RU2668799C1 - Субъединичная вакцина против mycoplasma spp. - Google Patents
Субъединичная вакцина против mycoplasma spp. Download PDFInfo
- Publication number
- RU2668799C1 RU2668799C1 RU2017131504A RU2017131504A RU2668799C1 RU 2668799 C1 RU2668799 C1 RU 2668799C1 RU 2017131504 A RU2017131504 A RU 2017131504A RU 2017131504 A RU2017131504 A RU 2017131504A RU 2668799 C1 RU2668799 C1 RU 2668799C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- active ingredient
- xylf
- pharmaceutically acceptable
- composition
- Prior art date
Links
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 title claims abstract description 20
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 title abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 27
- HMFHBZSHGGEWLO-IOVATXLUSA-N D-xylofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-IOVATXLUSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 20
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 38
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 12
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 6
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 3
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 claims description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 24
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 53
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 47
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 47
- 241000204045 Mycoplasma hyopneumoniae Species 0.000 description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 7
- 101150037483 bkdA gene Proteins 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 101150084945 pdhA gene Proteins 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 101150010108 xylF gene Proteins 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 101150105921 eutD gene Proteins 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 description 2
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101100242031 Mus musculus Pdha2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000202955 Mycoplasma bovigenitalium Species 0.000 description 1
- 241000202899 Mycoplasma flocculare Species 0.000 description 1
- 241001148548 Mycoplasma hyopharyngis Species 0.000 description 1
- 241000202938 Mycoplasma hyorhinis Species 0.000 description 1
- 241001148549 Mycoplasma hyosynoviae Species 0.000 description 1
- 241000202887 Mycoplasma sualvi Species 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 1
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 206010013663 drug dependence Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007119 pathological manifestation Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102200078755 rs786204608 Human genes 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению субъединичных вакцин против Mycoplasma spp., и может быть использовано в медицине для профилактики инфекции Mycoplasma spp. Предложены вакцинные композиции на основе белка XylF с SEQ ID NO:9 в сочетании с фармацевтически приемлемым адъювантом или фармацевтически приемлемой добавкой. Изобретение обеспечивает достижение сильных иммунных эффектов против Mycoplasma spp. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 9 табл., 3 пр., 4 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Это раскрытие относится к вакцине против Mycoplasma spp.; в частности, к субъединичной вакцине против Mycoplasma spp.
Уровень техники
Mycoplasma spp. является известной в настоящее время мельчайшей бактерией, способной к саморепликации вне клеток хозяина. Хотя энзоотическая пневмония свиней не должна вызывать смерть свиньи, она снижает эффективность кормления и вызывает замедление роста, воспаление и иммуносупрессию, а также делает свинью более восприимчивой к инфекции другими патогенами, что вследствие этого приводит к экономическому ущербу для производства.
На настоящий момент энзоотическую пневмонию свиней предотвращают тремя главными стратегиями, включая: введение лекарственного средства, контроль состояния окружающей среды и вакцинацию. Учитывая плохую предотвращающую эффективность антибиотиков от Mycoplasma hyopneumoniae, введение лекарственного средства может быть использовано только в целях лечения, и удовлетворение потребностей в профилактике представляет сложность. Кроме того, принимая во внимание то, что лекарственная зависимость может привести к более сильной инфекции, вызываемой посредством резистентных к лекарственным средствам бактерий, для введения лекарственного средства требуются меры предосторожности и существует множество ограничений.
Контроль состояния окружающей среды формирует основу профилактики инфекции Mycoplasma spp. Хорошая санитарная обработка и управление свиноводческими помещениями были бы полезными для снижения частоты инфекции. С другой стороны, профилактика могла бы быть более полноценной при вакцинации.
В обычных вакцинах в данной области используются неактивные/мертвые бактерии в качестве активного ингредиента. Однако стоимость обычных вакцин является слишком высокой из-за того, что Mycoplasma spp. являются прихотливыми бактериями и их трудно культивировать в лаборатории. Для того, чтобы снизить стоимость вакцин Mycoplasma spp., ученые непрерывно пытаются разработать вакцины различных типов, такие как: (1) аттенуированные вакцины, (2) векторные вакцины, (3) субъединичные вакцины и (4) ДНК вакцины. Среди них, субъединичные вакцины демонстрируют наибольшую эффективность из-за преимуществ в легкости производства и высокой безопасности.
К настоящему времени существует несколько потенциальных белков-кандидатов, которые могли бы быть использованы для вакцин M. hyopneumoniae; однако нет дополнительных сообщений, подтверждающих, что такие белки пригодны для вакцин M. hyopneumoniae.
Краткое описание изобретения
В свете вышеприведенного, одна из задач настоящего изобретения заключается в получении антигенов, пригодных для использования в вакцинах M. hyopneumoniae, с получением, посредством этого новых вакцин M. Hyopneumoniae, так, что стоимость профилактики может быть снижена.
Другая задача настоящего изобретения заключается в получении комбинации антигенов, которые пригодны для использования в вакцинах M. hyopneumoniae, с получением, посредством этого, субъединичных вакцин с лучшими характеристиками; вследствие этого будет иметь место большее количество вариантов для целей профилактики.
Для решения вышеуказанных задач, настоящее изобретение относится к рекомбинантному белку для профилактики инфекции Mycoplasma spp., включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или их комбинацию.
Настоящее изобретение также относится к композиции для профилактики инфекции Mycoplasma spp., содержащей: активный ингредиент, содержащий белок PdhA, XylF, EutD, Mhp145, P78, P132, Mhp389 или их комбинацию; и фармацевтически приемлемый адъювант.
Предпочтительно указанный активный ингредиент имеет концентрацию от 50 до 3500 мкг/мл в расчете на общий объем указанной композиции.
Предпочтительно, указанный активный ингредиент содержит по меньшей мере два белка, выбранных из группы, состоящей из PdhA, XylF, EutD, Mhp145, P78, P132 и Mhp389.
Предпочтительно, указанный активный ингредиент содержит PdhA и P78.
Предпочтительно, указанный активный ингредиент содержит XylF и Mhp145.
Предпочтительно, указанный фармацевтически приемлемый адъювант представляет собой полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, алюмогель, поверхностно-активное вещество, полианионный адъювант, пептид, масляную эмульсию или их комбинацию.
Предпочтительно, указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемую добавку.
Предпочтительно, указанная фармацевтически приемлемая добавка представляет собой растворитель, стабилизатор, разбавитель, консервант, антибактериальный агент, противогрибковый агент, изотонический агент, замедляющий абсорбцию агент или их комбинацию.
Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции для профилактики инфекции Mycoplasma spp., содержащей: активный ингредиент, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или их комбинацию; и фармацевтически приемлемый адъювант.
Предпочтительно, указанный активный ингредиент имеет концентрацию от 50 до 3500 мкг/мл в расчете на общий объем указанной композиции.
Предпочтительно, указанный активный ингредиент содержит по меньшей мере две аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14.
Предпочтительно, указанный активный ингредиент содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: и SEQ ID NO: 12.
Предпочтительно, указанный активный ингредиент содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 09 и SEQ ID NO: 11.
Предпочтительно, указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемую добавку. Предпочтительно, указанная фармацевтически приемлемая добавка представляет собой растворитель, стабилизатор, разбавитель, консервант, антибактериальный агент, противогрибковый агент, изотонический агент, замедляющий абсорбцию агент или их комбинацию.
Настоящее изобретение также относится к экспрессионному вектору для профилактики инфекции Mycoplasma spp., содержащему: плазмиду; где указанная плазмида содержит: нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 06 и SEQ ID NO: 07; и регуляторный элемент.
Предпочтительно, указанный регуляторный элемент содержит промотор и сайт связывания рибосомы.
Предпочтительно, указанная плазмида представляет собой pET-MSY, pET-YjgD, pET-D или pET-SUMO.
Предпочтительно, указанная плазмида дополнительно содержит ген, кодирующий партнер слияния.
Предпочтительно, указанный партнер слияния представляет собой MsyB E. coli, YjgD E. coli, белок D бактериофага лямбда или SUMO S. cerevisiae.
Предпочтительно, указанный экспрессионный вектор используется в системе экспрессии генов E. coli.
В целом, настоящее изобретение относится к антигенам, которые пригодны для использования в качестве активного ингредиента субъединичной вакцины/композиции M. hyopneumoniae, и к субъединичной вакцине M. hyopneumoniae, полученной с их использованием. Субъединичная вакцина по настоящему изобретению может быть не только эффективно использована в целях профилактики для снижения ее стоимости, раскрытие настоящего изобретения также демонстрирует, что ʺкоктейльнаяʺ субъединичная вакцина (т.е. имеющая по меньшей мере два антигена в качестве активных ингредиентов) с использованием по меньшей мере двух антигенов по настоящему изобретению имеет улучшенную индукцию иммунного ответа.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 демонстрирует результат двумерного электрофореза белков в геле, проведенного в 1ом примере данного изобретения.
Фигура 2 демонстрирует результат цветной реакции Вестерн-блота, проведенного в 1ом примере данного изобретения.
Фигура 3 демонстрирует результат электрофореза продуктов ПЦР, полученных во 2ом примере данного изобретения.
Фигура 4 демонстрирует записи стимуляционных экспериментов, проведенных в 3ем примере данного изобретения.
Подробное описание изобретения
Одна из ключевых целей данного изобретения заключалась в обзоре потенциальных кандидатных антигенов, пригодных для субъединичных вакцин, с использованием двумерного электрофореза белков в геле наряду с технологией иммунологического скринирования, и в идентифицировании антигенов посредством масс-спектрометра. Затем, характеристики субъединичных вакцин по данному изобретению подтверждали экспериментами с моделями на животном.
Кратко, ход выполнения данного изобретения являлся следующим:
(1) Индуцирование иммунного ответа экспериментальных свиней инъецированием общепринятой вакциной M. hyopneumoniae и получением сыворотки, содержащей антитела к M. hyopneumoniae. (2) Получение тотального белка M. hyopneumoniae для двумерного электрофореза белков в геле. (3) Проведение гибридизации результата двумерного электрофореза белков в геле этапа (2) с использованием сыворотки этапа (1) в качестве 1ого антитела и затем сбор белков, являющихся позитивными (т.е. кандидатными антигенами) из геля после амплификации 2ым антителом и последующей процедуры визуализации. (4) Идентификация кандидатных антигенов, полученных в этапе (3). (5) Экспрессирование указанных кандидатных антигенов в больших количествах с использованием системы экспрессии генов E. coli. (6) Исследование эффективности субъединичных вакцин по данному изобретению в уменьшении патологических проявлений в легком экспериментами стимуляции свиньи и, посредством этого проверяя ценность указанных кандидатных антигенов при использовании в качестве активного ингредиента субъединичной вакцины.
Композиция для профилактики инфекции Mycoplasma spp. по данному изобретению содержит активный ингредиент и фармацевтически приемлемый адъювант. В одном варианте осуществления данного изобретения, указанный активный ингредиент может представлять собой PdhA, XylF, EutD, Mhp145, P78, P132 или Mhp389. В альтернативном варианте осуществления при условии, что антигенная детерминанта любого из вышеуказанных белков не нарушается, указанный активный ингредиент может представлять собой слитый белок любых двух из вышеуказанных белков. В другом альтернативном варианте осуществления указанный активный ингредиент содержит по меньшей мере два из вышеуказанных белков; то есть является так называемой ʺкоктейльнойʺ вакциной по данному изобретению.
В другом варианте осуществления данного изобретения указанный активный ингредиент может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или их комбинацию. В альтернативном варианте осуществления при условии, что антигенная детерминанта, образованная укладкой пептида указанной аминокислотной последовательности, не нарушается, указанный активный ингредиент может представлять собой слитый белок с по меньшей мере двумя указанными последовательностями. В другом альтернативном варианте осуществления указанный активный ингредиент содержит два или более белков, соответственно содержащих одну из вышеуказанных аминокислотных последовательностей; то есть является так называемой ʺкоктейльнойʺ вакциной по данному изобретению.
Указанный фармацевтически приемлемый адъювант используется для улучшения иммунного эффекта указанного активного ингредиента, стабилизируя указанный активный ингредиент и/или увеличивая безопасность вакцин. Указанный фармацевтически приемлемый адъювант по данному изобретению включает в себя, но не ограничен ими: полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, алюмогель, поверхностно-активное вещество, полианионный адъювант, пептид, масляную эмульсию или их комбинацию.
Композиция по данному изобретению может иметь один или по меньшей мере два указанных активных ингредиента (т.е. коктейльная вакцина). В одном примере композиции по данному изобретению указанный активный ингредиент имеет концентрацию от 50 до 3500 мкг/мл в расчете на общий объем указанной композиции. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, когда указанная композиция содержит только один указанный активный ингредиент, указанный активный ингредиент имеет концентрацию от 50 до 500 мкг/мл в расчете на общий объем указанной композиции. В альтернативном варианте осуществления данного изобретения, композиция по данному изобретению содержит по меньшей мере один указанный активный ингредиент; где общая концентрация указанного активного ингредиента(ов), содержащаяся в указанной композиции, составляет от 50 до 1000 мкг/мл, от 50 до 1500 мкг/мл, от 50 до 2000 мкг/мл, от 50 до 2500 мкг/мл, от 50 до 3000 мкг/мл или от 50 до 3500 мкг/мл в расчете на общий объем указанной композиции.
Другой аспект данного изобретения заключается в предоставлении экспрессионного вектора для профилактики инфекции Mycoplasma spp. Конкретно, указанный экспрессионный вектор может быть использован для системы экспрессии генов E. coli. Тем не менее, не выходя за рамки основной идеи данного изобретения, рядовой специалист в данной области может модифицировать указанные векторы на основании данного открытия и сделать указанный вектор пригодным для другой системы экспрессии генов, что все еще будет находиться в рамках объема данного изобретения.
Указанный экспрессионный вектор содержит плазмиду. Указанная плазмида содержит: нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 06, SEQ ID NO: 07 и их комбинацию; и регуляторный элемент.
Указанный вектор используется в системе экспрессии генов E. coli и для продуцирования антигенов по данному изобретению посредством E. coli. Другими словами, указанная нуклеотидная последовательность может быть транслирована в последовательность аминокислот антигена по данному изобретению посредством системы экспрессии генов E. coli, и затем аминокислотная последовательность может быть уложена в антиген по данному изобретению.
В альтернативном варианте осуществления при условии, что функционирование системы экспрессии генов E. coli не блокировано и производство указанной нуклеотидной последовательности и укладка являющейся ее результатом аминокислотной последовательности не нарушены, указанная плазмида может содержать две или более указанных нуклеотидных последовательностей.
Указанный регуляторный элемент относится к элементу, требующемуся для инициирования транскрипции и трансляции в системе экспрессии. Указанный регуляторный элемент должен по меньшей мере содержать промотор и сайт связывания рибосомы. Предпочтительно указанный регуляторный элемент может дополнительно содержать: операторную, энхансерную последовательность или их комбинацию.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, указанная плазмида дополнительно содержит ген, кодирующий партнер слияния. Указанный партнер слияния включает в себя, но не ограничен ими MsyB E. coli, YjgD E. coli, белок D бактериофага лямбда или SUMO S. cerevisiae. Указанный MsyB имеет высокое содержание кислотных аминокислот и должен способствовать улучшению растворимости белков, которые должны быть продуцированы.
Последующие примеры, излагают испытания и эксперименты данного изобретения для того, чтобы дополнительно объяснить признаки и преимущества данного изобретения. Необходимо отметить, что последующие примеры являются иллюстративными и не должны быть использованы для ограничения объема притязаний данного изобретения.
Пример 1: Скринирование на кандидатные антигены, пригодные для использования в качестве активного ингредиента субъединичной вакцины.
Приготовление сыворотки, содержащей антитело против свиного Mycoplasm spp.
В соответствии с исследованиями из свиньи может быть выделено семь Mycoplasm spp.: Mycoplasm hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma flocculare, Mycoplasma hyopharyngis, Mycoplasma sualvi, Mycoplasma bovigenitalium (Gourlay et al., 1978; Blank et al., 1996; Assuncao et al., 2005). Среди них, M. hyopneumoniae является главным патогеном энзоотической пневмонии свиней с уровнем заболеваемости от 25 до 93%. Вследствие этого в данном изобретении использовали M. hyopneumoniae (штамм PRIT-5) для иммунных протеомных исследований и в качестве источников генов, кодирующих антигены. Среду Фриза (Friis et al., 1975) использовали для культивирования M. hyopneumoniae. В соответствии со схемой эксперимента соответствующее количество антибиотика или агар 1,5% добавляли для формирования твердой среды.
Три SPF свиньи возрастом 4 недели были доставлены из Научно-исследовательского института сельскохозяйственной технологии и их кормили одинаковым кормом и держали при одинаковых окружающих условиях и условиях роста в свинарнике перед экспериментами. После того, как свиней вскармливали до возраста 32 дня, 46 дней и 60 дней, свиньям вводили 2 мл вакцины Bayovac® MH-PRIT-5 (PRIT-5 M. hyopneumoniae) посредством внутримышечной инъекции. Затем свиней непрерывно вскармливали до возраста 74 дня и отбирали кровь из их яремной вены. Отобранную кровь помещали в условия комнатной температуры на 1 час и хранили при 4°C. На следующий день отобранную кровь центрифугировали при 1107×g в течение 30 минут и супернатант удаляли для очистки пробирки и хранили при -20°C.
Двумерный белковый электрофорез в геле тотального белка Mycoplasm spp.
Набор для выделения белка ReadyPrepTM (тотальный белок) (Bio-Rad, CA, USA) использовали для выделения тотального белка Mycoplasm spp. Впоследствии концентрацию собранного белка определяли с использованием Bio-Rad RC DC Protein Assay Kit (CA, USA). Подробный протокол может быть взят из описания продукта или может быть модифицирован из хорошо известных протоколов в данной области.
Двумерный электрофорез белков в геле проводили в два этапа: изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) и электрофорез в геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ-электрофорез). ИЭФ проводили для разделения белков в образце в зависимости от их изоэлектрической точки; ДСН-ПААГ-электрофорез проводили для разделения белков в соответствии с их молекулярной массой. См. фигуру 1, которая демонстрирует результат двумерного электрофореза белков в геле.
Гибридизация.
Сыворотку, полученную в этапе (1), использовали в качестве 1го антитела для гибридизирования с результатом двумерного электрофореза белков в геле в этапе (2). После того, как белки подвергали амплифицированию 2ым антителом и визуализации последующей процедурой визуализации, собирали белки, являвшиеся позитивными. Эти белки распознавались антителом к Mycoplasm spp. и вследствие этого могли быть пригодны в качестве кандидатных антигенов для активного ингредиента субъединичных вакцин.
Гибридизацию проводили посредством Вестерн-блотинга. Кратко, 2D гель после электрофореза переносили на PVDF мембрану. Затем мембрану инкубировали и гибридизировали последовательно с 1ым антителом (сыворотка, содержащая антитело к Mycoplasm spp.) и 2ым антителом (конъюгированные с AP анти-свиные IgG). Впоследствии проводили цветную реакцию с использованием раствора NBT/BCIP.
Результат цветной реакции Вестерн-блотинга показан на фигуре 2; где 10 белков, позитивных в иммуногибридизации с антителом к Mycoplasm spp., обозначали как кандидатные антигены для использования в качестве активных ингредиентов субъединичных вакцин.
Идентификация полученных кандидатных антигенов.
В соответствии с цветной реакцией Вестерн-блотинга гель, соответствующий позитивному положению на мембране, разрезали на микропептид и анализировали посредством масс-спектроскопии. Полученные данные масс-спектроскопии затем совмещали с аминокислотной последовательностью и базой данных белков для идентификации этих белков.
См. следующую таблицу 1, приведены указанные 10 белков, позитивных к иммуногибридизации с антителом к Mycoplasm spp.
Таблица 1 10 белков, позитивных к иммуногибридизации с антителом к Mycoplasm spp. и их амино последовательность. |
||
Кандидат | Название | SEQ ID NO |
1 | XylF (связывающий ксилозу липопротеин) | SEQ ID NO: 09 |
2 | XylF (связывающий ксилозу липопротеин) | SEQ ID NO: 09 |
3 | XylF (связывающий ксилозу липопротеин) | SEQ ID NO: 09 |
4 | PdhA (E1-альфа субъединица пируватдегидрогеназы) | SEQ ID NO: |
5 | Mhp145 (периплазматический связывающий сахар белок) | SEQ ID NO: 11 |
6 | EutD (фосфотрансацетилаза) | SEQ ID NO: 10 |
7 | EutD (фосфотрансацетилаза) | SEQ ID NO: 10 |
8 | Mhp389 | SEQ ID NO: 14 |
9 | P78 (липопротеин) | SEQ ID NO: 12 |
10 | P132 | SEQ ID NO: 13 |
*XylF и EutD имеют различные состояния заряда в клетках и вследствие этого становятся 3 и 2 позитивным положением на мембране. |
Пример 2: Экспрессирование указанных кандидатных антигенов в большом количестве посредством системы экспрессии генов
E. coli
.
Escherichia coli JM109 использовали в качестве клеток хозяина для клонирования и Escherichia coli BL21 (DE3) использовали в качестве клеток хозяина для экспрессии белка. Клетки Escherichia coli культивировали в среде LB (Luria-Bertani; Difco, Michigan, USA). В соответствии с планом эксперимента соответствующее количество антибиотика или агар 1,5% добавляли для формирования твердой среды.
Амплификация генов, кодирующих кандидатные антигены.
После того, как кандидатные антигены были идентифицированы, искали гены, кодирующие такие антигены в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information). Специфичные праймеры, нацеленные на гены антигена были сконструированы соответствующим образом. Затем гены антигена амплифицировали с использованием специфичных праймеров и хромосомы M. hyopneumoniae PRIT-5 в качестве матрицы. Использованные специфичные праймеры приведены в последующей таблице 2.
Таблица 2 Набор праймеров. |
|
Кандидат | Последовательности набора праймеров |
PdhA | PdhAF (SEQ ID NO: 15) 5'-GATATAGGATCCATGGACAAATTTCGCTATGTAAAGCCT G-3' PdhAR (SEQ ID NO: 16) 5'-CAATATGTCGACTTATTTTACTCCTTTAAAAAATTCAAGCG CTTC-3' |
XylF | XylFF (SEQ ID NO: 17) 5'-GATATAGGATCCATGAATGGAATAAATTTCTTGGCTTAGGC TTAGTTTTTC-3' XylFR (SEQ ID NO: 18) 5'-CAATATGTCGACTTAATTTTTATTAATATCGGTAATTAGTT TGTCTAAGC-3' |
EutD | EUTDF (SEQ ID NO: 19) 5'-GATATAGGATCCATGACATACCAAGAATATCTTCAAGCAA G-3' EUTDR (SEQ ID NO: 20) 5'-CAATATGTCGACCTATTTACCTTCTTCAAC TTGTAGAGCGCT-3' |
Mhp145 | Mhp145F (SEQ ID NO: 21) 5'-GATATAGGATCCATAGCTTCAAGGTCGAA TACAACTGC-3' Mhp145R (SEQ ID NO: 22) 5'-CAATATGTCGACTTAATTTACCTTTTGGAG TATCCCATTTTC-3' |
P78 | P78F (SEQ ID NO: 23) 5'-GATATAGGATCCTTATCCTATAAATTTAGG CGTTTTTTCC-3' P78R (SEQ ID NO: 24) 5'-CAATATGTCGACTTATTTTGATTTAAAAGCAGGACCTAA AT-3' |
P132 | P132F (SEQ ID NO: 25) 5'-GATATAGGATCCATTGGACTAACAATTTTTGAGAAATCATT TAG-3' P132R (SEQ ID NO: 26) 5'-CAATATGTCGACTTATTCCTAAATAGCCCC ATAAAGTG-3' |
Mhp389 | Mhp389F (SEQ ID NO: 27) 5'-GATATAGGATCCATGGACAAATTTTCACGA ACTGTTCT-3' Mhp389R (SEQ ID NO: 28) 5'-CAATATGTCGACCTAGATTTTAAAGGATTTTTTTAATTCAA TAATATAATC-3' |
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с наборами праймеров, приведенных в таблице 2 выше, для амплификации генов кандидатных антигенов. Амплифицированные гены затем использовали системе экспрессии генов E. coli. Условия ПЦР были следующими: 5 минут при 98°C (один цикл); 30 секунд при 94°C, 30 секунд при 55°C, X секунд при 68°C (35 циклов); 5 минут при 68°C (один цикл). Указанный X являлся временем элонгации для ДНК полимеразы и его устанавливали в зависимости от размера фрагмента, который должен быть амплифицирован. После ПЦР проводили электрофорез для проверки того, если продукты ПЦР содержали фрагменты ДНК ожидаемого размера. См. фигуру 3, которая демонстрирует результат электрофореза продуктов ПЦР; где трек 1 являлся геном eutD; трек 2 являлся pdhA; трек 3 являлся xylF; трек 4 являлся геном P78; трек 5 являлся геном P132; трек 6 являлся mhp145; трек 7 являлся mhp389.
Клонирование продуктов ПЦР.
Клонирование проводили с использованием набора для клонирования ПЦР CloneJET и лигационную смесь трансформировали в E. coli ECOSTM 9-5 (Yeastern, Taipei, Taiwan). Подробный протокол может быть получен из описания продукта или модифицирован из хорошо известного протокола в данной области.
После трансформации бактерии культивировали на твердой среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) до формирования их колонии. Затем проводили ПЦР по колониям для скринирования штаммов с успешной трансформацией. Условия ПЦР были следующими: 5 минут при 95°C (один цикл); 30 секунд при 95°C, 30 секунд при 55°C, X секунд при 72°C (25 циклов); 7 минут при 72°C (один цикл). Указанный X являлся временем элонгации для ДНК полимеразы и был установлен в зависимости от размера фрагмента, который должен быть амплифицирован. Скорость элонгации Taq ДНК полимеразы (Genomics, Taipei, Taiwan) составляет 1 т.н./мин; вследствие этого, если Taq ДНК полимераза используется для амплифицирования фрагмента ДНК 1 т.н., указанный X будет установлен на 1 минуту.
Плазмиды из штаммов, для которых было подтверждено наличие вставки ДНК в рекомбинантной плазмиде, затем подвергали ДНК секвенированию (Total Solution Provider of Systems Biology and Chemoinformatics Ltd.). Плазмиды, содержащие eutD, pdhA, xylF, ген P78, ген P132, mhp145 и mhp389 были названы pJET-eutD, pJET-pdhA, pJET-xylF, pJET-P78, pJET-P132, pJET-mhp145, pJET-mhp389, соответственно.
Точечная мутация и клонирование генов антигена M. hyopneumoniae.
Перед амплифицированием кандидатных антигенов в системе экспрессии генов E. coli необходимо рассмотреть значение кодона в различных организмах. При этом, если ген содержит кодон, который будет неодинаково кодироваться в организме, из которого он происходит, и E. coli, ген должен быть модифицирован точечной мутацией.
Гены антигена M. hyopneumoniae, pdhA, xylF, ген P78, ген P132, mhp145 и mhp389, содержат кодон TGA (eutD не имеет проблем со значением кодона подобно другими). Кодон TGA транслировался в триптофан в Mycoplasma spp., но транслировался как стоп-кодон в E. coli. Для того чтобы предотвратить невозможность продуцирования целого белка в системе экспрессии генов E. coli, сконструировали праймеры, нацеленные на сайт TGA, и проводили точечную мутацию, замещающую TGA на TGG с использованием полимеразной цепной реакции с перекрывающимися удлинениями. В результате, гены, которые должны быть экпрессированы в системе экспрессии генов E. coli, могут быть безошибочно транслированы в кандидатный антиген данного изобретения. Кроме того, сайты рестрикции BamHI гена P78, гена P132 и mhp389, были подвержены молчащей мутации для удобства клонирования.
Праймеры, использованные для точечной мутации, сконструировали, чтобы сайт точечной мутации был расположен в центральной части праймера и чтобы значение Tm было выше 78°C. Значение Tm праймеров для точечной мутации рассчитывали с использованием формулы, предоставленной Invitrogene Co.: Tm=81,5+0,41 (%GC) - 675/N - % несоответствия; где %GC обозначает процентное содержание GC относительно общего количества нуклеотидов, содержащихся в рассматриваемом праймере; N обозначает длину рассматриваемого праймера; %несоответствие обозначает процентное содержание основания, которое должно подвергнуться мутации относительно общего содержания нуклеотидов, содержащихся в рассматриваемом праймере. Наборы праймеров, использованных для вышеуказанных генов, приведены в последующих таблицах 3-8.
Таблица 3 Наборы праймеров для точечной мутации pdhA. |
|
Праймер | Последовательность ДНК (5'-3') |
PdhAF
SEQ ID NO: 29 |
GATATAGGATCCATGGACAAATTTCGCTATGTAAAGCCTG |
PdhAM1 SEQ ID NO: 30 |
GCTAACAAAAGATGACTGGTTTGTCCCAGCTTTTCG |
PdhAM2 SEQ ID NO: 31 |
CGAAAAGCTGGGACAAACCAGTCATCTTTTGTTAGC |
PdhAM3 SEQ ID NO: 32 |
CTTGCAAATGCAATATTGGAATGGTAGCGAAAAAGG |
PdhAM4 SEQ ID NO: 33 |
CCTTTTTCGCTACCATTCCAATATTGCATTTGCAAG |
PdhAM5 SEQ ID NO: 34 |
CGAGGCGCTAAATATTGCAAGTATTTGGAAATGGCCAGTTGTTTTTTGCGTAAATAAC |
PdhAM6 SEQ ID NO: 35 |
GTTATTTACGCAAAAAACAACTGGCCATTTCCAAATACTTGCAATATTTAGCGCCTCG |
PdhAM7 SEQ ID NO: 36 |
GTTTTTTGCGTAAATAACAATCAATGGGCAATTTCAACCCCAAATAAATATG |
PdhAM8 SEQ ID NO: 37 |
CATATTTATTTGGGGTTGAAATTGCCCATTGATTGTTATTTACGCAAAAAAC |
PdhAM9 SEQ ID NO: 38 |
GTTGAGTTTGTAACTTGGCGTCAAGGTGTTCATACC |
PdhAM10 SEQ ID NO: 39 |
GGTATGAACACCTTGACGCCAAGTTACAAACTCAAC |
PdhAM11 SEQ ID NO: 40 |
GAGAACACGAAAAATGGGAACCAATGCACCGG |
PdhAM12 SEQ ID NO: 41 |
CCGGTGCATTGGTTCCCATTTTTCGTGTTCTC |
PdhAM13 SEQ ID NO: 42 |
CCGAAAAACAAAAAATTTGGGATGAAGCGCTTGCGATTG |
PdhAM14 SEQ ID NO: 43 |
CAATCGCAAGCGCTTCATCCCAAATTTTTTGTTTTTCGG |
PdhAR SEQ ID NO: 44 |
CAATATGTCGACTTATTTTACTCCTTTAAAAAATTCAAGCGCTTC |
Таблица 4 Наборы праймеров для точечной мутации xylF |
|
Праймер | Последовательность ДНК (5'-3') |
XylFF SEQ ID NO: 45 |
GATATAGGATCCATGAAATGGAATAAATTTCTTGGCTTAGGCTTAGTTTTTC |
XylFM1 SEQ ID NO: 46 |
CATTTAACCAATCAAGTTGGGAGGCAATTCAACAACTTGG |
XylFM2 SEQ ID NO: 47 |
CCAAGTTGTTGAATTGCCTCCCAACTTGATTGGTTAAATG |
XylFM3 SEQ ID NO: 48 |
CTAATACCAACAAAAATGTTTGGGTACTTTCTGGTTTTCAACACG |
XylFM4 SEQ ID NO: 49 |
CGTGTTGAAAACCAGAAAGTACCCAAACATTTTTGTTGGTATTAG |
XylFM5 SEQ ID NO: 50 |
CGGTGATGCGATCACAAAATGGTTAAAAATCCCTGAAAATAAGC |
XylFM6 SEQ ID NO: 51 |
GCTTATTTTCAGGGATTTTTAACCATTTTGTGATCGCATCACCG |
XylFM7 SEQ ID NO: 52 |
TTATCATACTCGGAATTGACTGGACTGATACTGAAAATGTAATTC |
XylFM8 SEQ ID NO: 53 |
GAATTACATTTTCAGTATCAGTCCAGTCAATTCCGAGTATGATAA |
XylFM9 SEQ ID NO: 54 |
GAAGAAGCCGGATGGCTTGCAGGATATGC |
XylFM10 SEQ ID NO: 55 |
GCATATCCTGCAAGCCATCCGGCTTCTTC |
XylFM11 SEQ ID NO: 56 |
GGTTATCTAGCCGGAATTAAAGCTTGGAATCTAAAAAATTCTGATAAAAAAAC |
XylFM12 SEQ ID NO: 57 |
GTTTTTTTATCAGAATTTTTTAGATTCCAAGCTTTAATTCCGGCTAGATAACC |
XylFR SEQ ID NO: 58 |
CAATATGTCGACTTAATTTTTATTAATATCGGTAATTAGTTTGTCTAAGC |
Таблица 5 Наборы праймеров для точечной мутации гена P78. |
|
Праймер | Последовательность ДНК (5'-3') |
P78F SEQ ID NO: 59 |
GATATAGGATCCTTATCCTATAAATTTAGGCGTTTTTTCC |
P78M1 SEQ ID NO: 60 |
CAATTAATAAAGTTTTGTTTGGTTGGATGATTAATAAAGCACTTGCTGATCC |
P78M2 SEQ ID NO: 61 |
GGATCAGCAAGTGCTTTATTAATCATCCAACCAAACAAAACTTTATTAATTG |
P78M3 SEQ ID NO: 62 |
GATATTAAAGAAATTGAAAGAATCTGGAAAAAATATGTCTCCGATGATCAAGG |
P78M4 SEQ ID NO: 63 |
CCTTGATCATCGGAGACATATTTTTTCCAGATTCTTTCAATTTCTTTAATATC |
P78M5 SEQ ID NO: 64 |
GCCCTTTCAGGAGGCTCCACTGATTCGGCA |
P78M6 SEQ ID NO: 65 |
TGCCGAATCAGTGGAGCCTCCTGAAAGGGC |
P78M7 SEQ ID NO: 66 |
GCCGCAAAAGCTTTTGTTAAATGGCTTTTGACAGAAAAAATAGTCT |
P78M8 SEQ ID NO: 67 |
AGACTATTTTTTCTGTCAAAAGCCATTTAACAAAAGCTTTTGCGGC |
P78R SEQ ID NO: 68 |
CAATATGTCGACTTATTTTGATTTAAAAGCAGGACCTAAAT |
Таблица 6 Наборы праймеров для точечной мутации гена P132. |
|
Праймер | Последовательность ДНК (5'-3') |
P132F SEQ ID NO: 69 |
GATATAGGATCCATTGGACTAACAATTTTTGAGAAATCATTTAG |
P132M1 SEQ ID NO: 70 |
CTAACTTCTCTAAAAGGTTGGAAAGAAGAAGATGATTTTG |
P132M2 SEQ ID NO: 71 |
CAAAATCATCTTCTTCTTTCCAACCTTTTAGAGAAGTTAG |
P132M3 SEQ ID NO: 72 |
CTTTCTATTACTTTTGAACTCTGGGACCCAAATGGTAAATTAGTATC |
P132M4 SEQ ID NO: 73 |
GATACTAATTTACCATTTGGGTCCCAGAGTTCAAAAGTAATAGAAAG |
P132M5 SEQ ID NO: 74 |
CCCTGAAGGAGATTGGATAACTTTAGGGAG |
P132M6 SEQ ID NO: 75 |
CTCCCTAAAGTTATCCAATCTCCTTCAGGG |
P132M7 SEQ ID NO: 76 |
CTACCAGGAACTACCTGGGATTTCCATGTTGAAC |
P132M8 SEQ ID NO: 77 |
GTTCAACATGGAAATCCCAGGTAGTTCCTGGTAG |
P132M9 SEQ ID NO: 78 |
GGACAACTAATTTGGAGCCAGTTAGCTTCC |
P132M10 SEQ ID NO: 79 |
GGAAGCTAACTGGCTCCAAATTAGTTGTCC |
P132M11 SEQ ID NO: 80 |
GGAACAAAAAAGGAATGGATTCTTGTAGGATCTGG |
P132M12 SEQ ID NO: 81 |
CCAGATCCTACAAGAATCCATTCCTTTTTTGTTCC |
P132M13 SEQ ID NO: 82 |
CCAATACGCAAATATGGATAACCCGTCTAGGAAC |
P132M14 SEQ ID NO: 83 |
GTTCCTAGACGGGTTATCCATATTTGCGTATTGG |
P132M15 SEQ ID NO: 84 |
CCAAGGGGAAGTTCTCTGGACTACTATTAAATCCAAAC |
P132M16 SEQ ID NO: 85 |
GTTTGGATTTAATAGTAGTCCAGAGAACTTCCCCTTGG |
P132M17 SEQ ID NO: 86 |
CAAAAAACTTCACCTTTGGTGGATTGCTAATGATAGC |
P132M18 SEQ ID NO: 87 |
GCTATCATTAGCAATCCACCAAAGGTGAAGTTTTTTG |
P132R SEQ ID NO: 88 |
CAATATGTCGACT TATTCCTAAATAGCCCCATAAAGTG |
Таблица 7 Наборы праймеров для точечной мутации mhp145. |
|
Праймер | Последовательность ДНК (5'-3') |
Mhp145F SEQ ID NO: 89 |
GATATAGG ATCCAT AGCTTCAAGGTCGAATACAACTGC |
Mhp145M1 SEQ ID NO: 90 |
AATAATTGCAGAAAAAATTCTTAAAGATCAATGGAAAACAAGTAAATATTCTGATTTTTATTCACAAT |
Mhp145M2 SEQ ID NO: 91 |
ATTGTGAATAAAAATCAGAATATTTACTTGTTTTCCATTGATCTTTAAGAATTTTTTCTGCAATTATT |
Mhp145R SEQ ID NO: 92 |
CAATATGTCGACTTA ATTTACCTTTTGGAGTATCCCATTTTC |
Таблица 8 Наборы праймеров для точечной мутации mhp389. |
|
Праймер | Последовательность ДНК (5'-3') |
Mhp389F SEQ ID NO: 93 |
GATATAGGATCCATGGACAAATTTTCACGAACTGTTCT |
Mhp389M1 SEQ ID NO: 94 |
CAATAGTGACAATGGACCCCCCAAATGTTGGTCG |
Mhp389M2 SEQ ID NO: 95 |
CGACCAACATTTGGGGGGTCCATTGTCACTATTG |
Mhp389M3 SEQ ID NO: 96 |
GATAAAGGCGCATCATGGCTTGCGCTTGCACCAAC |
Mhp389M4 SEQ ID NO: 97 |
GTTGGTGCAAGCGCAAGCCATGATGCGCCTTTATC |
Mhp389M5 SEQ ID NO: 98 |
GGAAAACTTAAAGGTAAATGGACTTTTGGACTAACCTATTT |
Mhp389M6 SEQ ID NO: 99 |
AAATAGGTTAGTCCAAAAGTCCATTTACCTTTAAGTTTTCC |
Mhp389R SEQ ID NO: 100 |
CAATATGTCGACCTAGATTTTAAAGGATTTTTTTAATTCAATAATATAATC |
Способ точечной мутации кратко разъяснен ниже. Хромосому M. hyopneumoniae PRIT-5 использовали в качестве матрицы и ДНК фрагменты амплифицировали с использованием наборов праймеров, приведенных в таблицах 3-8 выше.
Реакционная смесь для ПЦР объемом 50 мкл содержала буфер для ПЦР 1× GDP-HiFi, 200 мкМ смеси dATP, dTTP, dGTP и dCTP, 1 мкМ праймеров, 100 нг хромосомы M. hyopneumoniae PRIT-5 и 1 Ед ДНК полимеразы GDP-HiFi. Условия ПЦР были следующими: 5 минут при 98°C (один цикл); 30 секунд при 94°C, 30 секунд при 55°C, X секунд при 68°C (35 циклов); 5 минут при 68°C (один цикл). Указанный X являлся временем элонгации для ДНК полимеразы и был установлен в зависимости от размера фрагмента, который должен быть амплифицирован. Скорость элонгации ДНК полимеразы GDP-HIFI (GeneDirex, Las Vegas, USA) составляет 1 т.н./15 секунд; вследствие этого, если ДНК полимераза GDP-HIFI используется для амплифицирования фрагмента ДНК 1 т.н., указанный X будет составлять 15 секунд. После ПЦР проводили электрофорез для проверки того, если продукты ПЦР содержали фрагменты ДНК ожидаемого размера. Затем продукт ПЦР был рециркулирован с использованием набора системы для выделения из геля Gel-MTM.
Впоследствии продукт ПЦР использовали в качестве матрицы и амплифицировали с использованием наборов праймеров, приведенных в таблице 2 выше. Условия ПЦР были следующими: 2 минуты при 98°C (один цикл); 30 секунд при 94°C, 30 секунд при 55°C, X секунд при 68°C (35 циклов); 5 минут при 68°C (один цикл). Указанный X являлся временем элонгации для ДНК полимеразы и был установлен в зависимости от размера фрагмента, который должен быть амплифицирован. Скорость элонгации ДНК полимеразы GDP-HIFI (GeneDirex, Las Vegas, USA) составляет 1 т.н./15 секунд; вследствие этого, если ДНК полимераза GDP-HIFI используется для амплифицирования фрагмента ДНК 1 т.н., указанный X будет составлять 15 секунд. После вышеуказанного этапа амплификации может быть получена полноразмерная последовательность кандидатных генов антигена с точечной мутацией.
Затем продукт ПЦР выделяли с использованием набора системы очистки PCR-MTM (GeneMark, Taichung, Taiwan) и проводили его клонирование использованием набора для клонирования ПЦР CloneJET. Проводили ПЦР по колониям для подтверждения того, что штаммы после трансформации, содержали плазмиду, имеющую вставку ДНК, и затем плазмиды выделяли для ДНК секвенирования (Total Solution Provider of Systems Biology and Chemoinformatics Ltd.). Плазмиды, содержащие мутированные кандидатные гены антигена, были названы pJET-pdhAM, pJET-xylFM, pJET-P78M, pJET-P132M, pJET-mhp145M, pJET-mhp389M, соответственно.
В соответствии с результатом секвенирования ДНК последовательности кандидатных генов антигена после точечной мутации являлись такими, как показано в SEQ ID NO:01 (pdhA), SEQ ID NO:02 (xylF), SEQ ID NO:03 (eutD, был без точечной мутации), SEQ ID NO:04 (mhp145), SEQ ID NO:05 (ген P78), SEQ ID NO:06 (ген P132), SEQ ID NO:07 (mhp389).
Конструирование экспрессионных векторов для экспрессирования антигенов M. hyopneumoniae
В этой части экспериментов плазмиду pET-MSY использовали в качестве остова для конструирования экспрессионного вектора для экспрессирования антигена M. hyopneumoniae. pET-MSY является производной pET29a и имеет MsyB E. coli. Вследствие этого, экспрессированный рекомбинантный антиген будет иметь партнера слияния MsyB. MsyB имеет большое содержание кислотных аминокислот и способен к увеличению растворимости экспрессированного белка.
После того, как pJET-eutD, pJET-pdhA, pJET-xylF, pJET-P78, pJET-P132, pJET-mhp145 и pJET-mhp389 были расщеплены BamHI и SalI, полученный фрагмент ДНК встраивали в pET-Msy, расщепленную предварительно с такими же рестрикционными ферментами, посредством лигазы. Затем pET-Msy с ДНК фрагментом трансформировали в E. coli ECOS 9-5. Проводили ПЦР по колониям для подтверждения штаммов после трансформации, содержащих плазмиду, имеющую вставку ДНК, и затем плазмиды выделяли из них для секвенирования ДНК (Total Solution Provider of Systems Biology and Chemoinformatics Ltd.). Плазмиды c подтвержденной корректной ДНК последовательностью были названы pET-MSYEutD, pET-MSYPdhA, pET-MSYXylF, pET-MSYP78, pET-MSYP132, pET-MSYMhp145 и pET-MSYMhp389, соответственно. Такие полученные плазмиды являлись примерами экспрессионных векторов для профилактики инфекции Mycoplasma spp. по данному изобретению.
Экспрессия и выделение антигенов M. hyopneumoniae
Векторы для экспрессии антигена трансформировали в E. coli BL21 (DE3). Единичные колонии штаммов, являющихся результатом трансформации, инокулировали в жидкую среду LB, содержащую канамицин (рабочая концентрация: 30 мкг/мл). После культивирования в течение ночи 37°C, 180 об./мин. суспензию бактерий разбавляли в соотношении 1:100 и инокулировали снова в другую жидкую среду LB, содержащую канамицин (рабочая концентрация: 30 мкг/мл). Бактерии культивировали при 37°C, 180 об./мин. до OD600 вследствие этого достигая приблизительно от 0,6 до 0,8. Затем добавляли 0,1 мМ IPTG для индуцирования экспрессии. После индукции в течение 4 часов осадок собирали центрифугированием (10000×g, 10 минут, 4°C) и экспрессию проверяли посредством белкового электрофореза.
Впоследствии использовали аффинную хроматографию с иммобилизованными металлами (IMAC) для выделения белка посредством ковалентного связывания между His tag N-конца рекомбинантного белка и ионами никеля или ионами кобальта. Протокол выделения белка соответствовал описанию продукта QIAexpressionistTM (fourth edition, Qiagen). Осадок суспендировали в буфере для лизиса (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, pH 8,0) и разрушали ультразвуковым гомогенизатором. После центрифугирования (8000×g, 15 минут) отбирали супернатант для введения в колонку с 1 мл смолы Ni-NTA. Рекомбинантные антигены должны были связаться на указанной смоле. Затем в колонку вводили 15 мл промывочного буфера (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, pH 8,0) для промывки смолы, чтобы неспецифически связанные белки были удалены. В заключение, добавляли 20 мл элюирующего буфера (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол, pH 8,0) для вымывания рекомбинантных антигенов со смолы; в которой имидазол с высокой концентрацией может конкурировать за сайт связывания на смоле с рекомбинантными белками и посредством этого вызывая вымывание рекомбинантных белков. Результат выделения затем проверяли электрофорезом белков.
Кандидатные антигены данного изобретения, собранные посредством выделения, могут затем быть использованы для последующих иммунных испытаний для подтверждения возможности их использования в качестве активного ингредиента субъединичных вакцин против Mycoplasm spp.
Пример 3: Эксперименты иммунной стимуляции свиней кандидатными антигенами данного изобретения.
В этом примере кандидатные антигены данного изобретения использовали в качестве активного ингредиента для приготовления субъединичных вакцин и тестировали на их иммунные эффекты в живой свинье.
Приготовление вакцины
Один выделенный рекомбинантный антиген или несколько выделенных рекомбинантных антигенов смешивали с алюмогелем в качестве адъюванта для приготовления субъединичной вакцины или коктейльной субъединичной вакцины. Каждая доза приготовленной вакцины имела объем 2 мл, и содержание каждого вида антигена составляло 100 мкг.
В последующей таблице 9 приведены образцы, приготовленные в этом примере для экспериментов иммунной стимуляции.
Таблица 9 Образцы вакцины, приготовленные в примере 3 |
|
Образец | Активный ингредиент (Антиген) |
1 | PdhA |
2 | XylF |
3 | EutD |
4 | Mhp145 |
5 | P78 |
6 | P132 |
7 | Mhp389 |
8 | PdhA+P78 |
9 | XylF+Mhp145 |
Эксперименты иммунной стимуляции свиней проводили с использованием Bayovac® MH-PRIT-5 (изготовлен с использованием M. hyopneumoniae PRIT-5, в качестве позитивной контрольной группы), субъединичных вакцин (образцы 1-7 данного изобретения) и коктейльных вакцин (образцы 8 и 9 данного изобретения).
33 свиньи SPF возрастом 4 недели доставляли из Научно-исследовательского института сельскохозяйственной технологии и кормили с одинаковыми кормом, окружающими условиями и условиями роста в свинарнике перед экспериментами.
После того, как свиней вскармливали до возраста 35 дней и 49 дней, свиньям вводили 2 мл вышеприведенной вакцины посредством внутримышечной инъекции.
Стимуляционные эксперименты
Вышеуказанных свиней, подвергаемых индуцированию иммунного ответа, стимулировали Mycoplasm spp. в возрасте 109 дней для подтверждения иммунного эффекта вышеуказанных вакцин.
Сначала легкое, отобранное у свиней, инфицированных Mycoplasm spp., измельчали в 20 мл среды Фриза и центрифугировали при 148,8×g в течение 10 минут. Супернатант удаляли для очистки пробирки и центрифугировали снова при 7870×g в течение 40 минут. Затем супернатант удаляли и осадок суспендировали в 6 мл среды Фриза для получения суспензии. Впоследствии суспензию фильтровали через мембраны 5 мкм и 0,45 мкм последовательно для получения растворов бактерий, требующихся для стимуляционных экспериментов.
Раствор бактерий (5 мл) вводили подвергнутым наркозу свиньям через их трахею. После 28 дней введения свиней умерщвляли и вскрывали для отбора их легкого. Иммунный эффект проверяли посредством наблюдения за легким и регистрировали в соответствии со следующими критериями: наблюдаемый патологический признак в любой из средних верхних долей и верхних долей любой стороны легкого оценивали как 10 баллов; наблюдаемый патологический признак в любой средней верхней доле и диафрагмальных долях любой стороны легкого, оценивали как 5 баллов. Общая оценка составляла 55 баллов. Запись результатов наблюдения представлена на фигуре 4.
По сравнению с результатами неинъецированных свиней семь кандидатных антигенов данного изобретения были способны обеспечивать иммунные эффекты, эквивалентные общепринятой вакцине (Bayovac® MH-PRIT-5). Если принимать во внимание более высокую безопасность субъединичных вакцин, то вакцины, содержащие кандидатные антигены данного изобретения, должны иметь большую ценность.
С другой стороны не являлось обычным использование двух или более антигенов, которые должны индуцировать иммунные эффекты в одной вакцине из-за того, что два или более антигенов могут не обеспечивать двойной иммунный эффект. В действительности имеет место более высокая вероятность того, что два или более антигенов будут препятствовать друг другу и в результате снижать иммунный эффект вакцины. В соответствии с результатом этого примера, образец 8 и образец 9 данного изобретения (т.е. коктейльная вакцина) неожиданно обеспечивали существенное возрастание иммунного эффекта. При этом субъединичные вакцины данного изобретения не только имеют высокую безопасность, но также предоставляют больший иммунный эффект, когда кандидатные антигены данного изобретения использованы в комбинации.
Рядовой специалист в данной области может легко понять любые возможные модификации на основании открытия данного изобретения без выхода за рамки основной идеи данного изобретения. Вследствие этого примеры выше не должны быть использованы для ограничения данного изобретения, но подразумевают охватывание любых возможных модификации в рамках основной идеи и объема данного изобретения в соответствии с приведенной далее формулой изобретения.
Claims (11)
1. Композиция для профилактики инфекции Mycoplasma spp., содержащая:
эффективное количество белка XylF в качестве активного ингредиента указанной композиции; и
фармацевтически приемлемый адъювант;
где XylF имеет последовательность SEQ ID NO: 09.
2. Композиция по п.1, где указанный активный ингредиент имеет концентрацию от 50 до 3500 мкг/мл общего объема указанной композиции.
3. Композиция по п.1, где указанный фармацевтически приемлемый адъювант представляет собой полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, алюмогель, поверхностно-активное вещество, полианионный адъювант, пептид, масляную эмульсию или их комбинацию.
4. Композиция для профилактики инфекции Mycoplasma spp., содержащая:
эффективное количество белка XylF в качестве активного ингредиента указанной композиции; фармацевтически приемлемый адъювант; и
фармацевтически приемлемую добавку;
где XylF имеет последовательность SEQ ID NO: 09.
5. Композиция по п.4, где указанная фармацевтически приемлемая добавка представляет собой растворитель, стабилизатор, разбавитель, консервант, антибактериальный агент, противогрибковый агент, изотонический агент, замедляющий абсорбцию агент или их комбинацию.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017131504A RU2668799C1 (ru) | 2017-09-08 | 2017-09-08 | Субъединичная вакцина против mycoplasma spp. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017131504A RU2668799C1 (ru) | 2017-09-08 | 2017-09-08 | Субъединичная вакцина против mycoplasma spp. |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015137851A Division RU2636459C2 (ru) | 2013-02-05 | 2013-02-05 | Субъединичная вакцина против mycoplasma spp. |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018132357A Division RU2695679C1 (ru) | 2018-09-11 | 2018-09-11 | Субъединичная вакцина против mycoplasma spp. |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2668799C1 true RU2668799C1 (ru) | 2018-10-02 |
Family
ID=63798478
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017131504A RU2668799C1 (ru) | 2017-09-08 | 2017-09-08 | Субъединичная вакцина против mycoplasma spp. |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2668799C1 (ru) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0359919A2 (en) * | 1988-06-29 | 1990-03-28 | Ml Technology Ventures, L.P. | Recombinant mycoplasma hyopneumoniae antigen and uses therefor |
EA009901B1 (ru) * | 2001-07-02 | 2008-04-28 | Пфайзер Продактс Инк. | Способ лечения или предупреждения заболевания или нарушения у животного, вызванного mycoplasma hyopneumoniae |
-
2017
- 2017-09-08 RU RU2017131504A patent/RU2668799C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0359919A2 (en) * | 1988-06-29 | 1990-03-28 | Ml Technology Ventures, L.P. | Recombinant mycoplasma hyopneumoniae antigen and uses therefor |
EA009901B1 (ru) * | 2001-07-02 | 2008-04-28 | Пфайзер Продактс Инк. | Способ лечения или предупреждения заболевания или нарушения у животного, вызванного mycoplasma hyopneumoniae |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
БД GenBank последовательность * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2636459C2 (ru) | Субъединичная вакцина против mycoplasma spp. | |
KR101842081B1 (ko) | 마이코플라즈마 에스피피 감염을 예방하기 위한 조성물 | |
RU2668799C1 (ru) | Субъединичная вакцина против mycoplasma spp. | |
RU2695679C1 (ru) | Субъединичная вакцина против mycoplasma spp. | |
WO2019084833A1 (zh) | 防治家禽滑膜霉浆菌感染的组合物 | |
RU2759427C2 (ru) | Субъединичная вакцина против mycoplasma spp | |
EP3498728A1 (en) | Composition for preventing and treatingmycoplasma hyorhinis |