CN117305192A - 一种猪肺炎支原体rt02株、疫苗组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了猪肺炎支原体RT02株、疫苗组合物及其应用，属于兽医微生物技术领域。本发明首先分离得到一株猪肺炎支原体RT02株，该菌株具有较好的免疫原性，将其制成疫苗组合物时，对仔猪的平均肺炎病变减少率可达84%，疫苗的防护效果较好，因此，在灭活疫苗的领域中具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于兽医微生物技术领域，具体涉及猪肺炎支原体RT02株、疫苗组合物及其应用。
背景技术
猪喘气病(Mycoplasma Pneumonia of Swine，MPS)，又称猪地方流行性肺炎(Enzootic pneumonia of pig)。它是猪的一种呼吸道飞沫性传染病，临床症状表现为咳嗽和气喘，病情加剧时呼吸喘促，肷肋煽动，张嘴呼吸。病变特点为融和性支气管肺炎，在尖叶、心叶、中间叶和膈叶外缘呈“肉样”或“胰样”实质变。该病存在于世界各地，其死亡率虽然不高，但由于流行的广泛性、长期性和消耗性，可使饲料转化率降低，并引起猪的多种并发病，是造成养猪业经济损失的最重要的疾病之一。
疫苗免疫是猪支原体肺炎的主要防制措施，目前商品化疫苗应用广泛，对防控MPS起到积极作用。目前使用较为广泛的疫苗主要是灭活疫苗。然而，市面上虽然有很多利用猪肺炎支原体株开发成灭活疫苗的产品，仍存在疫苗免疫效果不佳等问题。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供猪肺炎支原体RT02株、疫苗组合物及其应用。该株是由本发明人自行分离得到，具有较好的免疫原性，其对仔猪的平均肺炎病变减少率可达84％。
在第一方面，本发明提供了一株猪肺炎支原体RT02株。
所述猪肺炎支原体RT02株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2023年08月17日，保藏编号为CGMCC No. 26673。
在一些实施方案中，所述猪肺炎支原体RT02株的分离方法包括：从多个猪场选择49份以上的猪肺脏样品，并置于含猪鼻支原体高免血清的PPLO液体培养基中，连续盲传5代（由于猪肺炎支原体在体外培养相对比较困难，其菌体较小，不易观察，并且猪肺组织本身以及猪肺组织中经常存在的猪鼻支原体经常会引起含有酚红的培养基产生颜色变化，导致假阳性生长的现象，因此，采用在PPLO液体培养基中添加猪鼻支原体高免血清（包含猪鼻支原体抗体），以及多次盲传的方法来解决假阳性问题）后，经形态学、血清学鉴定以及分子生物学鉴定后，得到该猪肺炎支原体RT02株。通过攻毒试验的结果，确认所述猪肺炎支原体RT02株具有较好的免疫原性。
在一些实施方案中，所述猪鼻支原体高免血清的制备方法为将猪鼻支原体菌株ATCC 17981接种于PPLO液体培养基中，于37℃培养24~36h收获，加入终浓度0.2wt%甲醛溶液，于37℃灭活24h后，加入等质量佐剂制成疫苗，分四次，每次间隔7天，每次0.5ml/只，免疫0.8~1.5kg健康成年兔，第四次免疫21天后采集其血清，即为猪鼻支原体高免血清。
在一些实施方案中，所述PPLO液体培养基的配制方法为取PPLO 40g、酵母浸粉20g、葡萄糖10g、0.4%酚红溶液5ml，添加注射用水至1600ml，115℃，20分钟灭菌，灭菌后加入400ml猪血清。
较佳地，本发明中，猪肺炎支原体RT02株传代至18代后菌种各项检验指标均稳定，并且毒力以及免疫原性仍旧保持与原始菌种相当。根据菌种最高代次相关规定，为了满足生产需要，规定F1~F3代为原始种子代次，F4~F7代为基础种子代次，并且规定实际生产中菌种传代不得超过第15代。
在第二方面，本发明提供了所述猪肺炎支原体RT02株在制备疫苗组合物中的应用。
在第三方面，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含分离自所述猪肺炎支原体RT02株的抗原。
在一些实施方案中，所述抗原为灭活抗原。
在一些优选的实施方案中，所述抗原为猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子抗原，该F6代基础种子完全符合猪肺炎支原体菌种特性，菌种纯粹。
在一些实施方案中，所述灭活抗原的含量为1×107CCU/ml以上，在一些优选的实施方案中，所述灭活抗原的含量为1×108CCU/ml以上，在一些更优选的实施方案中，所述灭活抗原的含量为2×108CCU/ml以上。
在一些实施方案中，所述疫苗组合物还包含佐剂。
在一些实施方案中，所述佐剂为201佐剂；优选地，所述灭活抗原与所述佐剂的质量比为1:（0.8-1.2）；更优选地，所述灭活抗原与所述佐剂的质量比为1:1。
在第四方面，本发明提供了所述疫苗组合物的制备方法。
所述制备方法包括如下步骤：
培养所述猪肺炎支原体RT02株，得到菌液；
对所述菌液进行浓缩、纯化、灭活，得到抗原原液；
将所述抗原原液与佐剂进行混合处理，得到疫苗组合物。
在一些实施方案中，所述灭活包括向所述菌液加入二乙烯亚胺的步骤。
在第五方面，本发明提供了所述疫苗组合物或所述制备方法制得的疫苗组合物在制备用于预防和/或治疗猪支原体肺炎药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明分离得到一株猪肺炎支原体RT02株，该菌株具有较好的免疫原性，将其制成疫苗组合物时，对仔猪的平均肺炎病变减少率可达84%，疫苗的防护效果较好，并且，该猪肺炎支原体RT02株在18代以内稳定性较好，具有较好的毒力和免疫原性；同时，该猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子在菌种形态、培养特性、特异性等方面符合菌种标准。本发明提供的猪肺炎支原体RT02株制备成疫苗组合物时，具有免疫效果好、有效降低使用量的优势，因此，在灭活疫苗的领域中具有较好的应用前景。
保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2023年08月17日，保藏编号：CGMCC No.26673，分类命名为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)。
附图说明
图1为本发明实施例1中菌株YMhy18的菌落形态图（光学显微镜100×16）；
图2为本发明实施例1中菌株YMhy18经瑞氏染色后的形态图（光学显微镜10×16）；
图3为本发明实施例1中菌株YMhy18的PCR凝胶电泳图，其中，泳道从左至右依次为阳性对照、阴性对照、菌株YMhy18和Marker；
图4为本发明实施例1中猪肺炎支原体RT02株对试验猪进行攻毒后的剖检结果图；
图5为本发明实施例1中通过Goodwin氏55分法记分的示意图；
图6为本发明实施例4中猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子的PCR凝胶电泳图，其中，泳道1为Marker（条带自上至下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）， 泳道2为阴性对照，泳道3为阳性对照，泳道4为猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中部分原料如下：
PPLO液体培养基：取PPLO（购自BD公司，产品型号为255420）40g、酵母浸粉20g、葡萄糖10g、0.4%酚红溶液5ml，添加注射用水至1600ml，115℃，20分钟灭菌，灭菌后加入400ml猪血清。
PPLO固体培养基：在PPLO液体培养基中加入2%琼脂，灭菌后，保存备用。
猪鼻支原体高免血清的制备方法如下：
将猪鼻支原体菌株ATCC 17981接种于PPLO液体培养基中，于37℃培养24~36h收获，加入终浓度0.2wt%甲醛溶液，于37℃灭活24h后，加入等质量佐剂制成疫苗，分四次，每次间隔7天，每次0.5ml/只，免疫0.8~1.5kg健康成年兔（购自北京维通利华实验动物中心），第四次免疫21天后采集其血清，即为猪鼻支原体高免血清。
兔抗猪肺炎支原体高免血清的制备方法如下：
将猪肺炎支原体菌株ATCC 27715接种于PPLO液体培养基中，37℃培养72~96h收获，加入终浓度0.2wt%甲醛溶液，于37℃灭活24h后，加入等质量佐剂制成疫苗，分四次，每次间隔7天，每次0.5ml/只，免疫0.8~1.5kg健康成年兔（购自北京维通利华实验动物中心），第四次免疫21天后采集其血清，即为兔抗猪肺炎支原体高免血清。
健康兔血清的制备方法如下：
直接采集0.8~1.5kg健康成年兔的血清（购自北京维通利华实验动物中心），即为健康兔血清。
猪肺炎支原体阴性猪血清购自兰州民海生物有限公司。
28~35日龄健康仔猪，品系为大白×长白二元杂交（经IDEXX猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒检测呈阴性，经PCR检测血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪2型圆环病毒和猪伪狂犬病毒抗原均为阴性），购于江西九江养殖场。
实施例1 猪肺炎支原体菌种的分离与鉴定
1.1猪肺炎支原体菌种的分离
从广东、江西、河北多个猪场，选择疑似猪喘气病猪，无菌操作采集产生“胰样”和“肉样”变的肺脏病料49份。将上述病料组织块，在现配的500单位/ml青霉素溶液中浸泡5min，然后用无菌生理盐水冲洗病料块表面，无菌剪取病料内部组织，每份病料取3个样，每个样品约1~2g，剪碎，按质量体积比约1:1的比例加入PPLO液体培养基，置于无菌的玛瑙研钵中充分研磨，将组织研磨液通过4层无菌纱布过滤后，无菌操作离心1000rpm、3min，将离心上清液用0.45μm无菌滤器过滤，得到滤液备用。
将上述滤液接种于含猪鼻支原体高免血清的PPLO液体培养基中，于37℃摇床中培养（摇床转速为80~100rpm），每隔48h传代一次（每次取0.2ml上代培养物接种于2ml新鲜PPLO液体培养基中），每个样品连续盲传5代后，得到5株初筛菌株，见表1.1。
表1.1 菌株分离结果
将上述5株初筛菌株的第5代菌株培养物培养3~7d，观察培养基颜色由红色变为黄色时，吸取培养液0.2ml，经高速离心（12000rpm 20min），弃去上清，将沉淀连同残存在离心管底的培养基用移液枪吹吸混匀后一同涂片，经瑞氏染色法染色，可观察到典型的多形态菌体，有环状、球状和两极状特征，无杂菌污染（见图1）。
分别取上述5株初筛菌株的第5代菌株培养物0.1ml接种至PPLO固体培养基平皿中，置37℃恒温培养箱中培养10d后均可在显微镜下观察到细小圆型、边缘清晰、中间致密的“荷包蛋型”菌落（见图2）。
1.2 血清学鉴定代谢抑制试验
按10%的接种量，分别将上述5株初筛菌株的第5代菌株培养物接种于PPLO液体培养基（含有10wt%的兔抗猪肺炎支原体高免血清和10wt%的猪肺炎支原体阴性健康猪血清）中，同时，按10%的接种量，分别将上述5株初筛菌株的第5代菌株培养物接种于PPLO液体培养基（含有10wt%的健康兔血清和10wt%的猪肺炎支原体阴性健康猪血清）中作为对照，37℃培养3~7d，结果如下表1.2所示：
表1.2 5株初筛菌株代谢抑制试验结果
从表1.2中可以看出，猪肺炎支原体高免血清可抑制菌株YMhy18的生长，因此，初步判定菌株YMhy18为猪肺炎支原体，并将其命名为RT02株。
1.3 菌株的分子生物学鉴定
取步骤1.1中制得的菌株RT02的第5代菌株培养物1ml，按照DNA提取试剂盒操作说明提取菌株RT02的DNA。选取猪肺炎支原体P36基因的特异性引物序列设计引物，该引物由上海生工公司合成，具体如下：
上游引物P1：5'-TTACAGCGGGAAGACC-3'（SEQ ID NO: 2）
下游引物P2：5'-CGGCGAGAAACTGGATA-3'（SEQ ID NO: 3）
以猪肺炎支原体菌株（ATCC 27715）作为阳性对照，进行PCR鉴定。
反应体系(50μl)：2×PCR mix 12.5μl，1.5μmol/l上游引物P1 1μl，1.5μmo1/l下游引物P2 1μl，灭菌双蒸水8μl，模板2.5μl。
反应条件：92℃预变性10min；92℃ 60s，54℃ 50s，72℃ 1min，30个循环，72℃延伸l0min。经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色15min，置凝胶成像仪中观察并照相记录，结果如图3所示。
从图3中可以看出，菌株RT02的扩增片段与预期大小427bp相符。
将扩增产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后进行测序，获得的序列在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）官网上进行比对，结果发现，菌株RT02的P36基因序列与NCBI中猪肺炎支原体序列（编号为NC_007295.1的Mesomycoplasma hyopneumoniaeJ株）的同源性达到99%以上。因此，可以进一步判定菌株RT02为猪肺炎支原体。菌株RT02的P36基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
菌株RT02的P36基因序列（SEQ ID NO: 1）
TTACAGCGGGAAGACCACAAAAACCGGGTGAAACTCGGCTTGAATTAGTAGCTGATAACATCCGAATTATCCGGGAAATTGCACTAAAAGTCAAAGAAAGTGGCTTTAGTGGAATAAGTATTATTGTTGCTAATCCTGTTGATATAATTACAAGGGCTTACCGGGATGCTTCTGGATTTTCCGATCAAAAAGTTATCGGTAGTGGAACTGTTTTAGATACAGCAAGGCTTCAATTTGCAATCGCAAAAAGAGCAAAAGTATCTCCTAATTCGGTTCAGGCCTACGTAATGGGTGAACATGGTGATTCATCTTTTGTTGCTTATTCAAATATTAAAATTGCCGGTGAATGTTTCTGTGCTTATTCTAAACTAACCGGAATTGATAGCTCAAATTACGAAAAAGAACTTGAATATCCAGTTTCTCGCCG
通过形态学、血清学鉴定以及分子生物学鉴定的结果表明，菌株RT02为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)。
1.4 外源病毒检测
取步骤1.1中制得的菌株RT02的第5代菌株培养物，与兔抗猪肺炎支原体高免血清按体积比为1:1混合后中和15min，得到混合物。分别取3瓶BHK-21、IBRS-2和Marc-145单层细胞（其中，BHK-21单层细胞和IBRS-2单层细胞均购自中国典型培养物保藏中心；Marc-145单层细胞购自美国ATCC），每瓶接种1.0ml上述混合物，培养5d，盲传2代，观察细胞形态。
结果发现，BHK-21细胞、IBRS-2细胞和Marc-145细胞均无典型的细胞病变出现，因此，结果表明，本发明的猪肺炎支原体RT02株不含有口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪蓝耳病病毒。
1.5 毒力检测
将猪肺炎支原体RT02株接种于PPLO液体培养基中，置37℃恒温培养箱中培养3d，测定并调整菌液浓度为1×109CFU/ml，然后取5ml上述菌液，分别气管注射5头健康的28~35日龄试验猪，同时设5头气管内注射PPLO培养基作为对照。攻毒后，按隔离饲养并无抗饲喂，逐日观察，第20d剖检试验猪，剖检可见发病猪肺部均出现不同程度的“胰样”或“肉样”变（见图4），根据Goodwin氏55分法对试验猪肺部病变判分，结果如下表1.3所示：
表1.3 猪肺炎支原体RT02株毒力检测结果
从表1.3中的数据可以看出，猪肺炎支原体RT02株攻毒组5头均发病，而对照组均未产生肺部实质性病变，结果表明，猪肺炎支原体RT02株具有一定的毒力，可使试验猪产生典型的支原体肺炎的肺部病变。
其中，Goodwin氏55分法是根据猪支原体肺炎的典型肺部眼观病变对发病情况进行量化判定，患猪支原体肺炎的猪其肺尖叶、心叶，前三分之一的隔叶以及中间叶出现实质样病变，如“肉样变”、“胰样变”肺炎组织与健康肺组织眼观界限清楚，容易判定。根据发生实质病变的肺叶面积占该肺叶的比例进行打分，如图5所示，每个尖叶、心叶满分各为10分，隔叶前三分之一满分为5分，中间叶满分为5分。根据发生实质病变的肺叶面积占该肺叶的比例进行打分，记分时只对肺叶的一面进行记分，如肺叶正反两面均有病变，以病变面积大的一面进行记分。每个肺叶打分总和即为该发病猪的肺炎病变得分。
肺炎减少率计算方法为：
肺炎减水率=100%×（对照组肺炎算术平均分-免疫组肺炎算术平均分）/对照组肺炎算术平均分
实施例2 猪肺炎支原体灭活疫苗（RT02株）的制备及检验
2.1灭活疫苗的制备
将实施例1中分离纯化后的猪肺炎支原体RT02株接种于PPLO液体培养基中，置37℃恒温培养箱中培养3d，浓缩纯化，采用原体积1/10体积的灭菌生理盐水重悬，CCU测定及纯粹检验（《中国兽药典》规定的方法）合格后，加入浓度2wt%的 0.1M BEI溶液，37℃振荡孵育20~24h，灭活完成后，加入与BEI溶液等体积的1M的硫代硫酸钠溶液，灭活检验合格后，得到抗原原液，并于2~8℃保存，其中，要求抗原原液中的抗原CCU不低于1×1010CCU/ml。
按照质量比为1:1将上述抗原原液与201佐剂（购自法国赛比克公司）进行混合，分别配制4批不同抗原含量的疫苗，批号为Mhy001（抗原含量为1×109CCU/ml）、Mhy002（抗原含量为1×108CCU/ml）、Mhy003（1×107CCU/ml）和Mhy004（1×106CCU/ml），备用。
2.2 灭活疫苗的效力检验
免疫：将上述4批疫苗分别经颈部肌肉注射免疫仔猪5头（14~21日龄ELISA抗体阴性健康，经血清PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒为阴性，购于江苏养殖场。），免疫剂量为2ml/头，另设5头仔猪不接种疫苗作为对照，间隔21日二免，二免后14日连同对照组进行攻毒保护试验。
攻毒：二免后14日，经气管注射100倍稀释的猪肺炎支原体强毒（CVCC 354株），攻毒剂量为5ml/头。分组及处理如下表2.1所示：
表2.1攻毒试验分组及处理
攻毒后25日剖杀，观察肺部病变，采用Goodwin氏55分法判分，计算肺炎减少率，结果见表2.2：
表2.2靶动物攻毒效检结果
其中，肺炎减水率=100%×（对照组肺炎算术平均分-免疫组肺炎算术平均分）/对照组肺炎算术平均分
从表2.2中可以看出，批号为Mhy001、Mhy002和Mhy003疫苗的肺炎减少率分别为84.0%、76.8%和66.4%，符合《中国兽药典》中规定的疫苗效力标准。结果表明本发明制得的灭活疫苗最小免疫剂量中的抗原含量为1×107CCU/ml，当抗原含量为1×108CCU/ml时，免疫效果更好。
实施例3猪肺炎支原体RT02株最高代次范围的确定及种子批的建立
为了保证猪肺炎支原体RT02株在疫苗生产过程中的工艺稳定性，将实施例1中分离纯化后的的猪肺炎支原体RT02株记为取猪肺炎支原体F0代种子，取2ml接种含有18mlPPLO液体培养基的试管，37℃振摇培养2~5d，待pH值由7.5~7.8降至6.5~6.8时，培养基颜色变为亮黄色时收获，记为F1代种子，按照相同方法连续传至20代；并选择F15代种子、F18代种子进行各项菌种鉴定试验，根据试验结果确定了生产菌种的最高代次，并在此基础上规定了原始种子、基础种子的代次范围。鉴定试验具体如下：
培养特性及形态观察：将F15代种子和F18代种子分别接种于PPLO液体培养基中，37℃振摇培养4d，可见培养基颜色由红色变成黄色，pH值由7.5降至6.8；分别吸取上述培养液0.2ml，经高速离心（12000rpm、20min），弃去上清，将沉淀连同残存在离心管底的培养基用移液枪吹吸混匀后一同涂片，经瑞氏染色法染色，油镜镜检，结果发现，F15代种子和F18代种子，分别均可见多形性菌体，无杂菌污染。分别将F15代种子和F18代种子培养物接种于PPLO固体培养基平板，37℃，培养10d，两者均可在显微镜下（10倍）观察到中间致密边缘清晰的圆形菌落。
结果表明，猪肺炎支原体RT02株F15代种子和F18代种子菌体形态及菌落均形态符合猪肺炎支原体菌种特征。
血清学鉴定代谢抑制试验：按10%的接种量，分别将上述F15代种子和F18代种子接种于PPLO液体培养基（含有10wt%的兔抗猪肺炎支原体高免血清和10%wt的猪肺炎支原体阴性健康猪血清）中，同时，按10%的接种量，分别将上述F15代种子和F18代种子接种于PPLO液体培养基（含有10wt%的健康兔血清和10wt%的猪肺炎支原体阴性健康猪血清）中作为对照，37℃培养3~7d。结果发现，F15代种子和F18代种子均能在不含兔抗猪肺炎支原体高免血清的培养基中生长，均不能在含猪肺炎支原体高免血清的培养基中生长。
结果表明，猪肺炎支原体RT02株F15代种子和F18代种子均符合猪肺炎支原体的血清学检验标准。
毒力检测：取上述F15代种子和F18代种子（其中，猪肺炎支原体含量均为1×108CCU/ml以上），分别经气管注射的方式感染14~21日龄仔猪（猪肺炎支原体抗体，PRRSV、HCV、PCV抗原抗体均为阴性，购于江西九江养殖场，品系长白×大白二元杂交）5头，剂量为5ml/头，连续观察20~25d，记录临床表现。攻毒20~25d后剖杀全部试验猪，进行肺部病变评分。结果如下表3.1所示：
表3.1 猪肺炎支原体RT02株F15代种子和F18代种子毒力测定
从表3.1中可以看出，试验猪剖检可见肺部出现典型胰样或肉样变，平均得分分别为4.8分和6分。
免疫原性：取上述F15代种子和F18代种子（其中，猪肺炎支原体含量不低于1×108CCU/ml），分别用0.2wt%甲醛溶液，37℃、100转/分钟振荡孵育24h，经灭活检验合格后，按照抗原与201佐剂以质量比为1:1的比例制成猪肺炎支原体灭活疫苗。将F15代种子疫苗和F18代种子疫苗分别免疫14~21日龄仔猪（猪肺炎支原体抗体，PRRSV、HCV、PCV抗原抗体均为阴性，购于江西九江养殖场，品系长白×大白二元杂交）5头，剂量为2ml/头，首免后21日以相同剂量二免，二免后14日，连同对照组试验猪经气管注射100MID猪肺炎支原体强毒（菌号CVCC 354），攻毒5ml/头，攻毒20~25日后全部剖杀，按Goodwin氏55分记分法记录各猪肺部喘气病病变分数，计算肺炎减少率。结果如下表3.2所示：
表3.2 F15代种子和F18代种子免疫原性试验结果
从表3.2中可以看出， F15代种子疫苗和F18代种子疫苗的肺炎减少率为分别为73.8%和71.0%，结果表明，猪肺炎支原体RT02株传代15代和18代后仍具有很好的免疫原性。
基础种子代次的建立：根据菌种最高代次相关规定，为了满足生产需要，规定F1~F3代为原始种子代次，F4~F7代为基础种子代次。并且规定实际生产中菌种传代不得超过第15代。
综上所述，猪肺炎支原体RT02株传代至18代后菌种各项检验指标均稳定，并且毒力以及免疫原性仍旧保持与原始菌种相当。根据菌种最高代次相关规定，为了满足生产需要，规定F1~F3代为原始种子代次，F4~F7代为基础种子代次。并且规定实际生产中菌种传代不得超过第15代。
实施例4猪肺炎支原体RT02株种子批系统性鉴定研究
为保证猪肺炎支原体RT02株用于疫苗生产的稳定性，本发明中对所建立的猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子进行生化培养特性（代谢抑制试验）、活菌计数（CCU测定）、菌体及菌落形态观察、纯粹性检验。具体如下：
培养特性及形态观察：取猪肺炎支原体RT02株F6代冻干基础种子加入2ml PPLO培养基，充分溶解，转入液体培养试管中，用不透气试管塞密封试管，37℃，100转/分钟培养2~5d，待培养基颜色由红色变为黄色时收获菌液，取上述收获菌液0.1ml接种于PPLO固体培养基平皿，涂布，置于二氧化碳培养箱37℃恒温培养10~14d，显微镜下观察菌落形态，观察后取菌落涂片，经瑞氏染色后油镜下观察菌体形态。
结果发现，猪肺炎支原体RT02株F6代冻干基础种子符合猪肺炎支原体代谢葡萄糖的生化特性。并且在PPLO固体培养基上培养后均无肉眼可见的菌落产生，显微镜10×10倍放大后均可观察到小菌落，菌落中部致密、略突起。将菌落涂片后，经瑞氏染色镜检，可见多形性菌体，主要为多个菌体连成哑铃状或者项链状。
CCU测定：猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子经复苏培养后，进行活菌计数。将PPLO培养基分装至试管中，1.8ml/支，设2排，每排10支，取0.2ml培养物接种至第一管，混匀后取0.2ml加入第二管中，依次10倍稀释至第10管，每个样品做2排，设一管作为空白对照，置37℃培养，连续培养21d，记录颜色变化最高稀释管，取两排结果平均值作为CCU滴度。
结果发现，CCU滴度达到109CCU/ml。
纯粹性检验：按《中华人民共和国兽药典》（2010年版）第三部附录42页纯粹检验法进行纯粹性检验，结果如下表4.1所示：无细菌及霉菌生长。
表4.1 猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子纯粹检验结果
从表4.1中可以看出，猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子中无细菌及霉菌生长。
血清学鉴定：将猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子复苏后的培养物按10%接种量接种于含20wt%猪肺炎支原体抗体阳性兔血清的PPLO培养基中，同时按10%接种量接种于含20wt%猪肺炎支原体抗体阴性兔血清的PPLO培养基中，在37℃条件下，培养5d。结果发现，含有猪肺炎支原体抗体阳性兔血清的培养管颜色未变化，而含有猪肺炎支原体抗体阴性兔血清的培养管颜色由红色变为黄色。
结果表明，猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子可被猪肺炎支原体阳性血清抑制生长。
分子生物学鉴定：将猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子用生理盐水恢复至原体积，涡旋后，于沸水中水浴20min后，再放置-20℃冻结。冻融后10000转/分钟离心5min，取上清液作模板。选取猪肺炎支原体P36基因的特异性引物序列设计引物，该引物由上海生工公司合成，具体如下：
上游引物P1：5'-TTACAGCGGGAAGACC-3'（SEQ ID NO: 2）
下游引物P2：5'-CGGCGAGAAACTGGATA-3'（SEQ ID NO: 3）
以猪肺炎支原体菌株（ATCC 27715）作为阳性对照，进行PCR鉴定。
反应体系(50μl)：2×PCR mix 28μl，1.5μmol/l上游引物P1 1.5μl，1.5μmo1/l下游引物P2 1.5μl，灭菌双蒸水14μl，模板5μl。
反应条件：92℃预变性10min；92℃ 60s，54℃ 50s，72℃ 1min，30个循环，72℃延伸l0min。经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色15min，置凝胶成像仪中观察并照相记录，结果如图6所示。
从图6中可以看出，猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子的扩增片段与预期大小相符。
综上所述，本发明中的猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子完全符合猪肺炎支原体菌种特性，菌种纯粹。因此，该猪肺炎支原体RT02株F6代基础种子在菌种形态、培养特性、特异性等方面符合菌种标准。
以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 猪肺炎支原体RT02株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 26673。
2.权利要求1所述的猪肺炎支原体RT02株在制备疫苗组合物中的应用。
3.一种疫苗组合物，其特征在于，包含分离自权利要求1所述的猪肺炎支原体RT02株的抗原。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述抗原为灭活抗原。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述灭活抗原的含量为1×107CCU/ml以上，优选含量为1×108CCU/ml以上，更优选含量为2×108CCU/ml以上。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包含佐剂。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂为201佐剂。
8.一种疫苗组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
培养权利要求1所述的猪肺炎支原体RT02株，得到菌液；
对所述菌液进行浓缩、纯化、灭活，得到抗原原液；
将所述抗原原液与佐剂进行混合处理，得到疫苗组合物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述灭活包括向所述菌液加入二乙烯亚胺的步骤。
10.权利要求3-7任一项所述的疫苗组合物，或者权利要求8或9所述的制备方法制得的疫苗组合物在制备用于预防和/或治疗猪支原体肺炎的药物中的应用。
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