DE69533286T2 - Neues glyceroglycophospholipid, antikörper dagegen und verfahren zur detektion von mycoplasma - Google Patents

Neues glyceroglycophospholipid, antikörper dagegen und verfahren zur detektion von mycoplasma Download PDF

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    • G01N33/56933—Mycoplasma

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues aus Mycoplasma fermentans stammendes Glycoglycerophospholipid, einen Antikörper gegen das speziell in Mycoplasma fermentans vorhandene Glycoglycerophospholipid, ein Verfahren zur Messung des Glycoglycerophospholipids, welches auf der Verwendung des Antikörpers basiert, und ein Verfahren zum Nachweis von Mycoplasma fermentans.
  • Stand der Technik
  • Die vorliegenden Erfinder haben schon fünf Spezies von Glycoglycerophospholipiden (Phosphocholin enthaltende Glycoglycerolipide) aus MT-4-Zellen gefunden (menschliche T-Helfer-Zellen, die mit HTLV-I (menschlicher T-lymphotropischer Retrovirus Typ I) infiziert sind, Miyoshi et al., Gann., 71, 155–156 (1980)). Die vorliegenden Erfinder haben bisher herausgefunden, dass eine der fünf Spezies der Glycoglycerophospholipide ein 6'-O-Phosphocholin-α-Glucopyranosyl-(1'-3)-1,2-Diacyl-sn-Glycerol ist (Shishitsu-Seikagaku-Kenkyu (Studies on Lipid Biochemistry), Vol. 35, pp. 111–114, 1993).
  • Das J. Glycoconjugate (1993), Vol. 10, page 340, Abstract No. S19–24 offenbart die Glycolipid-Zusammensetzungen der HTLV-1 infizierten Zelllinien, MT-2, MT-4 und MT-4/HIV. Die Struktur von GGPL-III wurde beschrieben.
  • Auf der anderen Seite ist es berichtet worden, dass Mycoplasma fermentans ein Verschlimmerungsfaktor des menschlichen erworbenen Immunschwäche-Syndroms (AIDS) ist (Lo. S.,–C. et al., 1991, Science, 251: 1074–1076; US-amerikanisches Patent No. 5,242,820) oder dass Mycoplasma fermentans eine Ursache für Rheumatismus ist (Williams, M. H. et al., 1970, Lancet ii: 277–280).
  • Verschiedene Antikörper gegen Mycoplasmen sind bisher bekannt geworden und sie sind auch für die klinische Untersuchung verwendet worden. Die Mehrheit von diesen sind jedoch Antikörper gegen Mycoplasma pneumoniae oder Mycoplasma genitalium. Auch monoklonale Antikörper gegen diese Mycoplasmen sind hergestellt worden. Es wird jedoch vermutet, dass solch ein Antikörper ein Antikörper ist, der ein Protein von einem Mycoplasma erkennt oder gleichzeitig ein Protein und ein Lipid von einem Mycoplasma erkennt. Des Weiteren zeigt keiner diese Antikörper eine Spezifität zu Mycoplasma fermentans (japanische Patentoffenlegungen Nr. 62-298, 63-184064, 63-32496 und 5-304990 und US-amerikanische Patente Nr. 5,158,870, 4,945,041 und 5,242,820). Ein Antikörper, der eine Spezifität zu Mycoplasma fermentans zeigt, ist im US-amerikanischen Patent Nr. 5,242,820 offenbart. Dieser Antikörper wird jedoch unter Verwendung eines Gesamtextraktes aus mycoplasmalen Zellen als ein Immunogen verwendet und deshalb wird dieser Antikörper als ein Antikörper betrachtet, der ein Protein erkennt. Wenn dementsprechend ein Mycoplasma, das in einer Körperflüssigkeit wie z. B. einem Serum, das verschiedene Proteine enthält, enthalten ist, unter Verwendung dieses Antikörpers nachgewiesen wird, bindet der Antikörper höchstwahrscheinlich nicht spezifisch. Es darf daher unmöglich sein, eine hohe Sensitivität zu erwarten. Wenn des Weiteren ein Antigen ein Protein ist, wird es zureichend vermutet, dass die Antigenität durch eine Mutation in einer Aminosequenz des Proteins verloren geht.
  • Soweit die vorliegenden Erfinder wissen, ist es noch nicht berichtet worden, dass irgendein Mycoplasma ein Glycoglycerophospholipid aufweist, das Phosphocholin enthält. Es ist des Weiteren kein Fall bekannt geworden, in dem ein aus einem Mycoplasma stammendes Glycoglycerophospholipid als ein Immunogen verwendet wird, um einen Antikörper zu erhalten, der eine Spezifität zu dem Glycoglycerophospholipid zeigt. Es ist darüber hinaus überhaupt auch nicht bekannt geworden, dass der Antikörper, der die Spezifität zu dem Glycoglycerophospholipid zeigt, eine hohe Spezifität zu Mycoplasma fermentans zeigt.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Es ist berichtet worden, dass der Pathologieverlauf eines mit einem menschlichen Immunschwäche-Virus infizierten Patienten, um zu AIDS zu gelangen, durch die Infektion mit einem Mycoplasma beschleunigt wird (1991, Science, 251: 4991). Es ist auch berichtet worden, dass, wie oben beschrieben, Mycoplasma fermentans ein Verschlimmerungsfaktor von AIDS ist. Es gibt jedoch keine Mittel, um ein solches Verhalten von Mycoplasma fermentans in vivo korrekt nachzuweisen. Es ist daher erwünscht worden, einen Antikörper bereitzustellen, der zum immunologischen Nachweis von Mycoplasma fermentans in vivo geeignet ist.
  • Die vorliegende Erfindung ist in Anbetracht auf einen wie oben beschriebenen Gesichtspunkt ausgeführt worden, wobei es deren Ziel ist, ein speziell in Mycoplasma fermentans vorhandenes Glycoglycerophospholipid aufzuklären und einen Antikörper gegen das Glycoglycerophospholipid, ein Verfahren zur Messung des Glycoglycerophospholipids basierend auf der Verwendung des Antikörpers und ein Verfahren zum Nachweis von Mycoplasma fermentans bereitzustellen.
  • Um die anomale Proliferation von Zellen, die Zerstörung von Zellen und die durch die Infektion mit einem Retrovirus verursachte immunologische Anomalie aufzuklären, haben die vorliegenden Erfinder Lipide aus solchen infizierten Zellen analysiert. Die vorliegenden Erfinder haben während diesem Vorgang bestätigt, dass ein aus einem menschlichen T-Helfer-Zell-Stamm extrahiertes Glycoglycerophospholipid (ein Phosphocholin enthaltendes Glycoglycerolipid) unerwartet ein aus Mycooplasma fermentans stammendes Glycoglycerophospholipid ist (ein Phosphocholin enthaltendes Glycoglycerophospholipid: nachstehend zur Vereinfachung als „Glycoglycerophospholipid" bezeichnet). Die vorliegenden Erfinder haben des Weiteren eine Struktur des Lipids aufgeklärt. Die vorliegenden Erfinder haben darüber hinaus einen Antikörper gegen das Lipid hergestellt und die Spezifität zu verschiedenen Mycoplasmen bestätigt. Als ein Ergebnis haben die vorliegenden Erfinder herausgefunden, dass der Antikörper spezifisch Mycoplasma fermentans erkennt. Auf diese Weise ist die vorliegende Erfindung vollendet worden.
  • Und zwar liegt die vorliegende Erfindung in einem aus Mycoplasma fermentans erhältlichen Glycoglycerophospholipid, das die folgenden Eigenschaften aufweist:
    • (A) das Glycoglycerophospholipid ist mit einem Orcinol-Reagenz, einem Dittmer-Reagenz, einem Dragendorff-Reagenz und einem Ninhydrin-Reagenz reaktiv,
    • (B) das Glycoglycerophospholipid ist mit Alkali abbaubar,
    • (C) das Glycoglycerophospholipid wird als eine nicht-adsorptive Fraktion bei einer Fraktionierung mit einem Anionen-Austauscher erhalten, der eine Diethylaminoethyl-Gruppe aufweist, und
    • (D) das durch die Formel I (siehe unten) dargestellte Glycoglycerophospholipid weist ein unter Verwendung eines Massenspektrometers gemessenes Molekulargewicht von 1048 + 28 n auf, wobei n –1, 0, 1 oder 2 ist.
  • Das oben beschriebene Glycoglycerophospholipid kann konstitutionelle Komponenten des α-Glycopyranosyl-(1'-3)-1,2-Diacyl-sn-Glycerols, des Phosphocholins und des Phosphoresters des Aminopropandiols enthalten.
  • Der Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper kann eine Reaktions-Spezifität zu einem Glycoglycerophospholipid aufweisen, das mindestens Phosphocholin, Glucose, Fettsäure und Glycerol enthält, wobei das Lipid nicht-adsorptiv zu einem Anionen-Austauscher ist, der eine Diethylaminoethyl-Gruppe enthält, und gegen Alkali instabil ist. Das Glycoglycerophospholipid kann z. B. ein Glycoglycerophospholipid enthalten, das speziell in Mycoplasma fermentans vorhanden ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt als spezielle Ausführungen des Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers, einen polyklonalen Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper bereit, der immunologisch sowohl mit 6'-O-Phosphocholin-α-Glucopyranosyl-(1'-3)-1,2-di-Palmitoyl-sn-Glycerol, als auch das aus Mycoplasma fermentans extrahierbare die folgenden Eigenschaften aufweisende Glycoglycerophospholipid und einen monoklonalen Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper bereit, der eine Reaktions-Spezifität zu dem die folgenden Eigenschaften aufweisenden Glycoglycerophospholipid aufweist:
    • (A) das Glycoglycerophospholipid ist mit einem Orcinol-Reagenz, einem Dittmer-Reagenz, einem Dragendorff-Reaganz und einem Ninhydrin-Reagenz reaktiv,
    • (B) das Glycoglycerophospholipid ist mit Alkali abbaubar,
    • (C) das Glycoglycerophospholipid wird als eine nicht-adsorptive Fraktion bei einer Fraktionierung mit einem Anionen-Austauscher erhalten, der eine Diethylaminoethyl-Gruppe aufweist, und
    • (D) das durch die Formel I (siehe unten) dargestellte Glycoglycerophospholipid weist ein unter Verwendung eines Massenspektrometers gemessenes Molekulargewicht von 1048 + 28 n auf, wobei n –1, 0, 1 oder 2 ist.
  • In weiterer Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Messung eines Glycoglycerophospholipids, welches den Schritt der immunologischen Messung unter Verwendung des vorangegangenen Glycoglycerophospholipid-Antikörpers des in einer Probe enthaltenen Glycoglycerophospholipids umfasst, das die vorangegangenen Eigenschaften aufweist, und ein Verfahren zum Nachweis von Mycoplasma fermentans bereit, welches die Schritte der Messung des in einer Probe enthaltenen Glycoglycerophospholipids entsprechend dem vorangegangenen Verfahren und der Zuordnung der Anwesenheit oder der Abwesenheit des Glycoglycerophospholipids oder einer davon existierenden Menge zu der Anwesenheit oder der Abwesenheit von Mycoplasma fermentans oder einer davon existierenden Menge in der Probe umfasst.
  • In noch anderer Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Messung des Glycoglycerophospholipids, das die vorangegangenen Eigenschaften (A) bis (D) aufweist und/oder einer Substanz bereit, die eine ähnliche Antigenität wie die des Glycoglycerophospholipids aufweist, das in einer Probe enthalten ist, und den Schritt der immunologischen Messung des Glycoglycerophospholipids und/oder der Substanz, die eine ähnliche Antigenität wie die des Glycoglycerophospholipids aufweist, unter Verwendung des vorangegangenen Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers umfasst.
  • In noch anderer Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung ein Reagenz-Kit zum Nachweis von Mycoplasma fermentans oder einem Glycoglycerophospholipid aus Mycoplasma fermentans, welche in einer Probe enthalten sind, entsprechend mit einem immunologischen Verfahren bereit, welches den vorangegangenen Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper und ein von Mycoplasma fermentans mit einer Markierungssubstanz markiertes Glycoglycerophospholipid oder einen durch Markieren mit einer Markierungssubstanz erhaltenen Sekundär-Antikörper gegen Immunoglobin eines immunisierten Tieres enthält, wobei der Antikörper gegen das Immunoglobin des immunisierten Tieres unter Verwendung eines anderen Tieres als das zur Herstellung des Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers verwendeten immunisierten Tieres hergestellt ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt in noch anderer Hinsicht ein Verfahren zum Nachweis von AIDS bereit, das den Schritt zum Nachweis des Glycoglycerophospholipids, das die vorangegangenen Eigenschaften (A) bis (D) aufweist, einer Substanz, die eine ähnliche Antigenität wie die des Glycoglycerophospholipids aufweist, oder eines Antikörpers umfasst, der eine Reaktions-Spezifität zu dem im Blut enthaltenen Glycoglycerophospholipid aufweist.
  • Wenn nötig ist in dieser Beschreibung das Glycoglycerophospholipid, das speziell in Mycoplasma fermentans vorhanden ist, einfach als „Glycoglycerophospholipid" bezeichnet.
  • Die vorliegende Erfindung wird unten im Detail erklärt werden.
  • <1> Glycoglycerophospholipid der vorliegenden Erfindung
  • Der Antikörper der vorliegenden Erfindung, der unter Verwendung des Glycoglycerophospholipids als ein Antigen hergestellt wird, weist eine Reaktions-Spezifität zu einem Glycoglycerophospholipid aus Mycoplasma fermentans auf. Als erstes wird das Glycoglycerophospholipid aus Mycoplasma fermentans erklärt werden.
  • Die Existenz von Lipiden, die inhärent in mit einem Retrovirus infizierten Zellen sind, ist bisher bekannt geworden. Fünf Glycoglycerophospholipid-Spezies (GGPLs: GGPL-I, GGPL-II, GGPL-III, GGPL-IV, GGPL-V) sind in menschlichen mit HTLV-I infizierten T-Helfer-Zellen gefunden worden. Unter diesen ist die Struktur von GGPL-I von den vorliegenden Erfindern (Nishida et al., Nippon Nogeikagaku Kaishi, Vol. 68, No. 3 (1994), „Proceedings of 1994th Annual Meeting", p. 39) bestimmt worden. Für die anderen GGPLs mit Ausnahme von GGPL-I, ist nur ihre Existenz bekannt und weder ihre physikalischen Eigenschaften noch ihre Strukturen sind bekannt geworden.
  • Die vorliegenden Erfinder präparierten Lipidfraktionen von HTLV-I infizierten menschlichen T-Helfer-Zellen (MT-4 (GGPL+)), in denen GGPLs gefunden wurden, und von MT-4-Zellen (GGPL–), die durch Behandlung der MT-4-Zellen (GGPL+) mit einem Anti-Mycoplasmen-Mittel (MC201, hergestellt von Dainippon Pharmaceutical) erhalten werden. Die hergestellten Lipidfraktionen wurden mittels HPTLC (hochauflösende Dünnschicht-Chromatographie) getrennt. Das Glycolipid wurde mit dem Orcinol-Reagenz gefärbt und das Phospholipid wurde mit dem Dittmer-Reagenz gefärbt. Als ein Ergebnis wurden zwei Banden nachgewiesen (4), welche in MT-4 (GGPL+) gefunden wurden, und die nicht in MT-4 (GGPL–) gefunden wurden. Die zwei Banden wurden auch von MT-4 (GGPL–)-Zellen nachgewiesen, die durch Kultivierung mit Zugabe eines Kulturüberstands von MT-4 (GGPL+)-Zellen erhalten werden, die zuvor durch einen Filter, der eine Porengröße von 0,22 μm aufweist, gegeben wurden. Wie in den später beschriebenen Beispielen erklärt, wurde es herausgefunden, dass eine der zwei Banden GGPL-I war und die andere GGPL-III war.
  • Es ist nicht berichtet worden, dass irgendein zur Art Mycoplasma gehörender Mikroorganismus als eine konstitutionelle Komponente ein Glycoglycerophospholipid aufweist, das Phosphocholin enthält. Es ist in Betracht gezogen worden, dass GGPLs von menschlichen Zellen stammen. Es ist jedoch aus dem oben beschriebenen Ergebnis aufgeklärt worden, dass GGPLs von Mycoplasma fermentan stammen. Es ist daher angenommen worden, dass Mycoplasma fermentans nachgewiesen werden kann, wenn ein Antikörper erhalten wird, der eine Reaktions-Spezifität zu dem oben beschriebenen Glycoglycerophospholipid aufweist.
  • Das Glycoglycerophospholipid aus Mycoplasma fermentans kann aus einer Kultur von Mycoplasma fermentans hergestellt werden. Mycoplasma fermentans kann z. B. wie folgt erhalten werden. Ein Kulturüberstand von kultivierten Zellen, in denen die Existenz von GGPLs bestätigt ist („GGPL-positiv"), z. B. ein Kulturüberstand von MT-4-Zellen (menschliche T-Helfer-Zellen, die mit HTLV-I infiziert sind (menschlicher T-lymphotropischer Retrovirus Typ I)) wird mit einem Filter, der eine Porengröße von 0,22 μm aufweist, gefiltert. Auf diese Weise wird Mycoplasma fermentans in einem Filtrat erhalten. Alternativ ist es auch erlaubt, eine Bakterienstamm-Art, wie z. B. einen Mycoplasma fermentans PG18-Bakterienstamm, zu verwenden.
  • Der erhaltene Mycoplasma fermentans wird z. B. auf einem PPLO-Brühe-Agarmedium kultiviert (hergestellt von Difco Laboratories), um eine Kolonie zu isolieren, die dann in einem Flüssigmedium, wie z. B. einer PPLO-Brühe (hergestellt von Difco Laboratories) kultiviert, die 10% (v/v) fetales Rinderserum (FBS), 5% (w/v) Hefeextrakt (hergestellt von Flow Laboratories), 1.000 Units/ml Penicillin, 1% (w/v) Dextrose und 0,002% (w/v) Phenolrot enthält. Auf diese Weise werden kultivierte mikrobielle Zellen von Mycoplasma fermentans erhalten. Als nächstes wird Methanol zu den mikrobiellen Zellen von Mycoplasma fermentans hinzugegeben, gefolgt vom Stehenlassen für einige Stunden. Danach wird Chloroform dazugegeben, um eine Ultraschall-Behandlung durchzuführen, gefolgt vom Stehenlassen für mehrere Stunden. Anschließend werden die mikrobiellen Zellen unter Verwendung, z. B. eines Potter-Typs-Teflon-Homogenisiergeräts homogenisiert, um einen Überstand zu gewinnen. Ein Lipidextrakt wird durch Verdampfen des Überstands erhalten. Das auf diese Weise enthaltene Extrakt enthält das Glycoglycerophospholipid.
  • Wie in den Beispielen beschrieben, wurde die Lipidfraktion auf eine HTPLC (hochauflösende Dünnschicht-Chromatographie)-Platte aufgetragen, die mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform: Methanol: 0,2% (w/v) Kalziumchlorid wässrige Lösung = 50 : 45 : 10 (v/v/v) entwickelt wurde, um das Phospholipid zu analysieren. Als ein Ergebnis wurden sechs Banden (Lipid i, Lipid ii, Lipid iii, Lipid iv, Lipid v und Lipid vi) nachgewiesen (3). Entsprechend dem Verhalten bei der TLC wurde es offenbart, dass von diesen Lipid v und Lipid vi zu GGPL-I bzw. zu GGPL-III korrespondieren. Entsprechend einem Ergebnis einer FAB-Massen-Spektrometrie, wurde es bestätigt, dass GGPL-I identisch mit Lipid v war und GGPL-III identisch mit Lipid vi war.
  • Das Glycoglycerophospholipid aus Mycoplasma fermentans kann auch aus mit Mycoplasma fermentans infizierten MT-4-Zellen erhalten werden. Z. B. werden MT- 4-Zellen in RPMI-1640-Medium kultiviert, dem 10% (v/v) FCS (fetales Kalbsserum) hinzugegeben sind, und die erhaltenen Zellen werden mit PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung) gewaschen, aus der Lipide unter Verwendung von 400 ml einer Mischlösung aus Chloroform: Methanol (= 2 : 1, 1 : 1 oder 1 : 2) extrahiert werden.
  • Das Lipidextrakt aus Mycoplasma fermentans oder das, wie oben beschrieben, aus MT-4-Zellen erhalten wird, wird in eine nicht-adsorptive Fraktion (neutrale Fraktion) und eine adsorptive Fraktion (Säurefraktion) unter Verwendung eines Anionen-Austauscher-Harzes getrennt, das eine Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppe aufweist, wie z. B. eine DEAE-Sephadex-A25 (hergestellt von Pharmacia), und auf diese Weise wird die nicht-adsorptive Fraktion erhalten. Die nicht adsorptive Fraktion wird auf eine Silizium-Kügelchen-Säule aufgetragen und mit einem Konzentrationsgradienten fraktioniert, der auf Chloroform/Methanol/Wasser (83 : 16 : 0,5 bis 20 : 80 : 8 (v/v)) basiert. Auf diese Weise kann GGPL-III von anderen Phospholipiden getrennt werden. Des Weiteren wird GGPL-I unter Durchführung einer Elution mit einem Konzentrationsgradienten isoliert, der auf 1-Propanol/wässriges Ammonium/Wasser (80 : 5 : 15 bis 74 : 5 : 20) basiert.
  • GGPL-I und GGPL-III sind beide positiv mit dem Orcinol-Reagenz, dem Dittmer-Reagenz und dem Dragendorff-Reagenz (welches Cholin färbt), und sie werden durch die Behandlung durch mildes Alkali abgebaut. GGPL-I ist negativ bei der Ninhydrin-Reaktion (welche eine Aminogruppe färbt), jedoch ist GGPL-III positiv in dieser Reaktion.
  • Ergebnisse der physikalisch-chemischen Analyse, die unter Verwendung von gereinigtem GGPL-III durchgeführt ist, sind unten gezeigt.
  • (1) Infrarotabsorptionsspektrum
  • Absorptionsbanden die zu -CH2 und -CH3-Gruppen, zu einer Hydroxyl-Gruppe, zu einer Estercarbonyl-Gruppe, zu einer Phosphat-Gruppe, zu einer Cholin-Gruppe und entsprechend zu einer primären Amingruppe korrespondieren, wurden nachgewiesen.
  • (2) Sekundär-Ionen-Massen-Spektrometrie-Analyse aus der Lösung (LSIMS)
  • Es deutete drauf hin, dass mindestens drei Spezies von Fettsäuren in dem Molekül anwesend waren. Es wurde gefolgert, dass GGPL-III als mindestens vier Arten von Molekülen vorhanden ist, wobei eine Hauptkomponente von diesen ein Molekulargewicht von 1048 hatte. Es wurde des Weiteren gezeigt, dass auch GGPL-III-Arten, die Molekulargewichte von 1020, 1076 und 1104 aufweisen, vorhanden waren.
  • (3) Tandem-Massen-Spektrometrie (MS/MS)
  • Es deutete darauf hin, dass Phosphocholin in dem Molekül vorhanden war. Es wurde daraus gefolgert, dass die Hauptkomponente von GGPL-III ein Molekulargewicht von 1048 hatte.
  • (4) Eindimensionales 1H-NMR-Spektrum
  • Signale von Glycerol, Cholin und Glucose wurden nachgewiesen. Des Weiteren wurde es gefordert, dass Aminopropandiol anwesend war. Entsprechend wurde das Spektrum von GGPL-III mit den eindimensionalen 1H-NMR-Spektren verglichen, die unter Verwendung von Standardproben von 3-Aminopropan-1,2-Diol (1-Aminopropan-2,3-diol) und 2-Aminopropan-1,3-diol erhalten werden. Es wurde als ein Ergebnis angedeutet, dass GGPL-III möglicherweise 2-Aminopropan-1,3-diol als eine konstitutionelle Komponente enthielt.
  • (5) Zweidimensionales 1H-NMR-Spektrum (PH-DQF-COSY-Verfahren)
  • Ein vom Diacylglycerol stammendes Protonsignal wurde beobachtet. Auch ein Protonsignal von Cholin wurde beobachtet.
  • (6) Zweidimensionales 1H-31P-NMR-Spektrum
  • Es wurde gezeigt, dass ein GGPL-III-Molekül zwei Phosphoratome (P) enthielt. Es wurde gefordert, dass eine Verbindung, die Phosphor enthält, der an der 1- oder 6-Position eines Glucoserests gebunden ist. Diese Position war höchstwahrscheinlich eine 6-Position.
  • Es wurde eine Struktur des Phosphocholins vorgeschlagen, in welcher eine Phosphatgruppe an das Cholin gebunden ist. Es wurde eine Struktur gefordert, in der ein Phosphatester eines Aminopropandiols zunächst an der 6-Position des Glucoserests gebunden ist und ein Phosphocholin an dem Phosphorester des Aminopropandiols gebunden ist.
  • Gemäß den oben beschriebenen Ergebnissen ist es offenbart worden, dass GGPL-III ein neues Glycoglycerophospholipid ist, das die folgenden Eigenschaften aufweist:
    • (A) das Glycoglycerophospholipid ist mit einem Orcinol-Reagenz, mit einem Dittmer-Reagenz, mit einem Dragendorff-Reagenz und einem Ninhydrin-Reagenz reaktiv,
    • (B) das Glycoglycerophospholipid ist mit Alkali abbaubar,
    • (C) das Glycoglycerophospholipid wird als eine nicht-adsorptive Fraktion durch eine Fraktionierung mit einem Anionen-Austauscher erhalten, der eine DEAE-Gruppe aufweist, und
    • (D) das durch die Formel I (siehe unten) dargestellte Glycoglycerophospholipid weist ein unter Verwendung eines Massenspektrometers gemessenes Molekulargewicht von 1048 + 28 n auf, wobei n –1, 0, 1 oder 2 ist.
  • Es wurde gemäß den oben beschriebenen Ergebnissen gezeigt, dass GGPL-III konstitutionelle Komponenten des α-Glycopyranosyl-(1'-3)-1,2-Diacyl-sn-Glycerols, des Phosphocholins und des Phosphatesters des Aminopropandiols enthielt. Der Phosphatester des Aminopropandiols war ein Phosphatester des 2-Aminopropan-1,3-Diols. Es wurde gefordert, dass seine Bindungsstelle die 6-Position des Glucoserests des α-Glycopyranosyl-(1'-3)-1,2-Diacyl-sn-Glycerols ist. Es wurde des Weiteren vorgeschlagen, das Phosphocholin an dem Phosphatester des 2-Aminopropan-1,3-Diols gebunden ist. Die Hauptkomponente von GGPL-III hatte als Acylgruppen zwei Palmitoyl-Gruppen, die wie durch die folgende Formel (I) dargestellte abgeleitete Struktur aufweisen. Es wurde gefolgert, dass die Hauptkomponente von GGPL-III eine Struktur aufwies, in der der Phosphorester des 2-Aminopropan-1,3-Diols zwischen einem Phosphocholin und dem Glucoserest des GGPL-I eingefügt war (6'-O-Phosphocholin-α-Glycopyranosyl-(1'-3)-1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycerol).
  • Figure 00120001
  • Auf der anderen Seite beziehen die anderen GGPL-III-Moleküle, die unterschiedliche Molekulargewichte aufweisen, unterschiedliche Arten von Acylgruppen in einem α-Glycopyranosyl-(1'-3)-1,2-Diacyl-sn-Glycerol ein. Es wird gefordert, dass das Molekül, das ein Molekulargewicht von 1020 hat, eine Myristyl-Gruppe und eine Palmitoyl-Gruppe aufweist, das Molekül, das ein Molekulargewicht von 1076 hat, eine Palmitoyl-Gruppe und eine Stearyl-Gruppe aufweist, und das Molekül, das ein Molekulargewicht von 1104 hat, zwei Stearyl-Gruppen oder eine Palmitoyl-Gruppe und eine Eicosanoyl-Gruppe aufweist. Details sind jedoch nicht aufgeklärt.
  • <2> Herstellung eines Antikörpers der vorliegenden Erfindung
  • Der Antikörper der vorliegenden Erfindung wird durch Immunisierung eines Tieres mit einem aus Mycoplasma fermentans stammenden Antigen des Glycoglycerophospholipids und dem Separieren des Serums aus dem Tier erhalten. Alternativ wird der Antikörper der vorliegenden Erfindung durch Sammeln von Antikörper produzierenden Zellen des Tieres, durch Ermöglichen der permanenten Kultivierbarkeit der Antikörper produzierenden Zellen und durch Gewinnen des Antikörpers aus deren Kultur erhalten. Das Verfahren zur Herstellung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung wird exemplarisch unten beschrieben werden. Es ist jedoch nicht darauf eingeschränkt. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann, vorausgesetzt dass das Glycoglycerophospholipid aus Mycoplasma fermentans als ein Antigen verwendet wird, entsprechend mit anderen Verfahren hergestellt werden.
  • (1) Herstellung eines polyklonalen Antikörpers
  • Ein Monophosphat-Lipid, Freund's komplettes Adjuvans und Mineralöl werden zusammengegeben und mit dem wie oben erhaltenen Lipidextrakt aus Mycoplasma fermentans gemischt. PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung), die 0,1% (v/v) Tween 80 enthält, wird dazugegeben und emulgiert.
  • Als nächstes wird eine erhaltene Emulsion subkutan oder intraperitoneal einem Tier, wie z. B. einer Maus, einer Ratte, einem Kaninchen, einem Meerschweinchen oder einem Schaf verabreicht. Nach der primären Immunisierung wird zwei oder drei Wochen später eine Booster-Immunisierung entsprechend einem gewöhnlichen Verfahren durchgeführt. Auf diese Weise wird ein Antiserum erhalten, das einen hohen Titer aufweist. Eine Woche nach der Schlussimmunisierung wird Blut gesammelt und das Serum wird separiert. Zur Inaktivierung des Komplements wird das Serum hitzebehandelt. Danach wird eine Immunglobulin-Fraktion entsprechend einem Verfahren erhalten, das denjenigen ähnlich ist, die zur Reinigung eines gewöhnlichen Antikörpers verwendet werden, wie z. B. Aussalzen mit Ammoniumsulfat und Ionen-Austauscher-Chromatographie. In wünschenswerter Weise wird der Anstieg im Antikörpertiter im Blut nach der Endimmunisierung zum Beispiel entsprechend einem Enzym-Immuno-Assay bestimmt.
  • Der wie oben beschrieben erhaltene Antikörper weist eine Reaktions-Spezifität zu dem Glycoglycerophospholipid aus Mycoplasma fermentans auf, und er reagiert nicht mit Glycoglycerophospholipiden aus anderen Mycoplasmen, wie z. B. My coplasma arthritidis und Mycoplasma hominis.
  • Ein polyklonaler Antikörper, der die Reaktions-Spezifität zu GGPL-III aufweist, kann anstatt aus dem Lipidextrakt aus Mycoplasma fermentans unter Verwendung von gereinigtem GGPL-III erhalten werden.
  • (2) Herstellung eines monoklonalen Antikörpers
  • Ein monoklonaler Antikörper wird entsprechend einem Verfahren von Kohler and Milstein (Nature, pp. 495–492, 1975) erhalten. Und zwar werden Antikörper produzierende Zellen aus einem Säugetier, welche einen Antikörper gegen das Glycoglycerophospholipid herstellen, mit Myeloma-Zellen verschmolzen, um Hybridomen herzustellen. Ein Hybridom, das einen Ziel-Antikörper herstellt, wird geklont und das Hybridom wird kultiviert. Auf diese Weise wird der monoklonale Antikörper in einer Kulturflüssigkeit erhalten. Dieser Prozess wird unten unter Gliederung des Prozesses in die entsprechenden Schritte erklärt werden.
  • (i) Immunisierung eines Tieres und Herstellung von Antikörper produzierenden Zellen
  • Zellen, die den Antikörper gegen das Glycoglycerophospholipid produzieren, werden durch Immunisierung eines Tieres, wie z. B. einer Maus, einer Ratte, eines Kaninchens, eines Meerschweinchens oder eines Schafes mit dem Glycoglycerophospholipid und durch Präparation, z. B. der Milzzellen, der Lymphknotenzellen oder dem peripherem Blut aus dem Tier, erhalten. Das Tier kann in der gleichen Weise, wie in dem Punkt (1) beschrieben, mit dem Glycoglycerophospholipid immunisiert werden.
  • Der monoklonale Antikörper, der eine Reaktions-Spezifität zu GGPL-III aufweist, kann durch Immunisierung eines Tieres mit gereinigtem GGPL-III erhalten werden. Alternativ kann der monoklonale Antikörper durch Herstellen von Hybridomen unter Verwendung von Antikörper produzierenden Zellen des Tieres, das mit einer Glycoglycerophospholipid-Mischung immunisiert wird und durch Auswählen eines Stammes aus den erhaltenen Hybridomen erhalten werden, wobei der Stamm einen monoklonalen Antikörper produziert, der eine Reaktions-Spezifität zu GGPL-III aufweist. Gemäß dem letzteren Verfahren ist es unnötig, ein GGPL-III in einer Menge zu erhalten, die für die Immunisierung des Tieres erforderlich ist. Es ist ausreichend ein GGPL-III in einer winzigen Menge in einem Ausmaße herzustellen, um imstande zu sein, den Nachweis unter Hilfe eines Enzym-Immuno-Assays durchzuführen.
  • (ii) Herstellung des Hybridoms
  • Antikörper produzierende Zellen werden aus dem mit dem Glycoglycerophospholipid immunisierten Tier gesammelt, um eine Zellfusion mit Myelom-Zellen durchzuführen. Als die für die Zellfusion verwendeten Myelom-Zellen können verschiedene Säugetier-Zell-Linien verwendet werden. Es wird jedoch bevorzugt eine Zelllinie zu verwenden, die die gleiche Spezies wie das Tier ist, das für die Herstellung der Antikörper produzierenden Zellen verwendet wird. Um die fusionierten Zellen von den nicht-fusionierten Zellen nach der Zellfusion zu unterscheiden, ist es bevorzugt eine Myelom-Zelllinie zu verwenden, die einen Marker aufweist, so dass nicht-fusionierte Myelom-Zellen nicht überleben können und nur Hybridom-Zellen proliferieren können. Die 8-Azaguanin-resistente Linie ist zum Beispiel defizient in der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) und ihre Nukleinsäure-Synthese hängt von einem de novo-Synthese-Stoffwechsel ab. Eine fusionierte Zelle (Hybridom) einer solchen Myelom-Zelle und eine normale Antikörper produzierende Zelle können in einem Medium (HAT-Medium) proliferieren, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält, da die fusionierte Zelle eine Nukleinsäure unter Verwendung eines Ersatzkreislaufe, der aus der Lymphozyte stammt, infolge der Gegenwart von Thymidin und Hypoxanthin synthetisieren kann, selbst wenn der de novo-Synthese-Stoffwechsel durch Aminopterin inhibiert wird. Im Gegensatz dazu können die gegenüber 8- Azaguanin resistenten Myelom-Zellen keine Nukleinsäure synthetisieren, und die Zellen sterben, da der de novo-Synthese-Stoffwechsel durch Aminopterin inhibiert wird. Darüber hinaus können die Antikörper produzierenden Zellen wie die normalen Zellen nicht für einen langen Zeitraum kultiviert werden. Daher können nur die durch die Fusion der Antikörper produzierenden Zellen und der Myelom-Zellen hergestellten Hybridom-Zellen in dem HAT-Medium proliferieren. Entsprechend können fusionierte Zellen von den nicht-fusionierten Zellen selektiert werden (Science, Vol. 145, p. 709, 1964). Eine Linie, die kein inhärentes Immunoglobin sekretiert wird im Hinblick auf die Tatsache, dass es einfach ist, einen Ziel-Antikörper aus dem Kulturüberstand eines erhaltenen Hybridoms zu erhalten, bevorzugt als die Myelom-Zelle verwendet.
  • Die Zellfusion, um das Hybridom zu erhalten, wird z. B. wie folgt durchgeführt. Eine Milz eines immunisierten Tieres wird exzidiert, und sie wird in RPMI-1640-Medium suspendiert, um eine schwimmende Zellsuspension herzustellen. Die Milzzellen werden mit Maus-Myelom-Zellen, wie z. B. SP2/0-Zellen (Azaguanin-resistent, IgG-nicht-sekretierbar: ATCC CRL-1581) in der logarithmischen Wachstumsphase gemischt, so dass das Verhältnis der Milzzellen zu den Myelom-Zellen etwa 10 : 1 bis 1 : 1 ist. Nach dem Zentrifugieren wird Polyethylenglycol, das ein durchschnittliches Molekulargewicht von 1.000 bis 6.000 aufweist, zu einem Präzipitat hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 30 bis 50% zu ergeben. Auf diese Weise werden die Milzzellen und die Myelom-Zellen fusioniert. Die Fusion kann anstatt der Zugabe von Polyethylenglycol durch Anlegen eines elektrischen Pulses an die Zellmischung durchgeführt werden.
  • Die der Fusionsbehandlung unterzogenen Zellen werden zum Beispiel mit RPMI-1640-Medium kultiviert, das 10% (v/v) fetales Kälberserum (FCS) enthält, und dann werden die Zellen in einem Selektivmedium, wie z. B. HAT-Medium, schwimmen gelassen. Die Zellen werden dispensiert und z. B. in Löcher einer 96-Loch-Mikrotiter-Platte eingefüllt. Auf diese Weise werden die Zellen kultiviert, so dass nur Hybridomen ermöglicht wird zu wachsen.
  • (iii) Screenen nach einem Hybridom, das einen Antikörper produziert, der Reaktions-Spezifität zu Glycoglycerophospholipid aufweist
  • Die wie oben beschrieben erhaltenen Hybridomen werden als eine Mischung von Hybridomen bereitgestellt, die monoklonale Antikörper gegen eine Vielfalt von Antigenen bzw. Epitopen produzieren. Es ist entsprechend wichtig, aus diesen Hybridomen einen Linie zu selektieren, die einen monoklonalen Antikörper produziert, der eine Reaktions-Spezifität zu dem Glycoglycerophospholipid aufweist, insbesondere einen monoklonalen Antikörper, der eine Reaktions-Spezifität zu GGPL-III aufweist. Es wird bevorzugt eine Linie aus monoklonalen Antikörpern zu selektieren, die an GGPL-III binden, welche einen monoklonalen Antikörper gegen ein Epitop produziert, das eine starke Antigenität aufweist.
  • Eine Linie, die einen monoklonalen Antikörper gegen das Glycoglycerophospholipid produziert, kann gemäß einem Enzym-Immun-Assay unter Verwendung des Glycoglycerophospholipids als ein Antigen selektiert werden. Ein solches Verfahren enthält ein ELISA-Verfahren, das die folgenden Schritte einschließt. Und zwar wird das Antigen auf einer Festphase, wie z. B. einer Mikrotiter-Platte immobilisiert, zu der eine Kulturflüssigkeit eines Hybridoms hinzugegeben wird, gefolgt von der Zugabe eines mit z. B. einem Enzym, einer fluoreszierenden Substanz oder einer lumineszierenden Substanz markierten sekundären Antikörpers, um die Inkubation durchzuführen. Auf diese Weise wird der Antikörper mit Hilfe der gebundenen Markierungssubstanz nachgewiesen. Bei diesem Verfahren kann ein Antikörper auf einer Festphase immobilisiert sein, zu dem das Antigen und ein markierter sekundärer Antikörper sukzessiv hinzugegeben werden können, gefolgt von einer Inkubation. Das ELISA-Verfahren wird später im Detail beschrieben werden.
  • Wenn kein gereinigtes GGPL-III erhalten wird, wird die Lipidfraktion aus Mycoplasma fermentans unter Verwendung einer hochauflösenden Dünnschicht-Chromatographie (HPTLC)-Platte separiert. Eine Kulturflüssigkeit eines Hybridoms und eines markierten sekundären Antikörpers werden nacheinander auf die Platte gegeben, gefolgt von einer Inkubation, so dass eine Position an der die Markierungssubstanz eine Bindung eingeht, nachgewiesen wird. Wenn die Position mit einer von GGPL-III durch die HPTLC entwickelten Position identisch ist, wird das Hybridom dahingehend betrachtet, dass es einen monoklonalen Antikörper gegen GGPL-III produziert. Sobald der monoklonale Antikörper gegen GGPL-III erhalten ist, kann auch GGPL-III gemäß einer Affinitäts-Chromatographie oder dergleichen, basierend auf der Verwendung des monoklonalen Antikörpers, aus der Lipidfraktion gereinigt werden.
  • Wenn es bestätigt ist, dass ein Loch ein Hybridom enthält, das einen Ziel-monoklonalen-Antikörper herstellt, wird das Klonieren der Zellen in dem Loch, die das Hybridom enthalten, gemäß der Grenzverdünnungsanalyse oder dergleichen durchgeführt.
  • Wie in den später beschriebenen Beispielen gezeigt, ist die auf diese Weise erhaltene Hybridom-Linie, die den monoklonalen Antikörper herstellt, der die Reaktions-Spezifität zu GGPL-III aufweist, am 24. Mai 1994 im National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry unter einer Hinterlegungsnummer von FERM P-14324 zur internationalen Hinterlegung, die auf dem Budapester Übereinkommen basiert, am 26. Mai 1995 überführt und eine Hinterlegungsnummer von FERM BP-5115 zuerkannt worden.
  • (iv) Herstellung eines monoklonalen Antikörpers
  • Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung wird in einem Kulturüberstand durch Kultivierung des wie oben beschrieben erhaltenen Hybridoms in einem geeigneten Medium erhalten. Der monoklonale Antikörper kann gemäß einem gewöhnlichen Verfahren gereinigt werden, das zum Beispiel das Aussalzen mit Amoniumsulfat, die Ionen-Austauscher-Chromatographie und die Affinitäts-Chromatographie, die auf der Verwendung eines Protein A oder eines Protein G basieren, und eine Immun-Absorptions-Chromatographie, die auf der Verwendung eines immobilisierten Antigens basiert, enthält.
  • Der auf diese Weise erhaltene monoklonale Antikörper macht keine Kreuzreaktion mit einem Sialinsäure enthaltenen Glycolipid (Gangliosid), das im Serum einer nicht mit Mycoplasma fermentans infizierten gesunden Person existiert, mit einem Thrombozyten aktivierendem Faktor (1-Alkyl-2-Acetylglycero-3-Phosphocholin) oder einem teilweise deacylierten Produkt davon, mit Phosphatidylcholin oder einem teilweise deacylierten Produkt davon, mit Glycolipid und mit Phospholipid, wie z. B. Sphingomyelin.
  • Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann so wie er ist verwendet werden. Jedoch kann auch jener, der durch Fragmentierung erhalten wird, verwendet werden. Bei der Fragmentierung des Antikörpers ist es für die Bindung zwischen dem Antigen und dem Antikörper unabdingbar, dass die Antigen-Bindungsstelle (Fab) des Antikörpers konserviert wird. Daher ist es möglich, ein Fragment zu verwenden, das die Antigen-Bindungsstelle (Fab) enthält, welches durch Behandlung des Antikörpers mit einer Protease (z. B. Plasmin, Pepsin und Papain) erhalten wird, die nicht die Antigen-Bindungsstelle abbaut.
  • Wenn eine Nukleotid-Sequenz eines Gens, das für den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung kodiert, oder eine Aminiosäure-Sequenz des Antikörpers bestimmt wird, ist es möglich gemäß einer Genmanipulations-Technik ein Fragment herzustellen, das die Antigen-Bindungsstelle (Fab) enthält.
  • <3> Verwendung eines Glycoglycerophospholipids und eines Antikörpers dagegen der vorliegenden Erfindung
  • Der Antikörper der vorliegenden Erfindung weist eine Reaktions-Spezifität zu dem in Mycoplasma fermentans inhärenten Glycoglycerophospholipids auf. Dementsprechend kann das Glycoglycerophospholipid in einer Probe unter Verwendung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung immunologisch gemessen werden. Bei diesem Vorgehen kann GGPL-I und GGPL-III unter Verwendung des Antikörpers, der eine Reaktions-Spezifität sowohl zum GGPL-I als auch zum GGPL-III aufweist, gemessen werden. GGPL-III kann unter Verwendung des Antikörpers, der eine Reaktions-Spezifität zu GGPL-III aufweist, selektiv gemessen werden. Wenn GGPL-III gemessen wird, kann das wie oben beschrieben erhaltene GGPL-III als eine Standardsubstanz verwendet werden. Das Glycoglycerophospholipid in einer Probe enthält eine Lipidfraktion, die aus der aus einem lebenden Körper stammenden Probe extrahiert wird.
  • Diese ist für die immunologische Messung, enthaltend gewöhnliche immunologische Verfahren, die auf der Verwendung des Antikörpers basieren, wie z. B. ELISA-Verfahren und Immunfärbeverfahren, verwendbar. Das Glycoglycerophospholipid in einer Probe kann zum Beispiel durch das Ermöglichen einer Probelösung mit einer Festphase, die den daran gebundenen Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper enthält, in Kontakt zu treten, so dass das in der Probelösung enthaltene Glycoglycerophospholipid an den Antikörper gebunden wird, durch das Trennen und durch das Entfernen von nicht-adsorptiven Komponenten aus der Festphase, durch das anschließende Ermöglichen eines mit einer Markierungssubstanz aus Mycoplasma fermentans stammenden Glycoglycerophospholipids mit der Festphase in Kontakt zu treten, durch das Herstellen einer konkurrierenden Reaktion zwischen dem in der Probelösung enthaltenen Glycoglycerophospholipids und dem markierten Glycoglycerophospholipids und durch das Nachweisen der an der Festphase gebundenen Markierungssubstanz und der nicht an der Festphase gebundenen Markierungssubstanz hergestellt werden.
  • Das Glycoglycerophospholipid in einer Probe kann alternativ durch das Ermöglichen einer Probelösung und einem mit einer Standardsubstanz markierten Glycoglycerophospholipid mit einer Festphase in Kontakt zu treten, die den daran gebundenen Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper enthält, durch das Ermöglichen des in der Probelösung enthaltenen Glycoglycerophospholipids und dem markierten Glycoglycerophospholipid eine konkurrierende Reaktion mit dem Antikörper durchzuführen und durch das Nachweisen der an der Festphase gebundenen Markierungssubstanz und der nicht an der Festphase gebundenen Markierungssubstanz hergestellt werden. Bei diesem Verfahren kann ein nicht markiertes Standard-Glycoglycerophospholipid anstelle des markierten Glycoglycerophospholipids verwendet werden, um eine konkurrierende Reaktion zwischen dem Glycoglycerophospholipid in der Probe und dem Standard-Glycoglycerophospholipid durchzuführen, gefolgt durch das Ermöglichen des mit einer Markierungsubstanz markierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers, mit der Festphase in Kontakt zu treten, so dass jede an die Festphase gebundene Markierungssubstanz oder die nicht an die Festphase gebundene Markierungssubstanz nachweisbar ist. Auch ein markierter sekundärer Antikörper kann bei diesem Verfahren verwendet werden.
  • Es ist des Weiteren erlaubt, dass das Glycoglycerophospholipid in einer Probelösung an eine Festphase gebunden ist, mit der der Kontakt mit einem markierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper ermöglicht wird, so dass jede an die Festphase gebundene Markierungssubstanz und die nicht an die Festphase gebundene Markierungssubstanz nachweisbar ist.
  • Es ist auch erlaubt, dass ein Standard-Glycoglycerophospholipid an eine Festphase gebunden ist, mit der Kontakt mit einer Probelösung und einem markierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper ermöglicht wird, so dass jede an die Festphase gebundene Markierungssubstanz oder die nicht an die Festphase gebundene Markierungssubstanz nachweisbar ist. Auch ein markierter sekundärer Antikörper kann bei diesem Verfahren verwendet werden. GGPL-III in einer Probe kann unter Verwendung eines gereinigten GGPL-III als das Standard-Glycoglycerophospholipid gemessen werden.
  • Des Weiteren kann der Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper in einer Probe durch das Ermöglichen einer Probelösung mit einer Festphase in Kontakt zu treten, die das daran gebundene Anti-Glycoglycerophospholipid enthält, so dass der in der Probelösung enthaltene Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper an den Antikörper gebunden wird, durch das Trennen und durch das Entfernen nicht adsorptiver Komponenten aus der Festphase, durch das nachfolgende Herstellen einer Reaktion mit einem sekundären Antikörper, der durch Markieren eines Anti-Mensch-Immunoglobulin-Antikörpers mit einer Markierungssubstanz erhalten wird, und durch das Nachweisen der Markierungssubstanz, gemessen werden. Das Glycoglycerophospholipid der vorliegenden Erfindung ist inhärent in Mycoplasma fermentans. Es ist dementsprechend möglich, die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Infektion mit Mycoplasma fermentans durch Kontrollieren der Anwesenheit oder Abwesenheit des Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers in einer Probe zu erfahren.
  • Außer dem Vorangegangenen sind verschiedene Variationen als Verfahren für die immunologische Messung bekannt. Jedes der Verfahren kann auf die vorliegende Erfindung angewendet werden.
  • Außer dem Verfahren, das wie oben beschrieben auf der Verwendung der Festphase basiert, sind jene in der vorliegenden Erfindung annehmbar, die Verfahren enthalten, die für die immunologische Messung von Haptenen und Antikörpern verwendet werden, wie z. B. ein Flüssigphaseverfahren, das die Schritte umfasst, es einem Glycoglycerophospholipid in einer Probe und einem markierten Glycoglycerophospholipid zu ermöglichen, eine konkurrierende Reaktion mit dem oben beschriebenen Antikörper durchzuführen, das Trennen des an den Antikörper gebundenen Antigens von dem freien Antigen, z. B. unter Verwendung von Polyethlyenglycol, Dextran oder einem sekundären Antikörper, und das Nachweisen einer Markierungssubstanz des freien markierten Antigens.
  • Jene, die für die Festphase verwendbar sind, enthalten gewöhnliche Materialien, wie z. B. Agarosekügelchen, Latexpartikeln und Löcher von Mikrotiterplatten, die ohne Rücksicht auf ihre Formen (z. B. Partikel, Feinpartikel, Teströhrchen, Mikrotiterplatten und „Strips") z. B. aus Polystyren oder Nylon hergestellt sind. Es wird bevorzugt, das Blocking unter Verwendung von z. B. BSA (bovines Serum Albumin) oder Gelatine durchzuführen, nachdem der Antikörper oder das Glycoglycerophospholipid an die Festphase gebunden wird. Jene, die für die Markierungssubstanz verwendbar sind, enthalten z. B. Enzyme, die für die Farbentwicklung eines Färbemittels geeignet sind, das auf einer Enzymreaktion basiert, wie z. B. eine Peroxidase und eine alkalische Phosphatase, Radioisotope und Fluoreszenzfärbemittel, wie z. B. Fluoreszein-Isothiozyanat.
  • In Bezug auf das Färbemittel wird als Peroxidase z. B. 4-Chlor-1-Naphthol, O-Phenylendiamin (OPD) oder 3,3'-Diaminbenzidin verwendet, und p-Nitrophenylphosphat wird als alkalische Phosphatase verwendet.
  • Mycoplasma fermentans weist das Glycoglycerophospholipid gemäß der vorliegenden Erfindung auf. Mycoplasma fermentans kann daher unter Verwendung des Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden. Mycoplasma fermentans kann zum Beispiel in einer Probe durch Extraktion einer Lipidfraktion aus der Probe, durch das Ermöglichen der extrahierten Lipidfraktion mit einer Festphase in Kontakt zu treten, so dass das Lipid an der Festphase adsorbiert wird, durch das Reagieren der mit dem daran adsorbierten Lipid enthaltenen Festphase mit dem Antikörper der vorliegenden Erfindung, durch das gleichzeitige oder nacheinander folgende Durchführen einer Reaktion mit einem mit einer Markierungssubstanz markierten und mit dem Antikörper reaktiven Anti-Immunoglobin-Antikörper, und durch das Nachweisen der Markierungssubstanz, nachweisbar ist.
  • Des Weiteren ist das die vorliegende Erfindung betreffende Glycoglycerophospholipid inhärent in Mycoplasma fermentans. Mycoplasma fermentans kann daher auch durch Messung eines in einer Probe enthaltenen Glycoglycerophospholipids gemäß dem wie oben beschriebenen Verfahren und bezogen auf die Anwesenheit oder die Abwesenheit des Glycoglycerophospholipids oder einer davon existierenden Menge auf die Anwesenheit oder die Abwesenheit von Mycoplasma fermentans oder einer davon existierenden Menge in der Probe, nachgewiesen werden.
  • Jene, die als die Probe in dem oben beschriebenen Verfahren zum Nachweis des Glycoglycerophospholipids oder dem Verfahren zum Nachweis von Mycoplasma fermentans verwendbar sind, enthalten z. B. Blut, Serum, Plasma, Liquor, Urin, Gelenkflüssigkeit und eine kultivierte Zelllösung (Überstand).
  • Neben den vorangegangenen Verfahren kann Mycoplasma fermentans auch durch Reaktion des mit einer Markierungssubstanz markierten Glycoglycerophospholipid-Antikörpers mit einem Gewebe oder Zellen eines lebenden Organismus genau oder nach der Anwendung einer Behandlung zur Immobilisierung eines Glycoglycerophospholipids, wobei der markierte Antikörper an das Gewebe oder die Zellen des mit Mycoplasma fermentans infizierten lebenden Organismus bindet und durch das Nachweisen der Markierungssubstanz nachgewiesen werden. Jene, die als ein Verfahren für die Immobilisierungs-Behandlung verwendbar sind, enthalten z. B. Verfahren, die auf der Verwendung von Formalin, Glutaraldehyd und Paraformaldehyd basieren. Mycoplasma fermentans kann alternativ auch durch die Reaktion eines nicht-markierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers anstelle des mit der Markierungssubstanz markierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers mit einem Gewebe oder Zellen eines lebenden Organismus, der einer Immobilisierungs-Behandlung unterzogen wird, durch gleichzeitiges oder anschließendes Herstellen einer Reaktion mit einem sekundären Antikörper, der durch Markierung eines Antikörpers gegen Immunoglobin eines mit einer Markierungssubstanz immunisierten Tieres erhalten wird, wobei der Antikörper gegen das Immunoglobin des immunisierten Tieres unter Verwendung eines anderen Tieres als das für die Herstellung des Antikörpers verwendeten Tieres hergestellt worden ist, durch das Binden des markierten sekundären Antikörpers an das Gewebe oder die Zellen des mit Mycoplasma fermentans infizierten lebenden Organismus und durch das Nachweisen der Markierungssubstanz nachgewiesen werden.
  • Nach dem Nachweis des in einer Probe enthaltenen Glycoglycerophospholipids oder des Mycoplasma fermentans durch immunologische Verfahren, kann der Nachweis konventionell durch ein vorheriges Herstellen eines Reagenz-Kits durchgeführt werden, das den eine Reaktions-Spezifität zu dem Glycoglycerophospholipid aus Mycoplasma fermentans aufweisenden Antikörper und einen sekundären durch Markierung eines Antikörpers mit einem Immunoglobin eines immunisierten Tieres mit einer Markierungssubstanz erhaltenen Antikörper enthält, wobei der Antikörper gegen das Immunoglobin des immunisierten Tieres unter Verwendung eines anderen Tieres als das für die Herstellung des eine Reaktions-Spezifität zu dem Glycoglycerophospholipid des Mycoplasma fermentans aufweisenden Antikörpers hergestellt wird.
  • Das Kit wird speziell durch ein Kit beispielhaft erläutert, das z. B. eine Mikrotiterplatte, ein Blocking-Reagenz, wie z. B. BSA (Rinderserum Albumin), das Glycoglycerophospholipid aus Mycoplasma fermentans (Standard-Substanz), den Antikörper der vorliegenden Erfindung, einen Peroxidase markierten Anti-Maus-IgG-Antikörper, eine wässrige Wasserstoff-Peroxid-Lösung, OPD und einen Waschpuffer aufweist. Es ist bevorzugt, dass die Antikörper, das Glycoglycerophospholipid aus Mycoplasma fermentans und die anderen entsprechenden Komponenten des Kits als lyophilisierte Präparationen oder als gelöste Lösungen in einem Lösungsmittel bereitgestellt werden, welches für dessen stabile Lagerung geeignet ist.
  • Der Nachweis von Mycoplasma fermentans kann für die folgenden Diagnose-Verfahren verwendet werden.
  • (1) Prognose einer Krise einer Retrovirus-Infektions-Erkrankung
  • Es wird berichtet, dass Mycoplasma fermentans ein Verschlimmerungsfaktor des AIDS's (erworbenes Immunschwäche-Syndrom) ist (Lo, S.–C. et al., 1993, Res. Microbiol., 144, 489–493). Eine AIDS-Krise tritt nicht unbedingt ein, wenn ein Patient mit HIV (menschliches Immunschwäche-Virus) infiziert ist. Gewöhnlich weist AIDS einen langen latenten Zeitraum auf, und eine komplexe Infektion mit Mycoplasma fermentans ist an der AIDS-Krise beteiligt. Es wird verstanden, dass Mycoplasma fermentans auch an anderen durch Retroviren verursachten Infektionskrisen-Erkrankungen beteiligt ist.
  • Aus verschiedenen Mycoplasmen-Spezies extrahierte Lipide wurden zu einer Kulturflüssigkeit von latent mit HIV infizierten Zellen in bestimmten, wie in Tabelle 1 gezeigten Lipid-Konzentrationen (Endkonzentrationen) hinzugegeben, und die Zellen wurden kultiviert. Eine Anzahl von zerstörten Zellen wurde unter Verwendung eines optischen Mikroskops untersucht, welche als ein Index der Induktionsfrequenz der Expression von HIV verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1
    Figure 00250001
  • Entsprechend den Ergebnissen und dem vorangegangenen Bericht wird es verstanden, dass Mycoplasma fermentans eine Aktivität aufweist, um die Proliferation des Retrovirus zu induzieren. Daher ist es möglich, die Krise durch eine Untersuchung der Anwesenheit oder der Abwesenheit einer komplexen Infektion mit Mycoplasma fermentans mit z. B. dem Blut eines mit dem Retrovirus infizierten Patienten vorherzusagen. Auf diese Weise ist es möglich, eine geeignete Behandlung aufzunehmen.
  • (2) Diagnose von Rheumatismus
  • Es wird berichtet, dass Mycoplasma fermentans ein Grund für Rheumatismus ist (Williams, M. H. et al., Lancet ii: 277–280 (1970)). Es wird daher erwartet, dass die Erkrankung mit Rheumatismus durch das Nachweisen von Mycoplasma fermentans unter Verwendung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung diagnostiziert werden kann.
  • (3) Anwendung zur gezielten Therapie
  • Es wird erwartet, den Antikörper der vorliegenden Erfindung zur Prävention von Retroviren-Krisen-Erkrankungen und zur Heilung von Rheumatismus derart zu verwenden, dass ein Anti-HIV-Agens, wie z. B. Azidothymidin oder Dideoxyinosin, und/oder ein Anti-Mycoplasma-Agens an den Antikörper der vorliegenden Erfindung gebunden ist, um an einen mit dem Retrovirus infizierten Patienten oder einen Rheumatismus-Patienten verabreicht zu werden.
  • (4) Verwendung eines neutralisierenden Antikörpers zur Behandlung
  • Von dem Antikörper der vorliegenden Erfindung wird erwartet, dass er eine Aktivität als ein neutralisierender Antikörper zeigt, der an Mycoplasma fermentans bindet, um die durch Mycoplasma fermentans verursachte Infektion zu vermeiden. Die Verabreichung des Antikörpers an einen lebenden Körper macht es möglich, den Antikörper zur Heilung oder Prävention von durch Viren verursachte Erkrankungen zu verwenden, die höchstwahrscheinliche eine komplexe Infektion mit Mycoplasma fermentans aufweisen.
  • (5) Diagnose von Nephritis
  • Wie in den später beschriebenen Beispielen dargestellt, ist ein Lipid, an das der Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper der vorliegenden Erfindung bindet, hochfrequent im Blut von Patienten mit Nephritis gefunden worden. Es ist vorgeschlagen worden, dass Nephritis durch den Nachweis des Lipids diagnostiziert werden kann. Das Lipid unterscheidet sich ausgehend von der Position auf einer HPTLC von GGPL-III. Das Lipid wird jedoch dahingehend betrachtet, dass es ein Lipid ist, das eine ähnliche Antigenität wie die des GGPL-III aufweist, da der monoklonale Antikörper, der GGPL-III erkennt, an das Lipid bindet. Die Substanz, die eine ähnliche Antigenität zu der des GGPL-III aufweist, kann immunologisch unter Verwendung des Anti-Glycoglycerophospholipid-Anitkörpers der vorliegenden Erfindung gemessen werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt ein Elektrophoreseergebnis von amplifizierten Produkten, die durch einen ersten PCR-Schritt für die „Spacer"-Regionen zwischen den 16S–23S ribosomalen RNS-Genen aus verschiedenen Mycoplasmen erhalten werden, wobei:
    • 1: eine aus MT-4-Zellen aufbereitete Mycoplasma fermentans-GGPL-Linie,
    • 2: Mycoplasma fermentans PG 18,
    • 3: Mycoplasma hyorhinis DBS1050,
    • 4: Mycoplasma arginini G230,
    • 5: Mycoplasma orale CH19299,
    • 6: Mycoplasma salivarium PG20,
    • 7: Mycoplasma penetrans GTU-54-6A1 und
    • 8: eine Negativ-Kontrolle ist.
  • 2 zeigt ein Elektrophoreseergebnis von durch einen Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhaltene Fragmente, wobei die amplifizierten Produkte durch einen zweiten PCR-Schritt für eine „Spacer"-Region zwischen den 16S–23S ribosomalen RNS-Genen aus Mycoplasma fermentans erhalten werden, wobei 1: VspI, 2: HindIII, 3: ClaI, 4: HincII, 5: HaeIII, 6: keine Behandlung ist.
  • 3 zeigt ein TLC-Muster (Densitometrie) von Phospholipiden, die in einer Lipidfraktion aus Mycoplasma fermentans enthalten sind.
  • 4 zeigt ein TLC-Muster von Phospholipiden und Glycolipiden, die in Lipidfraktionen aus MT-4-Zellen enthalten sind, die mit Mycoplasma fermentans infiziert oder nicht infiziert sind, wobei PC Phosphatidylcholin angibt und SPM Sphingomyelin angibt.
  • 5 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum von GGPL-III.
  • 6 zeigt ein durch das (+)-Verfahren erhaltenes Spektrum einer Sekundär-Ionen-Massenspektrometrie aus der Lösung von GGPL-III.
  • 7 zeigt ein durch das (–)-Verfahren erhaltenes Spektrum einer Sekundär-Ionen-Massenspektrometrie aus der Lösung von GGPL-III.
  • 8 zeigt ein durch das (+)-Verfahren erhaltenes Tandem-Massen-Spektrum von GGPL-III.
  • 9 zeigt ein durch das (–)-Verfahren erhaltenes Tandem-Massen-Spektrum von GGPL-III.
  • 10 zeigt ein eindimensionales 1H-NMR-Spektrum.
  • 11 zeigt eindimensionale 1H-NMR-Spektren von 3-Aminopropan-1,2-Diol (1-Aminopropan-2,3-Diol) (A) und 2-Aminopropan-1,3-Diol (B).
  • 12 zeigt ein durch das PH-DQF-COSY-Verfahren erhaltenes zweidimensionales 1H-NMR-Spektrum von GGPL-III.
  • 13 zeigt ein zweidimensionales 1H-31P-NMR-Spektrum von GGPL-III.
  • 14 zeigt ein TLC-Ergebnis von Phospholipiden, die in Lipidfraktionen aus verschiedenen Mycoplasmen enthalten sind (gefärbt mit Dittmer-Reagenz), wobei:
    • 1: ein Mycoplasma fermentans GGPL-Stamm,
    • 2: Mycoplasma fermentans incognitus,
    • 3: ein Mycoplasma fermentans PG18-Stamm,
    • 4: ein Mycoplasma fermentans F17-Stamm,
    • 5: ein Mycoplasma fermentans F1-Stamm,
    • 6: ein Mycoplasma fermentans F7-Stamm,
    • 7: Mycoplasma arthritidis und
    • 8: Mycoplasma hominis ist.
  • 15 zeigt ein unter Verwendung eines wie in Beispiel 2 beschriebenen polyklonalen Antikörpers durch eine Immunfärbung einer Lipidfraktion aus MT-4-Zellen, die durch eine HPTLC aufbereitet sind, erhaltenes Ergebnis.
  • 16 zeigt ein unter Verwendung eines wie in Beispiel 3 beschriebenen monoklonalen Antikörpers durch eine Immunfärbung von Lipidfraktionen aus verschiedenen Mycoplasmen, welche durch eine HPTLC getrennt sind, erhaltenes Ergebnis (die Referenznummern kennzeichnen die gleichen Inhalte, wie diejenigen, die in 14 dargestellt sind).
  • 17 zeigt eine Fotografie, die ein unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung durch eine Immunfärbung von MT-4-Zellen, die mit Mycoplasma fermentans infiziert sind, erhaltenes Ergebnis darstellt.
  • 18 zeigt unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen monoklonalen Antikörpers durch eine Immunfärbung von Lipiden, die aus Blutproben von Patienten mit Nephritis oder normalen Individuen extrahiert und durch eine HPTLC aufbereitet sind, erhaltene Ergebnisse, wobei „Nephritis-Patienten" Ergebnisse für Lipide angeben, die aus den Blutproben von Patienten mit Nephritis extrahiert sind, und „normale Individuen" Ergebnisse für Lipide angeben, die aus den Blutproben von normalen Individuen extrahiert sind.
  • Bestes Verfahren zur Ausführung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird unten gemäß den Beispielen noch spezieller erklärt werden.
  • Beispiel 1: Isolierung und Strukturanalyse des neuen Glycoglycerophospholi
  • <1> Kultivierung von Mycoplasma fermentans und Herstellung von Lipiden
  • Ein Kulturüberstand aus MT-4-Zellen (menschliche T-Helfer-Zell-Linie, die mit einem menschlichen T-lymphotropischen Retrovirus Typ I (HTLV-I) infiziert ist), der GGPLs enthalten, wurde durch einen Filter filtriert, der eine Porengröße von 0,22 um aufweist. Ein erhaltenes Filtrat wurde auf ein PPLO-Brühe-Agarmedium (hergestellt von Difco Laboratories) inokuliert, um eine Kultivierung durchzuführen. Kolonien wurden isoliert und dann in einem PPLO-Brühe-Flüssigmedium kultiviert (hergestellt von Difco Laboratories), das 10% (v/v) fetales Rinderserum (FBS), 5% (w/v) Hefeextrakt (hergestellt von Flow Laboratories), 1.000 Units/ml Penicillin, 1 (w/v) Dextrose und 0,002% (w/v) Phenolrot enthält. Die gebildeten Kolonien waren spiegeleiförmig. Auf diese Weise wurde es bestätigt, dass der erhaltene Mikroorganismus ein Mycoplasma war.
  • Die DNS wurde aus diesem Mikroorganismus präpariert. Die „Spacer"-Region zwischen 16S–23S ribosomalem RNS-Genen, welche in Abhängigkeit von den Mycoplasmen-Spezies abweichen könnte, wurde mittels einer Zweischritt-PCR (Harasawa, R. et al., 1993, Res Microbiol., 144: 489–493), jeweils für Mycoplasmen-Spezies von Mycoplasma fermentans, die aus MT-4-Zellen, aus einem Mycoplasma fermentans Gattungsstamm PG18, Mycoplasma hyorhinis DBS1050 (ATCC 17981), Mycoplasma arginini G230 (ATCC 2383), Mycoplasma orale CH19299, Mycoplasma salivarium PG20 (ATCC 23064) und Mycoplasma penetrans GTU-54-6A1 isoliert sind, analysiert. Ein Produkt aus dem ersten PCR-Schritt dieses Mikroorganismus war als ein Ergebnis übereinstimmend mit dem des PG18-Stamms, als der Gattungsstamm von Mycoplasma fermentans (1). Des Weiteren wurde ein amplifiziertes Produkt, das durch den zweiten PCR- Schritt unter Verwendung des PCR-Produkts erhalten wurde, mit VspI und HindIII verdaut, und es wurde nicht mit ClaI, HincII und HaeIII verdaut (2). Auf diese Weise wurde dieser Mikroorganismus als der Mycoplasma fermentans identifiziert, der als GGPL-Stamm (M. fermentans GGPL-Stamm) bezeichnet wurde.
  • Zu den mikrobiellen Zellen (1 g) von Mycoplasma fermentans, die durch die Kultivierung entsprechend dem oben beschriebenen Verfahren erhalten werden, wurde Methanol (100 ml) hinzugegeben, gefolgt vom Stehenlassen für einige Stunden. Chloroform (200 ml) wurde dazu gegeben und die Präparation wurde einer Ultraschallbehandlung unterzogen, gefolgt vom Stehenlassen für mehrere Stunden. Die Präparation wurde mit einem Potter-Typ-Teflon-Homogenisiergerät homogenisiert, um ein Homogenat zu erhalten, das bei 10.000 rpm zentrifugiert wurde, um daraus einen Überstand zu gewinnen. Der Überstand wurde verdampft und auf diese Weise wurde ein Lipidextrakt (50 mg) erhalten.
  • <2> Analyse einer Lipidfraktion aus Mycoplasma fermentans
  • Die wie oben beschrieben erhaltene Lipidfraktion aus Mycoplasma fermentans wurde auf eine HPTLC (hochauflösende Dünnschicht-Chromatographie)-Platte (hergestellt von Merck) aufgetragen und mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform: Methanol: 0,2% (w/v) Kalziumchlorid wässrige Lösung = 50 : 45 : 10 (v/v/v) entwickelt. Das Phospholipid wurde mit Dittmer-Reagenz gefärbt. Ein Phospholipid-Muster wurde auf der Basis einer Adsorption bei 580 nm unter Verwendung eines TLC-Densitometers (CS910, hergestellt von Shimadzu) gemessen. Als ein Ergebnis wurden sechs Banden (Lipid i, Lipid ii, Lipid iii, Lipid iv, Lipid v und Lipid vi) nachgewiesen (3).
  • Lipidfraktionen wurden aus MT-4-Zellen, die mit Mycoplasma fermentans infiziert sind, und aus MT-4-Zellen extrahiert, die durch Behandlung der erstgenannten Zellen mit einem Anti-Mycoplasmen-Agens (MC201, hergestellt von Dainippon Pharmaceutical) gemäß einem bekannten Verfahren (Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911–917 (1959)) erhalten werden. Die jeweiligen Extrakte der Lipidfraktionen wurden auf eine HPTLC (hochauflösende Dünnschicht-Chromatographie)-Platte (hergestellt von Merck) aufgetragen und mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform: Methanol: 0,2% (w/v) Kalziumchlorid wässrige Lösung = 50 : 45 : 10 (v/v/v) entwickelt. Das Glycolipid wurde mit dem Orcinol-Reagenz gefärbt und das Phospholipid wurde mit einem Dittmer-Reagenz gefärbt. Als ein Ergebnis wurden zwei Banden nachgewiesen, die in MT-4 (GGPL+) gefunden wurden, und die nicht in MT-4 (GGPL–) gefunden wurden (4). Eine der beiden Banden wurde als GGPL-I mit seiner schon bekannten Struktur identifiziert, und die andere wurde als GGPL-III identifiziert. Andere Dittmer-Reagenz-positive-Banden wurden als GM2, GM1a und GD1a identifiziert und andere Orcinol-Reagenz-positive-Banden wurden als Phosphatidylcholin und Sphingomyelin identifiziert (Matsuda, K. et al., Biochem Biophys. Acta, 1168; 123–129 (1993)).
  • Eine Lipidfraktion wurde aus MT-4-Zellen (mit dem Anti-Mycoplasmen-Agens PC201 behandelt) extrahiert, die unter Zugabe eines Kulturüberstandes aus MT-4-Zellen (infiziert mit Mycoplasma fermentans) kultiviert werden, die durch einen Filter, der eine Porengröße von 0,22 μm aufweist, gegeben werden. Die extrahierte Lipidfraktion wurde in der gleichen Weise wie oben beschrieben durch eine HPTLC analysiert. Als ein Ergebnis wurden die zwei oben beschriebenen Banden nachgewiesen. Es ist daher klar, dass die zwei Banden, d. h., GGPL-I und GGPL-III, von Mycoplasma fermentans stammen.
  • Gemäß dem Verhalten bei der TLC, wurde es offenbart, dass GGPL-I und GGPL-III den oben beschriebenen aus Mycoplasma fermentans stammenden Lipid v bzw. dem Lipid iv entsprachen. Gemäß den Ergebnissen der FAB-Massen-Spektrometrie wurde es bestätigt, dass GGPL-I identisch mit Lipid v war und GGPL-III identisch mit Lipid iv war.
  • Eine Extraktion wurde unter Verwendung von Chloroform: Methanol-Lösungsmitteln = 2 : 1, 1 : 1 und 1 : 2 (400 ml) aus MT-4-Zellen (60 ml, Nassvolumen) durchgeführt, die mit Mycoplasma fermentans infiziert sind, um ein Gesamt-Lipid von 993 mg zu erhalten. Das Gesamt-Lipid wurde auf eine DEAE-Sephadex-A-25-Säule aufgetragen, um es in eine nicht-adsorptive Fraktion (neutrale Fraktion) und eine adsorptive Fraktion (saure Fraktion) zu trennen. Auf diese Weise wurden 775 mg der nicht-adsorptiven Fraktion erhalten. Die nicht-adsorptive Fraktion wurde auf eine Iatrokügelchen-Säule (hergestellt von Iatron) aufgetragen und dreimal mit einem Konzentrationsgradienten von Chloroform/Methanol/Wasser (83 : 16 : 0,5 bis 20 : 80 : 8, v/v/v) fraktioniert. Schließlich wurde eine Elution mit einem Konzentrationsgradienten von 1-Propanol/wässriges Ammonium/Wasser (80 : 5 : 15 bis 75 : 5 : 20, v/v/v) durchgeführt, um 3 mg des GGPL-III zu isolieren.
  • <3> GGPL-III-Strukturanalyse
  • GGPL-III war positiv mit dem Orcinol-Reagenz, dem Dittmer-Reagenz und dem Dragendorff-Reagenz, und es wurde durch eine Behandlung mit mildem Alkali abgebaut. Das GGPL-I war negativ in der Ninhydrin-Reaktion, jedoch war das GGPL-III positiv in der Ninhydrin-Reaktion. Gemäß diesen Ergebnissen wurde es offenbart, dass GGPL-III ein Cholin enthaltendes Glycophospholipid war.
  • Des Weiteren wurden, wie unten beschrieben, Strukturanalysen von GGPL-III durchgeführt.
  • (1) Infrarot-Absorptions-Spektrum-Messung
  • Ein Infrarot-Absorptions-Spektrum von GGPL-III wurde unter Verwendung eines Infrarot-Spektrophotometers (FTIR-8100M, hergestellt von Shimadzu) gemessen, das mit einem Infrarot-Mikroskop (IMS-8000, hergestellt von Shimadzu) ausgestattet ist. Ein Ergebnis ist in 5 gezeigt.
  • Als ein Ergebnis wurden Absorptionsbanden nachgewiesen, die einer -CH2- Gruppe und einer -CH3-Gruppe (2957, 2920, 2852, 1467, 1419, 1378 cm–1), einer Hydroxyl-Gruppe (3271 cm–1), einer Estercarbonyl-Gruppe (1740, 1165 cm–1), einer Phosphat-Gruppe (1091 cm–1), einer Cholin-Gruppe (970 cm–1) bzw. einer primären Amingruppe (1560 bis 1670 cm–1) entsprechen.
  • (2) Sekundär-Ionen-Massenspektrometrie aus der Lösung (LSIMS)
  • Das wie oben beschrieben gereinigte GGPL-III (etwa 1 μg) wurde in einer gemischten Lösung (1 μL) aus Chloroform : Methanol (1 Volumen : 1 Volumen) aufgelöst. 3-Nitrobenzylalkohol wurde in dem Fall des (+)-Verfahrens oder Triethanolamin in dem Fall des (–)-Verfahrens als eine Matrix in einer Menge von 0,5 mL zu der Lösung hinzugegeben und gemischt. Die erhaltene gemischte Lösung wurde als eine Probe verwendet, um eine Sekundär-Ionen-Massen-Spektrometrie-Analyse aus der Lösung unter Verwendung eines TSQ-70-dreifachquadropol-Massen-Spektrometers (hergestellt von Finnegan MAT) durchzuführen. Ein auf 20 keV beschleunigtes Cäsium-Ion (CS+) wurde als ein primärer Ionen-Fluss verwendet. Das Spektrum wurde bei einer Geschwindigkeit von 250 Atommasseneinheit (amu)/sec erhalten. Ein durch das (+)-Verfahren erhaltenes Spektrum ist in 6 gezeigt und ein durch das (–)-Verfahren erhaltenes Spektrum ist in 7 gezeigt.
  • Als ein Ergebnis wurden bei dem (+)-Verfahren Ionen bei m/z = 1021, m/z = 1049 und m/z = 1077 beobachtet. Es wurde gemäß dieser Tatsache vorgeschlagen, dass mindestens drei Arten von GGPL-III-Molekülen existierten, die unterschiedliche Fettsäurezusammensetzungen aufweisen. Es wurde gefolgert, dass eine Hauptkomponente von GGPI-III durch einen Peak von m/z = 1049 dargestellt wurde, dessen Molekulargewicht von 1048 durch Subtraktion einer Protonmasse von 1 von 1049 erhalten wird. Es wurde also gefolgert, dass die anderen Komponenten Molekulargewichte von 1020 und 1076 hatten.
  • Bei dem (–)-Verfahren wurden Ionen bei m/z = 1047, m/z = 1076 und m/z = 1103 beobachtet. Beurteilden aus der Kombination mit der Spektro-Analyse, die auf das (+)-Verfahren basiert, wurde es vorgeschlagen, dass mindestens vier Arten von GGPL-III-Molekülen existierten, die unterschiedliche Fettsäurezusammensetzungen aufweisen. Es wurde gefolgert, dass eine Hauptkomponente von dem bei dem (–)-Verfahren beobachteten GGPL-III durch einen Peak von m/z = 1047 dargestellt wurde, dessen Molekulargewicht von 1048 durch Addieren einer Masse eines Protons von 1 zu 1047 erhalten wird. Es wurde auch gefolgert, dass eine andere Komponente ein Molekulargewicht von 1104 hatte. Ein von dem Ion von m/z = 1076 abgeleitetes Molekulargewicht war 1077. Ein Molekulargewicht von 1076 wurde jedoch aus dem Ergebnis des (+)-Verfahrens abgeleitet. Ein Unterschied zwischen diesem Molekulargewicht und dem Molekulargewicht einer anderen Komponente entsprach einer Menge von 2 Methylen-Gruppen. Es wurde entsprechend gefolgert, dass das Molekulargewicht 1076 war.
  • (3) Tandem-Massen-Spektrometrie (MS/MS)
  • Proben, die in der gleichen Weise wie die für die LSIMS verwendeten Proben präpariert wurden (eine Probe für das (+)-Verfahren und eine Probe für das (–)-Verfahren) wurden verwendet, um die Tandem-Massen-Spektren unter Verwendung eines TSQ-70-dreifach-Quadropol-Massen-Spektrometers (hergestellt von Finnegan MAT) zu messen. Ein auf 20 keV beschleunigtes Cäsium-Ion (Cs+) wurde als ein primärer Ionenfluss verwendet. Algon, welches bei 0,26 Pascal (2,0 mTorr) gehalten wurde, wurde als ein CAD (Niedrig-Energie-Aufprall-aktivierte-Dissoziation)-Gas verwendet. Das Spektrum wurde bei einer Geschwindigkeit von 250 Atommasseneinheit (amu)/sec erhalten. Ein durch das (+)-Verfahren erhaltenes Spektrum ist in 8 gezeigt und ein durch das (–)-Verfahren erhaltenes Spektrum ist in 9 gezeigt.
  • Als ein Ergebnis wurden Ionen bei m/z = 184 und m/z = 1094 bei dem (+)-Verfahren beobachtet. Gemäß dem Vorhandensein des Ions bei m/z = 184 wurde es vorgeschlagen, das Phosphocholin in dem GGPL-III-Molekül vorhanden war. Es wurde gefolgert, dass das Molekulargewicht von GGPL-III 1048 war, welches durch Subtraktion einer Masse eines Protons von 1 von 1049 erhalten wird. Bei dem (–)-Verfahren wurde ein Ion bei m/z = 1047 beobachtet. Es wurde gemäß dieser Tatsache gefolgert, dass das Molekulargewicht von GGPL-III 1048 war, welches durch Addition einer Masse eines Protons von 1 zu 1047 erhalten wird. Es wurde bestätigt, dass innerhalb der Vielfalt der Arten von GGPL-III's, die durch die LSIMS nahe gelegt sind, das Molekül, welches das Molekulargewicht von 1048 aufweist, die Hauptkomponente war.
  • (4) Eindimensionales 1H-NMR-Spektrum
  • Das mit Deuterium (2H) substituierte GGPL-III (500 μg), Phosphatidylcholin (2 mg) und D-Glucose-6-Phosphat-Dinatrium-Salz (hergestellt von Oriental Yeast) (etwa 200 μg) wurden in 0,5 ml eines aus [2H]-Dimethyl-Sulfoxid ((C2H3)2SO) : 2H2O (98 Volumen: 2 Volumen) zusammengesetzten Lösungsmittels aufgelöst, um entsprechend 1H-NMR-Spektren bei 60°C bei 400 MHz unter Verwendung eines GX-400-Spektrometers (hergestellt von JEOL) zu erhalten. Textramethylsilan wurde als ein Standard verwendet.
  • Ein integrierter Wert eines Glucosesignals (GlcH1) wurde als 1,00 betrachtet, um das Spektrum zu standardisieren und Intensitäten der anderen Signale sind quantifiziert. Ein Ergebnis ist in 10 gezeigt.
  • Als ein Ergebnis wurden Signale von Glycerol (Gro) bei 4,319 ppm (GroH1b), 4,145 ppm (GroH1a), 5,118 ppm (GroH2), 3,677 ppm (GroH3b) und bei 3,562 ppm (GroH3a) nachgewiesen. Cholin-Signale wurden bei 4,074 ppm (-POCH2-), 3,529 ppm (-CH2N≡) und bei 3,139 ppm (-N(CH3)3) nachgewiesen. Das GGPL-III-Spektrum wurde mit den durch das vorangegangene Verfahren unter Verwendung von Standardproben von 3-Aminopropan-1,2-Diol (1-Aminopropan-2,3-Diol) bzw. von 2-Aminopropan-1,3-Diol erhaltenen eindimensionalen 1H-NMR-Spektren verglichen (siehe 11a und entsprechend 11b). Als ein Ergebnis wurde es herausgefunden, dass 2-Aminopropan-1,3-Diol höchstwahrscheinlich im GGPL-III enthalten war. Des Weiteren wurde deutlich ein Signal bei 4,647 ppm (GlcHI) als ein Glucosesignal (Glc) nachgewiesen.
  • (5) Zweidimensionales 1H-NMR-Spektrum
  • Die in der gleichen Weise wie jene für das eindimensionale 1H-NMR-Spektrum hergestellten Proben wurden verwendet, um eine zweidimensionale 1H-NMR-Analyse bei 60°C bei 400 MHz gemäß dem pH-DQF-COSY-Verfahren mit einer Breite von 2.000 Hz für jede Dimension unter Verwendung eines FX-400-Spektrometers (hergestellt von JEOL) durchzuführen. Ein Ergebnis ist in 12 gezeigt.
  • Als ein Ergebnis wurden Protonensignale beobachtet, die vom Diacylglycerol stammen (GroH2/H1b, GroH2/H1a, GroH2/H3b, GroH2/H3a in 12). Protonensignale von Cholin wurden beobachtet (-CH2-N-/-CH2OP- in 12).
  • (6) Zweidimensionales 1H-31P-NMR-Spektrum
  • Die in der gleichen Weise wie jene für die eindimensionale 1H-NMR hergestellten Proben wurden verwendet, um ein zweidimensionales 1H-31P-HMQC-Spektrum bei 60°C bei 400 MHz unter Verwendung eines FX-400-Spektrometers (hergestellt von JEOL) zu erhalten. Ein Ergebnis ist in 13 gezeigt.
  • Als ein Ergebnis wurde ein dem wie oben bei der 1H-NMR erhaltenes äquivalentes Spektrum für die erste Dimension (1H-NMR) erhalten, und zwei Signale wurden von der zweiten Dimension (31P-NMR) erhalten. Diese Tatsache deutet an, dass zwei Phosphoratome (P) in einem GGPL-III-Molekül enthalten sind.
  • Es wurde kein Kreuz-Peak zwischen Positionen in der ersten Dimension an denen Signale von 2-, 3-, 4- und 5-Protonen des Glucoserests erschienen (in der Umgebung von 2,9 bis 3,0 ppm) und Positionen in der zweiten Dimension nachgewiesen, bei der Phosphor-Signale erschienen (–0,9 ppm und 1,1 ppm). Es wurde entsprechend gefordert, dass eine Verbindung Phosphor enthält, der an der 1-Position oder 6-Position eines Glucoserests gebunden ist. Des Weiteren wurden Kreuz-Peaks zwischen einem Signal eines 6a-Protons eines Glucoserests (in der Umgebung von 4,0 ppm in der ersten Dimension) und einem Phosphor-Signal in der zweiten Dimension (–0,9 ppm) und entsprechend zwischen einem Signal eines 6b-Protons eines Glucoserests (in der Umgebung von 3,6 ppm in der ersten Dimension) und Phosphor-Signalen in der zweiten Dimension (–0,9 ppm und 1,1 ppm) nachgewiesen.
  • Des Weiteren wurde ein Kreuz-Peak zwischen einem Cholin-Signal in der ersten Dimension (etwa 4,05 bis 4,1 ppm) und einem Phosphor-Signal in der zweiten Dimension (–0,9 ppm) nachgewiesen. Entsprechend war es möglich, eine Phosphocholin-Struktur anzunehmen, in der eine Phosphatgruppe an Cholin gebunden ist. Des Weiteren wurde der Kreuz-Peak des Phosphocholins von dem Signal des 6a-Protons des Glucoserests (in der Umgebung von 4,0 ppm in der ersten Dimension) abgeleitet. Entsprechend wurde eine Struktur gefordert, in der der Phosphorester des Aminopropandiols erstens an der 6-Position des Glucoserests gebunden ist und des Weiteren Phosphocholin an den Phosphorester des Aminopropandiols gebunden ist.
  • Aus der Zusammenfassung der vorangegangenen Ergebnisse beurteilend, ist GGPL-III ein neues Glycoglycerophospholipid, das die folgenden Eigenschaften aufweist:
    • (A) das Glycoglycerophospholipid ist mit einem Orcinol-Reagenz, einem Dittmer-Reagenz, einem Dragendorff-Reagenz und einem Ninhydrin-Reagenz reaktiv,
    • (B) das Glycoglycerophospholipid ist mit Alkali abbaubar,
    • (C) das Glycoglycerophospholipid wird als eine nicht-adsorptive Fraktion bei der Fraktionierung mit einem Anion-Austauscher, der eine DEAE-Gruppe aufweist, erhalten und
    • (D) das Glycoglycerophospholipid weist ein unter Verwendung eines Massenspektrometers gemessenes Molekulargewicht von 1048 + 28n auf, wobei n –1, 0, 1 oder 2 ist.
  • Des Weiteren ist es durch die vorangegangenen Ergebnisse gezeigt worden, dass GGPL-III konstitutionelle α-Glucopyranosyl-(1'-3)-1,2-Diacyl-sn-Glycerol-, Phosphocholin- und Aminopropandiol-Phosphorester-Komponenten enthält. Der Aminopropandiol-Phosphorester ist ein 2-Aminopropan-1,3-Diol-Phosphorester. Es wird gefordert, dass seine Bindungsstelle die 6'-Position des α-Glucopyranosyl-(1'-3)-1,2-Diacyl-sn-Glycerols-Glucoserests ist. Es wird des Weiteren vorgeschlagen, dass Phosphocholin an den 2-Aminopropan-1,3-Diol-Phosphorester bindet.
  • Die entsprechenden GGPL-III-Moleküle, die die unterschiedlichen Molekulargewichte aufweisen, weisen unterschiedliche Arten von Acylgruppen in einem α-Glucopyranosyl-(1'-3)-1,2-Diacyl-sn-Glycerol auf. Es wird vorgeschlagen, dass jede Acylgruppe in der Hauptkomponente (Molekulargewicht 1048) eine Palmitoyl-Gruppe ist. Eine vollständig abgeleitete Struktur ist eine wie durch die vorangegangene Formel (I) dargestellte. Die GGPL-III-Moleküle, die andere Molekulargewichte aufweisen, sind in einer Länge der Acyl-Gruppe unterschiedlich. Es wird gefordert, dass das Molekül, das das Molekulargewicht von 1020 aufweist, eine Myristoyl-Gruppe und eine Palmitoyl-Gruppe aufweist, dass das Molekül, das das Molekulargewicht von 1076 aufweist, eine Palmitoyl-Gruppe und eine Stearoyl-Gruppe aufweist, und dass das Molekül, das ein Molekulargewicht von 1104 aufweist, zwei Stearoyl-Gruppen oder eine Palmitoyl-Gruppe und eine Eicosanoyl-Gruppe aufweist. Details sind jedoch nicht aufgeklärt.
  • <4> Analyse von Lipidkomponenten aus verschiedenen Mycoplasmen-Spezies
  • Verschiedene Mycoplasmen-Spezies (Mycoplasma fermentans GGPL-Stamm, Mycoplasma fermentans incognitus (ATCC 53949), Mycoplasma fermentans PG18-Stamm, Mycoplasma fermentans F17-Stamm, Mycoplasma fermentans F1-Stamm, Mycoplasma fermentans F7-Stamm, Mycoplasma arthritidis und Mycoplasma hominis (ATCC 15488)) wurden in einem PPLO-Brühe-Flüssigmedium (hergestellt von Difco Laboratories) kultiviert, welches 10% (v/v) FBS (fetales Rinderserum), 5% (w/v) Hefeextrakt (hergestellt von Flow Laboratories), 1.000 Units/ml Penicillin, 1% (w/v) Dextrose und 0,002% (w/v) Phenolrot enthält. Die Lipide wurden aus den erhaltenen Kulturflüssigkeiten entsprechend einem bekannten Verfahren (Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911–917 (1959)) extrahiert. Die Lipid-Extrakte wurden auf eine HPTLC-Platte (hergestellt von Merck) aufgetragen und mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform: Methanol: 0,2% (w/v) Kalziumchlorid wässriger Lösung = 50 : 45 : 10 (v/v/v) entwickelt. Die Platte wurde für 30 Sekunden in 0,4% Polyisobutylmethacrylsäuresalz getaucht, das in Hexan gelöst ist. Die Platte wurde gemäß einem gewöhnlichen Verfahren mit einem Dittmer-Reagenz gefärbt. Ein Ergebnis ist in 14 gezeigt. Entsprechend diesem Ergebnis wurden die zu GGPL-I und GGPL-III entsprechenden Banden nur in den betreffenden Spezies von Mycoplasma fermentans gefunden, und die Banden wurden nicht in anderen Mycoplasmen-Spezies gefunden. Es ist gemäß dieser Tatsache gefolgert worden, dass GGPL-I und GGPL-III charakteristische Glycoglycerophospholipide von Mycoplasma fermentans sind.
  • Beispiel 2: Herstellung eines polyklonalen Anti-Mycoplasma-Glycolipid-Antikörpers
  • Monophosphat-Lipid A (50 μg, hergestellt von Ribi ImmunoChem Research) und ein komplettes Adjuvanz (50 μg, hergestellt von nacalai tesque) wurden zu dem wie oben beschrieben erhaltenen Lipid-Extrakt (50 mg) aus Mycoplasma fermentans hinzugegeben, zudem des Weiteren Mineralöl (250 μl) hinzugegeben wurde, gefolgt vom Zermahlen bei 400 rpm für zwei Minuten. Des Weiteren wurde PBS dazugegeben, das 0,1% (v/v) Tween 80 (250 ml) enthält, gefolgt vom Zermahlen bei 400 rpm für zwei Minuten, um eine Emulsion (0,5 ml) zu erhalten, die das Lipid-Extrakt enthält.
  • Die durch das vorangegangene Verfahren hergestellte Emulsion wurde subkutan in sieben Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse in einer Menge von 0,5 ml pro Individuum injiziert. Zwei Wochen und drei Wochen nach der Grundimmunisierung wurde die durch das vorangegangene Verfahren hergestellte Emulsion, die das Lipid-Extrakt enthält, intraperitoneal in einer Menge von 0,5 ml pro Individuum injiziert.
  • Ein Serum wurde wie oben beschrieben aus dem Blut der immunisierten Mäuse aufbereitet. Das Serum wurde folgendermaßen verwendet, um eine Immunfärbung durchzuführen. Eine Lipidfraktion wurde gemäß einem bekannten Verfahren (Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911–917 (1959)) aus GGPL-positiven MT-4-Zellen extrahiert. Das Extrakt der Lipidfraktion wurde auf eine hochauflösende Dünnschichtchromatographie (HPTLC)-Platte (hergestellt von Merck) aufgetragen und mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform: Methanol: 0,2% (w/v) Kalziumchlorid wässrige Lösung = 50 : 45 : 10 (v/v/v) entwickelt. Die Platte wurde für 30 Sekunden in 0,4% Polyisobutylmethacrylsäuresalz getaucht, das in Hexan aufgelöst ist, und dann an der Luft getrocknet.
  • Das vorangegangene Serum oder ein Serum einer nicht-immunisierten Maus wurde als ein primärer Antikörper zu der HPTLC-Platte hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4°C. Die HTPLC-Platte wurde mit PBS gewa schen. Danach wurde ein mit Peroxidase markierter Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (hergestellt von Cappel) als ein sekundärer Antikörper zu der HPTLC-Platte hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation für vier Stunden bei Raumtemperatur. Die HPTLC-Platte wurde mit reinem Wasser gewaschen. Danach wurden Banden von Antigenen unter Verwendung eines Peroxidase-Farbe-Entwicklungs-Kits (KONICA Immunfärbe-HRPKit, hergestellt von Konica) nachgewiesen. Ein Ergebnis ist in 15 gezeigt. Es wurde gemäß diesem Ergebnis bestätigt, dass das vorangegangene Serum einen polyklonalen Antikörper gegen GGPL-I und GGPL-III enthielt.
  • Beispiel 3: Herstellung eines monoklonalen Anti-GGPL-III-Antikörpers
  • (1) Herstellung eines Hybridoms
  • Eine Emulsion, die das Lipid-Extrakt aus Mycoplasma fermentans enthält, wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 beschrieben subkutan in sieben Woche alte weibliche BALB/c-Mäuse in einer Menge von 0,5 ml pro Individuum injiziert. Zwei Wochen und drei Wochen nach der Grundimmunisierung wurde die das Lipid-Extrakt enthaltene Emulsion, die durch das vorangegangene Verfahren hergestellt wird, in einer Menge von 0,5 ml pro Individuum intraperitoneal injiziert.
  • Vier Tage nach der Schlussimmunisierung wurden die Milzen der Mäuse exzisiert und eine schwimmende Zellsuspension unter Verwendung eines RMPI-1640-Mediums hergestellt. Die Milzzellen (2 × 108-Zellen) wurden mit Maus-Myelom-SP2/0-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase (Azaguanin-resistent, nicht-IgG-sekretierbar, ATCC CRL-1581, 2 × 107-Zellen) gemischt, gefolgt von einer Zentrifugation, um ein rückständiges Präzipitat zu erhalten, zu dem 45% Polyethylen-Glycol (PEG-4000, hergestellt von Wako Pure Chemical, 1 ml) über eine Minute unter leichtem Schütteln hinzugegeben wurde, gefolgt von einer Inkubation für zwei Minuten bei 37°C unter leichtem Schütteln. Ein RPMI-1640-Medium (1 ml) wurde über eine Minute dazugegeben, gefolgt von leichtem Schütteln. Das gleiche Medium (1 ml) wurde über eine Minute dazu gegeben, gefolgt von leichtem Schütteln. Danach wurde des Weiteren das gleiche Medium (8 ml) über drei Minuten dazugegeben.
  • Nach einer Zentrifugation der gemischten Zellsuspension wurden die Zellen in RPMI-1640-Medium (50 ml) „gefloatet", das 10% fetales Kalbserum (FCS) enthält. Die Suspension wurde dispensiert und in Löcher von vier 96-Loch-Mikroplatten in einer Menge von 100 μl pro Loch gegossen. Die Zellen wurden in einem Kohlendioxid-Gas-Inkubator (5% Kohlendioxidgas, 37°C) kultiviert. Nach 24 Stunden wurde das Medium gegen ein HAT-Medium (10% (v/v) FCS-Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält) ausgetauscht und die Zellen wurden weiterhin in einem Kohlendioxid-Gas-Inkubator (5% Kohlendioxidgas, 37°C) kultiviert. Vier Tage nach dem Beginn der Kultivierung in dem HAT-Medium wurde frisches HAT-Medium in einer Menge von 100 μl pro Loch hinzugegeben. Sieben Tage nach dem Beginn der Kultivierung in dem HAT-Medium wurde das Medium gegen ein HT-Medium (hergestellt durch Entfernen des Aminopterin aus dem HAT-Medium) ausgetauscht. An dem dem Austausch folgenden Tag wurde das Medium mit einem RPMI-1640-Medium ausgetauscht, das 10% (v/v) enthält, und dann wurde die Anwesenheit oder die Abwesenheit einer Kolonie-Bildung überprüft.
  • (2) Selektion des Antikörper herstellenden Hybridoms
  • Die Lipidfraktion aus Mycoplasma fermentans (20 μg) wurde in 10 ml Ethanol gelöst, um eine Lösung herzustellen, die in Löcher einer 96-Loch-Mikroplatte in einer Menge von 50 μl pro Loch hinzugegeben wurde, gefolgt vom Getrocknetwerden mit einem Trockner für 30 Minuten. PBS, das 1% (w/v) Rinderserum Albumin (BSA) enthält, wurde in einer Menge von 100 μl pro Loch dazugegeben, gefolgt vom Stehenlassen bei Raumtemperatur für eine Stunde. Die Löcher wurden fünfmal mit einer 0,3 m Sucrose-Lösung in einer Menge von 100 μl pro Loch gewaschen. Danach wurden die wie Kulturüberstände, die wie oben beschrieben aus den Kulturen erhaltenen werden, zu den entsprechenden Löchern in einer Menge von 100 μl pro Loch hinzugegeben, gefolgt vom Schütteln bei Raumtemperatur für 60 Minuten. Die entsprechenden Löcher wurden mit einer 0,05% Tween-20-Lösung gewaschen. Danach wurde ein Peroxidase markierter Anti-Maus-IgG-Antikörper (hergestellt von Cappel), der 500-Mal mit PBS verdünnt ist, zu den Löchern in einer Menge von 50 μl pro Loch hinzugegeben, gefolgt vom Schütteln bei Raumtemperatur für 60 Minuten.
  • Die entsprechenden Löcher wurden mit einer 0,05% Tween-20-Lösung gewaschen. Danach wurde ein Zitratpuffer, der 10 mg Ortho-Phenylendiamin und 50 μl einer 30%igen (v/v) Wasserstoff-Peroxid wässrigen Lösung pro 10 ml des Puffers enthält, zu den Löchern in einer Menge von 100 μl pro Loch hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Schwefelsäure (0,5 M) wurde in einer Menge von 100 μl pro Loch zu den Löchern hinzugegeben, um die Enzymreaktion der Peroxidase zu stoppen, und dann wurde das Absorptionsvermögen bei 490 nm unter Verwendung eines Mirkoplatten-Lesers gemessen.
  • Die Antikörper produzierenden Hybridomen wurden gemäß dem limitierenden Verdünnungs-Verfahren einer wiederholten Klonierung unterzogen. Ein primäres Screenen wurde mittels eines ELISA durchgeführt, das auf der Verwendung des Antigens der Lipidfraktion des Mycoplasma fermentans basiert. Die beim ELISA positiven Kolonien wurden des Weiteren einem sekundären Screenen mittels einer Immunfärbung für die Lipidfraktion aus Mycoplasma fermentans auf einer HPTLC unterzogen. Auf dieser Weise wurde ein Hybridom-Stamm, d. h., ein MF-III-1-Stamm erhalten, der einen monoklonalen Antikörper herstellt, der eine Reaktions-Spezifität zu GGPL-III aufweist. Dieser Stamm wurde im National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry unter einer Hinterlegungsnummer FERM P-14324 hinterlegt und für die internationale Hinterlegung, die auf dem Budapester Übereinkommen vom 26. Mai 1995 basiert, übermittelt und erhielt eine Hinterlegungsnummer FERM BP-5115.
  • (3) Herstellung eines monoklonalen Antikörpers
  • Der monoklonale Antikörper gegen GGPL-III wurde durch Kultivierung des MF-III-1-Stamms in RMPI-1640-Medium, das 10% (v/v) FCS enthält, und durch Gewinnung dessen Kulturüberstandes erhalten.
  • Beispiel 4: Evaluation eines monoklonalen Antikörpers durch Immunfärbung
  • Eine Immunfärbung wurde wie unten beschrieben unter Verwendung des erhaltenen Anti-GGPL-III-monoklonalen-Antikörpers durchgeführt. Lipidfraktionen aus verschiedenen Mycoplasmen-Spezies (Mycoplasma fermentans GGPL-Stamm, Mycoplasma fermentans incognitus (ATCC 53949), Mycoplasma fermentans PG18-Stamm, Mycoplasma fermentans F17-Stamm, Mycoplasma fermentans F1-Stamm, Mycoplasma fermentans F7-Stamm, Mycoplasma arthritidis und Mycoplasma hominis (ATCC 15488)) wurden entsprechend einem bekannten Verfahren (Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol., 37 911–917 (1959)) extrahiert. Die Extrakte der Lipidfraktionen wurden auf eine hochauflösende Dünnschichtchromatographie (HPTLC)-Platte (hergestellt von Merck) aufgetragen und mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform: Methanol: 0,2% (w/v) Kalziumchlorid wässrige Lösung = 50 : 45 : 10 (v/v/v) entwickelt.
  • Die Platte wurde für 30 Sekunden in 0,4% (w/v) Polyisobutylmethacrylsäuresalz getaucht, das in Hexan gelöst ist, und dann an der Luft getrocknet. Der oben beschriebene Anti-GGPL-III-monoklonale-Antikörper wurde als ein primärer Antikörper auf die HPTLC-Platte gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 4°C über Nacht. Die HPTLC-Platte wurde mit PBS gewaschen. Danach wurde ein Peroxidase markierter Anti-Maus-IgG-Antikörper (hergestellt von Cappel) als ein sekundärer Antikörper auf die HPTLC-Platte hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für vier Stunden. Die HPTLC-Platte wurde mit reinem Wasser gewaschen. Danach wurden die Banden des Antigens unter Verwendung eines Peroxidase-Farbe-Entwicklungs-Kits (KONICA Immunfärbe-HRPKit, hergestellt von Konica) nachgewiesen. Ein Ergebnis ist in 16 gezeigt.
  • Entsprechend diesem Ergebnis ist es klar, dass der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung spezifisch an das Glycoglycerophospholipid aus Mycoplasma fermentans bindet, und nicht an Phospholipide oder Glycolipide aus Mycoplasma arthritidis und Mycoplasma hominis bindet. Was die auf der HPTLC mit Dittmer-Reagenz und dem Orcinol-Reagenz gefärbten Banden betrifft, wurde die Bande von GGPL-I und die als GM2, GM1a, GD1a, Phosphatidylcholin und Sphingomyelin identifizierten Banden nicht bei der Immunfärbung gefunden. Dem nach bindet der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung nur spezifisch an GGPL-III.
  • Als nächstes wurden die mit Mycoplasma fermentans infizierten MT-4-Zellen mit dem Anti-GGPL-III-monoklonalen-Antikörper als einen primären Antikörper und einem Fluorescein-Isothiozyanat (FITC) markierten Anti-Maus-IgG-Antikörper als einen sekundären Antikörper gefärbt, gefolgt durch die Beobachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop. Ein Ergebnis ist in 17 gezeigt.
  • Entsprechend diesem Ergebnis ist es klar, dass Mycoplasma fermentans unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden kann.
  • Beispiel 5: Nachweis von GGPL-III oder einer Substanz, die eine ähnlich Antigenität zu GGPL-III aufweist, im Blut von Patienten mit Nephritis
  • Seren wurden aus den Blutproben von Patienten mit Nephritis und normalen Individuen gemäß einem gewöhnlichen Verfahren hergestellt. Gesamtlipide in den Seren wurden aus den Seren (jedes 100 μl) mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform: Methanol (2 : 1, 1 : 1 und 1 : 2 (v/v), jedes 100 μl) gemäß einem bekannten Verfahren (Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911–917 (1959)) extrahiert. Das extrahierte Lösungsmittel wurde in drei Schichten unterteilt, von denen die unterste Schicht gewonnen wurde. Die gewonnene Fraktion wurde gegen Wasser dialysiert und dann lyophilisiert. Die Proben, die wie oben beschrieben erhalten werden, wurden auf eine hochauflösende Dünnschichtchromatographie (HPTLC)-Platte (hergestellt von Merck) aufgetragen und mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform: Methanol: 0,2% (w/v) Kalziumchlorid wässrige Lösung (50 : 45 : 10 (v/v/v)) entwickelt. Ein gereinigtes GGPL-III wurde als eine Standardsubstanz verwendet, die in der gleichen Weise wie oben beschrieben auf die HPTLC-Platte aufgetragen und entwickelt wurde.
  • Die Platte wurde für 30 Sekunden in 0,4% (w/v) Polyisobutylmethacrylsäuresalz getaucht, das in Hexan gelöst ist, und dann an der Luft getrocknet. Der oben beschriebene Anti-GGPL-III monoklonale Antikörper wurde als ein primärer Antikörper auf die HPTLC-Platte hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 4°C über Nacht. Die HPTLC-Platte wurde mit PBS gewaschen. Danach wurde ein Peroxidase markierter Anti-Maus-IgG-Antikörper (hergestellt von Cappel) als ein sekundärer Antikörper auf die HPTLC-Platte gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für vier Stunden. Die HPTLC-Platte wurde mit reinem Wasser gewaschen. Danach wurden unter Verwendung eines Peroxidase-Farbe-Entwicklungs-Kits (KONICA Immunfärbe-HRPKit, hergestellt von Konica) Banden des Antigens nachgewiesen.
  • Der Test wurde gemäß dem wie oben beschriebenen Verfahren für neun Serumproben von Patienten mit Nephritis und neun Serumproben von normalen Individuen durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde ein Signal in der Nähe von GGPL-III für sechs Proben von den neun Proben von den Patienten mit Nephritis beobachtet (18). Dieses Signal wurde nicht für die Proben von den normalen Individuen nachgewiesen (18). Das Signal, das häufig in Patienten mit Nephritis gefunden wurde, war beurteilend von der Position der HPTLC unterschiedlich vom GGPL-III. Es wird jedoch angenommen, dass das Signal ein Lipid darstellt, welches eine ähnliche Antigenität aufweist.
  • Alternativ können, nachdem die Lipide wie oben beschrieben extrahiert werden, die folgenden Schritte übernommen werden. Und zwar werden die Lipide lyophilisiert, um Proben herzustellen. Jede der Proben wird in einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform : Methanol : Wasser (83 : 16 : 0,5 (V/V/V)) gelöst und auf eine Iatrokügelchen-Säule (equilibriert mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform : Methanol : Wasser (83 : 16 : 0,5 (V/V/V)) aufgetragen, die mit Iatrokügelchen 6RS-8060 (hergestellt von Iatron) geladen ist. Eine schrittweise Elution wird durch Änderung der Zusammensetzung von Chloroform : Methanol : Wasser durchgeführt, um eine eluierte Fraktion zu erhalten, die auf eine HPTLC aufgetragen wird.
  • Beispiel 6: Nachweis eines Anti-GGPL-III-Antikörpers im Serum durch ein ELISA-Verfahren unter Verwendung von gereinigtem GGPL-III als ein Antigen
  • Ein in Beispiel 1 gereinigtes GGPL-III (40 μg) wurde in 10 ml Ethanol gelöst, um eine Lösung herzustellen, die in Löcher von 96-Loch-Mikroplatten in einer Menge von 50 μl pro Loch gegeben wurde, gefolgt vom Getrocknetwerden mit einem Trockner für 30 Minuten. PBS, das 1% (w/v) Rinderserum Albumin (BSA) enthält, wurde in einer Menge von 100 μl pro Loch hinzugegeben, gefolgt vom stationären Stehenlassen bei Raumtemperatur für eine Stunde. Die Platte wurde fünfmal mit einer 0,3 M Sucrose-Lösung in einer Menge von 100 μl pro Loch gewaschen. Danach wurden die gemäß einem gewöhnlichen Verfahren aus Blutproben von normalen Individuen, von AIDS-Patienten, von Patienten mit Nephritis bzw. von mit HTLV-1 assoziierten myelopathischen (HAM) Patienten hergestellte Seren zu den Löchern in einer Menge von 100 μl pro Loch hinzugegeben, gefolgt vom Schütteln bei Raumtemperatur für 60 Minuten. Die entsprechenden Löcher wurden mit einer 0,05% Tween-20-Lösung gewaschen. Danach wurde ein 2.000 Mal mit PBS verdünnter Peroxidase markierter Anti-Mensch-IgG-Antikörper (hergestellt von Cappel) zu den Löchern in einer Menge von 50 μl pro Loch hinzugegeben, gefolgt vom Schütteln bei Raumtemperatur für 60 Minuten.
  • Die entsprechenden Löcher wurden mit einer 0,05% Tween-20-Lösung gewaschen. Danach wurde ein Zitratpuffer, der 10 mg Ortho-Phenylendiamin und 50 μl einer 30%igen (v/v) Wasserstoff-Peroxidase wässrigen Lösung pro 10 ml des Puffers enthält, zu den Löchern in einer Menge von 100 μl pro Loch hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Schwefelsäure (0,5 M) wurde zu den Löchern in einer Menge von 100 μl pro Loch hinzugegeben, um die Enzymreaktion der Peroxidase zu stoppen, und dann wurde das Absorptionsvermögen bei 450 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesers gemessen.
  • Das Absorptionsvermögen bei 450 nm wurde gemäß dem oben beschriebenen Verfahren für Seren von normalen Individuen (46 Proben), von AIDS-Patienten (10 Proben), von Patienten mit Nephritis (22 Proben) und von mit HTLF-1 assoziierten myelopathischen (HAM) Patienten (9 Proben) gemessen. Ein Absorptionsvermögen, das von diesen eines normalen Individuums erhalten wird, wurde als eine Kontrolle verwendet. Serumproben, deren Absorptionsvermögen bei 450 nm größer als das der normalen Individuen sind, wurden als Anti-GGPL-III-Antikörper positiv betrachtet. Ein Ergebnis ist in Tabelle 2 gezeigt.
  • Tabelle 2
    Figure 00480001
  • Wie aus der Tabelle 2 zu verstehen ist, waren diejenigen, die im Serum GGPL-III-Antikörper-positiv waren, eine Probe von den 46 Proben (2,2%) für die normalen Individuen, acht Proben von den zehn Proben (80,0%) für die AIDS-Patienten, drei Proben von den 22 Proben (13,8%) für die Patienten mit Nephritis bzw. zwei Proben von den neun Proben (22,2%) für die mit HTLV-1 assoziierten myelopathischen Patienten. Des Weiteren wurde eine Untersuchung unter Verwendung eines Peroxidase markierten Anti-Mensch-IgM-Antikörpers (hergestellt von Cappel) anstelle des oben beschriebenen sekundären Antikörpers (Perioxidase markierter Anti-Mensch-IgG-Antikörper) gemacht. Als ein Ergebnis war das Positiv-Verhältnis für den Anti-GGPL-III-Antikörper in den Seren von Patienten mit Nephritis weiter angestiegen.
  • Gewerbliche Anwendbarkeit
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das neue Glycoglycerophospholipid, das aus Mycoplasma fermentans stammt, d. h., GGPL-III erhalten. Des Weiteren wird der Antikörper erhalten, der eine Reaktions-Spezifität zu dem Glycoglycerophospholipids, das aus Mycoplasma fermentans stammt, insbesondere der polyklonale Antikörper, der eine Reaktions-Spezifität zu GGPL-I und GGPL-III aufweist, und der monoklonale Antikörper, der eine Reaktions-Spezifität nur zu GGPL-III aufweist.
  • Die Verwendung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung macht es möglich, Mycoplasma fermentans spezifisch nachzuweisen. Es wird erwartet, den Antikörper der vorliegenden Erfindung für eine Nephritis-Diagnose anzuwenden.
  • Des Weiteren weist der Antikörper der vorliegenden Erfindung eine Möglichkeit auf, für eine Heilung oder eine Prävention von durch Viren verursachte Infektionserkrankungen verwendet zu werden, die höchstwahrscheinlich mit einer komplexen Infektion mit Mycoplasma fermentans einhergehen.

Claims (21)

  1. Aus Mycoplasma fermentans erhältliches Glycoglycerophospholipid, das durch die Formel 1 dargestellt ist:
    Figure 00500001
  2. Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper, der mit dem wie in Anspruch 1 definierten Glycoglycerophospholipid immunologisch reagiert.
  3. Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper nach Anspruch 2, der sowohl mit dem 6'-O-Phosphocholin-α-Glucopyranosyl-(1'-3)-1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycerol als auch mit dem in Anspruch 1 definierten Glycoglycerophospholipid immunologisch reagiert.
  4. Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper nach Anspruch 2 oder 3, der ein polyklonaler Antikörper ist.
  5. Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper nach Anspruch 2, der nur mit dem in Anspruch 1 definierten Glycoglycerophospholipid immunologisch reagiert.
  6. Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper nach einem der Ansprüche 2, 3 und 5, der ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist, der oder das mit dem in Anspruch 1 definierten Glycoglycerophospholipid immunologisch reagiert.
  7. Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper nach Anspruch 2, der Mycoplasma fermentans spezifisch erkennt und der keine anderen Mycoplasmen-Spezies erkennt.
  8. Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper nach Anspruch 7, wobei die anderen Mycoplasmen-Spezies Mycoplasma arthritidis und Mycoplasma hominis sind.
  9. Verfahren zur Messung einer in einer Probe enthaltenen Substanz, wobei die Substanz ein Glycoglycerophospholipid ist, das mindestens ein Phosphocholin, eine Glucose, eine Fettsäure und ein Glycerol enthält, und wobei das Glycoglycerophospholipid nicht-adsorptiv zu einem eine Diethylaminoethyl-Gruppe aufweisenden Anionen-Austauscher und instabil gegen Alkali und immunologisch durch den in einem der Ansprüche 2 bis 8 definierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper erkennbar ist, umfassend den Schritt der immunologischen Messung der Substanz unter Verwendung des wie in einem der Ansprüche 2 bis 8 definierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Substanz ein spezifisch in Mycoplasma fermentans existierendes Glycoglycerophospholipid ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der immunologische Messschritt die Schritte des Ermöglichens einer Probelösung, mit einer Festphase in Kontakt zu treten, die den in einem der Ansprüche 2 bis 8 definierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper enthält, der daran gebunden ist, so dass das in der Probelösung enthaltene Glycoglycerophospholipid an den Antikörper gebunden wird, des Trennens und Entfernens der nicht-adsorptiven Komponenten aus der Festphase, des anschließenden Ermöglichens dem in Anspruch 1 definierten und mit einer Markierungssubstanz markierten Glycoglycerophospholipid, mit der Festphase in Kontakt zu treten, des Herstellens einer konkurrierenden Reaktion zwi schen dem in der Probelösung enthaltenen Glycoglycerophospholipid und dem markierten Glycoglycerophospholipid, und des Nachweisens der an der Festphase gebundenen Markierungssubstanz oder der nicht an der Festphase gebundenen Markierungssubstanz umfasst.
  12. Verfahren zur Messung eines in einer Probe enthaltenen Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers, welches die Schritte des Ermöglichens einer Probelösung, mit einer Festphase in Kontakt zu treten, die das in Anspruch 1 definierte Glycoglycerophospholipid enthält, das daran gebunden ist, so dass der in der Probelösung enthaltene Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper an das Glycoglycerophospholipid gebunden wird, des Trennens und Entfernens der nicht-adsorptiven Komponenten aus der Festphase, des nachfolgenden Herstellens einer Reaktion mit einem sekundären Antikörper, der durch Markieren eines Anti-Mensch-Immunglobulin-Antikörpers mit einer Markierungssubstanz erhalten wird, und des Nachweisens der Markierungssubstanz umfasst.
  13. Verfahren zum Nachweis von Mycoplasma fermentans, welches die Schritte des Messens eines in einer Probe enthaltenen Glycoglycerophospho-lipids gemäß dem in Anspruch 10 oder 11 definierten Messverfahren und des in Relation Setzens des Vorhandenseins oder des Fehlens des Glycoglycerophospholipids oder einer davon existierenden Menge mit dem Vorhandensein oder dem Fehlen von Mycoplasma fermentans oder einer davon existierenden Menge in der Probe umfasst.
  14. Verfahren zum Nachweis von Mycoplasma fermentans nach Anspruch 13, wobei das in der Probe enthaltene Glycoglycerophospholipid eine Lipidfraktion ist, die aus der von einem lebenden Organismus stammenden Probe extrahiert wird.
  15. Verfahren zum Nachweis von Mycoplasma fermentans nach Anspruch 14, wobei die von dem lebenden Organismus stammende Probe Blut, Serum, Plasma, Cerebrospinalflüssigkeit, Urin, Gelenkflüssigkeit oder eine kultivierte Zelllösung ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Messschritt die Schritte des Extrahierens einer Lipidfraktion aus der Probe, des Ermöglichens der extrahierten Lipidfraktion, mit einer Festphase in Kontakt zu treten, so dass das Lipid an der Festphase adsorbiert wird, des Reagierens der Festphase, die das daran adsorbierte Lipid enthält, mit dem in einem der Ansprüche 2 bis 8 definierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper, des gleichzeitigen oder anschließenden Herstellens einer Reaktion mit einem sekundären Antikörper, der durch Markieren eines Antikörpers gegen Immunglobulin eines immunisierten Tieres mit einer Markierungssubstanz erhalten wird, wobei der Antikörper gegen das Immunglobulin des immunisierten Tieres unter Verwendung eines anderen Tieres als das zur Herstellung des Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers immunisierte Tier hergestellt worden ist, und des Nachweisens der Markierungs-substanz umfasst.
  17. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Messschritt die Schritte des sofortigen oder des nach der Anwendung einer Behandlung zur Immobilisierung eines Glycoglycerophospholipids erfolgenden Reagierens des in einem der Ansprüche 2 bis 8 definierten und mit einer Markierungssubstanz markierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers mit einem Gewebe oder mit Zellen eines lebenden Organismus, des Bindens des markierten Antikörpers an das Gewebe oder an die Zellen des mit Mycoplasma fermentans infizierten lebenden Organismus und des Nachweisens der Markierungssubstanz umfasst.
  18. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Messschritt die Schritte des sofortigen oder des nach der Anwendung einer Behandlung zur Immobilisierung eines Glycoglycerophospholipids erfolgenden Reagierens des in einem der Ansprüche 2 bis 8 definierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers mit einem Gewebe oder mit Zellen eines lebenden Organismus, des gleichzeitigen oder anschließenden Herstellens einer Reaktion mit einem sekundären Antikörper, der durch Markieren eines Antikörpers gegen Immunglobulin eines immunisierten Tieres mit einer Markierungssubstanz erhalten wird, wobei der Antikörper gegen das Immunglobulin des immunisierten Tieres unter Verwendung eines anderen Tieres als das zur Herstellung des Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers immunisierte Tier hergestellt worden ist, des Bindens des markierten sekundären Antikörpers an das Gewebe oder an die Zellen des mit Mycoplasma fermentans infizierten lebenden Organismus und des Nachweisens der Markierungssubstanz umfasst.
  19. Reagenziensatz zum Nachweis von Mycoplasma fermentans oder eines in einer Probe enthaltenen Glycoglycerophospholipids von Mycoplasma fermentans gemäß einem immunologischen Verfahren, welcher den in einem der Ansprüche 2 bis 8 definierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper und eine durch den in einem der Ansprüche 2 bis 8 definierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper immunologisch erkennbare Substanz enthält, wobei die Substanz mit einer Markierungssubstanz markiert ist.
  20. Reagenziensatz zum Nachweis von Mycoplasma fermentans oder eines in einer Probe enthaltenen Glycoglycerophospholipids von Mycoplasma fermentans gemäß einem immunologischen Verfahren, welcher den in einem der Ansprüche 2 bis 8 definierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper und einen sekundären Antikörper enthält, der durch Markieren eines Antikörpers gegen Immunglobulin eines immunisierten Tieres mit einer Markierungssubstanz erhalten wird, wobei der Antikörper gegen das Immunglobulin des immunisierten Tieres unter Verwendung eines anderen Tieres als das zur Herstellung des Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörpers immunisierte Tier hergestellt worden ist.
  21. Verfahren zum Nachweis von Nephritis, welches den Schritt des Nachweisens des in Anspruch 1 definierten Glycoglycerophospholipids oder einer Substanz umfasst, die durch den in einem der Ansprüche 2 bis 8 definierten Anti-Glycoglycerophospholipid-Antikörper immunologisch erkennbar ist, wobei das Glycoglycerophospholipid und die Substanz in Blut enthalten sind.
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