパンジオール
のリン酸エステルを構成成分とする可能性が高い。
ラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グ
リセロール、ホスホコリン及びアミノプロパンジオール
のリン酸エステルを構成成分とする可能性が高い。
【００１１】また、本願発明は、少なくともホスホコリ
ン、グルコース、脂肪酸及びグリセロールを含み、ジエ
チルアミノエチル基を有する陰イオン交換体に対して非
吸着性の脂質であり、アルカリに不安定であるグリセロ
糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗グリセロ糖リ
ン脂質抗体である。このグリセロ糖リン脂質としては、
マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在する
グリセロ糖リン脂質が挙げられる。
ン、グルコース、脂肪酸及びグリセロールを含み、ジエ
チルアミノエチル基を有する陰イオン交換体に対して非
吸着性の脂質であり、アルカリに不安定であるグリセロ
糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗グリセロ糖リ
ン脂質抗体である。このグリセロ糖リン脂質としては、
マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在する
グリセロ糖リン脂質が挙げられる。
【００１２】上記抗グリセロ糖リン脂質抗体の具体的態
様として本願発明は、６’−Ｏ−ホスホコリン−α−グ
ルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓ
ｎ−グリセロールと、以下の性質を有する、マイコプラ
ズマ・ファーメンタンスから抽出され得るグリセロ糖リ
ン糖脂質との両方と反応する抗グリセロ糖リン脂質ポリ
クローナル抗体、及び以下の性質を有するグリセロ糖リ
ン脂質に対する反応特異性を有する抗グリセロ糖リン脂
質モノクローナル抗体を提供する。 （Ａ）オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 （Ｂ）アルカリで分解される。 （Ｃ）ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体
による分画において非吸着画分として得られる。 （Ｄ）質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋
２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である。
様として本願発明は、６’−Ｏ−ホスホコリン−α−グ
ルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓ
ｎ−グリセロールと、以下の性質を有する、マイコプラ
ズマ・ファーメンタンスから抽出され得るグリセロ糖リ
ン糖脂質との両方と反応する抗グリセロ糖リン脂質ポリ
クローナル抗体、及び以下の性質を有するグリセロ糖リ
ン脂質に対する反応特異性を有する抗グリセロ糖リン脂
質モノクローナル抗体を提供する。 （Ａ）オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 （Ｂ）アルカリで分解される。 （Ｃ）ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体
による分画において非吸着画分として得られる。 （Ｄ）質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋
２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である。
【００１３】また本願発明は、検体中の上記の性質を有
するグリセロ糖リン脂質を、上記の抗グリセロ糖リン脂
質抗体を用いて免疫学的に測定することを特徴とするグ
リセロ糖リン脂質の測定法、及びこの方法により検体中
のグリセロ糖リン脂質を測定し、このグリセロ糖リン脂
質の存否またはその存在量と検体中のマイコプラズマ・
ファーメンタンスの存否またはその存在量とを関連づけ
ることを特徴とするマイコプラズマ・ファーメンタンス
の検出法を提供する。
するグリセロ糖リン脂質を、上記の抗グリセロ糖リン脂
質抗体を用いて免疫学的に測定することを特徴とするグ
リセロ糖リン脂質の測定法、及びこの方法により検体中
のグリセロ糖リン脂質を測定し、このグリセロ糖リン脂
質の存否またはその存在量と検体中のマイコプラズマ・
ファーメンタンスの存否またはその存在量とを関連づけ
ることを特徴とするマイコプラズマ・ファーメンタンス
の検出法を提供する。
【００１４】さらに本発明は、検体中に含まれる上記
（Ａ）〜（Ｄ）の性質を有するグリセロ糖リン脂質及び
／又はこのグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質
を、上記の抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いて免疫学的
に測定することを特徴とするグリセロ糖リン脂質及び／
又はこのグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質の
測定法を提供する。
（Ａ）〜（Ｄ）の性質を有するグリセロ糖リン脂質及び
／又はこのグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質
を、上記の抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いて免疫学的
に測定することを特徴とするグリセロ糖リン脂質及び／
又はこのグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質の
測定法を提供する。
【００１５】また本願発明は、免疫学的方法により検体
中のマイコプラズマ・ファーメンタンスまたはマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質を検出
するための試薬キットであって、前記抗グリセロ糖リン
脂質抗体と、標識物質で標識化したマイコプラズマ・フ
ァーメンタンスのグリセロ糖リン脂質、または前記抗体
の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前
記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質
で標識化した二次抗体とを含むことを特徴とする試薬キ
ットを提供する。
中のマイコプラズマ・ファーメンタンスまたはマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質を検出
するための試薬キットであって、前記抗グリセロ糖リン
脂質抗体と、標識物質で標識化したマイコプラズマ・フ
ァーメンタンスのグリセロ糖リン脂質、または前記抗体
の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前
記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質
で標識化した二次抗体とを含むことを特徴とする試薬キ
ットを提供する。
【００１６】さらに本願発明は、血液中に含まれる、上
記（Ａ）〜（Ｄ）の性質を有するグリセロ糖リン脂質も
しくはこのグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物
質、またはこれらのグリセロ糖リン脂質に対して反応特
異性を有する抗体を検出することを特徴とする、エイ
ズ、腎炎及びＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパチーから選ばれ
る疾病の検出法を提供する。
記（Ａ）〜（Ｄ）の性質を有するグリセロ糖リン脂質も
しくはこのグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物
質、またはこれらのグリセロ糖リン脂質に対して反応特
異性を有する抗体を検出することを特徴とする、エイ
ズ、腎炎及びＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパチーから選ばれ
る疾病の検出法を提供する。
【００１７】尚、本明細書において、マイコプラズマ・
ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ糖リン脂
質を、単に「グリセロ糖リン脂質」ということがある。
以下、本発明を詳細に説明する。
ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ糖リン脂
質を、単に「グリセロ糖リン脂質」ということがある。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】＜１＞本発明のグリセロ糖リン脂質 本発明の抗体は、マイコプラズマ・ファーメンタンス
（Mycoplasma fermentans）のグリセロ糖リン脂質に対
して反応特異性を有するものであり、このグリセロ糖リ
ン脂質を抗原として調製される。はじめに、マイコプラ
ズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質について
説明する。
（Mycoplasma fermentans）のグリセロ糖リン脂質に対
して反応特異性を有するものであり、このグリセロ糖リ
ン脂質を抗原として調製される。はじめに、マイコプラ
ズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質について
説明する。
【００１９】従来、レトロウイルス感染細胞に特有な脂
質が存在することが知られており、ＨＴＬＶ−Ｉ感染ヒ
トヘルパーＴ細胞から５種のグリセロ糖リン脂質（ＧＧ
ＰＬｓ：ＧＧＰＬ−Ｉ、ＧＧＰＬ−II、ＧＧＰＬ−II
I、ＧＧＰＬ−IV、ＧＧＰＬ−Ｖ）が見い出されてい
る。そのうちＧＧＰＬ−Ｉの構造が本発明者らによって
決定されている（西田ら、日本農芸化学会誌 第６８巻
第３号（１９９４）「１９９４年度大会講演要旨集」第
３９頁）。ＧＧＰＬ−Ｉ以外のＧＧＰＬｓは存在が認め
られているのみであり、その物性、構造などは知られて
いなかった。
質が存在することが知られており、ＨＴＬＶ−Ｉ感染ヒ
トヘルパーＴ細胞から５種のグリセロ糖リン脂質（ＧＧ
ＰＬｓ：ＧＧＰＬ−Ｉ、ＧＧＰＬ−II、ＧＧＰＬ−II
I、ＧＧＰＬ−IV、ＧＧＰＬ−Ｖ）が見い出されてい
る。そのうちＧＧＰＬ−Ｉの構造が本発明者らによって
決定されている（西田ら、日本農芸化学会誌 第６８巻
第３号（１９９４）「１９９４年度大会講演要旨集」第
３９頁）。ＧＧＰＬ−Ｉ以外のＧＧＰＬｓは存在が認め
られているのみであり、その物性、構造などは知られて
いなかった。
【００２０】本発明者らは、ＧＧＰＬｓが認められたＨ
ＴＬＶ−Ｉ感染ヒトヘルパーＴ細胞（ＭＴ−４（ＧＧＰ
Ｌ＋））と、これを抗マイコプラズマ剤（ＭＣ２０１
（大日本製薬（株）製））で処理したＭＴ−４（ＧＧＰ
Ｌ−）から調製した脂質画分をＨＰＴＬＣ（高速薄層ク
ロマトグラフィー）で分離し、オルシノール（orcino
l）試薬で糖脂質を、ディットマー（Dittmer）試薬でリ
ン脂質を染色したところ、ＭＴ−４（ＧＧＰＬ＋）にみ
られ、ＭＴ−４（ＧＧＰＬ−）ではみられない２本のバ
ンドが検出された（図４）。この２本のバンドは、ポア
サイズ０．２２μｍのフィルターを通過させたＭＴ−４
（ＧＧＰＬ＋）細胞の培養上清を加えて培養したＭＴ−
４（ＧＧＰＬ−）細胞からも検出された。後記実施例に
示すように、これらのうち一方はＧＧＰＬ−Ｉであり、
他方はＧＧＰＬ−IIIであることがわかった。
ＴＬＶ−Ｉ感染ヒトヘルパーＴ細胞（ＭＴ−４（ＧＧＰ
Ｌ＋））と、これを抗マイコプラズマ剤（ＭＣ２０１
（大日本製薬（株）製））で処理したＭＴ−４（ＧＧＰ
Ｌ−）から調製した脂質画分をＨＰＴＬＣ（高速薄層ク
ロマトグラフィー）で分離し、オルシノール（orcino
l）試薬で糖脂質を、ディットマー（Dittmer）試薬でリ
ン脂質を染色したところ、ＭＴ−４（ＧＧＰＬ＋）にみ
られ、ＭＴ−４（ＧＧＰＬ−）ではみられない２本のバ
ンドが検出された（図４）。この２本のバンドは、ポア
サイズ０．２２μｍのフィルターを通過させたＭＴ−４
（ＧＧＰＬ＋）細胞の培養上清を加えて培養したＭＴ−
４（ＧＧＰＬ−）細胞からも検出された。後記実施例に
示すように、これらのうち一方はＧＧＰＬ−Ｉであり、
他方はＧＧＰＬ−IIIであることがわかった。
【００２１】マイコプラズマ属微生物がホスホコリンを
含有したグリセロ糖リン脂質を細胞の構成成分として有
するという報告はなく、ＧＧＰＬｓはヒト細胞由来であ
ると考えられていたが、上記結果から、マイコプラズマ
・ファーメンタンスに由来することが明らかとなった。
したがって、上記グリセロ糖リン脂質に対して反応特異
性を有する抗体が得られれば、マイコプラズマ・ファー
メンタンスを検出することが可能となると考えた。
含有したグリセロ糖リン脂質を細胞の構成成分として有
するという報告はなく、ＧＧＰＬｓはヒト細胞由来であ
ると考えられていたが、上記結果から、マイコプラズマ
・ファーメンタンスに由来することが明らかとなった。
したがって、上記グリセロ糖リン脂質に対して反応特異
性を有する抗体が得られれば、マイコプラズマ・ファー
メンタンスを検出することが可能となると考えた。
【００２２】マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリ
セロ糖リン脂質は、マイコプラズマ・ファーメンタンス
の培養物から調製することができる。マイコプラズマ・
ファーメンタンスは、例えば以下のようにして得られ
る。ＧＧＰＬｓの存在が認められる（「ＧＧＰＬ陽
性」）培養細胞、例えばＭＴ−４細胞（ＨＴＬＶ−Ｉ
（ヒトＴリンパ球向性レトロウイルス−タイプＩ）が感
染したヒトヘルパーＴ細胞）の培養上清を、ポアサイズ
0.22μｍのフィルターで濾過することによって、濾液中
にマイコプラズマ・ファーメンタンスが得られる。ま
た、マイコプラズマ・ファーメンタンス ＰＧ１８株等
のタイプストレイン等を用いてもよい。
セロ糖リン脂質は、マイコプラズマ・ファーメンタンス
の培養物から調製することができる。マイコプラズマ・
ファーメンタンスは、例えば以下のようにして得られ
る。ＧＧＰＬｓの存在が認められる（「ＧＧＰＬ陽
性」）培養細胞、例えばＭＴ−４細胞（ＨＴＬＶ−Ｉ
（ヒトＴリンパ球向性レトロウイルス−タイプＩ）が感
染したヒトヘルパーＴ細胞）の培養上清を、ポアサイズ
0.22μｍのフィルターで濾過することによって、濾液中
にマイコプラズマ・ファーメンタンスが得られる。ま
た、マイコプラズマ・ファーメンタンス ＰＧ１８株等
のタイプストレイン等を用いてもよい。
【００２３】得られたマイコプラズマ・ファーメンタン
スを、PPLO broth（デイフコ・ラボラトリーズ製）寒天
培地等を用いて培養し、コロニーを単離した後、10％(v
/v)ウシ胎仔血清(FBS)、５％(w/v)酵母抽出物（フロー
・ラボラトリーズ製）、1000単位／ｍｌペニシリン、１
％(w/v)デキストロース、０．００２％(w/v)フェノール
レッドを含むPPLO broth（ディフコ・ラボラトリーズ
製）等の液体培地中で培養すれば、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンスの培養菌体が得られる。次に、マイコプ
ラズマ・ファーメンタンスの菌体にメタノールを加え数
時間放置した後、クロロホルムを加えて超音波処理し、
さらに数時間放置した後に、菌体をポーター型テフロン
ホモジナイザー等を用いてホモジナイズして上清を回収
し、この上清を蒸発させることにより、脂質抽出物が得
られる。こうして得られる脂質抽出物はグリセロ糖リン
脂質を含有する。
スを、PPLO broth（デイフコ・ラボラトリーズ製）寒天
培地等を用いて培養し、コロニーを単離した後、10％(v
/v)ウシ胎仔血清(FBS)、５％(w/v)酵母抽出物（フロー
・ラボラトリーズ製）、1000単位／ｍｌペニシリン、１
％(w/v)デキストロース、０．００２％(w/v)フェノール
レッドを含むPPLO broth（ディフコ・ラボラトリーズ
製）等の液体培地中で培養すれば、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンスの培養菌体が得られる。次に、マイコプ
ラズマ・ファーメンタンスの菌体にメタノールを加え数
時間放置した後、クロロホルムを加えて超音波処理し、
さらに数時間放置した後に、菌体をポーター型テフロン
ホモジナイザー等を用いてホモジナイズして上清を回収
し、この上清を蒸発させることにより、脂質抽出物が得
られる。こうして得られる脂質抽出物はグリセロ糖リン
脂質を含有する。
【００２４】実施例に示すように、この脂質画分をＨＰ
ＴＬＣ（高速薄層クロマトグラフィー）プレートにアプ
ライし、クロロホルム：メタノール：0.2％(w/v)塩化カ
ルシウム水溶液＝50：45：10(v/v/v)の混合溶媒で展開
し、リン脂質の分析を行ったところ、６本のバンド（Li
pid i、Lipid ii、Lipid iii、Lipid iv、Lipid v、及
びLipid vi）が検出された（図３）。ＴＬＣ上の挙動か
ら、これらのうち、Lipid v及びLipid viは、各々ＧＧ
ＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIに相当することがわかっ
た。また、ＦＡＢマススペクトルの結果から、ＧＧＰＬ
−ＩはLipid vと同一であり、ＧＧＰＬ−IIIはLipid vi
と同一であることが確認された。
ＴＬＣ（高速薄層クロマトグラフィー）プレートにアプ
ライし、クロロホルム：メタノール：0.2％(w/v)塩化カ
ルシウム水溶液＝50：45：10(v/v/v)の混合溶媒で展開
し、リン脂質の分析を行ったところ、６本のバンド（Li
pid i、Lipid ii、Lipid iii、Lipid iv、Lipid v、及
びLipid vi）が検出された（図３）。ＴＬＣ上の挙動か
ら、これらのうち、Lipid v及びLipid viは、各々ＧＧ
ＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIに相当することがわかっ
た。また、ＦＡＢマススペクトルの結果から、ＧＧＰＬ
−ＩはLipid vと同一であり、ＧＧＰＬ−IIIはLipid vi
と同一であることが確認された。
【００２５】マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリ
セロ糖リン脂質は、マイコプラズマ・ファーメンタンス
が感染したＭＴ−４細胞からも得られる。例えば、ＭＴ
−４細胞を１０％(v/v)ＦＣＳ（仔ウシ胎仔血清）添加
ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、ＰＢＳ（リン酸緩衝
生理食塩水）で洗浄した細胞に対し、クロロホルム：メ
タノール（＝２：１、１：１、あるいは１：２）の混合
液４００ｍｌを用いて脂質を抽出する。
セロ糖リン脂質は、マイコプラズマ・ファーメンタンス
が感染したＭＴ−４細胞からも得られる。例えば、ＭＴ
−４細胞を１０％(v/v)ＦＣＳ（仔ウシ胎仔血清）添加
ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、ＰＢＳ（リン酸緩衝
生理食塩水）で洗浄した細胞に対し、クロロホルム：メ
タノール（＝２：１、１：１、あるいは１：２）の混合
液４００ｍｌを用いて脂質を抽出する。
【００２６】上記のようにして得られたマイコプラズマ
・ファーメンタンスまたはＭＴ−４細胞の脂質抽出物
を、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有する陰イ
オン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ−セファデックス Ａ２
５（ファルマシア社製）等を用いて非吸着画分（中性画
分）と吸着画分（酸性画分）に分け、非吸着画分を得
る。この非吸着画分をシリカビーズカラムにかけ、クロ
ロホルム／メタノール／水（８３：１６：０．５〜２
０：８０：８ (v/v)）による濃度勾配で分画することに
より、ＧＧＰＬ−IIIを他のリン脂質から分離すること
ができる。さらに、１−プロパノール／アンモニア水／
水（８０：５：１５〜７５：５：２０）の濃度勾配で溶
出することにより、ＧＧＰＬ−Ｉが単離される。
・ファーメンタンスまたはＭＴ−４細胞の脂質抽出物
を、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有する陰イ
オン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ−セファデックス Ａ２
５（ファルマシア社製）等を用いて非吸着画分（中性画
分）と吸着画分（酸性画分）に分け、非吸着画分を得
る。この非吸着画分をシリカビーズカラムにかけ、クロ
ロホルム／メタノール／水（８３：１６：０．５〜２
０：８０：８ (v/v)）による濃度勾配で分画することに
より、ＧＧＰＬ−IIIを他のリン脂質から分離すること
ができる。さらに、１−プロパノール／アンモニア水／
水（８０：５：１５〜７５：５：２０）の濃度勾配で溶
出することにより、ＧＧＰＬ−Ｉが単離される。
【００２７】ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIは、いず
れもオルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲンド
ルフ（Dragendorff）試薬（コリンを染色する）に陽性
を示し、また、緩和なアルカリ処理で分解した。さら
に、ＧＧＰＬ−Ｉはニンヒドリン反応（アミノ基を染色
する）に陰性を示したが、ＧＧＰＬ−IIIは陽性であっ
た。
れもオルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲンド
ルフ（Dragendorff）試薬（コリンを染色する）に陽性
を示し、また、緩和なアルカリ処理で分解した。さら
に、ＧＧＰＬ−Ｉはニンヒドリン反応（アミノ基を染色
する）に陰性を示したが、ＧＧＰＬ−IIIは陽性であっ
た。
【００２８】精製したＧＧＰＬ−IIIを用いて行った物
理化学的分析の結果を以下に示す。 赤外線吸収スペクトル -CH2および-CH3基、水酸基、エステルカルボニル基、リ
ン酸基、コリン基及び一級アミン基にそれぞれ対応する
吸収が検出された。
理化学的分析の結果を以下に示す。 赤外線吸収スペクトル -CH2および-CH3基、水酸基、エステルカルボニル基、リ
ン酸基、コリン基及び一級アミン基にそれぞれ対応する
吸収が検出された。
【００２９】液体２次イオン質量分析（ＬＳＩＭＳ） 分子中に少なくとも３種類の脂肪酸の存在が示唆され
た。また、ＧＧＰＬ−IIIには少なくとも４種類の分子
が存在し、そのうち主要成分の分子量については１０４
８であると結論された。さらに、分子量１０２０、１０
７６及び１１０４のＧＧＰＬ−IIIも存在することが示
された。
た。また、ＧＧＰＬ−IIIには少なくとも４種類の分子
が存在し、そのうち主要成分の分子量については１０４
８であると結論された。さらに、分子量１０２０、１０
７６及び１１０４のＧＧＰＬ−IIIも存在することが示
された。
【００３０】タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ
／ＭＳ） 分子中にホスホコリンの存在が示唆された。また、ＧＧ
ＰＬ−IIIの分子量は、主要成分については１０４８で
あると結論された。
／ＭＳ） 分子中にホスホコリンの存在が示唆された。また、ＧＧ
ＰＬ−IIIの分子量は、主要成分については１０４８で
あると結論された。
【００３１】一次元1Ｈ ＮＭＲスペクトル グリセロールのシグナル、コリンのシグナル及びグルコ
ースのシグナルが検出された。さらに、アミノプロパン
ジオールの存在が予測されたので、３−アミノプロパン
−１，２−ジオール（１−アミノプロパン−２，３−ジ
オール）および２−アミノプロパン−１，３−ジオール
の標準標品を用いて得られた一次元1ＨＮＭＲスペクト
ルとＧＧＰＬ−IIIのスペクトルとを比較した結果、Ｇ
ＧＰＬ−IIIは２−アミノプロパン−１，３−ジオール
を構成成分として含有している可能性が示唆された。
ースのシグナルが検出された。さらに、アミノプロパン
ジオールの存在が予測されたので、３−アミノプロパン
−１，２−ジオール（１−アミノプロパン−２，３−ジ
オール）および２−アミノプロパン−１，３−ジオール
の標準標品を用いて得られた一次元1ＨＮＭＲスペクト
ルとＧＧＰＬ−IIIのスペクトルとを比較した結果、Ｇ
ＧＰＬ−IIIは２−アミノプロパン−１，３−ジオール
を構成成分として含有している可能性が示唆された。
【００３２】二次元1Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＰＨ−Ｄ
ＱＦ−ＣＯＳＹ法） ジアシルグリセロールに由来するプロトンのシグナルが
認められた。またコリンのプロトンのシグナルが認めら
れた。
ＱＦ−ＣＯＳＹ法） ジアシルグリセロールに由来するプロトンのシグナルが
認められた。またコリンのプロトンのシグナルが認めら
れた。
【００３３】二次元1Ｈ−31Ｐ ＮＭＲスペクトル １分子のＧＧＰＬ−III中に２個のＰ（リン）が含まれ
ていることが示された。また、リンを含有する化合物は
グルコース残基の１位または６位に結合していると推定
された。この位置は６位である可能性がより高い。
ていることが示された。また、リンを含有する化合物は
グルコース残基の１位または６位に結合していると推定
された。この位置は６位である可能性がより高い。
【００３４】さらに、コリンにリン酸基が結合したホス
ホコリンの構造が示唆され、グルコース残基の６位には
まずアミノプロパンジオールのリン酸エステルが結合し
ており、さらにこのアミノプロパンジオールのリン酸エ
ステルにホスホコリンが結合した構造が推定された。
ホコリンの構造が示唆され、グルコース残基の６位には
まずアミノプロパンジオールのリン酸エステルが結合し
ており、さらにこのアミノプロパンジオールのリン酸エ
ステルにホスホコリンが結合した構造が推定された。
【００３５】以上の結果から、ＧＧＰＬ−IIIは、下記
性質を有する新規グリセロ糖リン脂質であることがわか
った。 （Ａ）オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 （Ｂ）アルカリで分解される。 （Ｃ）ＤＥＡＥ基を有する陰イオン交換体による分画に
おいて非吸着画分として得られる。 （Ｄ）質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋
２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である。
性質を有する新規グリセロ糖リン脂質であることがわか
った。 （Ａ）オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 （Ｂ）アルカリで分解される。 （Ｃ）ＤＥＡＥ基を有する陰イオン交換体による分画に
おいて非吸着画分として得られる。 （Ｄ）質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋
２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である。
【００３６】さらに、上記結果からＧＧＰＬ−IIIは、
α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシ
ル−ｓｎ−グリセロール、ホスホコリン及びアミノプロ
パンジオールのリン酸エステルを構成成分とすることが
示された。このアミノプロパンジオールのリン酸エステ
ルは、２−アミノプロパン−１，３−ジオールのリン酸
エステルであり、その結合部位は、α−グルコピラノシ
ル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ
ールのグルコース残基の６’位であると推定された。さ
らに、この２−アミノプロパン−１，３−ジオールのリ
ン酸エステルにホスホコリンが結合していることが示唆
された。また、ＧＧＰＬ−IIIの主要成分は、アシル基
として２個のパルミトイル基を有し、その推定構造は下
記式の通りであり、ＧＧＰＬ−Ｉ（６’−Ｏ−ホスホコ
リン−α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−
ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール）のグルコース残
基とホスホコリンとの間に２−アミノプロパン−１，３
−ジオールのリン酸エステルが挿入された構造を有して
いると推定される。
α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシ
ル−ｓｎ−グリセロール、ホスホコリン及びアミノプロ
パンジオールのリン酸エステルを構成成分とすることが
示された。このアミノプロパンジオールのリン酸エステ
ルは、２−アミノプロパン−１，３−ジオールのリン酸
エステルであり、その結合部位は、α−グルコピラノシ
ル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ
ールのグルコース残基の６’位であると推定された。さ
らに、この２−アミノプロパン−１，３−ジオールのリ
ン酸エステルにホスホコリンが結合していることが示唆
された。また、ＧＧＰＬ−IIIの主要成分は、アシル基
として２個のパルミトイル基を有し、その推定構造は下
記式の通りであり、ＧＧＰＬ−Ｉ（６’−Ｏ−ホスホコ
リン−α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−
ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール）のグルコース残
基とホスホコリンとの間に２−アミノプロパン−１，３
−ジオールのリン酸エステルが挿入された構造を有して
いると推定される。
【００３７】
【化１】 また、分子量が異なる他のＧＧＰＬ−III分子は、α−
グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−
ｓｎ−グリセロール中のアシル基の種類が異なるもので
あり、分子量１０２０のものではミリストイル基とパル
ミトイル基、１０７６のものではパルミトイル基とステ
アロイル基、１１０４のものでは２つのステアロイル
基、またはパルミトイル基とエイコサノイル基を有して
いると推定されるが、詳細は明らかではない。
グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−
ｓｎ−グリセロール中のアシル基の種類が異なるもので
あり、分子量１０２０のものではミリストイル基とパル
ミトイル基、１０７６のものではパルミトイル基とステ
アロイル基、１１０４のものでは２つのステアロイル
基、またはパルミトイル基とエイコサノイル基を有して
いると推定されるが、詳細は明らかではない。
【００３８】＜２＞本発明の抗体の調製 本発明の抗体は、マイコプラズマ・ファーメンタンス由
来のグリセロ糖リン脂質を抗原として動物を免疫し、そ
の動物から血清を分離するか、あるいはその動物の抗体
産生細胞を採取し、永続的に培養可能とし、その培養物
から回収することによって得られる。以下に、本発明の
抗体の調製法を例示するが、これに限定されるものでは
なく、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖
リン脂質を抗原に用いるならば、その他の方法によって
調製してもよい。
来のグリセロ糖リン脂質を抗原として動物を免疫し、そ
の動物から血清を分離するか、あるいはその動物の抗体
産生細胞を採取し、永続的に培養可能とし、その培養物
から回収することによって得られる。以下に、本発明の
抗体の調製法を例示するが、これに限定されるものでは
なく、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖
リン脂質を抗原に用いるならば、その他の方法によって
調製してもよい。
【００３９】（１）ポリクローナル抗体の調製 前記のようにして得られたマイコプラズマ・ファーメン
タンスの脂質抽出物に、モノフォスフェートリピド、フ
ロイント完全アジュバント、及びミネラルオイルを加え
て混合し、さらに０．１％(v/v)Tween 80を含むＰＢＳ
（リン酸緩衝生理食塩水）を加えて乳化する。
タンスの脂質抽出物に、モノフォスフェートリピド、フ
ロイント完全アジュバント、及びミネラルオイルを加え
て混合し、さらに０．１％(v/v)Tween 80を含むＰＢＳ
（リン酸緩衝生理食塩水）を加えて乳化する。
【００４０】次に、得られた乳化物をマウス、ラット、
ウサギ、モルモット、ヒツジ等の動物の皮下または腹腔
内に投与する。初回免疫後、２〜３週間目に常法によっ
て追加免疫を行うと、力価の高い抗血清が得られる。最
終免疫から１週間後に血液を採取し、血清を分離する。
この血清を熱処理して補体を失活させた後、硫酸アンモ
ニウムによる塩析、イオン交換クロマトグラフィー等の
通常の抗体の精製と同様の方法によってイムノグロブリ
ン画分を取得する。尚、最終免疫の後に、酵素免疫測定
法等により血中抗体価の上昇を確認しておくことが望ま
しい。
ウサギ、モルモット、ヒツジ等の動物の皮下または腹腔
内に投与する。初回免疫後、２〜３週間目に常法によっ
て追加免疫を行うと、力価の高い抗血清が得られる。最
終免疫から１週間後に血液を採取し、血清を分離する。
この血清を熱処理して補体を失活させた後、硫酸アンモ
ニウムによる塩析、イオン交換クロマトグラフィー等の
通常の抗体の精製と同様の方法によってイムノグロブリ
ン画分を取得する。尚、最終免疫の後に、酵素免疫測定
法等により血中抗体価の上昇を確認しておくことが望ま
しい。
【００４１】上記のようにして得られる抗体は、マイコ
プラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質に対
して反応特異性を有し、マイコプラズマ・アルソリティ
ディス及びマイコプラズマ・ホミニスなど他のマイコプ
ラズマのグリセロ糖リン脂質には反応しない。
プラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質に対
して反応特異性を有し、マイコプラズマ・アルソリティ
ディス及びマイコプラズマ・ホミニスなど他のマイコプ
ラズマのグリセロ糖リン脂質には反応しない。
【００４２】マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質
抽出物の代わりに、精製したＧＧＰＬ−IIIを用いれ
ば、ＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有するポリク
ローナル抗体が得られる。
抽出物の代わりに、精製したＧＧＰＬ−IIIを用いれ
ば、ＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有するポリク
ローナル抗体が得られる。
【００４３】（２）モノクローナル抗体の調製 モノクローナル抗体は、ケーラーとミルステインの方法
（Ｎａｔｕｒｅ，４９５〜４９２頁、１９７５年）によ
って得られる。すなわち、グリセロ糖リン脂質に対する
抗体を産生する哺乳動物の抗体産生細胞と骨髄腫（ミエ
ローマ）細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、目
的の抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、
このハイブリドーマを培養することによって培養液中に
モノクローナル抗体が得られる。以下、工程ごとに分説
する。
（Ｎａｔｕｒｅ，４９５〜４９２頁、１９７５年）によ
って得られる。すなわち、グリセロ糖リン脂質に対する
抗体を産生する哺乳動物の抗体産生細胞と骨髄腫（ミエ
ローマ）細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、目
的の抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、
このハイブリドーマを培養することによって培養液中に
モノクローナル抗体が得られる。以下、工程ごとに分説
する。
【００４４】(i)動物の免疫及び抗体産生細胞の調製 グリセロ糖リン脂質に対する抗体を産生する細胞は、グ
リセロ糖リン脂質でマウス、ラット、ウサギ、モルモッ
ト、ヒツジなどの動物を免疫し、その動物から脾臓細
胞、リンパ節細胞、末梢血液等を調製することにより得
られる。上記動物をグリセロ糖リン脂質で免疫するに
は、（１）と同様に行えばよい。
リセロ糖リン脂質でマウス、ラット、ウサギ、モルモッ
ト、ヒツジなどの動物を免疫し、その動物から脾臓細
胞、リンパ節細胞、末梢血液等を調製することにより得
られる。上記動物をグリセロ糖リン脂質で免疫するに
は、（１）と同様に行えばよい。
【００４５】ＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有す
るモノクローナル抗体を得るには、精製したＧＧＰＬ−
IIIで動物を免疫してもよいが、グリセロ糖リン脂質混
合物で免疫した動物の抗体産生細胞を用いてハイブリド
ーマを調製し、得られたハイブリドーマからＧＧＰＬ−
IIIに対して反応特異性を有するモノクローナル抗体を
産生する株を選択してもよい。この方法によれば、動物
の免疫に必要な量のＧＧＰＬ−IIIを得る必要がなく、
酵素免疫法による検出が可能な程度の微量のＧＧＰＬ−
IIIがあればよい。
るモノクローナル抗体を得るには、精製したＧＧＰＬ−
IIIで動物を免疫してもよいが、グリセロ糖リン脂質混
合物で免疫した動物の抗体産生細胞を用いてハイブリド
ーマを調製し、得られたハイブリドーマからＧＧＰＬ−
IIIに対して反応特異性を有するモノクローナル抗体を
産生する株を選択してもよい。この方法によれば、動物
の免疫に必要な量のＧＧＰＬ−IIIを得る必要がなく、
酵素免疫法による検出が可能な程度の微量のＧＧＰＬ−
IIIがあればよい。
【００４６】(ii)ハイブリドーマの作製 グリセロ糖リン脂質で免疫した動物から抗体産生細胞を
採取し、骨髄腫細胞との細胞融合を行う。細胞融合に使
用する骨髄腫細胞には種々の哺乳動物の細胞株を利用す
ることができるが、抗体産生細胞の調製に用いた動物と
同種の動物の細胞株を使用するのが好ましい。また、骨
髄腫細胞株は、細胞融合の後に未融合細胞と融合細胞と
を区別できるようにするために、未融合の骨髄腫細胞が
生存できずハイブリドーマだけが増殖できるように、マ
ーカーを有するものを用いることが好ましい。例えば、
８−アザグアニン耐性株は、ヒポキサンチン−グアニン
−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を
欠損しており、核酸合成はｄｅ ｎｏｖｏ合成経路に依
存している。このような骨髄腫細胞と正常抗体産生細胞
との融合細胞（ハイブリドーマ）では、ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジンを含む培地（ＨＡＴ培
地）中で、アミノプテリンによりｄｅ ｎｏｖｏ合成経
路が阻害されても、チミジン、ヒポキサンチンが存在し
ているので、リンパ球由来のサルベージ回路により核酸
合成できるので、増殖が可能である。これに対し、８−
アザグアニン耐性の骨髄腫細胞は、アミノプテリンによ
りｄｅ ｎｏｖｏ合成経路も阻害されるため、核酸合成
できずに死滅し、また正常細胞である抗体産生細胞も長
期培養はできない。したがって、抗体産生細胞と骨髄腫
細胞との融合によって生成したハイブリドーマのみがＨ
ＡＴ培地で増殖できるので、非融合細胞から融合細胞を
選択することができる（サイエンス 第１４５巻７０９
頁、１９６４年）。また、骨髄腫細胞として、固有のイ
ムノグロブリンを分泌しない株を使用することが、ハイ
ブリドーマの培養上清から目的の抗体を取得することが
容易となる点で好ましい。
採取し、骨髄腫細胞との細胞融合を行う。細胞融合に使
用する骨髄腫細胞には種々の哺乳動物の細胞株を利用す
ることができるが、抗体産生細胞の調製に用いた動物と
同種の動物の細胞株を使用するのが好ましい。また、骨
髄腫細胞株は、細胞融合の後に未融合細胞と融合細胞と
を区別できるようにするために、未融合の骨髄腫細胞が
生存できずハイブリドーマだけが増殖できるように、マ
ーカーを有するものを用いることが好ましい。例えば、
８−アザグアニン耐性株は、ヒポキサンチン−グアニン
−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を
欠損しており、核酸合成はｄｅ ｎｏｖｏ合成経路に依
存している。このような骨髄腫細胞と正常抗体産生細胞
との融合細胞（ハイブリドーマ）では、ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジンを含む培地（ＨＡＴ培
地）中で、アミノプテリンによりｄｅ ｎｏｖｏ合成経
路が阻害されても、チミジン、ヒポキサンチンが存在し
ているので、リンパ球由来のサルベージ回路により核酸
合成できるので、増殖が可能である。これに対し、８−
アザグアニン耐性の骨髄腫細胞は、アミノプテリンによ
りｄｅ ｎｏｖｏ合成経路も阻害されるため、核酸合成
できずに死滅し、また正常細胞である抗体産生細胞も長
期培養はできない。したがって、抗体産生細胞と骨髄腫
細胞との融合によって生成したハイブリドーマのみがＨ
ＡＴ培地で増殖できるので、非融合細胞から融合細胞を
選択することができる（サイエンス 第１４５巻７０９
頁、１９６４年）。また、骨髄腫細胞として、固有のイ
ムノグロブリンを分泌しない株を使用することが、ハイ
ブリドーマの培養上清から目的の抗体を取得することが
容易となる点で好ましい。
【００４７】ハイブリドーマを得るための細胞融合は、
例えば以下のようにして行う。免疫動物から脾臓を摘出
し、RPMI1640培地に懸濁して細胞浮遊液を調製する。こ
の脾細胞と、対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞、
例えばSP2/O細胞（アザグアニン耐性、ＩｇＧ非分泌：A
TCC CRL-1581）とを、脾細胞とミエローマ細胞が１０：
１〜１：１程度となるように混合し、遠沈後、沈渣に平
均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコ
ールを、最終濃度が３０〜５０％となるように加えて細
胞を融合させる。ポリエチレングリコールを加える代わ
りに、細胞混合液に電気パルスを印加することによって
融合させてもよい。
例えば以下のようにして行う。免疫動物から脾臓を摘出
し、RPMI1640培地に懸濁して細胞浮遊液を調製する。こ
の脾細胞と、対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞、
例えばSP2/O細胞（アザグアニン耐性、ＩｇＧ非分泌：A
TCC CRL-1581）とを、脾細胞とミエローマ細胞が１０：
１〜１：１程度となるように混合し、遠沈後、沈渣に平
均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコ
ールを、最終濃度が３０〜５０％となるように加えて細
胞を融合させる。ポリエチレングリコールを加える代わ
りに、細胞混合液に電気パルスを印加することによって
融合させてもよい。
【００４８】融合処理を行った細胞は、例えば１０％(v
/v)仔ウシ胎仔血清(FCS)を含むRPMI1640培地などで培養
後、ＨＡＴ培地などの選択培地に浮遊させ、９６ウェル
のマイクロタイタープレートなどに分注して培養を行い
ハイブリドーマのみを生育させる。
/v)仔ウシ胎仔血清(FCS)を含むRPMI1640培地などで培養
後、ＨＡＴ培地などの選択培地に浮遊させ、９６ウェル
のマイクロタイタープレートなどに分注して培養を行い
ハイブリドーマのみを生育させる。
【００４９】(iii)グリセロ糖リン脂質に対して反応特
異性を有する抗体を産生するハイブリドーマの検索 上記のようにして得られたハイブリドーマは、複数の抗
原あるいは抗原決定部位に対する各々のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマの混合物であるので、こ
れらの中からグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を
有するモノクローナル抗体、特にＧＧＰＬ−IIIに対し
て反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生する株
を選択する。また、ＧＧＰＬ−IIIに結合するモノクロ
ーナル抗体のうち、抗原性の強い抗原決定部位に対する
モノクローナル抗体を産生する株を選択することが好ま
しい。
異性を有する抗体を産生するハイブリドーマの検索 上記のようにして得られたハイブリドーマは、複数の抗
原あるいは抗原決定部位に対する各々のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマの混合物であるので、こ
れらの中からグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を
有するモノクローナル抗体、特にＧＧＰＬ−IIIに対し
て反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生する株
を選択する。また、ＧＧＰＬ−IIIに結合するモノクロ
ーナル抗体のうち、抗原性の強い抗原決定部位に対する
モノクローナル抗体を産生する株を選択することが好ま
しい。
【００５０】グリセロ糖リン脂質に対するモノクローナ
ル抗体を産生する株は、これらを抗原として用いる酵素
免疫法によって選択できる。このような方法としてＥＬ
ＩＳＡ法、すなわち、抗原をマイクロタイタープレート
等に固相化しておき、これにハイブリドーマ培養液を加
え、さらに酵素、ケイ光物質、発光物質などで標識した
第２抗体を加えてインキュベートし、結合した標識物質
によって抗体を検出する方法が挙げられる。その際、抗
体を固相化し、これに抗原、標識第２抗体を順次加えて
インキュベートしてもよい。尚、ＥＬＩＳＡ法について
は後に詳述する。
ル抗体を産生する株は、これらを抗原として用いる酵素
免疫法によって選択できる。このような方法としてＥＬ
ＩＳＡ法、すなわち、抗原をマイクロタイタープレート
等に固相化しておき、これにハイブリドーマ培養液を加
え、さらに酵素、ケイ光物質、発光物質などで標識した
第２抗体を加えてインキュベートし、結合した標識物質
によって抗体を検出する方法が挙げられる。その際、抗
体を固相化し、これに抗原、標識第２抗体を順次加えて
インキュベートしてもよい。尚、ＥＬＩＳＡ法について
は後に詳述する。
【００５１】精製されたＧＧＰＬ−IIIが得られていな
い場合には、マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質
画分を高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）プレ
ートを用いて分離し、このプレートにハイブリドーマの
培養液、標識２次抗体を順次加えてインキュベートし、
標識物質が結合する位置を検出する。この位置がＧＧＰ
Ｌ−IIIがＨＰＴＬＣによって展開される位置と同じで
あれば、そのハイブリドーマはＧＧＰＬ−IIIに対する
モノクローナル抗体を産生すると認められる。ＧＧＰＬ
−IIIに対するモノクローナル抗体が得られれば、これ
を用いたアフィニティークロマトグラフィー等によっ
て、脂質画分からＧＧＰＬ−IIIを精製することもでき
る。
い場合には、マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質
画分を高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）プレ
ートを用いて分離し、このプレートにハイブリドーマの
培養液、標識２次抗体を順次加えてインキュベートし、
標識物質が結合する位置を検出する。この位置がＧＧＰ
Ｌ−IIIがＨＰＴＬＣによって展開される位置と同じで
あれば、そのハイブリドーマはＧＧＰＬ−IIIに対する
モノクローナル抗体を産生すると認められる。ＧＧＰＬ
−IIIに対するモノクローナル抗体が得られれば、これ
を用いたアフィニティークロマトグラフィー等によっ
て、脂質画分からＧＧＰＬ−IIIを精製することもでき
る。
【００５２】目的とするモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマを含むことが確認されたら、そのハイブ
リドーマが含まれていたウェルの細胞から限界希釈法な
どによりクローニングを行う。
ハイブリドーマを含むことが確認されたら、そのハイブ
リドーマが含まれていたウェルの細胞から限界希釈法な
どによりクローニングを行う。
【００５３】後記実施例に示すように、このようにして
得られたＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有するモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株は、通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ
Ｐ−１４３２４の受託番号で寄託されている。
得られたＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有するモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株は、通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ
Ｐ−１４３２４の受託番号で寄託されている。
【００５４】(iv)モノクローナル抗体の調製 上記のようにして得られたハイブリドーマを適当な培地
中で培養すれば、その培養上清中に本発明のモノクロー
ナル抗体が得られる。さらに常法により、硫安塩析、イ
オン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロ
テインＧを用いたアフィニティクロマトグラフィー、あ
るいは抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィーな
どによってモノクローナル抗体を精製することができ
る。
中で培養すれば、その培養上清中に本発明のモノクロー
ナル抗体が得られる。さらに常法により、硫安塩析、イ
オン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロ
テインＧを用いたアフィニティクロマトグラフィー、あ
るいは抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィーな
どによってモノクローナル抗体を精製することができ
る。
【００５５】こうして得られるモノクローナル抗体は、
マイコプラズマ・ファーメンタンスに感染していない健
常人の血清中に存在するシアル酸含有糖脂質（ガングリ
オシド）、血小板活性化因子（１−アルキル−２−アセ
チルグリセロ−３−ホスホコリン）もしくはその部分脱
アシル化物、ホスファチジルコリンもしくはその部分脱
アシル化物、またはスフィンゴミエリン等の糖脂質及び
リン脂質とは交差反応を示さない。
マイコプラズマ・ファーメンタンスに感染していない健
常人の血清中に存在するシアル酸含有糖脂質（ガングリ
オシド）、血小板活性化因子（１−アルキル−２−アセ
チルグリセロ−３−ホスホコリン）もしくはその部分脱
アシル化物、ホスファチジルコリンもしくはその部分脱
アシル化物、またはスフィンゴミエリン等の糖脂質及び
リン脂質とは交差反応を示さない。
【００５６】本発明のモノクローナル抗体は、そのまま
使用することもできるが、フラグメント化したものを使
用することもできる。抗体のフラグメント化の際、抗体
の抗原結合部位（Ｆａｂ）が保存されていることが抗原
と抗体との結合に必須であるので、抗原結合部位を分解
しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パ
パイン）で抗体を処理して得られる抗原結合部位（Ｆａ
ｂ）を含むフラグメントは使用することができる。
使用することもできるが、フラグメント化したものを使
用することもできる。抗体のフラグメント化の際、抗体
の抗原結合部位（Ｆａｂ）が保存されていることが抗原
と抗体との結合に必須であるので、抗原結合部位を分解
しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パ
パイン）で抗体を処理して得られる抗原結合部位（Ｆａ
ｂ）を含むフラグメントは使用することができる。
【００５７】また、本発明のモノクローナル抗体をコー
ドする遺伝子の塩基配列もしくは抗体のアミノ酸配列が
決定されれば、遺伝子工学的に抗原結合部位（Ｆａｂ）
を含むフラグメントを作製することが可能である。
ドする遺伝子の塩基配列もしくは抗体のアミノ酸配列が
決定されれば、遺伝子工学的に抗原結合部位（Ｆａｂ）
を含むフラグメントを作製することが可能である。
【００５８】＜３＞本発明のグリセロ糖リン脂質及びそ
れに対する抗体の利用法 本発明の抗体は、マイコプラズマ・ファーメンタンス固
有のグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有するの
で、これを用いて検体中のグリセロ糖リン脂質を免疫学
的に測定することができる。この際、ＧＧＰＬ−Ｉ及び
ＧＧＰＬ−IIIの両方に対して反応特異性を有する抗体
を用いれば、ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIを測定す
ることができ、ＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有
する抗体を用いれば、ＧＧＰＬ−IIIを選択的に測定す
ることができる。ＧＧＰＬ−IIIの測定に際しては、前
記のようにして得られるＧＧＰＬ−IIIを標準物質とし
て使用することができる。また、前記検体中のグリセロ
糖リン脂質としては、生体由来の検体から抽出した脂質
画分が挙げられる。
れに対する抗体の利用法 本発明の抗体は、マイコプラズマ・ファーメンタンス固
有のグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有するの
で、これを用いて検体中のグリセロ糖リン脂質を免疫学
的に測定することができる。この際、ＧＧＰＬ−Ｉ及び
ＧＧＰＬ−IIIの両方に対して反応特異性を有する抗体
を用いれば、ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIを測定す
ることができ、ＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有
する抗体を用いれば、ＧＧＰＬ−IIIを選択的に測定す
ることができる。ＧＧＰＬ−IIIの測定に際しては、前
記のようにして得られるＧＧＰＬ−IIIを標準物質とし
て使用することができる。また、前記検体中のグリセロ
糖リン脂質としては、生体由来の検体から抽出した脂質
画分が挙げられる。
【００５９】免疫学的な測定法としては、ＥＬＩＳＡ
法、免疫染色法等、抗体を用いる通常の免疫学的方法を
適用することができる。例えば、抗グリセロ糖リン脂質
抗体が結合した固相に検体液を接触させて検体液中に含
まれるグリセロ糖リン脂質を前記抗体に結合させ、非吸
着成分を固相から分離除去し、次いで、標識物質で標識
化したマイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖
リン脂質を前記固相に接触させ、前記検体液中に含まれ
るグリセロ糖リン脂質と標識化したグリセロ糖リン脂質
とを競合反応させ、固相に結合した標識物質または固相
に結合しない標識物質のいずれかを検出することによ
り、検体液中のグリセロ糖リン脂質を測定することがで
きる。
法、免疫染色法等、抗体を用いる通常の免疫学的方法を
適用することができる。例えば、抗グリセロ糖リン脂質
抗体が結合した固相に検体液を接触させて検体液中に含
まれるグリセロ糖リン脂質を前記抗体に結合させ、非吸
着成分を固相から分離除去し、次いで、標識物質で標識
化したマイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖
リン脂質を前記固相に接触させ、前記検体液中に含まれ
るグリセロ糖リン脂質と標識化したグリセロ糖リン脂質
とを競合反応させ、固相に結合した標識物質または固相
に結合しない標識物質のいずれかを検出することによ
り、検体液中のグリセロ糖リン脂質を測定することがで
きる。
【００６０】また、抗グリセロ糖リン脂質抗体が結合し
た固相に、検体液と、標識物質で標識化したグリセロ糖
リン脂質とを接触させ、前記検体液中に含まれるグリセ
ロ糖リン脂質と標識化したグリセロ糖リン脂質とを前記
抗体に対して競合反応させ、固相に結合した標識物質ま
たは固相に結合しない標識物質のいずれかを検出するこ
とにより検体中のグリセロ糖リン脂質を測定することが
できる。この際、標識化したグリセロ糖リン脂質の代わ
りに無標識の標準グリセロ糖リン脂質を用い、検体中の
グリセロ糖リン脂質と標準グリセロ糖リン脂質との競合
反応を行った後、さらに標識物質で標識化した抗グリセ
ロ糖リン脂質抗体を固相に接触させ、固相に結合した標
識物質または固相に結合しない標識物質のいずれかを検
出してもよい。この場合も、さらに標識化した二次抗体
を用いてもよい。
た固相に、検体液と、標識物質で標識化したグリセロ糖
リン脂質とを接触させ、前記検体液中に含まれるグリセ
ロ糖リン脂質と標識化したグリセロ糖リン脂質とを前記
抗体に対して競合反応させ、固相に結合した標識物質ま
たは固相に結合しない標識物質のいずれかを検出するこ
とにより検体中のグリセロ糖リン脂質を測定することが
できる。この際、標識化したグリセロ糖リン脂質の代わ
りに無標識の標準グリセロ糖リン脂質を用い、検体中の
グリセロ糖リン脂質と標準グリセロ糖リン脂質との競合
反応を行った後、さらに標識物質で標識化した抗グリセ
ロ糖リン脂質抗体を固相に接触させ、固相に結合した標
識物質または固相に結合しない標識物質のいずれかを検
出してもよい。この場合も、さらに標識化した二次抗体
を用いてもよい。
【００６１】さらに、検体液中のグリセロ糖リン脂質を
固相に結合し、これに標識化した抗グリセロ糖リン脂質
抗体を接触させ、固相に結合した標識物質または固相に
結合しない標識物質のいずれかを検出してもよい。
固相に結合し、これに標識化した抗グリセロ糖リン脂質
抗体を接触させ、固相に結合した標識物質または固相に
結合しない標識物質のいずれかを検出してもよい。
【００６２】また、標準グリセロ糖リン脂質を固相に結
合させ、これに検体液及び標識化した抗グリセロ糖リン
脂質抗体を接触させ、固相に結合した標識物質または固
相に結合しない標識物質のいずれかを検出してもよい。
この場合においても、標識二次抗体を使用することもで
きる。標準グリセロ糖リン脂質として精製したＧＧＰＬ
−IIIを用いれば、検体中のＧＧＰＬ−IIIを測定するこ
とができる。
合させ、これに検体液及び標識化した抗グリセロ糖リン
脂質抗体を接触させ、固相に結合した標識物質または固
相に結合しない標識物質のいずれかを検出してもよい。
この場合においても、標識二次抗体を使用することもで
きる。標準グリセロ糖リン脂質として精製したＧＧＰＬ
−IIIを用いれば、検体中のＧＧＰＬ−IIIを測定するこ
とができる。
【００６３】さらには、抗グリセロ糖リン脂質が結合し
た固相に検体液を接触させて検体液中に含まれる抗グリ
セロ糖リン脂質抗体を前記抗体に結合させ、非吸着成分
を固相から分離除去し、次いで、抗ヒトイムノグロブリ
ン抗体を標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、標
識物質を検出することにより、検体中の抗グリセロ糖リ
ン脂質抗体を測定することができる。本発明のグリセロ
糖リン脂質は、マイコプラズマ・ファーメンタンスに固
有であるので、検体中の抗グリセロ糖リン脂質抗体の有
無を調べることによって、マイコプラズマ・ファーメン
タンスの感染の有無を知ることができる。
た固相に検体液を接触させて検体液中に含まれる抗グリ
セロ糖リン脂質抗体を前記抗体に結合させ、非吸着成分
を固相から分離除去し、次いで、抗ヒトイムノグロブリ
ン抗体を標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、標
識物質を検出することにより、検体中の抗グリセロ糖リ
ン脂質抗体を測定することができる。本発明のグリセロ
糖リン脂質は、マイコプラズマ・ファーメンタンスに固
有であるので、検体中の抗グリセロ糖リン脂質抗体の有
無を調べることによって、マイコプラズマ・ファーメン
タンスの感染の有無を知ることができる。
【００６４】その他、免疫学的測定法には種々の態様が
知られているが、いずれの方法も本発明に適用すること
ができる。また、上記のような固相を用いる方法以外
に、ハプテン、抗原の免疫測定に使用される方法、例え
ば、前記抗体に対して検体中のグリセロ糖リン脂質と標
識化したグリセロ糖リン脂質を競合反応させ、抗体と結
合した抗原と遊離の抗原を、例えばポリエチレングリコ
ール、デキストラン、二次抗体等を用いて分離し、遊離
の標識抗原の標識物質を検出する液相法を採用してもよ
い。
知られているが、いずれの方法も本発明に適用すること
ができる。また、上記のような固相を用いる方法以外
に、ハプテン、抗原の免疫測定に使用される方法、例え
ば、前記抗体に対して検体中のグリセロ糖リン脂質と標
識化したグリセロ糖リン脂質を競合反応させ、抗体と結
合した抗原と遊離の抗原を、例えばポリエチレングリコ
ール、デキストラン、二次抗体等を用いて分離し、遊離
の標識抗原の標識物質を検出する液相法を採用してもよ
い。
【００６５】上記固相としては、アガロースビーズ、ラ
テックス粒子、ポリスチレン、ナイロン等のマイクロタ
イタープレートのウェル等の通常の材料及び形態（粒
子、微粒子、試験管、マイクロタイタープレート、スト
リップ等）のものが挙げられる。固相に抗体またはグリ
セロ糖リン脂質を結合させた後に、ＢＳＡ（ウシ血清ア
ルブミン）やゼラチンなどを用いてブロッキングを行う
ことが好ましい。また、標識物質としては、ペルオキシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ等、酵素反応により
色素の発色が可能な酵素；放射性同位元素；フルオレセ
インイソチオシアネート等の蛍光色素などが挙げられ
る。
テックス粒子、ポリスチレン、ナイロン等のマイクロタ
イタープレートのウェル等の通常の材料及び形態（粒
子、微粒子、試験管、マイクロタイタープレート、スト
リップ等）のものが挙げられる。固相に抗体またはグリ
セロ糖リン脂質を結合させた後に、ＢＳＡ（ウシ血清ア
ルブミン）やゼラチンなどを用いてブロッキングを行う
ことが好ましい。また、標識物質としては、ペルオキシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ等、酵素反応により
色素の発色が可能な酵素；放射性同位元素；フルオレセ
インイソチオシアネート等の蛍光色素などが挙げられ
る。
【００６６】色素は、ペルオキシダーゼに対しては４−
クロロ−１−ナフトール、Ｏ−フェニレンジアミン（Ｏ
ＰＤ）もしくは３，３’−ジアミノベンチジン等、アル
カリフォスファターゼに対してはｐ−ニトロフェニルフ
ォスフェート等を使用する。
クロロ−１−ナフトール、Ｏ−フェニレンジアミン（Ｏ
ＰＤ）もしくは３，３’−ジアミノベンチジン等、アル
カリフォスファターゼに対してはｐ−ニトロフェニルフ
ォスフェート等を使用する。
【００６７】マイコプラズマ・ファーメンタンスは本発
明に係るグリセロ糖リン脂質を有しているので、本発明
の抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いてマイコプラズマ・
ファーメンタンスを検出することができる。例えば、検
体から脂質画分を抽出し、該脂質抽出物を固相と接触さ
せて脂質を吸着させ、脂質が吸着した固相と本発明の抗
体を反応させ、同時またはその後に、標識物質で標識化
された該抗体と反応する抗免疫グロブリン抗体を反応さ
せ、標識物質を検出することにより、検体中のマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスを検出することができる。
明に係るグリセロ糖リン脂質を有しているので、本発明
の抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いてマイコプラズマ・
ファーメンタンスを検出することができる。例えば、検
体から脂質画分を抽出し、該脂質抽出物を固相と接触さ
せて脂質を吸着させ、脂質が吸着した固相と本発明の抗
体を反応させ、同時またはその後に、標識物質で標識化
された該抗体と反応する抗免疫グロブリン抗体を反応さ
せ、標識物質を検出することにより、検体中のマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスを検出することができる。
【００６８】また、本発明に係るグリセロ糖リン脂質
は、マイコプラズマ・ファーメンタンスに固有であるの
で、前記の方法により検体中のグリセロ糖リン脂質を測
定し、グリセロ糖リン脂質の存否またはその存在量と検
体中のマイコプラズマ・ファーメンタンスの存否または
その存在量とを関連づけることによって、マイコプラズ
マ・ファーメンタンスを検出することもできる。
は、マイコプラズマ・ファーメンタンスに固有であるの
で、前記の方法により検体中のグリセロ糖リン脂質を測
定し、グリセロ糖リン脂質の存否またはその存在量と検
体中のマイコプラズマ・ファーメンタンスの存否または
その存在量とを関連づけることによって、マイコプラズ
マ・ファーメンタンスを検出することもできる。
【００６９】上記グリセロ糖リン脂質の測定法またはマ
イコプラズマ・ファーメンタンスの検出法において、検
体としては、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、関節液
または細胞培養液（上清）等が挙げられる。
イコプラズマ・ファーメンタンスの検出法において、検
体としては、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、関節液
または細胞培養液（上清）等が挙げられる。
【００７０】上記方法の他に、生体組織または細胞を、
そのまま又はグリセロ糖リン脂質の固定処理を施した
後、標識物質で標識化した抗グリセロ糖リン脂質抗体と
反応させ、マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染し
た生体組織または細胞に標識化抗体を結合させ、標識物
質を測定することにより、マイコプラズマ・ファーメン
タンスを検出することもできる。固定処理の方法として
は、例えばホルマリン、グルタルアルデヒド、パラホル
ムアルデヒド等を用いる方法が挙げられる。また、標識
物質で標識化した抗グリセロ糖リン脂質抗体の代わり
に、無標識の抗グリセロ糖リン脂質抗体を固定処理した
生体組織または細胞と反応させ、同時またはその後に、
前記抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調
製した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を
標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、マイコプラ
ズマ・ファーメンタンスが感染した生体組織または細胞
に標識化二次抗体を結合させ、標識物質を測定してもよ
い。
そのまま又はグリセロ糖リン脂質の固定処理を施した
後、標識物質で標識化した抗グリセロ糖リン脂質抗体と
反応させ、マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染し
た生体組織または細胞に標識化抗体を結合させ、標識物
質を測定することにより、マイコプラズマ・ファーメン
タンスを検出することもできる。固定処理の方法として
は、例えばホルマリン、グルタルアルデヒド、パラホル
ムアルデヒド等を用いる方法が挙げられる。また、標識
物質で標識化した抗グリセロ糖リン脂質抗体の代わり
に、無標識の抗グリセロ糖リン脂質抗体を固定処理した
生体組織または細胞と反応させ、同時またはその後に、
前記抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調
製した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を
標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、マイコプラ
ズマ・ファーメンタンスが感染した生体組織または細胞
に標識化二次抗体を結合させ、標識物質を測定してもよ
い。
【００７１】免疫学的方法により被検体中のグリセロ糖
リン脂質またはマイコプラズマ・ファーメンタンスを検
出する際に、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリ
セロ糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗体と、こ
の抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製
した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標
識物質で標識化した二次抗体とを含む試薬キットを予め
用意しておくと、検出を簡便に行うことができる。
リン脂質またはマイコプラズマ・ファーメンタンスを検
出する際に、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリ
セロ糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗体と、こ
の抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製
した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標
識物質で標識化した二次抗体とを含む試薬キットを予め
用意しておくと、検出を簡便に行うことができる。
【００７２】具体的なキットの一例として、マイクロタ
イタープレート、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のブ
ロッキング試薬、マイコプラズマ・ファーメンタンスの
グリセロ糖リン脂質（標準物質）、本発明の抗体、ペル
オキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧ抗体、過酸化水素
水、ＯＰＤ、洗浄用緩衝液からなるキットが挙げられ
る。抗体類、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリ
セロ糖リン脂質等は、凍結乾燥品として、またはこれら
を安定して保存できる溶媒に溶解しておくことが好まし
い。
イタープレート、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のブ
ロッキング試薬、マイコプラズマ・ファーメンタンスの
グリセロ糖リン脂質（標準物質）、本発明の抗体、ペル
オキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧ抗体、過酸化水素
水、ＯＰＤ、洗浄用緩衝液からなるキットが挙げられ
る。抗体類、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリ
セロ糖リン脂質等は、凍結乾燥品として、またはこれら
を安定して保存できる溶媒に溶解しておくことが好まし
い。
【００７３】マイコプラズマ・ファーメンタンスの検出
は、以下に示すような診断法に利用することができる。
は、以下に示すような診断法に利用することができる。
【００７４】レトロウイルス感染症の発症予測 マイコプラズマ・ファーメンタンスは、エイズ（後天性
免疫不全症候群）の増悪因子であるという報告がある
（Lo, S.-C. et al. 1993. Res.Microbiol. 144,489-49
3）。エイズは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）が感
染していても必ずしも発症するものではなく、通常潜伏
期間が長く、発症にはマイコプラズマ・ファーメンタン
スの複合感染が関与している。同様に、他のレトロウイ
ルス感染症の発症にもマイコプラズマ・ファーメンタン
スが関与しているものがあると考えられる。
免疫不全症候群）の増悪因子であるという報告がある
（Lo, S.-C. et al. 1993. Res.Microbiol. 144,489-49
3）。エイズは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）が感
染していても必ずしも発症するものではなく、通常潜伏
期間が長く、発症にはマイコプラズマ・ファーメンタン
スの複合感染が関与している。同様に、他のレトロウイ
ルス感染症の発症にもマイコプラズマ・ファーメンタン
スが関与しているものがあると考えられる。
【００７５】ＨＩＶが潜伏感染した細胞の培養液に、各
種マイコプラズマから抽出した脂質を表１に示した脂質
濃度（終濃度）で加えて培養し、光学顕微鏡を用いて破
壊された細胞数を調べることにより、ＨＩＶの発現誘導
頻度の指標とした。結果を表１に示す。
種マイコプラズマから抽出した脂質を表１に示した脂質
濃度（終濃度）で加えて培養し、光学顕微鏡を用いて破
壊された細胞数を調べることにより、ＨＩＶの発現誘導
頻度の指標とした。結果を表１に示す。
【００７６】
【表１】
【００７７】この結果及び従来の報告から、マイコプラ
ズマ・ファーメンタンスはレトロウイルスの増殖を誘導
する活性を有することがわかる。したがって、レトロウ
イルス感染者の血液等でマイコプラズマ・ファーメンタ
ンスの複合感染の有無を調べることによって、発症の予
測が可能となり、適切な処置を行うことができる。
ズマ・ファーメンタンスはレトロウイルスの増殖を誘導
する活性を有することがわかる。したがって、レトロウ
イルス感染者の血液等でマイコプラズマ・ファーメンタ
ンスの複合感染の有無を調べることによって、発症の予
測が可能となり、適切な処置を行うことができる。
【００７８】リウマチの診断 マイコプラズマ・ファーメンタンスはリウマチの原因で
あるという報告がある（Williams, M. H. et al. Lance
t ii: 277-280(1970)）。したがって、本発明の抗体を
用いてマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出するこ
とにより、リウマチ罹患の診断が可能となることが期待
される。
あるという報告がある（Williams, M. H. et al. Lance
t ii: 277-280(1970)）。したがって、本発明の抗体を
用いてマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出するこ
とにより、リウマチ罹患の診断が可能となることが期待
される。
【００７９】ターゲティング療法への応用 アジドチミジン、ジデオキシイノシン等の抗ＨＩＶ剤ま
たは／及び抗マイコプラズマ剤を結合させた本発明の抗
体をレトロウイルス感染者やリウマチ患者に投与し、レ
トロウイルス発症の予防あるいはリウマチの治療に利用
する等の応用が期待される。
たは／及び抗マイコプラズマ剤を結合させた本発明の抗
体をレトロウイルス感染者やリウマチ患者に投与し、レ
トロウイルス発症の予防あるいはリウマチの治療に利用
する等の応用が期待される。
【００８０】中和抗体として治療への利用 本発明の抗体はマイコプラズマ・ファーメンタンスに結
合してそれによる感染を阻止するための中和抗体として
の活性が期待され、この抗体を生体に投与してマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスが複合感染する可能性の高い
ウイルスによる感染症の治療または予防に使用すること
ができる。
合してそれによる感染を阻止するための中和抗体として
の活性が期待され、この抗体を生体に投与してマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスが複合感染する可能性の高い
ウイルスによる感染症の治療または予防に使用すること
ができる。
【００８１】腎炎の診断 後記実施例に示すように、腎炎患者の血液中に、本発明
の抗グリセロ糖リン脂質抗体が結合する脂質が高率で認
められ、この脂質を検出することによって腎炎の診断を
行うことができることが示唆された。この脂質は、ＨＰ
ＴＬＣ上の位置からはＧＧＰＬ−IIIとは区別される
が、ＧＧＰＬ−IIIを認識するモノクローナル抗体が結
合したことから、ＧＧＰＬ−IIIと抗原性が類似した脂
質であると考えられる。このＧＧＰＬ−IIIに抗原性が
類似した物質は、本発明の抗グリセロ糖リン脂質抗体を
用いて免疫学的に測定することができる。
の抗グリセロ糖リン脂質抗体が結合する脂質が高率で認
められ、この脂質を検出することによって腎炎の診断を
行うことができることが示唆された。この脂質は、ＨＰ
ＴＬＣ上の位置からはＧＧＰＬ−IIIとは区別される
が、ＧＧＰＬ−IIIを認識するモノクローナル抗体が結
合したことから、ＧＧＰＬ−IIIと抗原性が類似した脂
質であると考えられる。このＧＧＰＬ−IIIに抗原性が
類似した物質は、本発明の抗グリセロ糖リン脂質抗体を
用いて免疫学的に測定することができる。
【００８２】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００８３】
【実施例１】 新規グリセロ糖リン脂質の単離及びその
構造解析 ＜１＞マイコプラズマ・ファーメンタンスの培養及び脂
質の調製 ＧＧＰＬｓを含むＭＴ−４細胞（ヒトＴリンパ球向性レ
トロウィルス−タイプＩ（ＨＴＬＶ−Ｉ）が感染したヒ
トヘルパーＴ細胞株）の培養上清を、ポアサイズ0.22μ
ｍのフィルターで濾過して、その濾液をPPLO broth（デ
ィフコ・ラボラトリーズ製）寒天培地に接種して培養
し、コロニーを単離した後、10％(v/v)ウシ胎仔血清(FB
S)、５％(w/v)酵母抽出物（フロー・ラボラトリーズ
製）、1000単位／ｍｌペニシリン、１％(w/v)デキスト
ロース、０．００２％(w/v)フェノールレッドを含むPPL
O broth（ディフコ・ラボラトリーズ製）の液体培地中
で培養した。形成されたコロニーはフライドエッグ状を
呈し、マイコプラズマであることが確認された。
構造解析 ＜１＞マイコプラズマ・ファーメンタンスの培養及び脂
質の調製 ＧＧＰＬｓを含むＭＴ−４細胞（ヒトＴリンパ球向性レ
トロウィルス−タイプＩ（ＨＴＬＶ−Ｉ）が感染したヒ
トヘルパーＴ細胞株）の培養上清を、ポアサイズ0.22μ
ｍのフィルターで濾過して、その濾液をPPLO broth（デ
ィフコ・ラボラトリーズ製）寒天培地に接種して培養
し、コロニーを単離した後、10％(v/v)ウシ胎仔血清(FB
S)、５％(w/v)酵母抽出物（フロー・ラボラトリーズ
製）、1000単位／ｍｌペニシリン、１％(w/v)デキスト
ロース、０．００２％(w/v)フェノールレッドを含むPPL
O broth（ディフコ・ラボラトリーズ製）の液体培地中
で培養した。形成されたコロニーはフライドエッグ状を
呈し、マイコプラズマであることが確認された。
【００８４】また、本微生物からＤＮＡを調製し、マイ
コプラズマの種によって異なる１６Ｓ−２３Ｓリボゾー
ムＲＮＡ遺伝子間スペーサ領域の二段階ＰＣＲ（Harasa
wa,R. et al. 1993. Res. Microbiol. 144: 489-493）
による解析を、ＭＴ−４細胞から分離したマイコプラズ
マ・ファーメンタンス、マイコプラズマ・ファーメンタ
ンス タイプストレインＰＧ１８、マイコプラズマ・ヒ
オリニス（M. hyorhinis）ＤＢＳ１０５０(ATCC 1798
1)、マイコプラズマ・アルギニニ（M. arginini）Ｇ２
３０(ATCC 23838)、マイコプラズマ・オラレ（M. oral
e）ＣＨ１９２９９、マイコプラズマ・サリバリウム
（M. salivarium）ＰＧ２０(ATCC 23064)、マイコプラ
ズマ・ペネトランス（M. penetrans）ＧＴＵ−５４−６
Ａ１の各菌種について行った。その結果、一段階ＰＣＲ
産物は、マイコプラズマ・ファーメンタンスのタイプス
トレインであるＰＧ１８株と一致した（図１）。さら
に、このＰＣＲ産物を用いて第２段階のＰＣＲを行って
得られた増幅産物は、VspI及びHindIIIで切断され、Cla
I、HincII及びHaeIIIでは切断されなかった（図２）こ
とから、本微生物はマイコプラズマ・ファーメンタンス
と同定され、ＧＧＰＬ株（M. fermentans GGPL strai
n）と命名された。
コプラズマの種によって異なる１６Ｓ−２３Ｓリボゾー
ムＲＮＡ遺伝子間スペーサ領域の二段階ＰＣＲ（Harasa
wa,R. et al. 1993. Res. Microbiol. 144: 489-493）
による解析を、ＭＴ−４細胞から分離したマイコプラズ
マ・ファーメンタンス、マイコプラズマ・ファーメンタ
ンス タイプストレインＰＧ１８、マイコプラズマ・ヒ
オリニス（M. hyorhinis）ＤＢＳ１０５０(ATCC 1798
1)、マイコプラズマ・アルギニニ（M. arginini）Ｇ２
３０(ATCC 23838)、マイコプラズマ・オラレ（M. oral
e）ＣＨ１９２９９、マイコプラズマ・サリバリウム
（M. salivarium）ＰＧ２０(ATCC 23064)、マイコプラ
ズマ・ペネトランス（M. penetrans）ＧＴＵ−５４−６
Ａ１の各菌種について行った。その結果、一段階ＰＣＲ
産物は、マイコプラズマ・ファーメンタンスのタイプス
トレインであるＰＧ１８株と一致した（図１）。さら
に、このＰＣＲ産物を用いて第２段階のＰＣＲを行って
得られた増幅産物は、VspI及びHindIIIで切断され、Cla
I、HincII及びHaeIIIでは切断されなかった（図２）こ
とから、本微生物はマイコプラズマ・ファーメンタンス
と同定され、ＧＧＰＬ株（M. fermentans GGPL strai
n）と命名された。
【００８５】上記の方法で培養したマイコプラズマ・フ
ァーメンタンスの菌体１ｇにメタノールを１００ｍｌ加
え数時間放置した後、クロロホルムを２００ｍｌ加えて
超音波処理し、さらに数時間放置した。これを、ポータ
ー型テフロンホモジナイザーでホモジナイズして得られ
たホモジネートを１０，０００ｒｐｍで遠心し、その上
清を回収した。この上清を蒸発させることにより、脂質
抽出物５０ｍｇを得た。
ァーメンタンスの菌体１ｇにメタノールを１００ｍｌ加
え数時間放置した後、クロロホルムを２００ｍｌ加えて
超音波処理し、さらに数時間放置した。これを、ポータ
ー型テフロンホモジナイザーでホモジナイズして得られ
たホモジネートを１０，０００ｒｐｍで遠心し、その上
清を回収した。この上清を蒸発させることにより、脂質
抽出物５０ｍｇを得た。
【００８６】＜２＞マイコプラズマ・ファーメンタンス
脂質画分の分析 上記で得られたマイコプラズマ・ファーメンタンスの脂
質画分をＨＰＴＬＣ（高速薄層クロマトグラフィー）プ
レート（メルク社製）にアプライし、クロロホルム：メ
タノール：0.2％(w/v)塩化カルシウム水溶液＝50：45：
10(v/v/v)の混合溶媒で展開し、ディットマー試薬を用
いてリン脂質を染色した。リン脂質のパターンを、ＴＬ
Ｃデンシトメータ（島津製作所製ＣＳ９１０）を用いて
５８０ｎｍでの吸収により測定した。その結果、６本の
バンド（Lipid i、Lipid ii、Lipid iii、Lipid iv、Li
pid v、及びLipid vi）が検出された（図３）一方、マ
イコプラズマ・ファーメンタンスが感染したＭＴ−４細
胞及びこの細胞を抗マイコプラズマ剤（ＭＣ２０１（大
日本製薬（株）製））で処理して得られたＭＴ−４細胞
から脂質画分を既知の方法(Bligh and Dyer, Can. J. B
iochem. Physiol. 37,911-917(1959))により抽出した。
各々の脂質画分抽出物を、ＨＰＴＬＣ（高速薄層クロマ
トグラフィー）プレート（メルク社製）にアプライし、
クロロホルム：メタノール：0.2％(v/v)塩化カルシウム
水溶液＝50：45：10(v/v/v)の混合溶媒で展開し、オル
シノール（orcinol）試薬を用いて糖脂質を染色し、デ
ィットマー（Dittmer）試薬を用いてリン脂質を染色し
たところ、ＭＴ−４（ＧＧＰＬ＋）にみられ、ＭＴ−４
（ＧＧＰＬ−）ではみられない２本のバンドが検出され
た（図４）。これらのバンドのうち一方は、すでに構造
が知られているＧＧＰＬ−Ｉであり、他方はＧＧＰＬ−
IIIであると同定された。尚、その他のディットマー試
薬陽性のバンドはＧＭ２、ＧＭ１ａ、ＧＤ１ａ、オルシ
ノール試薬陽性のバンドはホスファチジルコリン及びス
フィンゴミエリンと同定されている（Matsuda , K. et
al. Biochem. Biophys. Acta, 1168, 123-129 (199
3)）。
脂質画分の分析 上記で得られたマイコプラズマ・ファーメンタンスの脂
質画分をＨＰＴＬＣ（高速薄層クロマトグラフィー）プ
レート（メルク社製）にアプライし、クロロホルム：メ
タノール：0.2％(w/v)塩化カルシウム水溶液＝50：45：
10(v/v/v)の混合溶媒で展開し、ディットマー試薬を用
いてリン脂質を染色した。リン脂質のパターンを、ＴＬ
Ｃデンシトメータ（島津製作所製ＣＳ９１０）を用いて
５８０ｎｍでの吸収により測定した。その結果、６本の
バンド（Lipid i、Lipid ii、Lipid iii、Lipid iv、Li
pid v、及びLipid vi）が検出された（図３）一方、マ
イコプラズマ・ファーメンタンスが感染したＭＴ−４細
胞及びこの細胞を抗マイコプラズマ剤（ＭＣ２０１（大
日本製薬（株）製））で処理して得られたＭＴ−４細胞
から脂質画分を既知の方法(Bligh and Dyer, Can. J. B
iochem. Physiol. 37,911-917(1959))により抽出した。
各々の脂質画分抽出物を、ＨＰＴＬＣ（高速薄層クロマ
トグラフィー）プレート（メルク社製）にアプライし、
クロロホルム：メタノール：0.2％(v/v)塩化カルシウム
水溶液＝50：45：10(v/v/v)の混合溶媒で展開し、オル
シノール（orcinol）試薬を用いて糖脂質を染色し、デ
ィットマー（Dittmer）試薬を用いてリン脂質を染色し
たところ、ＭＴ−４（ＧＧＰＬ＋）にみられ、ＭＴ−４
（ＧＧＰＬ−）ではみられない２本のバンドが検出され
た（図４）。これらのバンドのうち一方は、すでに構造
が知られているＧＧＰＬ−Ｉであり、他方はＧＧＰＬ−
IIIであると同定された。尚、その他のディットマー試
薬陽性のバンドはＧＭ２、ＧＭ１ａ、ＧＤ１ａ、オルシ
ノール試薬陽性のバンドはホスファチジルコリン及びス
フィンゴミエリンと同定されている（Matsuda , K. et
al. Biochem. Biophys. Acta, 1168, 123-129 (199
3)）。
【００８７】また、ポアサイズ０．２２μｍのフィルタ
ーを通過させたＭＴ−４細胞（マイコプラズマ・ファー
メンタンスが感染したもの）の培養上清を加えて培養し
たＭＴ−４（抗マイコプラズマ剤ＰＣ２０１で処理した
もの）細胞から抽出した脂質画分を上記と同様にしてＨ
ＰＴＬＣにより分析したところ、上記の２本のバンドが
検出された。したがって、これらのバンド、すなわちＧ
ＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIは、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンスに由来することが明らかである。
ーを通過させたＭＴ−４細胞（マイコプラズマ・ファー
メンタンスが感染したもの）の培養上清を加えて培養し
たＭＴ−４（抗マイコプラズマ剤ＰＣ２０１で処理した
もの）細胞から抽出した脂質画分を上記と同様にしてＨ
ＰＴＬＣにより分析したところ、上記の２本のバンドが
検出された。したがって、これらのバンド、すなわちＧ
ＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIは、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンスに由来することが明らかである。
【００８８】これらＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−III
は、ＴＬＣ上の挙動から、前記マイコプラズマ・ファー
メンタンス由来のLipid v及びLipid viに各々相当する
ことがわかった。また、ＦＡＢマススペクトルの結果か
ら、ＧＧＰＬ−ＩはLipid vと同一であり、ＧＧＰＬ−I
IIはLipid viと同一であることが確認された。
は、ＴＬＣ上の挙動から、前記マイコプラズマ・ファー
メンタンス由来のLipid v及びLipid viに各々相当する
ことがわかった。また、ＦＡＢマススペクトルの結果か
ら、ＧＧＰＬ−ＩはLipid vと同一であり、ＧＧＰＬ−I
IIはLipid viと同一であることが確認された。
【００８９】マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染
したＭＴ−４細胞６０ml（湿体積）に対し４００mlのク
ロロホルム：メタノール＝２：１,１：１および１：２
を用いて抽出し９９３ｍｇの総脂質を得た。総脂質は、
ＤＥＡＥ Ｓephadex Ａ-２５カラムにより非吸着画分
（中性画分）と吸着画分（酸性画分）に分け、非吸着画
分７７５mgが得られた。この非吸着画分をイアトロビー
ズカラム（イアトロン社製）にかけ、クロロホルム／メ
タノール／水（８３：１６：０．５〜２０：８０：８,
v/v/v）の濃度勾配で３回分画し、最後に１-プロパノー
ル／アンモニア水／水（８０：５：１５〜７５：５：２
０, v/v/v）による濃度勾配で溶出してＧＧＰＬ−III
３ｍｇを単離した。
したＭＴ−４細胞６０ml（湿体積）に対し４００mlのク
ロロホルム：メタノール＝２：１,１：１および１：２
を用いて抽出し９９３ｍｇの総脂質を得た。総脂質は、
ＤＥＡＥ Ｓephadex Ａ-２５カラムにより非吸着画分
（中性画分）と吸着画分（酸性画分）に分け、非吸着画
分７７５mgが得られた。この非吸着画分をイアトロビー
ズカラム（イアトロン社製）にかけ、クロロホルム／メ
タノール／水（８３：１６：０．５〜２０：８０：８,
v/v/v）の濃度勾配で３回分画し、最後に１-プロパノー
ル／アンモニア水／水（８０：５：１５〜７５：５：２
０, v/v/v）による濃度勾配で溶出してＧＧＰＬ−III
３ｍｇを単離した。
【００９０】＜３＞ＧＧＰＬ−IIIの構造解析 ＧＧＰＬ−IIIは、オルシノール試薬、ディットマー試
薬、ドラゲンドルフ試薬に陽性を示し、また、緩和なア
ルカリ処理で分解した。さらに、ＧＧＰＬ−Ｉはニンヒ
ドリン反応に陰性を示したが、ＧＧＰＬ−IIIは陽性を
示した。これらの結果から、ＧＧＰＬ−IIIはコリンを
含む糖リン脂質であることがわかった。
薬、ドラゲンドルフ試薬に陽性を示し、また、緩和なア
ルカリ処理で分解した。さらに、ＧＧＰＬ−Ｉはニンヒ
ドリン反応に陰性を示したが、ＧＧＰＬ−IIIは陽性を
示した。これらの結果から、ＧＧＰＬ−IIIはコリンを
含む糖リン脂質であることがわかった。
【００９１】さらに、以下に示すようにして、ＧＧＰＬ
−IIIの構造解析を行った。
−IIIの構造解析を行った。
【００９２】（１）赤外線吸収スペクトル測定 ＧＧＰＬ−IIIの赤外線吸収スペクトルを、赤外線顕微
鏡（ＩＭＳ−８０００、島津製作所製）を装着した赤外
分光光度計（ＦＴＩＲ−８１００Ｍ：島津製作所製）を
用いて測定した。結果を図５に示す。
鏡（ＩＭＳ−８０００、島津製作所製）を装着した赤外
分光光度計（ＦＴＩＲ−８１００Ｍ：島津製作所製）を
用いて測定した。結果を図５に示す。
【００９３】その結果、-CH2および-CH3基（２９５７，
２９２０，２８５２，１４６７，１４１９，１３７８ｃ
ｍ-1）、水酸基（３２７１ｃｍ-1）、エステルカルボニ
ル基（１７４０，１１６５ｃｍ-1）、リン酸基（１０９
１ｃｍ-1）、コリン基（９７０ｃｍ-1）、及び一級アミ
ン基（１５６０−１６７０ｃｍ-1）にそれぞれ対応する
吸収が検出された。
２９２０，２８５２，１４６７，１４１９，１３７８ｃ
ｍ-1）、水酸基（３２７１ｃｍ-1）、エステルカルボニ
ル基（１７４０，１１６５ｃｍ-1）、リン酸基（１０９
１ｃｍ-1）、コリン基（９７０ｃｍ-1）、及び一級アミ
ン基（１５６０−１６７０ｃｍ-1）にそれぞれ対応する
吸収が検出された。
【００９４】（２）液体２次イオン質量分析（ＬＳＩＭ
Ｓ） 前記のようにして精製したＧＧＰＬ−III 約１μｇをク
ロロホルム：メタノール（１体積：１体積）の混合溶液
１μＬに溶解し、この溶液に、（＋）法の場合は３−ニ
トロベンジルアルコールを、（−）法の場合はトリエタ
ノールアミンをマトリクスとして０．５ｍＬ加えて混合
した。これらの混合溶液を試料とし、ＴＳＱ７０三連四
重極型質量分析計（Finnegan MAT製）を使用して液体２
次イオン質量分析を行った。、一次イオン流として、２
０ｋｅＶに加速したセシウムイオン（Ｃｓ+）を用い
た。スペクトルは、250原子質量単位(amu)/secの速度で
得た。（＋）法によるスペクトルを図６に、（−）法に
よるスペクトルを図７に示す。
Ｓ） 前記のようにして精製したＧＧＰＬ−III 約１μｇをク
ロロホルム：メタノール（１体積：１体積）の混合溶液
１μＬに溶解し、この溶液に、（＋）法の場合は３−ニ
トロベンジルアルコールを、（−）法の場合はトリエタ
ノールアミンをマトリクスとして０．５ｍＬ加えて混合
した。これらの混合溶液を試料とし、ＴＳＱ７０三連四
重極型質量分析計（Finnegan MAT製）を使用して液体２
次イオン質量分析を行った。、一次イオン流として、２
０ｋｅＶに加速したセシウムイオン（Ｃｓ+）を用い
た。スペクトルは、250原子質量単位(amu)/secの速度で
得た。（＋）法によるスペクトルを図６に、（−）法に
よるスペクトルを図７に示す。
【００９５】その結果、（＋）法でｍ／ｚ１０２１、ｍ
／ｚ１０４９およびｍ／ｚ１０７７イオンが認められ
た。このことから、脂肪酸組成が異なるＧＧＰＬ−III
分子が少なくとも３種類存在することが示唆された。ま
た、ＧＧＰＬ−IIIの主要成分はｍ／ｚ１０４９のピー
クであり、その分子量は、１０４９からプロトンの質量
１を差し引いた１０４８であると結論された。他の成分
の分子量も同様に、１０２０及び１０７６であると結論
された。
／ｚ１０４９およびｍ／ｚ１０７７イオンが認められ
た。このことから、脂肪酸組成が異なるＧＧＰＬ−III
分子が少なくとも３種類存在することが示唆された。ま
た、ＧＧＰＬ−IIIの主要成分はｍ／ｚ１０４９のピー
クであり、その分子量は、１０４９からプロトンの質量
１を差し引いた１０４８であると結論された。他の成分
の分子量も同様に、１０２０及び１０７６であると結論
された。
【００９６】また、（−）法では、ｍ／ｚ１０４７、ｍ
／ｚ１０７６およびｍ／ｚ１１０３イオンが認められ
た。（＋）法によるスペクトル解析と併せると、ＧＧＰ
Ｌ−III分子は、脂肪酸組成が異なる分子が少なくとも
４種類存在することが示唆された。（−）法におけるＧ
ＧＰＬ−IIIの主要成分はｍ／ｚ１０４７のピークであ
り、その分子量は、１０４７にプロトンの質量１を加え
た１０４８であると結論された。他の成分の分子量も、
同様に１１０４であると結論された。ｍ／ｚ１０７６イ
オンから推定される分子量は１０７７であるが、（＋）
法の結果から推定される分子量は１０７６であり、他の
成分の分子量との差がメチレン基２個分に相当すること
から、１０７６であると結論された。
／ｚ１０７６およびｍ／ｚ１１０３イオンが認められ
た。（＋）法によるスペクトル解析と併せると、ＧＧＰ
Ｌ−III分子は、脂肪酸組成が異なる分子が少なくとも
４種類存在することが示唆された。（−）法におけるＧ
ＧＰＬ−IIIの主要成分はｍ／ｚ１０４７のピークであ
り、その分子量は、１０４７にプロトンの質量１を加え
た１０４８であると結論された。他の成分の分子量も、
同様に１１０４であると結論された。ｍ／ｚ１０７６イ
オンから推定される分子量は１０７７であるが、（＋）
法の結果から推定される分子量は１０７６であり、他の
成分の分子量との差がメチレン基２個分に相当すること
から、１０７６であると結論された。
【００９７】（３）タンデムマススペクトロメトリー
（ＭＳ／ＭＳ） ＬＳＩＭＳに用いた試料と同様に調製した試料（（＋）
法用の試料および（−）法の試料）を用い、ＴＳＱ７０
三連四重極型質量分析計（Finnegan MAT製）を使用して
タンデムマススペクトルの測定を行った。一次イオン流
として、２０ｋｅＶに加速したセシウムイオン（Ｃ
ｓ+）を用い、ＣＡＤ（低エネルギー衝突活性化開裂）
気体として、０．２６パスカル（２．０ｍＴｏｒｒ）に
維持したアルゴンを用いた。スペクトルは、250原子質
量単位(amu)/secの速度で得た。（＋）法によるスペク
トルを図８に、（−）法によるスペクトルを図９に示
す。
（ＭＳ／ＭＳ） ＬＳＩＭＳに用いた試料と同様に調製した試料（（＋）
法用の試料および（−）法の試料）を用い、ＴＳＱ７０
三連四重極型質量分析計（Finnegan MAT製）を使用して
タンデムマススペクトルの測定を行った。一次イオン流
として、２０ｋｅＶに加速したセシウムイオン（Ｃ
ｓ+）を用い、ＣＡＤ（低エネルギー衝突活性化開裂）
気体として、０．２６パスカル（２．０ｍＴｏｒｒ）に
維持したアルゴンを用いた。スペクトルは、250原子質
量単位(amu)/secの速度で得た。（＋）法によるスペク
トルを図８に、（−）法によるスペクトルを図９に示
す。
【００９８】その結果、（＋）法ではｍ／ｚ１８４イオ
ンおよびｍ／ｚ１０４９イオンが認められた。ｍ／ｚ１
８４イオンから、ＧＧＰＬ−IIIの分子中にホスホコリ
ンの存在が示唆された。また、ＧＧＰＬ−IIIの分子量
は、１０４９からプロトンの質量１を差し引いた１０４
８であると結論された。（−）法では、ｍ／ｚ１０４７
イオンが認められた。このことから、ＧＧＰＬ−IIIの
分子量は１０４７にプロトンの質量１を加えた１０４８
であると結論された。また、ＬＳＩＭＳにより示唆され
た複数種類のＧＧＰＬ−IIIのうち、分子量１０４８の
分子が主要成分であることが支持された。
ンおよびｍ／ｚ１０４９イオンが認められた。ｍ／ｚ１
８４イオンから、ＧＧＰＬ−IIIの分子中にホスホコリ
ンの存在が示唆された。また、ＧＧＰＬ−IIIの分子量
は、１０４９からプロトンの質量１を差し引いた１０４
８であると結論された。（−）法では、ｍ／ｚ１０４７
イオンが認められた。このことから、ＧＧＰＬ−IIIの
分子量は１０４７にプロトンの質量１を加えた１０４８
であると結論された。また、ＬＳＩＭＳにより示唆され
た複数種類のＧＧＰＬ−IIIのうち、分子量１０４８の
分子が主要成分であることが支持された。
【００９９】（４）一次元1Ｈ ＮＭＲスペクトル 重水素（2H）で置換したＧＧＰＬ−III（５００μ
ｇ）、ホスファチジルコリン（２ｍｇ）、Ｄ−グルコー
ス ６−リン酸・２ナトリウム塩（オリエンタル酵母
製）（約２００μｇ）を、各々０．５ｍＬの［2H］ジメ
チルスルホキシド（(C2H3)2SO)：2H2O（９８体積：２体
積）に溶解し、ＧＸ−４００スペクトロメーター（日本
電子製）を使用して、６０℃下、４００ＭＨｚにおける
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを得た。スタンダードとしては
テトラメチルシランを用いた。
ｇ）、ホスファチジルコリン（２ｍｇ）、Ｄ−グルコー
ス ６−リン酸・２ナトリウム塩（オリエンタル酵母
製）（約２００μｇ）を、各々０．５ｍＬの［2H］ジメ
チルスルホキシド（(C2H3)2SO)：2H2O（９８体積：２体
積）に溶解し、ＧＸ−４００スペクトロメーター（日本
電子製）を使用して、６０℃下、４００ＭＨｚにおける
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを得た。スタンダードとしては
テトラメチルシランを用いた。
【０１００】グルコース(GlcH1)のシグナルの積分値を
1.00として標準化し、他のシグナルの強度を定量化し
た。結果を図１０に示す。その結果、グリセロール（Gr
o）のシグナルが４．３１９ｐｐｍ（GroH1b）、４．１
４５ｐｐｍ（GroH1a）、５．１１８ｐｐｍ（GroH2）、
３．６７７ｐｐｍ（GroH3b）、３．５６２ｐｐｍ（GroH
3a）に検出された。また、コリンのシグナルが４．０７
４ｐｐｍ（-POCH2-）、３．５２９ｐｐｍ（-CH2N≡）、
３．１３９ｐｐｍ（-N(CH3)3）に検出された。また、３
−アミノプロパン−１，２−ジオール（１−アミノプロ
パン−２，３−ジオール）および２−アミノプロパン−
１，３−ジオールの標準標品を用いて、それぞれ上述の
方法により得られた一次元1Ｈ ＮＭＲスペクトル（それ
ぞれ図１１Ａ，図１１Ｂ）とＧＧＰＬ−IIIのスペクト
ルとを比較した結果、ＧＧＰＬ−IIIには２−アミノプ
ロパン−１，３−ジオールが含有されている可能性が高
い。さらに、グルコース（Glc）のシグナルとして４．
６４７ｐｐｍ（GlcH1）が顕著に検出された。
1.00として標準化し、他のシグナルの強度を定量化し
た。結果を図１０に示す。その結果、グリセロール（Gr
o）のシグナルが４．３１９ｐｐｍ（GroH1b）、４．１
４５ｐｐｍ（GroH1a）、５．１１８ｐｐｍ（GroH2）、
３．６７７ｐｐｍ（GroH3b）、３．５６２ｐｐｍ（GroH
3a）に検出された。また、コリンのシグナルが４．０７
４ｐｐｍ（-POCH2-）、３．５２９ｐｐｍ（-CH2N≡）、
３．１３９ｐｐｍ（-N(CH3)3）に検出された。また、３
−アミノプロパン−１，２−ジオール（１−アミノプロ
パン−２，３−ジオール）および２−アミノプロパン−
１，３−ジオールの標準標品を用いて、それぞれ上述の
方法により得られた一次元1Ｈ ＮＭＲスペクトル（それ
ぞれ図１１Ａ，図１１Ｂ）とＧＧＰＬ−IIIのスペクト
ルとを比較した結果、ＧＧＰＬ−IIIには２−アミノプ
ロパン−１，３−ジオールが含有されている可能性が高
い。さらに、グルコース（Glc）のシグナルとして４．
６４７ｐｐｍ（GlcH1）が顕著に検出された。
【０１０１】（５）二次元1Ｈ ＮＭＲスペクトル 一次元1Ｈ ＮＭＲと同様に調製した試料を用い、ＦＸ−
４００スペクトロメーター（日本電子製）を使用して、
６０℃下、４００ＭＨｚで、各次元２０００Ｈｚ幅でＰ
Ｈ−ＤＱＦ−ＣＯＳＹ法による二次元の1Ｈ−ＮＭＲ分
析を行った。結果を図１２に示す。
４００スペクトロメーター（日本電子製）を使用して、
６０℃下、４００ＭＨｚで、各次元２０００Ｈｚ幅でＰ
Ｈ−ＤＱＦ−ＣＯＳＹ法による二次元の1Ｈ−ＮＭＲ分
析を行った。結果を図１２に示す。
【０１０２】その結果、ジアシルグリセロールに由来す
るプロトンのシグナル（図１２中、GroH2/H1b，GroH2/H
1a，GroH2/H3b，GroH2/H3a）が認められた。またコリン
（図中、-CH2-N-/-CH2OP-）のプロトンのシグナルが認
められた。
るプロトンのシグナル（図１２中、GroH2/H1b，GroH2/H
1a，GroH2/H3b，GroH2/H3a）が認められた。またコリン
（図中、-CH2-N-/-CH2OP-）のプロトンのシグナルが認
められた。
【０１０３】（６）二次元1Ｈ−31Ｐ ＮＭＲスペクトル 一次元1Ｈ ＮＭＲと同様に調製した試料をＦＸ−４００
スペクトロメーター（日本電子製）を使用して、６０℃
下４００ＭＨｚで二次元の1Ｈ−31Ｐ ＨＭＱＣスペクト
ルを得た。結果を図１３に示す。
スペクトロメーター（日本電子製）を使用して、６０℃
下４００ＭＨｚで二次元の1Ｈ−31Ｐ ＨＭＱＣスペクト
ルを得た。結果を図１３に示す。
【０１０４】その結果一次元目（1Ｈ ＮＭＲ）は、前述
の1Ｈ ＮＭＲと同様のスペクトルが得られ、二次元目（
31Ｐ ＮＭＲ）からは、２本のシグナルが得られた。こ
れは、１分子のＧＧＰＬ−III中に２個のＰ（リン）が
含まれていることを示している。
の1Ｈ ＮＭＲと同様のスペクトルが得られ、二次元目（
31Ｐ ＮＭＲ）からは、２本のシグナルが得られた。こ
れは、１分子のＧＧＰＬ−III中に２個のＰ（リン）が
含まれていることを示している。
【０１０５】また一次元目で、グルコース残基の２位，
３位，４位，５位のプロトンのシグナルが出ている位置
（２．９〜３．０ｐｐｍ付近）と、二次元目のリンのシ
グナルが出ている位置（−０．９ｐｐｍおよび１．１ｐ
ｐｍ）にクロスするピークが検出されなかったことか
ら、リンを含有する化合物はグルコース残基の１位また
は６位に結合していると推定された。さらに、グルコー
ス残基の６ａ位のプロトンのシグナル（一次元目の４．
０ｐｐｍ付近）と二次元目のリンのシグナル（−０．９
ｐｐｍ）およびグルコース残基の６ｂ位のプロトンのシ
グナル（一次元目の３．６ｐｐｍ付近）と二次元目のリ
ンのシグナル（−０．９ｐｐｍおよび１．１ｐｐｍ）の
シグナルとクロスするピークがそれぞれ検出された。
３位，４位，５位のプロトンのシグナルが出ている位置
（２．９〜３．０ｐｐｍ付近）と、二次元目のリンのシ
グナルが出ている位置（−０．９ｐｐｍおよび１．１ｐ
ｐｍ）にクロスするピークが検出されなかったことか
ら、リンを含有する化合物はグルコース残基の１位また
は６位に結合していると推定された。さらに、グルコー
ス残基の６ａ位のプロトンのシグナル（一次元目の４．
０ｐｐｍ付近）と二次元目のリンのシグナル（−０．９
ｐｐｍ）およびグルコース残基の６ｂ位のプロトンのシ
グナル（一次元目の３．６ｐｐｍ付近）と二次元目のリ
ンのシグナル（−０．９ｐｐｍおよび１．１ｐｐｍ）の
シグナルとクロスするピークがそれぞれ検出された。
【０１０６】また、一次元目のコリンのシグナル（約
４．０５〜約４．１ｐｐｍ）と二次元目のリンのシグナ
ル（−０．９ｐｐｍ）とのクロスピークが検出されたこ
とから、コリンにリン酸基が結合したホスホコリンの構
造をたどることができる。さらに、このホスホコリンの
クロスピークは、グルコース残基の６ａ位のプロトンシ
グナル（一次元目の４．０ｐｐｍ付近）とずれているこ
とから、グルコース残基の６位にはまずアミノプロパン
ジオールのリン酸エステルが結合しており、さらにこの
アミノプロパンジオールのリン酸エステルにホスホコリ
ンが結合する構造が推定された。
４．０５〜約４．１ｐｐｍ）と二次元目のリンのシグナ
ル（−０．９ｐｐｍ）とのクロスピークが検出されたこ
とから、コリンにリン酸基が結合したホスホコリンの構
造をたどることができる。さらに、このホスホコリンの
クロスピークは、グルコース残基の６ａ位のプロトンシ
グナル（一次元目の４．０ｐｐｍ付近）とずれているこ
とから、グルコース残基の６位にはまずアミノプロパン
ジオールのリン酸エステルが結合しており、さらにこの
アミノプロパンジオールのリン酸エステルにホスホコリ
ンが結合する構造が推定された。
【０１０７】以上の結果をまとめると、ＧＧＰＬ−III
は、下記性質を有する新規グリセロ糖リン脂質である。 （Ａ）オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 （Ｂ）アルカリで分解される。 （Ｃ）ＤＥＡＥ基を有する陰イオン交換体による分画に
おいて非吸着画分として得られる。 （Ｄ）質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋
２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である。
は、下記性質を有する新規グリセロ糖リン脂質である。 （Ａ）オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 （Ｂ）アルカリで分解される。 （Ｃ）ＤＥＡＥ基を有する陰イオン交換体による分画に
おいて非吸着画分として得られる。 （Ｄ）質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋
２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である。
【０１０８】さらに、上記結果からＧＧＰＬ−IIIは、
α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシ
ル−ｓｎ−グリセロール、ホスホコリン及びアミノプロ
パンジオールのリン酸エステルを構成成分とすることが
示された。このアミノプロパンジオールのリン酸エステ
ルは、２−アミノプロパン−１，３−ジオールのリン酸
エステルであり、その結合部位は、α−グルコピラノシ
ル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ
ールのグルコース残基の６’位であると推定された。さ
らに、この２−アミノプロパン−１，３−ジオールのリ
ン酸エステルにホスホコリンが結合していることが示唆
された。
α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシ
ル−ｓｎ−グリセロール、ホスホコリン及びアミノプロ
パンジオールのリン酸エステルを構成成分とすることが
示された。このアミノプロパンジオールのリン酸エステ
ルは、２−アミノプロパン−１，３−ジオールのリン酸
エステルであり、その結合部位は、α−グルコピラノシ
ル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ
ールのグルコース残基の６’位であると推定された。さ
らに、この２−アミノプロパン−１，３−ジオールのリ
ン酸エステルにホスホコリンが結合していることが示唆
された。
【０１０９】分子量が異なるそれぞれのＧＧＰＬ−III
分子は、α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２
−ジアシル−ｓｎ−グリセロール中のアシル基の種類が
異なるものであり、主要成分（分子量１０４８）におけ
るアシル基はいずれもパルミトイル基であると推定さ
れ、全体の推定構造は、前記化１式に示した通りであ
る。尚、他の分子量を有するＧＧＰＬ−III分子はアシ
ル基の長さが異なり、分子量１０２０のものではミリス
トイル基とパルミトイル基、１０７６のものではパルミ
トイル基とステアロイル基、１１０４のものでは２つの
ステアロイル基、またはパルミトイル基とエイコサノイ
ル基を有していると推定されるが、詳細は明らかではな
い。
分子は、α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２
−ジアシル−ｓｎ−グリセロール中のアシル基の種類が
異なるものであり、主要成分（分子量１０４８）におけ
るアシル基はいずれもパルミトイル基であると推定さ
れ、全体の推定構造は、前記化１式に示した通りであ
る。尚、他の分子量を有するＧＧＰＬ−III分子はアシ
ル基の長さが異なり、分子量１０２０のものではミリス
トイル基とパルミトイル基、１０７６のものではパルミ
トイル基とステアロイル基、１１０４のものでは２つの
ステアロイル基、またはパルミトイル基とエイコサノイ
ル基を有していると推定されるが、詳細は明らかではな
い。
【０１１０】＜４＞各種マイコプラズマの脂質成分の解
析 各種マイコプラズマ（マイコプラズマ・ファーメンタン
ス ＧＧＰＬ株、マイコプラズマ・ファーメンタンス
インコグニタス(incognitus)（ATCC 53949）、マイコプ
ラズマ・ファーメンタンス ＰＧ１８株、マイコプラズ
マ・ファーメンタンス Ｆ１７株、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンス Ｆ１株、マイコプラズマ・ファーメン
タンスＦ７株、マイコプラズマ・アルスリティディス
(M. arthritidis)、マイコプラズマ・ホミニス(M. homi
nis)(ATCC 15488)）を、１０％(v/v)ＦＢＳ（ウシ胎仔
血清）、５％(w/v)酵母抽出物（フロー・ラボラトリー
ズ製）、1000単位／ｍｌペニシリン、１％(w/v)デキス
トロース、０．００２％(w/v)フェノールレッドを含むP
PLO broth（ディフコ・ラボラトリーズ製）の液体培地
中で培養した。これらの培養液から既知の方法(Bligh a
nd Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37,911-917(195
9))により脂質を抽出し、この脂質抽出物をＨＰＴＬＣ
プレート（メルク社製）にアプライし、クロロホルム：
メタノール：0.2％(w/v)塩化カルシウム水溶液＝50：4
5：10(v/v/v)の混合溶媒で展開した。このプレートをヘ
キサンに溶解した0.4％ポリイソブチルメタクリル酸塩
に３０秒間浸した。このプレートを常法に従い、ディッ
トマー試薬による染色を行った。結果を図１４に示す。
この結果より、ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIに相当
するバンドは、各種マイコプラズマ・ファーメンタンス
にのみ見られ、他のマイコプラズマ菌種には見られなか
った。このことから、ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−III
は、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特徴的なグリ
セロ糖リン脂質であると結論された。
析 各種マイコプラズマ（マイコプラズマ・ファーメンタン
ス ＧＧＰＬ株、マイコプラズマ・ファーメンタンス
インコグニタス(incognitus)（ATCC 53949）、マイコプ
ラズマ・ファーメンタンス ＰＧ１８株、マイコプラズ
マ・ファーメンタンス Ｆ１７株、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンス Ｆ１株、マイコプラズマ・ファーメン
タンスＦ７株、マイコプラズマ・アルスリティディス
(M. arthritidis)、マイコプラズマ・ホミニス(M. homi
nis)(ATCC 15488)）を、１０％(v/v)ＦＢＳ（ウシ胎仔
血清）、５％(w/v)酵母抽出物（フロー・ラボラトリー
ズ製）、1000単位／ｍｌペニシリン、１％(w/v)デキス
トロース、０．００２％(w/v)フェノールレッドを含むP
PLO broth（ディフコ・ラボラトリーズ製）の液体培地
中で培養した。これらの培養液から既知の方法(Bligh a
nd Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37,911-917(195
9))により脂質を抽出し、この脂質抽出物をＨＰＴＬＣ
プレート（メルク社製）にアプライし、クロロホルム：
メタノール：0.2％(w/v)塩化カルシウム水溶液＝50：4
5：10(v/v/v)の混合溶媒で展開した。このプレートをヘ
キサンに溶解した0.4％ポリイソブチルメタクリル酸塩
に３０秒間浸した。このプレートを常法に従い、ディッ
トマー試薬による染色を行った。結果を図１４に示す。
この結果より、ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIに相当
するバンドは、各種マイコプラズマ・ファーメンタンス
にのみ見られ、他のマイコプラズマ菌種には見られなか
った。このことから、ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−III
は、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特徴的なグリ
セロ糖リン脂質であると結論された。
【０１１１】
【実施例２】 抗マイコプラズマ糖脂質ポリクローナル
抗体の作製 前記のようにして得たマイコプラズマ・ファーメンタン
スの脂質抽出物５０ｍｇに、モノフォスフェートリピド
Ａ（リビ・イムノケム・リサーチ社）５０μｇと、完全
アジュバント（ナカライテスク（株））５０μｇとを加
え、さらにミネラルオイル２５０μｌ加えて４００ｒｐ
ｍで２分間グラインドした。さらに０．１％(v/v)Tween
80を含むＰＢＳを２５０μｌ加えて４００ｒｐｍで２
分間グラインドして、脂質抽出物を含むエマルジョン
０．５ｍｌを得た。
抗体の作製 前記のようにして得たマイコプラズマ・ファーメンタン
スの脂質抽出物５０ｍｇに、モノフォスフェートリピド
Ａ（リビ・イムノケム・リサーチ社）５０μｇと、完全
アジュバント（ナカライテスク（株））５０μｇとを加
え、さらにミネラルオイル２５０μｌ加えて４００ｒｐ
ｍで２分間グラインドした。さらに０．１％(v/v)Tween
80を含むＰＢＳを２５０μｌ加えて４００ｒｐｍで２
分間グラインドして、脂質抽出物を含むエマルジョン
０．５ｍｌを得た。
【０１１２】上記の方法で調製したエマルジョンを、７
週齢のメスBALB/cマウスの皮下に１匹あたり０．５ｍｌ
注射した。初回免疫後２週間目と３週間目に、上記の方
法で調製した脂質抽出物を含むエマルジョンを１匹あた
り０．５ｍｌ腹腔内に注射した。
週齢のメスBALB/cマウスの皮下に１匹あたり０．５ｍｌ
注射した。初回免疫後２週間目と３週間目に、上記の方
法で調製した脂質抽出物を含むエマルジョンを１匹あた
り０．５ｍｌ腹腔内に注射した。
【０１１３】上記のようにして免疫したマウスの血液か
ら、常法によって血清を分離した。この血清を用いて以
下のように免疫染色を行った。ＧＧＰＬ陽性のＭＴ−４
細胞から、脂質画分を既知の方法(Bligh and Dyer, Ca
n. J. Biochem. Physiol. 37,911-917(1959))で抽出
し、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）プレー
ト（メルク社製）に脂質画分抽出物をアプライし、クロ
ロホルム：メタノール：0.2％(w/v)塩化カルシウム水溶
液＝50：45：10(v/v/v)の混合溶媒で展開した。このプ
レートを、ヘキサンに溶解した0.4％ポリイソブチルメ
タクリル酸塩に３０秒間浸した後、風乾した。
ら、常法によって血清を分離した。この血清を用いて以
下のように免疫染色を行った。ＧＧＰＬ陽性のＭＴ−４
細胞から、脂質画分を既知の方法(Bligh and Dyer, Ca
n. J. Biochem. Physiol. 37,911-917(1959))で抽出
し、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）プレー
ト（メルク社製）に脂質画分抽出物をアプライし、クロ
ロホルム：メタノール：0.2％(w/v)塩化カルシウム水溶
液＝50：45：10(v/v/v)の混合溶媒で展開した。このプ
レートを、ヘキサンに溶解した0.4％ポリイソブチルメ
タクリル酸塩に３０秒間浸した後、風乾した。
【０１１４】１次抗体として、上記の血清または免疫し
てないマウスの血清をＨＰＴＬＣプレートに添加して、
４℃下で一晩インキュベートした。ＰＢＳでＨＰＴＬＣ
プレートを洗った後、２次抗体としてペルオキシダーゼ
標識抗ウサギＩｇＧ抗体（カペル社製）をＨＰＴＬＣプ
レートに添加して、室温で４時間インキュベートした。
ＨＰＴＬＣプレートを純水で洗った後、抗原のバンドを
ペルオキシダーゼ発色キット（KONICA Immunostaining
HRPKit：コニカ社製）を用いて検出した。結果を図１５
に示す。この結果から上記の血清はＧＧＰＬ−Ｉおよび
ＧＧＰＬ−IIIに対するポリクローナル抗体を含むこと
が確認された。
てないマウスの血清をＨＰＴＬＣプレートに添加して、
４℃下で一晩インキュベートした。ＰＢＳでＨＰＴＬＣ
プレートを洗った後、２次抗体としてペルオキシダーゼ
標識抗ウサギＩｇＧ抗体（カペル社製）をＨＰＴＬＣプ
レートに添加して、室温で４時間インキュベートした。
ＨＰＴＬＣプレートを純水で洗った後、抗原のバンドを
ペルオキシダーゼ発色キット（KONICA Immunostaining
HRPKit：コニカ社製）を用いて検出した。結果を図１５
に示す。この結果から上記の血清はＧＧＰＬ−Ｉおよび
ＧＧＰＬ−IIIに対するポリクローナル抗体を含むこと
が確認された。
【０１１５】
【実施例３】 抗ＧＧＰＬ−IIIモノクローナル抗体の作
製 （１）ハイブリドーマの調製 実施例２と同様に、マイコプラズマ・ファーメンタンス
の脂質抽出物を含むエマルジョンを、７週齢のメスBALB
/cマウスの皮下に１匹あたり０．５ｍｌ注射した。初回
免疫後２週間目と３週間目に、上記の方法で調製した脂
質抽出物を含むエマルジョンを１匹あたり０．５ｍｌ腹
腔内に注射した。
製 （１）ハイブリドーマの調製 実施例２と同様に、マイコプラズマ・ファーメンタンス
の脂質抽出物を含むエマルジョンを、７週齢のメスBALB
/cマウスの皮下に１匹あたり０．５ｍｌ注射した。初回
免疫後２週間目と３週間目に、上記の方法で調製した脂
質抽出物を含むエマルジョンを１匹あたり０．５ｍｌ腹
腔内に注射した。
【０１１６】最終免疫の４日後にマウスから脾臓を摘出
し、RPMI1640培地を用いて細胞浮遊液を調製した。この
２×108個の脾細胞と、対数増殖期にあるマウスミエロ
ーマSP2/O細胞〔アザグアニン耐性、ＩｇＧ非分泌；ATC
C CRL-1581〕（２×107 個）とを混合し、遠沈後、沈渣
に45％ポリエチレングリコール（PEG4000（和光純薬
（株）製）１ｍｌを１分間かけてゆるやかに振盪しなが
ら加え、その後３７℃下でゆるやかに振盪しながら２分
間インキュベーションした。これに、RPMI1640培地１ｍ
ｌを１分間かけて加えてゆるやかに振盪し、同じく１ｍ
ｌを１分間かけて加えてゆるやかに振盪した後、更に８
ｍｌを３分間かけて加えた。
し、RPMI1640培地を用いて細胞浮遊液を調製した。この
２×108個の脾細胞と、対数増殖期にあるマウスミエロ
ーマSP2/O細胞〔アザグアニン耐性、ＩｇＧ非分泌；ATC
C CRL-1581〕（２×107 個）とを混合し、遠沈後、沈渣
に45％ポリエチレングリコール（PEG4000（和光純薬
（株）製）１ｍｌを１分間かけてゆるやかに振盪しなが
ら加え、その後３７℃下でゆるやかに振盪しながら２分
間インキュベーションした。これに、RPMI1640培地１ｍ
ｌを１分間かけて加えてゆるやかに振盪し、同じく１ｍ
ｌを１分間かけて加えてゆるやかに振盪した後、更に８
ｍｌを３分間かけて加えた。
【０１１７】上記細胞混合液を遠沈後、細胞を１０％仔
牛胎仔血清(FCS)を含むRPMI1640培地５０ｍｌに浮遊さ
せ、９６穴マイクロプレート４枚に、１ウェルあたり１
００μｌずつ分注し、炭酸ガスインキュベーター（５％
炭酸ガス、３７℃）中で培養した。２４時間後、培地を
ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン含有、１０％(v/v)FCS培地）に交換し、ひきつづき炭
酸ガスインキュベーター（５％炭酸ガス、３７℃）で培
養した。ＨＡＴ培地での培養開始後４日目に、新しいＨ
ＡＴ培地を１ウェルあたり１００μl追加した。ＨＡＴ
培地での培養開始後７日目にＨＴ培地（ＨＡＴ培地から
アミノプテリンを除いたもの）に交換し、その翌日に１
０％(v/v)ＦＣＳを含むRPMI1640培地に交換した後、コ
ロニー形成の有無をチェックした。
牛胎仔血清(FCS)を含むRPMI1640培地５０ｍｌに浮遊さ
せ、９６穴マイクロプレート４枚に、１ウェルあたり１
００μｌずつ分注し、炭酸ガスインキュベーター（５％
炭酸ガス、３７℃）中で培養した。２４時間後、培地を
ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン含有、１０％(v/v)FCS培地）に交換し、ひきつづき炭
酸ガスインキュベーター（５％炭酸ガス、３７℃）で培
養した。ＨＡＴ培地での培養開始後４日目に、新しいＨ
ＡＴ培地を１ウェルあたり１００μl追加した。ＨＡＴ
培地での培養開始後７日目にＨＴ培地（ＨＡＴ培地から
アミノプテリンを除いたもの）に交換し、その翌日に１
０％(v/v)ＦＣＳを含むRPMI1640培地に交換した後、コ
ロニー形成の有無をチェックした。
【０１１８】（２）抗体産生ハイブリドーマの選択 マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質画分２０μｇ
を１０ｍｌのエタノールに溶解した溶液を、９６穴マイ
クロプレートの１ウェルあたり５０μｌ加えた後、ドラ
イヤーで３０分間乾燥させた。１％(w/v)ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳを１ウェルあたり１００
μｌ加え、室温で１時間静置した。１ウェルあたり１０
０μｌの０．３Ｍショ糖溶液で５回洗った後、前記の培
養上清を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で６０分
間振盪した。０．０５％Tween 20溶液で各ウェルを洗っ
た後、ＰＢＳで５００倍希釈したペルオキシダーゼ標識
抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製製）を１ウェルあたり
５０μｌ加え、室温で６０分間振盪した。
を１０ｍｌのエタノールに溶解した溶液を、９６穴マイ
クロプレートの１ウェルあたり５０μｌ加えた後、ドラ
イヤーで３０分間乾燥させた。１％(w/v)ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳを１ウェルあたり１００
μｌ加え、室温で１時間静置した。１ウェルあたり１０
０μｌの０．３Ｍショ糖溶液で５回洗った後、前記の培
養上清を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で６０分
間振盪した。０．０５％Tween 20溶液で各ウェルを洗っ
た後、ＰＢＳで５００倍希釈したペルオキシダーゼ標識
抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製製）を１ウェルあたり
５０μｌ加え、室温で６０分間振盪した。
【０１１９】０．０５％Tween 20溶液で各ウェルを洗っ
た後、１０ｍｇオルトフェニレンジアミンおよび５０μ
ｌの３０％(v/v)過酸化水素水を含む１０ｍｌのクエン
酸緩衝液を１ウェルあたり１００μｌ加えて室温で１５
分間インキュベートした。１ウェルあたり１００μｌの
０．５Ｍ硫酸を加えてペルオキシダーゼの酵素反応を停
止させた後、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの
吸光度を測定した。抗体を産生するハイブリドーマにつ
いて限界希釈法によってクローニングを繰り返し、マイ
コプラズマ・ファーメンタンスの脂質画分を抗原に用い
たＥＬＩＳＡにより第一次スクリーニングを行い、ＥＬ
ＩＳＡ陽性のコロニーについては、さらにマイコプラズ
マ・ファーメンタンスの脂質画分のＨＰＴＬＣの免疫染
色により二次スクリーングを行い、ＧＧＰＬ−IIIに対
して反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ株ＭＦ−III−１株を得た。この株は、
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４３２４の受託番号で寄託されている。
た後、１０ｍｇオルトフェニレンジアミンおよび５０μ
ｌの３０％(v/v)過酸化水素水を含む１０ｍｌのクエン
酸緩衝液を１ウェルあたり１００μｌ加えて室温で１５
分間インキュベートした。１ウェルあたり１００μｌの
０．５Ｍ硫酸を加えてペルオキシダーゼの酵素反応を停
止させた後、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの
吸光度を測定した。抗体を産生するハイブリドーマにつ
いて限界希釈法によってクローニングを繰り返し、マイ
コプラズマ・ファーメンタンスの脂質画分を抗原に用い
たＥＬＩＳＡにより第一次スクリーニングを行い、ＥＬ
ＩＳＡ陽性のコロニーについては、さらにマイコプラズ
マ・ファーメンタンスの脂質画分のＨＰＴＬＣの免疫染
色により二次スクリーングを行い、ＧＧＰＬ−IIIに対
して反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ株ＭＦ−III−１株を得た。この株は、
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４３２４の受託番号で寄託されている。
【０１２０】（３）モノクローナル抗体の獲得 つづいてＭＦ−III−１株を、１０％(v/v)FCSを含むRPM
I1640培地中で培養し、その培養上清を回収することに
より、ＧＧＰＬ−IIIに対するモノクローナル抗体を得
た。
I1640培地中で培養し、その培養上清を回収することに
より、ＧＧＰＬ−IIIに対するモノクローナル抗体を得
た。
【０１２１】
【実施例４】モノクローナル抗体の免疫染色による評価 得られた抗ＧＧＰＬ−IIIモノクローナル抗体を用い
て、以下のように免疫染色を行った。各種マイコプラズ
マ（マイコプラズマ・ファーメンタンス ＧＧＰＬ株、
マイコプラズマ・ファーメンタンス インコグニタス(i
ncognitus)（ATCC53949）、マイコプラズマ・ファーメ
ンタンス ＰＧ１８株、マイコプラズマ・ファーメンタ
ンス Ｆ１７株、マイコプラズマ・ファーメンタンス Ｆ
１株、マイコプラズマ・ファーメンタンスＦ７株、マイ
コプラズマ・アルスリティディス(M. arthritidis)、マ
イコプラズマ・ホミニス(M. hominis)(ATCC 15488)）の
脂質画分を、既知の方法(Bligh and Dyer, Can. J. Bio
chem. Physiol. 37,911-917(1959))で抽出し、高速薄層
クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）プレート（メルク社
製）に脂質画分抽出物をアプライし、クロロホルム：メ
タノール：０．２％(w/v)塩化カルシウム水溶液＝５
０：４５：１０(v/v/v)の混合溶媒で展開した。
て、以下のように免疫染色を行った。各種マイコプラズ
マ（マイコプラズマ・ファーメンタンス ＧＧＰＬ株、
マイコプラズマ・ファーメンタンス インコグニタス(i
ncognitus)（ATCC53949）、マイコプラズマ・ファーメ
ンタンス ＰＧ１８株、マイコプラズマ・ファーメンタ
ンス Ｆ１７株、マイコプラズマ・ファーメンタンス Ｆ
１株、マイコプラズマ・ファーメンタンスＦ７株、マイ
コプラズマ・アルスリティディス(M. arthritidis)、マ
イコプラズマ・ホミニス(M. hominis)(ATCC 15488)）の
脂質画分を、既知の方法(Bligh and Dyer, Can. J. Bio
chem. Physiol. 37,911-917(1959))で抽出し、高速薄層
クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）プレート（メルク社
製）に脂質画分抽出物をアプライし、クロロホルム：メ
タノール：０．２％(w/v)塩化カルシウム水溶液＝５
０：４５：１０(v/v/v)の混合溶媒で展開した。
【０１２２】上記プレートを、ヘキサンに溶解した０．
４％(w/v)ポリイソブチルメタクリル酸塩に３０秒間浸
した後、風乾した。１次抗体として、上記の抗ＧＧＰＬ
−IIIモノクローナル抗体をＨＰＴＬＣプレートに添加
して、４℃下で一晩インキュベートした。ＰＢＳでＨＰ
ＴＬＣプレートを洗った後、２次抗体としてペルオキシ
ダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）をＨＰＴ
ＬＣプレートに添加して、室温で４時間インキュベート
した。ＨＰＴＬＣプレートを純水で洗った後、抗原のバ
ンドをペルオキシダーゼ発色キット（KONICA Immunosta
ining HRPKit：コニカ社製）で検出した。結果を図１６
に示す。
４％(w/v)ポリイソブチルメタクリル酸塩に３０秒間浸
した後、風乾した。１次抗体として、上記の抗ＧＧＰＬ
−IIIモノクローナル抗体をＨＰＴＬＣプレートに添加
して、４℃下で一晩インキュベートした。ＰＢＳでＨＰ
ＴＬＣプレートを洗った後、２次抗体としてペルオキシ
ダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）をＨＰＴ
ＬＣプレートに添加して、室温で４時間インキュベート
した。ＨＰＴＬＣプレートを純水で洗った後、抗原のバ
ンドをペルオキシダーゼ発色キット（KONICA Immunosta
ining HRPKit：コニカ社製）で検出した。結果を図１６
に示す。
【０１２３】この結果から、本発明のモノクローナル抗
体は、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖
リン脂質に特異的に結合し、マイコプラズマ・アルソリ
ティディス及びマイコプラズマ・ホミニスのリン脂質及
び糖脂質には結合しないことが明らかである。さらに、
ＨＰＴＬＣ上でディットマー試薬及びオルシノール試薬
で染色されたバンドのうち、ＧＭ２、ＧＭ１ａ、ＧＤ１
ａ、ホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンと同
定されているバンド及びＧＧＰＬ−Ｉのバンドは、免疫
染色においては認められず、本発明のモノクローナル抗
体はＧＧＰＬ−IIIのみに特異的に結合した。
体は、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖
リン脂質に特異的に結合し、マイコプラズマ・アルソリ
ティディス及びマイコプラズマ・ホミニスのリン脂質及
び糖脂質には結合しないことが明らかである。さらに、
ＨＰＴＬＣ上でディットマー試薬及びオルシノール試薬
で染色されたバンドのうち、ＧＭ２、ＧＭ１ａ、ＧＤ１
ａ、ホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンと同
定されているバンド及びＧＧＰＬ−Ｉのバンドは、免疫
染色においては認められず、本発明のモノクローナル抗
体はＧＧＰＬ−IIIのみに特異的に結合した。
【０１２４】次に、マイコプラズマ・ファーメンタンス
が感染したＭＴ−４細胞を、１次抗体として抗ＧＧＰＬ
−IIIモノクローナル抗体、２次抗体としてフルオロセ
インイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇ
Ｇ抗体で免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を図１
７に示す。
が感染したＭＴ−４細胞を、１次抗体として抗ＧＧＰＬ
−IIIモノクローナル抗体、２次抗体としてフルオロセ
インイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇ
Ｇ抗体で免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を図１
７に示す。
【０１２５】この結果から、本発明のモノクローナル抗
体を用いてマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出す
ることができることが明らかである。
体を用いてマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出す
ることができることが明らかである。
【０１２６】
【実施例５】腎炎患者の血液中のＧＧＰＬ−IIIまたは
ＧＧＰＬ−IIIに抗原性が類似した物質の検出 腎炎患者の血液および正常人の血液から、常法により調
製した血清それぞれ１００μｌに対し、既知の方法（Bl
igh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911-9
17 (1959)）に従い、それぞれ１００μｌのクロロホル
ム：メタノール（２：１、１：１及び１：２(V/V)）の
混合溶媒を用いて血清中の総脂質を抽出した。抽出溶媒
は３層に分かれ、そのうちの最下層を回収し、これを水
に対して透析し、凍結乾燥させた。このようにして得ら
れた試料を高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）
プレート（メルク社製）にアプライし、クロロホルム：
メタノール：０．２％（W/V）塩化カルシウム水溶液の
混合溶媒（５０：４５：１０(V/V/V)）で展開した。ま
た、標準物質として、精製したＧＧＰＬ−IIIを用いて
同様にＨＰＴＬＣプレートにアプライして展開した。
ＧＧＰＬ−IIIに抗原性が類似した物質の検出 腎炎患者の血液および正常人の血液から、常法により調
製した血清それぞれ１００μｌに対し、既知の方法（Bl
igh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911-9
17 (1959)）に従い、それぞれ１００μｌのクロロホル
ム：メタノール（２：１、１：１及び１：２(V/V)）の
混合溶媒を用いて血清中の総脂質を抽出した。抽出溶媒
は３層に分かれ、そのうちの最下層を回収し、これを水
に対して透析し、凍結乾燥させた。このようにして得ら
れた試料を高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）
プレート（メルク社製）にアプライし、クロロホルム：
メタノール：０．２％（W/V）塩化カルシウム水溶液の
混合溶媒（５０：４５：１０(V/V/V)）で展開した。ま
た、標準物質として、精製したＧＧＰＬ−IIIを用いて
同様にＨＰＴＬＣプレートにアプライして展開した。
【０１２７】上記プレートを、ヘキサンに溶解した０．
４％(w/v)ポリイソブチルメタクリル酸塩に３０秒間浸
した後、風乾した。１次抗体として、上記の抗ＧＧＰＬ
−IIIモノクローナル抗体をＨＰＴＬＣプレートに添加
して、４℃下で一晩インキュベートした。ＰＢＳでＨＰ
ＴＬＣプレートを洗った後、２次抗体としてペルオキシ
ダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）をＨＰＴ
ＬＣプレートに添加して、室温で４時間インキュベート
した。ＨＰＴＬＣプレートを純水で洗った後、抗原のバ
ンドをペルオキシダーゼ発色キット（KONICA Immunosta
ining HRPKit：コニカ社製）で検出した。
４％(w/v)ポリイソブチルメタクリル酸塩に３０秒間浸
した後、風乾した。１次抗体として、上記の抗ＧＧＰＬ
−IIIモノクローナル抗体をＨＰＴＬＣプレートに添加
して、４℃下で一晩インキュベートした。ＰＢＳでＨＰ
ＴＬＣプレートを洗った後、２次抗体としてペルオキシ
ダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）をＨＰＴ
ＬＣプレートに添加して、室温で４時間インキュベート
した。ＨＰＴＬＣプレートを純水で洗った後、抗原のバ
ンドをペルオキシダーゼ発色キット（KONICA Immunosta
ining HRPKit：コニカ社製）で検出した。
【０１２８】上記の方法で、腎炎患者の血清９検体およ
び正常人の血清９検体について行ったところ、腎炎患者
９検体のうち６検体についてはＧＧＰＬ−IIIの付近に
シグナルが認められた（図１８）。このシグナルは、正
常人の検体には検出されなかった（図１８）。腎炎患者
に高率に見られるこのシグナルは、ＨＰＴＬＣ上の位置
からはＧＧＰＬ−IIIとは異なっているが、抗原性が類
似した脂質であると考えられる。
び正常人の血清９検体について行ったところ、腎炎患者
９検体のうち６検体についてはＧＧＰＬ−IIIの付近に
シグナルが認められた（図１８）。このシグナルは、正
常人の検体には検出されなかった（図１８）。腎炎患者
に高率に見られるこのシグナルは、ＨＰＴＬＣ上の位置
からはＧＧＰＬ−IIIとは異なっているが、抗原性が類
似した脂質であると考えられる。
【０１２９】尚、上記のようにして脂質を抽出した後、
それぞれの凍結乾燥試料を、クロロホルム：メタノー
ル：水（８３：１６：０．５(V/V/V)）の混合溶媒に溶
解し、イアトロビーズ ６ＲＳ−８０６０（イアトロン
社製）をつめたイアトロビーズカラム（クロロホルム：
メタノール：水（８３：１６：０．５(V/V/V)）の混合
溶媒で平衡化したもの）にアプライし、クロロホルム：
メタノール：水の組成を変えて段階的に溶出させたもの
をＨＰＴＬＣにかけてもよい。
それぞれの凍結乾燥試料を、クロロホルム：メタノー
ル：水（８３：１６：０．５(V/V/V)）の混合溶媒に溶
解し、イアトロビーズ ６ＲＳ−８０６０（イアトロン
社製）をつめたイアトロビーズカラム（クロロホルム：
メタノール：水（８３：１６：０．５(V/V/V)）の混合
溶媒で平衡化したもの）にアプライし、クロロホルム：
メタノール：水の組成を変えて段階的に溶出させたもの
をＨＰＴＬＣにかけてもよい。
【０１３０】
【実施例６】精製ＧＧＰＬ−IIIを抗原としたＥＬＩＳ
Ａ法による、血清中の抗ＧＧＰＬ−III抗体の検出 実施例１で精製されたＧＧＰＬ−III ４０μｇを１０ｍ
ｌのエタノールに溶解した溶液を、９６穴マイクロプレ
ートの１ウェルあたり５０μｌ加えた後、ドライヤーで
３０分間乾燥させた。１％(w/v)ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含むＰＢＳを１ウェルあたり１００μｌ加
え、室温で１時間静置した。１ウェルあたり１００μｌ
の０．３Ｍショ糖溶液で５回洗った後、正常人、エイズ
（ＡＩＤＳ）患者、腎炎（nephritis）患者、ＨＴＬＶ
−Ｉ関連ミエロパチー（ＨＡＭ；HTLV-1 associated my
elopathy）患者それぞれの血液から常法によって調製し
た血清を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で６０分
間振盪した。０．０５％Tween 20溶液で各ウェルを洗っ
た後、ＰＢＳで２０００倍希釈したペルオキシダーゼ標
識抗ヒトＩｇＧ抗体（カペル社製）を１ウェルあたり５
０μｌ加え、室温で６０分間振盪した。
Ａ法による、血清中の抗ＧＧＰＬ−III抗体の検出 実施例１で精製されたＧＧＰＬ−III ４０μｇを１０ｍ
ｌのエタノールに溶解した溶液を、９６穴マイクロプレ
ートの１ウェルあたり５０μｌ加えた後、ドライヤーで
３０分間乾燥させた。１％(w/v)ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含むＰＢＳを１ウェルあたり１００μｌ加
え、室温で１時間静置した。１ウェルあたり１００μｌ
の０．３Ｍショ糖溶液で５回洗った後、正常人、エイズ
（ＡＩＤＳ）患者、腎炎（nephritis）患者、ＨＴＬＶ
−Ｉ関連ミエロパチー（ＨＡＭ；HTLV-1 associated my
elopathy）患者それぞれの血液から常法によって調製し
た血清を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で６０分
間振盪した。０．０５％Tween 20溶液で各ウェルを洗っ
た後、ＰＢＳで２０００倍希釈したペルオキシダーゼ標
識抗ヒトＩｇＧ抗体（カペル社製）を１ウェルあたり５
０μｌ加え、室温で６０分間振盪した。
【０１３１】０．０５％Tween 20溶液で各ウェルを洗っ
た後、１０ｍｇオルトフェニレンジアミンおよび５０μ
ｌの３０％(v/v)過酸化水素水を含む１０ｍｌのクエン
酸緩衝液を１ウェルあたり１００μｌ加えて室温で１５
分間インキュベートした。１ウェルあたり１００μｌの
０．５Ｍ硫酸を加えてペルオキシダーゼの酵素反応を停
止させた後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの
吸光度を測定した。
た後、１０ｍｇオルトフェニレンジアミンおよび５０μ
ｌの３０％(v/v)過酸化水素水を含む１０ｍｌのクエン
酸緩衝液を１ウェルあたり１００μｌ加えて室温で１５
分間インキュベートした。１ウェルあたり１００μｌの
０．５Ｍ硫酸を加えてペルオキシダーゼの酵素反応を停
止させた後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの
吸光度を測定した。
【０１３２】正常人血清４６検体、エイズ（ＡＩＤＳ）
患者血清１０検体、腎炎（nephritis）患者血清２２検
体、ＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパチー（ＨＡＭ；HTLV-1 a
ssociated myelopathy）患者血清９検体について上述の
方法で４５０ｎｍの吸光度を測定し、正常人をコントロ
ールとして、正常人よりも４５０ｎｍの吸光度が大きい
血清検体を、抗ＧＧＰＬ−III抗体陽性とした。結果を
表２に示す。
患者血清１０検体、腎炎（nephritis）患者血清２２検
体、ＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパチー（ＨＡＭ；HTLV-1 a
ssociated myelopathy）患者血清９検体について上述の
方法で４５０ｎｍの吸光度を測定し、正常人をコントロ
ールとして、正常人よりも４５０ｎｍの吸光度が大きい
血清検体を、抗ＧＧＰＬ−III抗体陽性とした。結果を
表２に示す。
【０１３３】
【表２】
【０１３４】表２から分かるように、正常人では４６検
体中１検体（２．２％）、エイズ患者では１０検体中８
検体（８０．０％）、腎炎患者では２２検体中３検体
（１３．８％）、ＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパチー患者で
は９検体中２検体（２２．２％）が、それぞれ血清中の
抗ＧＧＰＬ−III抗体陽性であった。また、前述の２次
抗体（ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体）のかわ
りにペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ抗体（カペル社
製）を用いて同様に調べた場合、腎炎患者の血清中の抗
ＧＧＰＬ−III抗体陽性率はさらに増加した。
体中１検体（２．２％）、エイズ患者では１０検体中８
検体（８０．０％）、腎炎患者では２２検体中３検体
（１３．８％）、ＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパチー患者で
は９検体中２検体（２２．２％）が、それぞれ血清中の
抗ＧＧＰＬ−III抗体陽性であった。また、前述の２次
抗体（ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体）のかわ
りにペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ抗体（カペル社
製）を用いて同様に調べた場合、腎炎患者の血清中の抗
ＧＧＰＬ−III抗体陽性率はさらに増加した。
【０１３５】
【発明の効果】本発明により、マイコプラズマ・ファー
メンタンス由来の新規グリセロ糖リン脂質、ＧＧＰＬ−
IIIが得られた。また、マイコプラズマ・ファーメンタ
ンス由来のグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有
する抗体、特に、ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIに対
して反応特異性を有するポリクローナル抗体、及びＧＧ
ＰＬ−IIIのみに対して反応特異性を有するモノクロー
ナル抗体が得られた。
メンタンス由来の新規グリセロ糖リン脂質、ＧＧＰＬ−
IIIが得られた。また、マイコプラズマ・ファーメンタ
ンス由来のグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有
する抗体、特に、ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIに対
して反応特異性を有するポリクローナル抗体、及びＧＧ
ＰＬ−IIIのみに対して反応特異性を有するモノクロー
ナル抗体が得られた。
【０１３６】本発明の抗体を用いることにより、マイコ
プラズマ・ファーメンタンスの特異的な検出が可能とな
り、エイズ等のレトロウイルス感染症の発症の予測、及
びリウマチの診断、腎炎の診断等への応用が期待され
る。
プラズマ・ファーメンタンスの特異的な検出が可能とな
り、エイズ等のレトロウイルス感染症の発症の予測、及
びリウマチの診断、腎炎の診断等への応用が期待され
る。
【０１３７】さらに、マイコプラズマ・ファーメンタン
スが複合感染する可能性の高いウイルスによる感染症の
治療または予防に使用できる可能性がある。
スが複合感染する可能性の高いウイルスによる感染症の
治療または予防に使用できる可能性がある。
【図１】 各種マイコプラズマの１６Ｓ−２３Ｓリボゾ
ームＲＮＡ遺伝子間スペーサ領域の第一段階ＰＣＲによ
る増幅産物の電気泳動の結果を示す図。 １：ＭＴ−４細胞から分離したマイコプラズマ・ファー
メンタンス ＧＧＰＬ株 ２：マイコプラズマ・ファーメンタンス ＰＧ１８ ３：マイコプラズマ・ヒオリニス ＤＢＳ１０５０ ４：マイコプラズマ・アルギニニ Ｇ２３０ ５：マイコプラズマ・オラレ ＣＨ１９２９９ ６：マイコプラズマ・サリバリウム ＰＧ２０ ７：マイコプラズマ・ペネトランス ＧＴＵ−５４−６
Ａ１ ８：ネガティブコントロール
ームＲＮＡ遺伝子間スペーサ領域の第一段階ＰＣＲによ
る増幅産物の電気泳動の結果を示す図。 １：ＭＴ−４細胞から分離したマイコプラズマ・ファー
メンタンス ＧＧＰＬ株 ２：マイコプラズマ・ファーメンタンス ＰＧ１８ ３：マイコプラズマ・ヒオリニス ＤＢＳ１０５０ ４：マイコプラズマ・アルギニニ Ｇ２３０ ５：マイコプラズマ・オラレ ＣＨ１９２９９ ６：マイコプラズマ・サリバリウム ＰＧ２０ ７：マイコプラズマ・ペネトランス ＧＴＵ−５４−６
Ａ１ ８：ネガティブコントロール
【図２】 マイコプラズマ・ファーメンタンスの１６Ｓ
−２３ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子間スペーサ領域の第二
段階ＰＣＲによる増幅産物を各種制限酵素で消化した断
片の電気泳動の結果を示す図。１．VspI，２．HindII
I，３．ClaI，４．HincII，５．HaeIII，６．無処理
−２３ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子間スペーサ領域の第二
段階ＰＣＲによる増幅産物を各種制限酵素で消化した断
片の電気泳動の結果を示す図。１．VspI，２．HindII
I，３．ClaI，４．HincII，５．HaeIII，６．無処理
【図３】 マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質画
分に含まれるリン脂質のＴＬＣパターン（デンシトメト
リー）を示す図。
分に含まれるリン脂質のＴＬＣパターン（デンシトメト
リー）を示す図。
【図４】 マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染し
た又は非感染のＭＴ−４細胞の脂質画分に含まれるリン
脂質及び糖脂質のＴＬＣパターンを示す図。ＰＣはホス
ファチジルコリンを、ＳＰＭはスフィンゴミエリンを各
々表す。
た又は非感染のＭＴ−４細胞の脂質画分に含まれるリン
脂質及び糖脂質のＴＬＣパターンを示す図。ＰＣはホス
ファチジルコリンを、ＳＰＭはスフィンゴミエリンを各
々表す。
【図５】 ＧＧＰＬ−IIIの赤外線吸収スペクトルを示
す図。
す図。
【図６】 ＧＧＰＬ−IIIの（＋）法による液体２次イ
オン質量スペクトルを示す図。
オン質量スペクトルを示す図。
【図７】 ＧＧＰＬ−IIIの（−）法による液体２次イ
オン質量スペクトルを示す図。
オン質量スペクトルを示す図。
【図８】 ＧＧＰＬ−IIIの（＋）法によるタンデムマ
ススペクトルを示す図。
ススペクトルを示す図。
【図９】 ＧＧＰＬ−IIIの（−）法によるタンデムマ
ススペクトルを示す図。
ススペクトルを示す図。
【図１０】 一次元1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図。
【図１１】 ３−アミノプロパン−１，２−ジオール
（１−アミノプロパン−２，３−ジオール）（Ａ）およ
び２−アミノプロパン−１，３−ジオールの一次元1Ｈ
ＮＭＲスペクトル（Ｂ）を示す図。
（１−アミノプロパン−２，３−ジオール）（Ａ）およ
び２−アミノプロパン−１，３−ジオールの一次元1Ｈ
ＮＭＲスペクトル（Ｂ）を示す図。
【図１２】 ＧＧＰＬ−IIIのＰＨ−ＤＱＦ−ＣＯＳＹ
法による二次元の1ＨＮＭＲスペクトルを示す図。
法による二次元の1ＨＮＭＲスペクトルを示す図。
【図１３】 ＧＧＰＬ−IIIの二次元1Ｈ−31Ｐ ＮＭＲ
スペクトルを示す図。
スペクトルを示す図。
【図１４】 各種マイコプラズマの脂質画分に含まれる
リン脂質のＴＬＣの結果（ディットマー試薬で染色）を
示す図。 １．マイコプラズマ・ファーメンタンス ＧＧＰＬ株 ２．マイコプラズマ・ファーメンタンス インコグニタ
ス ３．マイコプラズマ・ファーメンタンス ＰＧ１８株 ４．マイコプラズマ・ファーメンタンス Ｆ１７株 ５．マイコプラズマ・ファーメンタンス Ｆ１株 ６．マイコプラズマ・ファーメンタンスＦ７株 ７．マイコプラズマ・アルスリティディス ８．マイコプラズマ・ホミニス
リン脂質のＴＬＣの結果（ディットマー試薬で染色）を
示す図。 １．マイコプラズマ・ファーメンタンス ＧＧＰＬ株 ２．マイコプラズマ・ファーメンタンス インコグニタ
ス ３．マイコプラズマ・ファーメンタンス ＰＧ１８株 ４．マイコプラズマ・ファーメンタンス Ｆ１７株 ５．マイコプラズマ・ファーメンタンス Ｆ１株 ６．マイコプラズマ・ファーメンタンスＦ７株 ７．マイコプラズマ・アルスリティディス ８．マイコプラズマ・ホミニス
【図１５】 ＨＰＴＬＣで分離したＭＴ−４細胞の脂質
画分を実施例２のポリクローナル抗体を用いて免疫染色
した結果を示す図。
画分を実施例２のポリクローナル抗体を用いて免疫染色
した結果を示す図。
【図１６】 ＨＰＴＬＣで分離した各種マイコプラズマ
の脂質画分を実施例３のモノクローナル抗体を用いて免
疫染色した結果を示す図。（数字は図１４と同じ。）
の脂質画分を実施例３のモノクローナル抗体を用いて免
疫染色した結果を示す図。（数字は図１４と同じ。）
【図１７】 マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染
したＭＴ−４細胞を本発明のモノクローナル抗体を用い
て免疫染色した結果を示す写真（生物の形態）。
したＭＴ−４細胞を本発明のモノクローナル抗体を用い
て免疫染色した結果を示す写真（生物の形態）。
【図１８】 ＨＰＴＬＣで分離した腎炎患者および正常
人の血液から抽出した脂質を実施例３のモノクローナル
抗体を用いて免疫染色した結果を示す図（クロマトグラ
フ）。nephritis patientsは腎炎患者の血液から抽出し
た脂質、normal individualsは正常人の血液から抽出し
た脂質についての結果を示す。
人の血液から抽出した脂質を実施例３のモノクローナル
抗体を用いて免疫染色した結果を示す図（クロマトグラ
フ）。nephritis patientsは腎炎患者の血液から抽出し
た脂質、normal individualsは正常人の血液から抽出し
た脂質についての結果を示す。
【手続補正書】
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成７年６月１４日
【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所
工業技術研究所
【旧受託番号】 微工研菌寄第ＦＥＲＭ Ｐ−１
４３２４
４３２４
【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所
工業技術研究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−５１１５
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｚ 7432−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (25)
- 【請求項１】 以下の性質を有する、マイコプラズマ・
ファーメンタンスから抽出され得るグリセロ糖リン脂
質。 （Ａ）オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲン
ドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。 （Ｂ）アルカリで分解される。 （Ｃ）ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体
による分画において非吸着画分として得られる。 （Ｄ）質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋
２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である。 - 【請求項２】 α−グルコピラノシル−（１’−３）−
１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール、ホスホコリン
及びアミノプロパンジオールのリン酸エステルを構成成
分とする請求項１記載のグリセロ糖リン脂質。 - 【請求項３】 少なくともホスホコリン、グルコース、
脂肪酸及びグリセロールを含み、ジエチルアミノエチル
基を有する陰イオン交換体に対して非吸着性の脂質であ
り、アルカリに不安定であるグリセロ糖リン脂質に対し
て反応特異性を有する抗グリセロ糖リン脂質抗体。 - 【請求項４】 前記グリセロ糖リン脂質が、マイコプラ
ズマ・ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ糖
リン脂質である請求項３記載の抗グリセロ糖リン脂質抗
体。 - 【請求項５】 ６’−Ｏ−ホスホコリン−α−グルコピ
ラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グ
リセロールと、請求項１記載のグリセロ糖リン脂質との
両方と反応する請求項３または４に記載の抗グリセロ糖
リン脂質抗体。 - 【請求項６】 ポリクローナル抗体である請求項３〜５
のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。 - 【請求項７】 請求項１記載のグリセロ糖リン脂質のみ
に対して反応特異性を有する請求項３または４に記載の
抗グリセロ糖リン脂質抗体。 - 【請求項８】 モノクローナル抗体またはそのフラグメ
ントである請求項３、４、５または７のいずれか一項に
記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。 - 【請求項９】 マイコプラズマ・ファーメンタンスを特
異的に認識し、他種のマイコプラズマを認識しない請求
項３記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。 - 【請求項１０】 前記他種のマイコプラズマが、マイコ
プラズマ・アルソリティディス及びマイコプラズマ・ホ
ミニスである請求項９記載の抗グリセロ糖リン脂質抗
体。 - 【請求項１１】 シアル酸含有糖脂質（ガングリオシ
ド）、血小板活性化因子（１−アルキル−２−アセチル
グリセロ−３−ホスホコリン）もしくはその部分脱アシ
ル化物、ホスファチジルコリンもしくはその部分脱アシ
ル化物、またはスフィンゴミエリンに交差反応を示さな
い請求項４記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。 - 【請求項１２】 検体中の以下の性質を有するグリセロ
糖リン脂質を、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の
抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いて免疫学的に測定する
ことを特徴とするグリセロ糖リン脂質の測定法；少なく
ともホスホコリン、グルコース、脂肪酸及びグリセロー
ルを含み、ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交
換体に対して非吸着性の脂質であり、アルカリに不安定
であるグリセロ糖リン脂質。 - 【請求項１３】 検体中に含まれる請求項１記載のグリ
セロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質を、請求項３〜
１１のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体
を用いて免疫学的に測定することを特徴とするグリセロ
糖リン脂質に抗原性が類似した物質の測定法。 - 【請求項１４】 検体中のマイコプラズマ・ファーメン
タンスに特異的に存在するグリセロ糖リン脂質を、請求
項３〜１１のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂
質抗体を用いて免疫学的に測定することを特徴とするグ
リセロ糖リン脂質の測定法。 - 【請求項１５】 請求項３〜１１のいずれか一項に記載
の抗グリセロ糖リン脂質抗体が結合した固相に検体液を
接触させて検体液中に含まれるグリセロ糖リン脂質を前
記抗体に結合させ、非吸着成分を固相から分離除去し、
次いで、標識物質で標識化したマイコプラズマ・ファー
メンタンスのグリセロ糖リン脂質を前記固相に接触さ
せ、前記検体液中に含まれるグリセロ糖リン脂質と標識
化したグリセロ糖リン脂質とを競合反応させ、固相に結
合した標識物質または固相に結合しない標識物質のいず
れかを検出することを特徴とする検体中のグリセロ糖リ
ン脂質の測定法。 - 【請求項１６】 請求項１記載のグリセロ糖リン脂質が
結合した固相に検体液を接触させて検体液中に含まれる
抗グリセロ糖リン脂質抗体を前記グリセロ糖リン脂質に
結合させ、非吸着成分を固相から分離除去し、次いで、
抗ヒトイムノグロブリン抗体を標識物質で標識化した二
次抗体を反応させ、標識物質を検出することを特徴とす
る検体中の抗グリセロ糖リン脂質抗体の測定法。 - 【請求項１７】 検体中のグリセロ糖リン脂質を、請求
項１４または１５記載の測定法によって測定し、このグ
リセロ糖リン脂質の存否またはその存在量と検体中のマ
イコプラズマ・ファーメンタンスの存否またはその存在
量とを関連づけることを特徴とするマイコプラズマ・フ
ァーメンタンスの検出法。 - 【請求項１８】 前記検体中のグリセロ糖リン脂質が、
生体由来の検体から抽出した脂質画分である請求項１７
記載のマイコプラズマ・ファーメンタンスの検出法。 - 【請求項１９】 生体由来の検体が、血液、血清、血
漿、脳脊髄液、尿、関節液または細胞培養液である請求
項１８記載のマイコプラズマ・ファーメンタンスの検出
法。 - 【請求項２０】 検体から脂質画分を抽出し、該脂質抽
出物を固相と接触させて脂質を吸着させ、脂質が吸着し
た固相と請求項３〜１１のいずれか一項に記載の抗グリ
セロ糖リン脂質抗体を反応させ、同時またはその後に、
前記抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調
製した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を
標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、標識物質を
検出することを特徴とする検体中のマイコプラズマ・フ
ァーメンタンスの検出法。 - 【請求項２１】 生体組織または細胞を、そのまま又は
グリセロ糖リン脂質の固定処理を施した後、標識物質で
標識化した請求項３〜１１のいずれか一項に記載の抗グ
リセロ糖リン脂質抗体と反応させ、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンスが感染した生体組織または細胞に標識化
抗体を結合させ、標識物質を測定することを特徴とする
マイコプラズマ・ファーメンタンスの検出法。 - 【請求項２２】 生体組織または細胞を、そのまま又は
グリセロ糖リン脂質の固定処理を施した後、請求項３〜
１１のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体
を反応させ、同時またはその後に、前記抗体の調製に用
いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前記免疫動物
のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化し
た二次抗体を反応させ、マイコプラズマ・ファーメンタ
ンスが感染した生体組織または細胞に標識化二次抗体を
結合させ、標識物質を測定することを特徴とするマイコ
プラズマ・ファーメンタンスの検出法。 - 【請求項２３】 免疫学的方法により検体中のマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスまたはマイコプラズマ・ファ
ーメンタンスのグリセロ糖リン脂質を検出するための試
薬キットであって、請求項３〜１１のいずれか一項に記
載の抗グリセロ糖リン脂質抗体と、標識物質で標識化し
たマイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン
脂質とを含むことを特徴とする試薬キット。 - 【請求項２４】 免疫学的方法により検体中のマイコプ
ラズマ・ファーメンタンスまたはマイコプラズマ・ファ
ーメンタンスのグリセロ糖リン脂質を検出するための試
薬キットであって、請求項３〜１１のいずれか一項に記
載の抗グリセロ糖リン脂質抗体と、前記抗体の調製に用
いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前記免疫動物
のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化し
た二次抗体とを含むことを特徴とする試薬キット。 - 【請求項２５】 血液中に含まれる、請求項１記載のグ
リセロ糖リン脂質もしくはこのグリセロ糖リン脂質に抗
原性が類似した物質、またはこれらのグリセロ糖リン脂
質に対して反応特異性を有する抗体を検出することを特
徴とする、エイズ、腎炎及びＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパ
チーから選ばれる疾病の検出法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28603894A JP3735388B2 (ja) | 1994-06-03 | 1994-10-26 | 新規グリセロ糖リン脂質とその抗体及びマイコプラズマの検出法 |
| KR1019960706894A KR970703352A (ko) | 1994-06-03 | 1995-06-02 | 신규글리세로당인지질과 그 항체 및 마이코플라즈마검출법 |
| DE69533286T DE69533286T2 (de) | 1994-06-03 | 1995-06-02 | Neues glyceroglycophospholipid, antikörper dagegen und verfahren zur detektion von mycoplasma |
| PCT/JP1995/001091 WO1995033758A1 (fr) | 1994-06-03 | 1995-06-02 | Nouveau glyceroglycophospholipide, anticorps contre ce compose et procede de detection de mycoplasme |
| EP95920247A EP0767176B1 (en) | 1994-06-03 | 1995-06-02 | Novel glyceroglycophospholipid, antibody there against, and method of detecting mycoplasma |
| AU25761/95A AU698248B2 (en) | 1994-06-03 | 1995-06-02 | Novel glycoglycerophospholipid, antibody thereagainst, and method for detecting mycoplasma |
| US08/750,677 US5994090A (en) | 1994-06-03 | 1995-06-02 | Glycoglycerophospholipid, antibody thereagainst, and method for detecting mycoplasma |
| CA2191884A CA2191884C (en) | 1994-06-03 | 1995-06-02 | Novel glycoglycerophospholipid, antibody thereagainst, and method for detecting mycoplasma |
| US09/349,824 US6376203B1 (en) | 1994-06-03 | 1999-07-08 | Glycoglycerophospholipid, antibody thereagainst, and method for detecting mycoplasma |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-145537 | 1994-06-03 | ||
| JP14553794 | 1994-06-03 | ||
| JP28603894A JP3735388B2 (ja) | 1994-06-03 | 1994-10-26 | 新規グリセロ糖リン脂質とその抗体及びマイコプラズマの検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0848693A true JPH0848693A (ja) | 1996-02-20 |
| JP3735388B2 JP3735388B2 (ja) | 2006-01-18 |
Family
ID=26476622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28603894A Expired - Fee Related JP3735388B2 (ja) | 1994-06-03 | 1994-10-26 | 新規グリセロ糖リン脂質とその抗体及びマイコプラズマの検出法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5994090A (ja) |
| EP (1) | EP0767176B1 (ja) |
| JP (1) | JP3735388B2 (ja) |
| KR (1) | KR970703352A (ja) |
| AU (1) | AU698248B2 (ja) |
| CA (1) | CA2191884C (ja) |
| DE (1) | DE69533286T2 (ja) |
| WO (1) | WO1995033758A1 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007145361A1 (ja) * | 2006-06-14 | 2007-12-21 | M Bio Technology Inc. | マススペクトロメーターを用いた脂質抗原検出法 |
| WO2010126146A1 (ja) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Tanaka Noriaki | 腎疾患重篤度を判定する方法又は装置若しくはその作動方法 |
| JP5212973B2 (ja) * | 2005-08-22 | 2013-06-19 | 国立大学法人名古屋大学 | 糖脂質誘導体合成中間体及びその製造方法、並びに糖脂質誘導体及びその製造方法 |
| JP5968622B2 (ja) * | 2009-06-04 | 2016-08-10 | 国立感染症研究所長 | マイコプラズマ感染症用ワクチン |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19652586A1 (de) * | 1996-12-17 | 1998-06-18 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Dhc-Peptid und Mittel |
| US7250494B2 (en) * | 1998-06-15 | 2007-07-31 | Biosynexus Incorporated | Opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of Gram positive bacteria |
| GB0022017D0 (en) * | 2000-09-08 | 2000-10-25 | Univ Dundee | Cell assays |
| US20040091503A1 (en) * | 2002-08-20 | 2004-05-13 | Genitrix, Llc | Lectin compositions and methods for modulating an immune response to an antigen |
| US7408075B1 (en) * | 2005-03-23 | 2008-08-05 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Synthesis of phosphocholine ester derivatives and conjugates thereof |
| US7855051B2 (en) * | 2005-09-12 | 2010-12-21 | Research & Diagnostic Systems, Inc. | Mycoplasma detection method and composition |
| RU2484095C1 (ru) * | 2011-12-30 | 2013-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Технофарма" | НАНОАНТИТЕЛА aMh1, aMh2, СВЯЗЫВАЮЩИЕ АНТИГЕН MYCOPLASMA HOMINIS, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ MYCOPLASMA HOMINIS |
| RU2562158C2 (ru) * | 2013-12-02 | 2015-09-10 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России) | Рекомбинантная псевдоаденовирусная частица, продуцирующая модифицированные наноантитела, узнающие микоплазму m.hominis, фармацевтическая композиция на ее основе и способ ее использования для терапии микоплазмозов |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4945041A (en) | 1983-11-17 | 1990-07-31 | Board Of Regents | Monoclonal antibodies for Mycoplasma pneumoniae and use for diagnosis of pneumonia |
| US4666851A (en) | 1985-04-25 | 1987-05-19 | Lee Sin H | Specific mycoplasma membrane antigen and antibody and their clinical applications |
| US5242820A (en) * | 1986-06-18 | 1993-09-07 | American Registry Of Pathology | Pathogenic mycoplasma |
| US5158870A (en) | 1986-07-28 | 1992-10-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Diagnostic methods for mycoplasma genitalium infections |
| US5332567A (en) | 1989-08-24 | 1994-07-26 | Immunomedics | Detection and treatment of infections with immunoconjugates |
-
1994
- 1994-10-26 JP JP28603894A patent/JP3735388B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-06-02 DE DE69533286T patent/DE69533286T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-02 AU AU25761/95A patent/AU698248B2/en not_active Ceased
- 1995-06-02 KR KR1019960706894A patent/KR970703352A/ko not_active Application Discontinuation
- 1995-06-02 WO PCT/JP1995/001091 patent/WO1995033758A1/ja active IP Right Grant
- 1995-06-02 EP EP95920247A patent/EP0767176B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-02 US US08/750,677 patent/US5994090A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-02 CA CA2191884A patent/CA2191884C/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-07-08 US US09/349,824 patent/US6376203B1/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5212973B2 (ja) * | 2005-08-22 | 2013-06-19 | 国立大学法人名古屋大学 | 糖脂質誘導体合成中間体及びその製造方法、並びに糖脂質誘導体及びその製造方法 |
| WO2007145361A1 (ja) * | 2006-06-14 | 2007-12-21 | M Bio Technology Inc. | マススペクトロメーターを用いた脂質抗原検出法 |
| JP5265357B2 (ja) * | 2006-06-14 | 2013-08-14 | エム バイオ テック株式会社 | マススペクトロメーターを用いた脂質抗原検出法 |
| WO2010126146A1 (ja) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Tanaka Noriaki | 腎疾患重篤度を判定する方法又は装置若しくはその作動方法 |
| JP5197846B2 (ja) * | 2009-04-30 | 2013-05-15 | 紀陽 田仲 | 腎疾患重篤度を判定する方法又は装置若しくはその作動方法 |
| JP5968622B2 (ja) * | 2009-06-04 | 2016-08-10 | 国立感染症研究所長 | マイコプラズマ感染症用ワクチン |
| JP2016172754A (ja) * | 2009-06-04 | 2016-09-29 | 国立感染症研究所長 | マイコプラズマ感染症用ワクチン |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR970703352A (ko) | 1997-07-03 |
| WO1995033758A1 (fr) | 1995-12-14 |
| AU698248B2 (en) | 1998-10-29 |
| JP3735388B2 (ja) | 2006-01-18 |
| CA2191884A1 (en) | 1995-12-14 |
| DE69533286T2 (de) | 2005-10-06 |
| CA2191884C (en) | 2010-04-20 |
| US6376203B1 (en) | 2002-04-23 |
| EP0767176B1 (en) | 2004-07-21 |
| AU2576195A (en) | 1996-01-04 |
| DE69533286D1 (de) | 2004-08-26 |
| EP0767176A4 (en) | 1998-05-06 |
| US5994090A (en) | 1999-11-30 |
| EP0767176A1 (en) | 1997-04-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3735388B2 (ja) | 新規グリセロ糖リン脂質とその抗体及びマイコプラズマの検出法 | |
| US20050043514A1 (en) | Monoclonal antibody recognizing phosphatidylinositol-3,4-diphosphate | |
| JP4646985B2 (ja) | マイコプラズマ・ニューモニエのグリセロ型糖脂質抗原 | |
| US7276375B2 (en) | Monoclonal antibody recognizing phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate | |
| Ferretti et al. | Putative cholinergic‐specific gangliosides in guinea pig forebrain | |
| Bonafede et al. | Isolation and characterization of ganglioside 9‐O‐acetyl‐GD3 from bovine buttermilk | |
| US20030096790A1 (en) | Antibacterials diasccharide derivatives | |
| Nastainczyk et al. | Isolation and characterization of a monoclonal anti-protein kinase CK2 β-subunit antibody of the IgG class for the direct detection of CK2 β-subunit in tissue cultures of various mammalian species and human tumors | |
| JP2010156699A (ja) | ヤドリギレクチンに対する個体の応答性を判定する方法 | |
| Morrison-Plummer et al. | An ELISA to detect monoclonal antibodies specific for lipid determinants of Mycoplasma pneumoniae | |
| JPS61185183A (ja) | 膣トリコモナスに対して細胞溶解性のモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリツド細胞系統 | |
| Mutsumi et al. | Immunogenic properties of mannose-containing ceramide tetrasaccharide from fresh-water bivalve, Hyriopsis schlegelii | |
| JP2002243737A (ja) | 抗スフィンゴ脂質モノクローナル抗体 | |
| JP3009159B2 (ja) | 抗フォスファチジルコリンモノクローナル抗体および該抗体の製造方法 | |
| JPH07278175A (ja) | ホスホリルコリン含有グリセロ糖脂質化合物 | |
| Clausen et al. | Antibody-mediated immunochemistry and immunoassay in plant-related diseases | |
| JP4230282B2 (ja) | グラム陽性菌由来で免疫増強活性を有する複合糖質の活性を抑制する抗体、およびその利用 | |
| JPH07278174A (ja) | ホスホリルコリン含有グリセロ糖脂質化合物 | |
| JPH03197865A (ja) | フォスファチジルコリンの測定法 | |
| JPH02490A (ja) | モノクローナル抗体の製造方法 | |
| JPH07116238B2 (ja) | 抗ガングリオシドＧＤ１ａ単クローン性抗体ＭＺ、これを産生する細胞及びこれから成る試薬 | |
| JPH06253888A (ja) | モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び過酸化アシルグリセロールの測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050208 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050411 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20050413 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050411 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050413 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050927 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20051024 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S303 | Written request for registration of pledge or change of pledge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R316303 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091028 Year of fee payment: 4 |
|
| S803 | Written request for registration of cancellation of provisional registration |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R316805 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091028 Year of fee payment: 4 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091028 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101028 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101028 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111028 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121028 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121028 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131028 Year of fee payment: 8 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |